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CN110376366B - 一种烟酸通过gpr109a受体应用于治疗奶牛乳腺炎的实验方法 - Google Patents

一种烟酸通过gpr109a受体应用于治疗奶牛乳腺炎的实验方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种烟酸通过GPR109A受体应用于治疗奶牛乳腺炎的实验方法，包括以下步骤：S1、乳腺炎奶牛的筛选：初步筛选出乳腺炎为阳性的奶牛，其体细胞数约为80‑200万/mL；S2、奶牛血清和乳清中促炎因子的检测：分别在第0天和第7天收集正常奶牛、乳腺炎奶牛和饲喂烟酸的乳腺炎奶牛中的外周血，然后提取血液中的血清。本发明通过制定全新的奶牛乳腺炎治疗策略，通过分离奶牛的血清和乳清检测了烟酸治疗后乳腺炎奶牛体内促炎介质的表达，利用分子生物学方法全面的评估了烟酸对奶牛乳腺炎的治疗效果，烟酸能够有效减少奶牛血清和乳清中促炎介质的表达，从而达到保护乳腺缓解炎症的功效。

Description

一种烟酸通过GPR109A受体应用于治疗奶牛乳腺炎的实验 方法
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体为一种烟酸通过GPR109A受体应用于治疗奶牛乳腺炎的实验方法。
背景技术
奶牛乳腺炎是一种由多种病原微生物混合感染乳腺组织所引起的一种炎症性疾病。在全世界范围内，奶牛乳腺炎都是阻碍奶牛产业健康发展的严峻问题。在最近的几十年间，奶牛乳腺炎问题并未得到很好的解决，仍然对全世界奶牛产业造成巨大经济损失。每年全球因奶牛乳腺炎所造成的经济损失高达350亿美元。而引起奶牛乳腺炎的主要原因则是病原微生物入侵奶牛乳腺。而在奶牛临床中抗生素的应用虽然可以杀灭病原微生物，但是对于一些耐药菌株和感染后的炎症反应并无太好的效果。细菌感染后，会在乳腺中产生大量内毒素，这些内毒素的主要成分就是脂多糖(LPS)。它能够引起机体产生强烈的免疫原性反应。LPS也会引发乳腺上皮细胞或巨噬细胞的免疫反应，从而分泌大量的炎性因子，损伤乳腺上皮细胞，导致乳腺炎。目前针对乳腺炎的治疗主要是抗生素配合抗炎药物的联合应用，因此抗乳腺炎药物的研发具有重要意义，这是因为单纯的抗生素应用无法很好的治愈奶牛乳腺炎，在奶牛乳腺炎的治疗过程中需要配合使用抗炎药物，以缓解奶牛乳腺中严重的炎症反应。以往的抗炎药物价格较高且有一定药物残留，在奶牛生产中药物残留会严重影响患病奶牛所产牛奶的收购，因此会严重影响奶牛场的经济效益从而造成大量经济损失。那么如何尽快恢复乳腺炎奶牛的正常生产成为治疗奶牛乳腺炎的又一难点，而本发明中应用烟酸作为一种新型抗奶牛乳腺炎的药物，具有无残留和价格低廉的特点，在奶牛乳腺炎治愈后可以快速恢复乳腺炎奶牛的泌乳和生产。
GPR109A属于G蛋白偶联受体家族，它能够通过激活下游相关信号通路来抑制炎症的发生和发展，从而达到抗炎的效果，许多研究表明GPR109A在体内参与抗炎、降脂和抗癌的功能。而烟酸作为GPR109A的配体，能够通过激活GPR109A发挥抗炎功能，并在奶牛中予以应用。
