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CN114107303A - sgRNA、质粒、IRF7功能缺失的细胞系及其构建方法和应用 - Google Patents

sgRNA、质粒、IRF7功能缺失的细胞系及其构建方法和应用 Download PDF

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CN114107303A
CN114107303A CN202111494484.6A CN202111494484A CN114107303A CN 114107303 A CN114107303 A CN 114107303A CN 202111494484 A CN202111494484 A CN 202111494484A CN 114107303 A CN114107303 A CN 114107303A
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irf7
sgrna
plasmid
cell line
cell
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CN202111494484.6A
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陈瑞爱
杨洁
向程威
王婷
黄梅
杨泽坤
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Zhaoqing Institute Of Biotechnology Co ltd
Zhaoqing Branch Center Of Guangdong Provincial Laboratory Of Lingnan Modern Agricultural Science And Technology
Original Assignee
Zhaoqing Institute Of Biotechnology Co ltd
Zhaoqing Branch Center Of Guangdong Provincial Laboratory Of Lingnan Modern Agricultural Science And Technology
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Abstract

本发明属于生物技术领域，提供了一种用于特异性靶向IRF7基因的sgRNA，所述sgRNA序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。该sgRNA引物可与合适的载体结构构成质粒，用于敲除相应的基因实现IRF7功能的缺失。同时，本发明还提供了一种质粒、IRF7功能缺失的细胞系及其构建方法和应用。本发明的细胞系的优势在于：IFN‑βmRNA水平、IRF1mRNA水平、VIPERIN mRNA水平、CMPK2mRNA水平可以达到显著的抑制。相比于CN201910352557.4仅抑制干扰素β表达水平，其其他方面的抑制更为显著。

Description

sgRNA、质粒、IRF7功能缺失的细胞系及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体而言，涉及一种用于特异性靶向IRF7基因的sgRNA、质粒、IRF7功能缺失的细胞系及其构建方法和应用。
背景技术
干扰素调节因子7(interferon regulatory factor 7,IRF7)属于干扰素调节因子(interferon regulatory factor 7,IRF)家族的一员，因能与EB病毒核抗原1(Epsten-Barr virus nuclear antigen-1,EBNA-1)基因Qp启动子上(BamHIQ promoter,Qp)的SRE类似元件结合并抑制其转录而被发现，其现被认为是诱导I型IFN最重要的干扰素调节因子。人的IRF7于1997年首次克隆，是TLR和RIG-I信号通路的共同下游因子。所有的IRF7都含有一个保守的N端DNA结合域(DNA-binding domain,DBD)和一个IRF相关结构域(IRF-associated domain,IAD)，其中IRF家族成员IRF7和IRF3在I型IFN介导的天然免疫中起着关键作用。PRRs对病原体的识别导致IRF3和/或IRF7的激活。磷酸化激活IRF7，诱导核定位信号(nuclear localization signal,NLS)的二聚化和暴露。激活的IRF7/IRF3转位到细胞核，与激活蛋白1(activating protein 1,AP-1)和核因子κ核因子κtivating protein 1,AP-1)NL形成增强体。这些蛋白结合到它们各自的正调控结构域，导致辅助因子的招募，从而导致I型IFN的转录。