烟酸属于B族维生素。烟酸主要参与体内的脂质代谢，炎症反应和糖代谢等。前人的研究表明烟酸能够通过激活GPR109A抑制结肠炎的发展。也有人发现烟酸能抑制血管内皮细胞炎症。有研究表明传统抗炎药的长期应用很容易产生胃肠道反应、肾毒性和肝毒性等其他副作用，由于传统抗炎药物的价格昂贵，因此大规模的抗炎药应用也会造成大量经济损失。而且甾体类抗炎药物含有的激素成分会对奶牛的乳汁成分产生影响，从而影响牛奶的收购，进一步加大奶牛场的损失。而烟酸本身不会产生药物残留，且廉价易得。因此烟酸作为一种新型的抗乳腺炎药物具有传统药物不具备的优势，但是目前烟酸对于乳腺炎的作用还不清楚，因此本发明拟应用烟酸治疗和预防奶牛乳腺炎。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种烟酸通过GPR109A受体应用于治疗奶牛乳腺炎的实验方法，在ELISA试验中证实了烟酸能够通过激活GPR109A，并且显著抑制乳腺炎奶牛乳清和血清中IL-6、TNF-α和IL-1β的蛋白表达。
(二)技术方案
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种烟酸通过GPR109A受体应用于治疗奶牛乳腺炎的实验方法，包括以下步骤：
S1、乳腺炎奶牛的筛选：初步筛选出乳腺炎为阳性的奶牛，其体细胞数约为80-200万/mL；
S2、奶牛血清和乳清中促炎因子的检测：分别在第0天和第7天收集正常奶牛、乳腺炎奶牛和饲喂烟酸的乳腺炎奶牛中的外周血，然后提取血液中的血清；
S3、奶牛乳汁中促炎因子的检测：分别在第0天和第7天收集正常奶牛、乳腺炎奶牛和饲喂烟酸的乳腺炎奶牛患病乳房或正常乳房中的乳汁，然后提取乳汁中的乳清；
S4、CCK8实验
将原代奶牛乳腺上皮细胞接种到96孔细胞培养板中，每孔含有细胞约0.5×104个，加入培养基100μL，将细胞放入37℃和5％CO2的无菌恒温培养箱中培养24小时，然后加入不同浓度的烟酸或烟酸+LPS，待24小时后再次向每个孔中加入10μL的CCK8试剂，继续在培养基中培养2小时，然后取出96孔板放入酶标仪中在450nm波长处测定吸光光度；
S5、烟酸对原代奶牛乳腺上皮细胞炎症反应的抑制作用试验
将0.3×105个原代奶牛乳腺上皮细胞接种到60mm×15mm细胞培养皿中，分为4组：正常组、烟酸组、LPS(1μg/ml)组、LPS+烟酸组，当细胞数达到培养皿的80％时，用无血清培养基代替培养基培养3小时后加入烟酸，再过1小时后加入LPS，3小时后收集培养皿中的原代奶牛乳腺上皮细胞，收集好的细胞用Trizol法提取总RNA并反转录成cDNA用于后续试验或者提取细胞中的总蛋白并应用BCA蛋白浓度测定法将细胞中的总蛋白含量统一用于后续试验，在后续试验中利用荧光定量PCR法检测原代乳腺上皮细胞中IL-6、TNF-α和IL-1β的基因表达，再利用western blot法检测原代奶牛乳腺上皮细胞中COX2和INOS的蛋白表达；
S6、烟酸对GPR109A的激活作用
将0.3×105个原代奶牛乳腺上皮细胞接种到60mm×15mm细胞培养皿中，分别用烟酸处理0h、1h、3h、6h和12h后收集细胞并提取细胞中的总蛋白，通过western blot的方法检测细胞中GPR109A的表达量。
优选的，筛选出的奶牛的特性为盘底沉淀物较多，比较粘稠，并有少量胶状物，倾斜测试盒时，沉淀物有明显黏附于盘底难于流动的现象，旋转测试盘时，沉淀物有向中心聚集的倾向。
优选的，乳汁中体细胞数的检测方法为：首先配制染色液，取40mL四氯乙烷和54mL乙醇，充分混合均匀，然后放置于65℃问水溶液中进行3min加热，再添加0.6g甲基蓝，最后放置于温度调整为4℃的冰箱中2小时，然后加入6mL冰醋酸，放于常温保存；我们再取一块干净的载玻片，滴入10μL的生鲜乳样品，放入恒温箱中干燥，再浸入染色液中，最后形成均匀的玻片；将制备好的样品放在计数板中进行染色细胞计数。
优选的，血液中血清的提取方法为：将步骤S2中采好的血液呈45度角放置于4℃冰箱中约1小时，然后用3000转的速度离心5分钟，收集上清液并应用ELISA法检测血清中IL-6、TNF-α和IL-1β的蛋白表达。
优选的，乳汁中乳清的提取方法为：将步骤S3中采好的乳汁用3000转的速度离心20分钟，收集上清液并应用ELISA法检测血清中IL-6、TNF-α和IL-1β的蛋白表达。
优选的，乳腺上皮细胞总蛋白的提取方法：利用蛋白提取试剂收集原代乳腺上皮细胞并提取总蛋白，应用western blot的方法检测奶牛乳腺上皮细胞中iNOS、COX-2和GPR109A的相对表达量。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明提供了一种烟酸通过GPR109A受体应用于治疗奶牛乳腺炎的实验方法，具备以下有益效果：
1、本发明通过制定全新的奶牛乳腺炎治疗策略，通过分离奶牛的血清和乳清检测了烟酸治疗后乳腺炎奶牛体内促炎介质的表达，利用分子生物学方法全面的评估了烟酸对奶牛乳腺炎的治疗效果，烟酸能够有效减少奶牛血清和乳清中促炎介质的表达，从而达到保护乳腺缓解炎症的功效。
2、本发明又通过体外实验全面证实了烟酸治疗乳腺炎的作用机制，本方法通过检测乳腺上皮细胞中GPR109A、INOS和COX2蛋白的表达量明确了烟酸抗炎的作用机制。从体外实验结果中我们发现烟酸不仅对乳腺炎有治疗作用而且还有保护功能，提前饲喂烟酸能够维持奶牛的乳腺健康，减少乳腺炎发生。
3、本发明可以通过口服的方式缓解奶牛乳腺炎，方便了乳腺炎的治疗，只需要在喂食期间将将烟酸放入饲料上层即可，方便快捷，不会产生耐药性和其他抗生素污染，而且不会对奶牛产生应激反应，有利于奶牛乳腺炎的治疗和预防。
附图说明
图1为烟酸对奶牛乳清中IL-1β的影响；
图2为烟酸对奶牛乳清中IL-6的影响；
图3为烟酸对奶牛乳清中TNF-α的影响；
图4为烟酸对奶牛乳汁中体细胞数的影响；
图5为烟酸对奶牛血清中IL-1β的影响；
图6为烟酸对奶牛血清中IL-6的影响；
图7为烟酸对奶牛血清中TNF-α的影响；
图8为烟酸对奶牛乳腺上皮细胞中IL-1β基因水平的影响；
图9为烟酸对奶牛乳腺上皮细胞中IL-6基因水平的影响；
图10为烟酸对奶牛乳腺上皮细胞中TNF-α基因水平的影响；
图11为烟酸对奶牛乳腺上皮细胞存活的影响；
图12为烟酸对奶牛乳腺上皮细胞中iNOS和COX-2的影响；
图13为烟酸对奶牛乳腺上皮细胞中GPR109A的影响。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种烟酸通过GPR109A受体应用于治疗奶牛乳腺炎的实验方法，包括以下步骤：
S1、乳腺炎奶牛的筛选：初步筛选出乳腺炎为阳性的奶牛，其体细胞数约为80-200万/mL；
S2、奶牛血清和乳清中促炎因子的检测：分别在第0天和第7天收集正常奶牛、乳腺炎奶牛和饲喂烟酸的乳腺炎奶牛中的外周血，然后提取血液中的血清；
S3、奶牛乳汁中促炎因子的检测：分别在第0天和第7天收集正常奶牛、乳腺炎奶牛和饲喂烟酸的乳腺炎奶牛患病乳房或正常乳房中的乳汁，然后提取乳汁中的乳清；
S4、CCK8实验
将原代奶牛乳腺上皮细胞接种到96孔细胞培养板中，每孔含有细胞约0.5×104个，加入培养基100μL，将细胞放入37℃和5％CO2的无菌恒温培养箱中培养24小时，然后加入不同浓度的烟酸或烟酸+LPS，待24小时后再次向每个孔中加入10μL的CCK8试剂，继续在培养基中培养2小时，然后取出96孔板放入酶标仪中在450nm波长处测定吸光光度；
S5、烟酸对原代奶牛乳腺上皮细胞炎症反应的抑制作用试验