在哺乳动物中，IRF7和IRF3在启动I型干扰素反应以建立抗病毒状态上的协同作用是很有特点的；然而，由于禽类中免疫相关基因的库较少，禽类可能利用不同的调节系统。特别是，禽类缺少IRF3，只有IRF7，它与其哺乳动物同源物的氨基酸序列同源性不到40％。因此，对禽IRF7基因的研究可能是阐明鸭体内宿主免疫调节抗DTMUV的潜在细胞机制的一个很好的起点。
CRISPR/Cas9起源于细菌和古生菌适应性免疫系统，它们防御噬菌体或外来质粒的入侵。CRISPR/Cas9系统可以通过使用Cas9蛋白和gRNA来靶向特定的基因组位点，gRNA包括一个20nt的序列，通过WatsonCrick碱基配对与其DNA靶点结合。靶位点必须有一个序列基序，称为前间区序列邻近基序(protospacer adjacent motif,PAM)，正好位于20bp的靶序列下游。ZFN和TALEN需要为每个靶序列设计一个新的蛋白质，而CRISPR/Cas9系统中只需将20nt的靶互补gRNA与PAM附近的靶DNA序列进行匹配。因此，这些gRNA可以快速构建并且易于使用。在体外工作显示了特定位点的切割功能之后，迅速开发了CRISPR/Cas9系统。到目前为止，CRISPR/Cas9技术已经应用于人类细胞和许多其他生物，如斑马鱼、小鼠、大鼠，猪和山羊。然而，关于这项技术在鸡中应用的信息很少。
经过检索，得到如下对比文件：CN201910352557.4公开了一种靶向敲除鸡IRF7基因的方法及其在疫苗制备中的应用；基于CRISPR/Cas9，设计针对鸡IRF7基因的gRNA靶序列并连接至VK001-02质粒，获得鸡IRF7基因打靶载体；利用脂质体将打靶载体转染至鸡成纤维细胞中。通过嘌呤霉素筛选转染成功的细胞后，经有限倍比稀释法筛选获得敲除chIRF7基因的鸡成纤维细胞。该敲除细胞系经TCID50验证表明其可使病毒滴度增高。
该方案采用鸡成纤维细胞DF-1转染载体并采用使用嘌呤霉素筛选转染成功的细胞，其有益效果记载：敲除鸡IRF7，干扰素β的表达受到显著抑制，因干扰素β对于机体抵御病毒感染至关重要，故由此可推测敲除鸡IRF7将有利于病毒繁殖，鸡IRF7缺失的细胞病毒滴度更高，亦即敲除鸡IRF7基因有利于病毒的增殖。
本案要解决的问题是：如何实现更好的基因功能敲除效果。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种sgRNA；该sgRNA引物可与合适的载体结构构成质粒，用于敲除相应的基因实现IRF7功能的缺失。
同时，本发明还提供了一种质粒、IRF7功能缺失的细胞系及其构建方法和应用。
本发明的细胞系的优势在于：IFN-βmRNA水平、IRF1 mRNA水平、VIPERIN mRNA水平、CMPK2 mRNA水平可以达到显著的抑制。
相比于CN201910352557.4仅抑制干扰素β表达水平，其其他方面的抑制更为显著。
根据本发明的第一方面，提供了一种用于特异性靶向IRF7基因的sgRNA，所述sgRNA序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
sgRNA-F：ggtcgtcgttgcacttggag(SEQ ID NO：1)；
sgRNA-R：ctccaagtgcaacgacgacc(SEQ ID NO：2)。
其中，IRF7基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
同时，本发明还公开了一种CRISPR/Cas9敲除IRF7基因的质粒，所述质粒含有sgRNA，所述如sgRNA的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
在上述的CRISPR/Cas9敲除IRF7基因的质粒中，所述质粒由所述sgRNA和pX459载体连接得到。
同时，本发明还公开了一种IRF7功能缺失的细胞系的构建方法，包括如下步骤：
步骤1：构建如上所述的质粒；
步骤2：将所述质粒转染至宿主细胞，得到转染细胞；
步骤3：将转染细胞培养筛选得到IRF7功能缺失的细胞系；
所述宿主细胞为DF-1细胞。
在上述的IRF7功能缺失的细胞系的构建方法中，所述步骤1具体为：
步骤11：构建两端加上酶切位点的sgRNA，得到引物；
加上酶切位点的sgRNA如下所示：(斜体为酶切位点)
sgRNA-F：CACCg GGTCGTCGTTGCACTTGGAG
sgRNA-R：AAAC CTCCAAGTGCAACGACGACC c
步骤12：将引物磷酸化修饰和退火；
步骤13：将通过Bbsl酶切的pX459载体与引物连接，并转化进入到转化DH5α感受态细菌；
步骤14：挑取步骤13转化得到的细菌进行单克隆细菌扩增培养，分离得到质粒pX459-sgIRF7。
在上述的IRF7功能缺失的细胞系的构建方法中，所述步骤2具体为：
用质粒pX459-sgIRF7转染DF-1细胞；