将0.3×105个原代奶牛乳腺上皮细胞接种到60mm×15mm细胞培养皿中，分为4组：正常组、烟酸组、LPS(1μg/ml)组、LPS+烟酸组，当细胞数达到培养皿的80％时，用无血清培养基代替培养基培养3小时后加入烟酸，再过1小时后加入LPS，3小时后收集培养皿中的原代奶牛乳腺上皮细胞，收集好的细胞用Trizol法提取总RNA并反转录成cDNA用于后续试验或者提取细胞中的总蛋白并应用BCA蛋白浓度测定法将细胞中的总蛋白含量统一用于后续试验，在后续试验中利用荧光定量PCR法检测原代乳腺上皮细胞中IL-6、TNF-α和IL-1β的基因表达，再利用western blot法检测原代奶牛乳腺上皮细胞中COX2和INOS的蛋白表达；
S6、烟酸对GPR109A的激活作用
将0.3×105个原代奶牛乳腺上皮细胞接种到60mm×15mm细胞培养皿中，分别用烟酸处理0h、1h、3h、6h和12h后收集细胞并提取细胞中的总蛋白，通过western blot的方法检测细胞中GPR109A的表达量。
为配合上述检测，现提供如下物质提取方法：
首先，筛选出的奶牛的特性为盘底沉淀物较多，比较粘稠，并有少量胶状物，倾斜测试盒时，沉淀物有明显黏附于盘底难于流动的现象，旋转测试盘时，沉淀物有向中心聚集的倾向。
乳汁中体细胞数的检测方法为：首先配制染色液，取40mL四氯乙烷和54mL乙醇，充分混合均匀，然后放置于65℃问水溶液中进行3min加热，再添加0.6g甲基蓝，最后放置于温度调整为4℃的冰箱中2小时，然后加入6mL冰醋酸，放于常温保存；我们再取一块干净的载玻片，滴入10μL的生鲜乳样品，放入恒温箱中干燥，再浸入染色液中，最后形成均匀的玻片；将制备好的样品放在计数板中进行染色细胞计数。
血液中血清的提取方法为：将步骤S2中采好的血液呈45度角放置于4℃冰箱中约1小时，然后用3000转的速度离心5分钟，收集上清液并应用ELISA法检测血清中IL-6、TNF-α和IL-1β的蛋白表达。
乳汁中乳清的提取方法为：将步骤S3中采好的乳汁用3000转的速度离心20分钟，收集上清液并应用ELISA法检测血清中IL-6、TNF-α和IL-1β的蛋白表达。
乳腺上皮细胞总蛋白的提取方法：利用蛋白提取试剂收集原代乳腺上皮细胞并提取总蛋白，应用western blot的方法检测奶牛乳腺上皮细胞中iNOS、COX-2和GPR109A的相对表达量。
观察烟酸通过GPR109A受体应用于治疗奶牛乳腺炎的效果统计如下：
从图1中可以看出饲喂烟酸7天后奶牛乳清中IL-1β得到表达量显著降低，而不饲喂烟酸则降低较少，因此烟酸能够有效的减少奶牛乳清中IL-1β的表达量，从而缓解奶牛乳腺炎。
从图2中可以看出饲喂烟酸7天后奶牛乳清中IL-6得到表达量显著降低，而不饲喂烟酸则降低较少，因此烟酸能够有效的减少奶牛乳清中IL-6的表达量，从而缓解奶牛乳腺炎。
从图3中可以看出饲喂烟酸7天后奶牛乳清中TNF-α得到表达量显著降低，而不饲喂烟酸则降低较少，因此烟酸能够有效的减少奶牛乳清中TNF-α的表达量，从而缓解奶牛乳腺炎。
从图4中可以看出饲喂烟酸7天后奶牛乳汁中体细胞得到表达量显著降低，而不饲喂烟酸则降低较少，因此烟酸能够有效的减少奶牛乳汁中体细胞数的表达量，从而缓解奶牛乳腺炎。
从图5中可以看出饲喂烟酸7天后奶牛血清中IL-1β得到表达量显著降低，而不饲喂烟酸则降低较少，因此烟酸能够有效的减少奶牛血清中IL-1β的表达量，从而缓解奶牛乳腺炎。
从图6中可以看出饲喂烟酸7天后奶牛血清中IL-6得到表达量显著降低，而不饲喂烟酸则降低较少，因此烟酸能够有效的减少奶牛血清中IL-6的表达量，从而缓解奶牛乳腺炎。
从图7中可以看出饲喂烟酸7天后奶牛血清中TNF-α得到表达量显著降低，而不饲喂烟酸则降低较少，因此烟酸能够有效的减少奶牛血清中TNF-α的表达量，从而缓解奶牛乳腺炎。
从图8中可以看出LPS刺激后奶牛乳腺上皮细胞中IL-1β的相对表达量显著升高，而烟酸处理后奶牛乳腺上皮细胞中IL-1β的相对表达量显著降低，因此烟酸能够有效的减少奶牛乳腺上皮细胞炎症模型中IL-1β的相对表达量，从而缓解奶牛乳腺上皮细胞的炎症反应。