所述步骤3具体为：
转染后的DF-1细胞培养一段时间后在培养皿内加入嘌呤霉素使其终浓度为5μg/ml，并坚持每3天用含5μg/ml的嘌呤霉素的细胞培养液更换一次，10天后改为用不含嘌呤霉素的细胞培养液每5天更换一次，直到有明显的细胞群落出现，经筛选得到IRF7功能缺失的细胞系。
在上述的IRF7功能缺失的细胞系的构建方法中，所述转染为阳离子脂质体介导的转染。
同时，本发明还公开了一种IRF7功能缺失的DF-1细胞系，所述DF-1细胞系表达突变型IRF7，所述突变型IRF7的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述DF-1细胞系含有编码所述突变型IRF7的如SEQ ID NO.4所示的核苷酸。
SEQ ID NO：3：
MAALDSEGDAQKLRFGPWLLNAVSSGLYRGLCWIDPDRRIFRIPWKHNARKDVTSSDVEIFKAWAKASGRYEGNAEDPAKWKTNFRCALRSTHMFMLLEDRSVQRRPAQGLRGCLRRPQ*
上述的DF-1细胞系在以下至少之一中的应用：干扰素及其调控基因的全功能研究；病原微生物复制、调控、致病机制研究；抗病药物筛选。
本发明上述技术方案中的一个技术方案至少具有如下优点或有益效果之一：
本发明提供了用于特异性靶向IRF7基因的sgRNA、用于CRISPR/Cas9敲除IRF7基因的质粒，以及IRF7功能缺失的细胞系的构建方法，成功构建得到了IRF7功能缺失的DF-1细胞系，为干扰素调节因子的全功能研究，如寻找与干扰素调节因子调控机理相关的病原分子以及干扰素调节因子下游因子；病原微生物，如病毒，复制、调控、致病机制的研究；抗病药物筛选等提供了不可多得的研究工具。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步地说明；
图1 DF1-WT和KO IRF7培养4-48h的细胞表型；
图2 DF1-WT和KO IRF7的细胞生长曲线；
图3 DF1-WT和KO IRF7感染后IFN-β的mRNA水平；
图4 DF1-WT和KO IRF7感染后IRF1的mRNA水平；
图5 DF1-WT和KO IRF7感染后VIPERIN的mRNA水平；
图6 DF1-WT和KO IRF7感染后CMPK2的mRNA水平。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施方式，实施方式的示例在附图中示出，其中相同或类似的标号自始至终表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施方式是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明实施例中使用的仪器，试剂如下：
超净工作台SW-CJ-2FD(苏州安泰空气技术有限公司，中国江苏)；CO2恒温培养箱Forma371(Thermo公司，美国)；生物安全柜1300SERIES A2(Thermo公司，美国)；倒置光学显微镜(Nikon公司，日本)；移液器Research plus(Eppendorf公司，德国)；高速离心机Centrifuge 5804R(Eppendorf公司，德国)；PCR仪C1000 Touch(Bio-Rad公司，美国)；垂直电泳槽Mini Protean Tetra(Bio-Rad公司，美国)；电泳仪Power Pac Basic(Bio-Rad公司，美国)；凝胶成像系统2500(R)(Tanon公司，中国上海)。
Gel Extraction Kit(D2500-02)购自OMEGA；TIAN prep Mini Plasmid Kit(DP103-03)购自天根生化科技(北京)有限公司；M-MLVRT(2641A)购自TAKARA；RRI(2313A)购自TAKARA；Random 6primer(3801)购自TAKARA；Agarose(E0301)购自TSINGK；Lipofectamine LTX and Plus Reagent(15338-100)购自Invitrogen；0.25％Trypsin-EDTA(25200-056)，DMEM basic(C11995500BT)购自Gibco；FBS(10099-141C)购自Gibco；Premix-Taq(RR902A)购自TAKARA；Prime STAR GXL(R050)购自TAKARA；Pen Streppenicillin Streptomycin(15140-122)购自Gibco；T4 DNA连接酶及其他常用限制性内切酶均购自TAKARA；氯仿，异丙醇，无水乙醇等生化试剂购自宁波萃英化学技术有限公司；Trizol 15596-026购自Invitrogen；CCK-8试剂盒购自赛默飞，抗DTMUV E蛋白抗体，抗VIPERIN抗体由武汉百意欣生物有限购公司制备。坦布苏病毒DTMUV QY17(GenBankAccession No.MT447092)由华农(肇庆)生物产业技术研究院提供。
本发明实施例中使用的pX459质粒来自于微旋基因公司。克隆载体pMD19T-Vector和大肠杆菌感受态细胞DH5α购自大连宝日医生物有限公司。
本发明实施例涉及的测序及引物合成均在生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
实施例1构建用于敲除IRF7基因的sgRNA质粒pX459-sgIRF7
1.设计筛选得到下面两条sgRNA：
sgRNA-F：GGTCGTCGTTGCACTTGGAG(SEQ ID NO：1)；
sgRNA-R：CTCCAAGTGCAACGACGACC(SEQ ID NO：2)。
2.在sgRNA两端加上Bbsl酶切位点(斜体)
sgRNA-F：CACCg GGTCGTCGTTGCACTTGGAG
sgRNA-R：AAAC CTCCAAGTGCAACGACGACC c
将上述引物送生物工程公司合成。
3.将引物磷酸化修饰和退火，具体操作如下：
用蒸馏水重悬sgRNA到终浓度100μM，按下述方法加磷酸基团和退火，具体工艺和配方可参考表1。
表1
Figure BDA0003399695010000061
Figure BDA0003399695010000062
4.将pX459载体通过Bbsl酶切：
取1μg pX459质粒，37℃下用Bbsl-HFTM酶切30min，具体配方可参考表2：
表2
pX459 1μg
FastDigest Bbsl-HF<sup>TM</sup> 1μl
10×Cutsmart 2μl
ddH2O 2μl
Total 20μl
琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，并用胶回收试剂盒回收线性化后的片段。
5.将按上述方法制备好的sgRNA与线性化的pX459连接，室温连接半小时。具体配方可参考表3。
表3
Figure BDA0003399695010000063
Figure BDA0003399695010000071
6.将上述连接产物直接用于转化DH5α感受态细菌(大连宝日医生物有限公司),并按厂家说明书进行转化。
7.挑取单克隆细菌扩增培养，并用TIAN prep Mini Plasmid Kit提取质粒DNA提质粒，命名为pX459-sgIRF7并送生物公司测序验证。质粒DNA的提取完全按试剂盒的指导方法进行。
实施例2筛选IRF7功能缺失细胞系
1.将DF-1细胞培养于30mm瓶皿，24h之内用pX459-sgIRF7质粒进行转染。转染使用赛默飞Lipofectamine LTX DNA Transfection Reagents转染试剂盒，并严格按试剂盒指导方法进行转染。
2.待转染细胞培养36小时后在培养皿内加入嘌呤霉素使其终浓度为5μg/ml，并坚持每3天用含嘌呤霉素(5μg/ml)的细胞培养液更换一次。(如果细胞密度太大需将细胞稀释培养以利于筛选单个细胞系。)10天后改为用不含嘌呤霉素的细胞培养液每5天更换一次，直到有明显的细胞群落出现(约需2-3周)。我们挑选了10个细胞群落进行单群落细胞培养，并将这些细胞株命名为DF1-dIRF7-A1，DF-dIRF7-A2，DF1-dIRF7-A3，……，DF-dIRF7-A10。细胞培养液为含10％FBS的DMEM-F12培养基。
3.鉴定DF-dIRF7细胞株的突变IRF7基因。
分别从上述10个细胞株单独提取细胞全基因组DNA，并用Premix Taq(TAKARA)和引物F:TAGTCTTCAAGGCAGGTGAG；R:CTGCAATGCTCCAGCAGCAG进行PCR。
将PCR产物纯化后分别用T4连接酶连接到pMD19-T载体。
经细菌转化，质粒提取后分别用M13F/M3R引物检测这4个质粒的核苷酸序列。
结果显示10个PCR产物中有9个出现缺失性突变。经测序显示，与野生型IRF7基因(SEQ ID NO：5)相比，突变型IRF7基因(SEQ ID NO：4)的第306(C)和第307(A)核苷酸丢失了，该碱基的丢失造成了氨基酸移码突变，突变造成第102个氨基酸(S)以后移码并提前终止，突变型IRF7的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
SEQ ID NO：3：
MAALDSEGDAQKLRFGPWLLNAVSSGLYRGLCWIDPDRRIFRIPWKHNARKDVTSSDVEIFKAWAKASGRYEGNAEDPAKWKTNFRCALRSTHMFMLLEDRSVQRRPAQGLRGCLRRPQ*
斜体字部分为异常IRF7序列，其余为正常IRF7序列。
实施例3鉴定IRF7突变细胞株(KO IRF7)的生物学功能
1.细胞生长特性
图1示野生型DF-1(DF1-WT)和KO IRF7细胞培养12-96h时的细胞表型。结果示二者无明显差异。12-36h细胞生长良好，48h后由于接触性抑制细胞出现衰老甚至老死亡(空泡)。
用CCK法测定DF1-WT和KO IRF7细胞活力并绘制生长曲线。方法如下：
将细胞悬液接种于96孔板中，100μl/每孔，每个时间点设置6孔，置37℃，5％CO2培养。每隔12小时取出细胞每孔加入10μl CCK-8，轻轻混匀，避免产生气泡，再置回培养箱孵育2小时后用酶标仪测定450nm吸收值。计算6孔的平均值和标准误，作图。
结果(图2)显示二者无明显差异。二者完成1个复制周期(对倍增殖)的时间均在24h左右。后期受接触性抑制影响细胞逐渐死亡。
2.鉴定KO IRF7的IRF7功能
IRF7现被认为是诱导I型IFN最重要的干扰素调节因子，DTMUV感染DF-1后，I型干扰素会激活干扰素信号通路诱导大量ISG表达，如果细胞的IRF7功能受损，这些调控过程将不能顺利进行，以至于病毒感染后不能诱导ISG表达。下面的实验结果证明了KO IRF7有严重的IRF7功能缺失。
DF1-WT和KO IRF7细胞分别转染空载和过表达IRF7质粒，24h后以1MOI DTMUV感染，并分别在感染后24h,36h和48h搜集细胞，提取总RNA，进行RT-qPCR定量检测IFN-β、IRF1、VIPERIN、CMPK2的mRNA水平。
细胞培养与病毒感染操作方法如下：
细胞培养液：含10％FBS的DMEM-F12
细胞培养箱：37℃，5％CO2
转染过表达质粒：将细胞培养于6孔板内，待其95％贴壁后弃去培养液，用无菌PBS洗两遍后，每孔各加入150μL OPTI-MEM。按照Lipofectamine LTX and Plus Reagent转染试剂说明书进行转染，6h后更换成含10％FBS的DMEM-F12培养液。
病毒感染：转染24h后，用无菌PBS清洗2次后加2mL含约1个MOI病毒量的含1％FBS的DMEM-F12培养基。将细胞置回细胞培养箱孵育2h后再弃去培养液，加入2mL含1％FBS的DMEM-F12培养基，置回细胞培养箱继续培养。
上述涉及细胞，病毒的实验均在生物安全柜进行。
RT-qPCR定量检测方法如下：
总RNA用TRIzol(Invitrogen)提取。RT(reverse-transcription)用PrimeScriptTM RT Master Mix(Takara)试剂盒，qPCR(quantitative PCR)用
Figure BDA0003399695010000091
Premix Ex TaqTM II Kid试剂盒(Applied Biosystems公司)。所有反应完全按照厂家提供的方法进行。RT引物为随机引物(Random 6primer#3801)，qPCR引物序列见下表4。
表4
Figure BDA0003399695010000092
qPCR用QuantStudio 3 Real-Time PCR System(Applied Biosystems公司)方法进行分析。标准反应包括50℃for 3min，95℃for 3min,然后40个循环反应(95℃,5s，60℃,30s)。上述IFN-β、IRF1、VIPERIN、CMPK2d的mRNA水平分别通过用IFN-β、IRF1、VIPERIN、CMPK2的qPCR值除以同一样本中的GAPDH值所获的相对值来表示。通过这种标准化处理排除人为实验误差。
其结果如下：如图3所示，病毒感染DF1-WT细胞24h，36h和48h后，IFN-βmRNA水平(纵坐标表示IFN-βmRNA水平)分别增加了约25和15倍；而用同样方法感染KO IRF7细胞，在同一时间点IRF1 mRNA水平仅有微弱的上升，其值约为5和1.5倍上升。如图4所示，病毒感染DF1-WT细胞24h，36h和48h后，IRF1 mRNA水平(纵坐标表示IRF1 mRNA水平)分别增加了约14和13倍；而用同样方法感染KO IRF7细胞，在同一时间点IRF1 mRNA水平仅有微弱的上升，约为1.6和1.5倍上升。如图5所示，病毒感染DF1-WT细胞24h，36h和48h后，VIPERIN mRNA水平(纵坐标表示VIPERIN mRNA水平)分别增加了约6.2和3.3倍；而用同样方法感染KO IRF7细胞，而在同一时间点VIPERIN mRNA水平有微弱的下降，约为0.15和0.28倍下降。如图6所示，病毒感染DF1-WT细胞24h，36h和48h后，CMPK2 mRNA水平(纵坐标表示CMPK2 mRNA水平)分别增加了约7和4倍；而用同样方法感染KO IRF7细胞，在同一时间点IRF1 mRNA水平仅有微弱的上升，约为2.8和1.8倍上升。在敲除细胞上进行过表达后，IFN-β、IRF1、VIPERIN、CMPK2的表达有一定的恢复。
尽管已经示出和描述了本发明的实施方式，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 岭南现代农业科学与技术广东省实验室肇庆分中心
华农（肇庆）生物产业技术研究院有限公司
<120> sgRNA、质粒、IRF7功能缺失的细胞系及其构建方法和应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
ggtcgtcgtt gcacttggag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
ctccaagtgc aacgacgacc 20
<210> 3
<211> 119
<212> PRT
<213> 突变型IRF7(人工序列)
<400> 3
Met Ala Ala Leu Asp Ser Glu Gly Asp Ala Gln Lys Leu Arg Phe Gly
1 5 10 15
Pro Trp Leu Leu Asn Ala Val Ser Ser Gly Leu Tyr Arg Gly Leu Cys
20 25 30
Trp Ile Asp Pro Asp Arg Arg Ile Phe Arg Ile Pro Trp Lys His Asn
35 40 45
Ala Arg Lys Asp Val Thr Ser Ser Asp Val Glu Ile Phe Lys Ala Trp
50 55 60
Ala Lys Ala Ser Gly Arg Tyr Glu Gly Asn Ala Glu Asp Pro Ala Lys
65 70 75 80
Trp Lys Thr Asn Phe Arg Cys Ala Leu Arg Ser Thr His Met Phe Met
85 90 95
Leu Leu Glu Asp Arg Ser Val Gln Arg Arg Pro Ala Gln Gly Leu Arg
100 105 110
Gly Cys Leu Arg Arg Pro Gln
115
<210> 4
<211> 360
<212> DNA
<213> 编码突变型IRF7基因(人工序列)
<400> 4
atggcagcac tggacagcga gggggacgcc cagaagctgc gcttcgggcc atggctgctg 60
aacgccgtca gcagcgggct gtaccgcggc ctctgctgga tcgacccgga ccgccgtatc 120
ttccgcatcc cttggaagca caacgccagg aaggatgtca ccagcagcga cgtggagatc 180
ttcaaggcct gggcgaaggc cagcggcagg tacgagggga acgctgagga tccggccaaa 240
tggaagacca acttccgctg tgccctgagg agcactcaca tgttcatgct gctggaggac 300
cgctcagtgc aacgacgacc cgcacaaggt ctacgcggtt gcctcaggcg tccccaatga 360
<210> 5
<211> 1476
<212> DNA
<213> IRF7基因(人工序列)
<400> 5
atggcagcac tggacagcga gggggacgcc cagaagctgc gcttcgggcc atggctgctg 60
aacgccgtca gcagcgggct gtaccgcggc ctctgctgga tcgacccgga ccgccgtatc 120
ttccgcatcc cttggaagca caacgccagg aaggatgtca ccagcagcga cgtggagatc 180
ttcaaggcct gggcgaaggc cagcggcagg tacgagggga acgctgagga tccggccaaa 240
tggaagacca acttccgctg tgccctgagg agcactcaca tgttcatgct gctggaggac 300
cgctccaagt gcaacgacga cccgcacaag gtctacgcgg ttgcctcagg cgtccccaat 360
gacagaggtt ctgggggccc tgtggcaggc gccctgcaac agcagccgca gctgttgctc 420
aaccaccacg atttggcctt ggaaaacact cccacagaca gtactgaagg tgttgctgca 480
gcagccctga cgcaggtgga tttggacctg ctgcagtccg tactgcagca ctgcaacatc 540
tctgccctcg gctcccagcc aaccctgtgg gcacacacag gggatgcctt gcctgaggat 600
gctctgctgc ttcctggcca agatggctgc ctcccagggc cacagtttca ggattggaga 660
cagctggagg agcctctgct gctggggaac cagcccctca caggtggggg ctgtgggcag 720
gacggggccg gggccctccc tgtgagtgag gaatgtgcca tccctgcacc atccccggct 780
gaggagctac tcttccagtc tgccaacccc gcgcctccgc caccggcagg tgacatagga 840
gggctgcccc ccctcctgga catcactatc tactaccgag gaaagatggt ctaccatgag 900
caggtggacg acagccgctg tgtgctggcc taccagcccc tggacccggc cgtggccgag 960
cagcggctgg tgctgttccc cagccccgcg agcctgcccg accccaggca gcggcgctac 1020
actgaggact tgctggaggt ggcggggctg cggctggagc agcgtgccgg ccagctcctg 1080
gccacgcgcc tgaagaagtg caaggtcttc tgggccttgt cgcagcagct cgagggcggg 1140
gaacccccac tcaacctgct ccaccgggat caggagacca ccatcttcga cttcagggtg 1200
ttttgcacag agctccggga cttccgcgac agccgcaggg agcgctcccc cgacttcacc 1260
atcttcctct gcttcgggca gtgcttctcc agcacaaagc ccaaggagtc caagctcatc 1320
ctggtgaagc tggttcccca gttctgcgag tactggtacg agcaggtgca gcggggagga 1380
gcctcctccc tcaacagtgg caacgtcagc ctgcagctct ctgactcttt caacctcttc 1440
gagcttatcg agcaatacca catgcagaca gactga 1476

Claims (9)

1.一种用于特异性靶向IRF7基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
2.一种CRISPR/Cas9敲除IRF7基因的质粒，其特征在于，所述质粒含有sgRNA，所述如sgRNA的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求2所述的CRISPR/Cas9敲除IRF7基因的质粒，其特征在于，所述质粒由所述sgRNA和pX459载体连接得到。
4.一种IRF7功能缺失的细胞系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：构建如权利要求3或4所述的质粒；
步骤2：将所述质粒转染至宿主细胞，得到转染细胞；
步骤3：将转染细胞培养筛选得到IRF7功能缺失的细胞系；
所述宿主细胞为DF-1细胞。
5.根据权利要求4所述的IRF7功能缺失的细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤1具体为：
步骤11：构建两端加上酶切位点的sgRNA，得到引物；
步骤12：将引物磷酸化修饰和退火；
步骤13：将通过Bbsl酶切的pX459载体与引物连接，并转化进入到转化DH5α感受态细菌；
步骤14：挑取步骤13转化得到的细菌进行单克隆细菌扩增培养，分离得到质粒pX459-sgIRF7。
6.根据权利要求5所述的IRF7功能缺失的细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤2具体为：
用质粒pX459-sgIRF7转染DF-1细胞；
所述步骤3具体为：
转染后的DF-1细胞培养一段时间后在培养皿内加入嘌呤霉素使其终浓度为5μg/ml，并坚持每3天用含5μg/ml的嘌呤霉素的细胞培养液更换一次，10天后改为用不含嘌呤霉素的细胞培养液每5天更换一次，直到有明显的细胞群落出现，经筛选得到IRF7功能缺失的细胞系。
7.根据权利要求6所述的IRF7功能缺失的细胞系的构建方法，其特征在于，所述转染为阳离子脂质体介导的转染。
8.一种IRF7功能缺失的DF-1细胞系，其特征在于，所述DF-1细胞系表达突变型IRF7，所述突变型IRF7的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述DF-1细胞系含有编码所述突变型IRF7的如SEQ ID NO.4所示的核苷酸。
9.权利要求8所述的DF-1细胞系在以下至少之一中的应用：干扰素及其调控基因的全功能研究；病原微生物复制、调控、致病机制研究；抗病药物筛选。
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