从图9中可以看出LPS刺激后奶牛乳腺上皮细胞中IL-6的相对表达量显著升高，而烟酸处理后奶牛乳腺上皮细胞中IL-6的相对表达量显著降低，因此烟酸能够有效的减少奶牛乳腺上皮细胞炎症模型中IL-6的相对表达量，从而缓解奶牛乳腺上皮细胞的炎症反应。
从图10中可以看出LPS刺激后奶牛乳腺上皮细胞中TNF-α的相对表达量显著升高，而烟酸处理后奶牛乳腺上皮细胞中TNF-α的相对表达量显著降低，因此烟酸能够有效的减少奶牛乳腺上皮细胞炎症模型中TNF-α的相对表达量，从而缓解奶牛乳腺上皮细胞的炎症反应。
从图11中可以看出不同浓度烟酸处理后对奶牛乳腺上皮细胞的存活并无影响，因此烟酸的用药剂量在安全范围内。
从图12中可以看出LPS刺激后奶牛乳腺上皮细胞中iNOS和COX-2的相对表达量显著升高，而烟酸处理后奶牛乳腺上皮细胞中iNOS和COX-2的相对表达量显著降低，这说明烟酸能够有效的减少奶牛乳腺上皮细胞炎症模型中iNOS和COX-2的相对表达量，从而缓解奶牛乳腺上皮细胞的炎症反应。
从图13中可以看出随着时间的增加，烟酸能够显著增强GPR109A的表达从而激活GPR109A发挥抗炎功能。
综上所述，该实验证明了烟酸能够对奶牛乳腺炎起到治疗和保护的功能，从动物试验中我们发现饲喂烟酸7天后，奶牛的乳清、血清或乳汁中的促炎介质(IL-1β、IL-6和TNF-α)出现了显著下调，与同期不饲喂烟酸的奶牛相比也有显著的降低，这说明烟酸能够很好的缓解奶牛乳腺炎。在细胞实验中我们又证明了烟酸能够通过激活GPR109A减少细胞中iNOS和COX-2的蛋白表达量而降低LPS诱导的乳腺上皮细胞炎症反应模型中IL-1β、IL-6和TNF-α的表达，而且不同浓度的烟酸均未对奶牛乳腺上皮细胞产生影响。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (4)

1.一种烟酸通过GPR109A受体用于制备治疗奶牛乳腺炎药物的应用，其特征在于，包括以下步骤：
S1、乳腺炎奶牛的筛选：初步筛选出乳腺炎为阳性的奶牛，其体细胞数为80-200万/mL；
S2、奶牛血清中促炎因子的检测：分别在第0天和第7天收集正常奶牛、乳腺炎奶牛和饲喂烟酸的乳腺炎奶牛中的外周血，然后提取血液中的血清；
S3、奶牛乳汁中乳清的提取及促炎因子的检测：分别在第0天和第7天收集正常奶牛、乳腺炎奶牛和饲喂烟酸的乳腺炎奶牛的乳汁，然后提取乳汁中的乳清，将采好的乳汁用3000转的速度离心20分钟，收集上清液并应用ELISA法检测乳清中IL-6、TNF-α和IL-1β的蛋白表达；
S4、CCK8实验
将原代奶牛乳腺上皮细胞接种到96孔细胞培养板中，每孔含有细胞0.5×104个，加入培养基100μL，将细胞放入37℃和5％CO2的无菌恒温培养箱中培养24小时，然后加入不同浓度的烟酸或烟酸+LPS，待24小时后再次向每个孔中加入10μL的CCK8试剂，继续在培养基中培养2小时，然后取出96孔板放入酶标仪中在450nm波长处测定吸光光度；
S5、烟酸对原代奶牛乳腺上皮细胞炎症反应的抑制作用试验
将0.3×105个原代奶牛乳腺上皮细胞接种到60mm×15mm细胞培养皿中，分为4组：正常组、烟酸组、1μg/mlLPS组、LPS+烟酸组，当细胞数达到培养皿的80％时，用无血清培养基代替培养基培养3小时后加入烟酸，再过1小时后加入LPS，正常组不添加任何成分，烟酸组仅添加烟酸，1μg/mlLPS组仅添加1μg/ml LPS，LPS+烟酸组按照实验步骤分别添加烟酸和LPS，3小时后收集培养皿中的原代奶牛乳腺上皮细胞，收集好的细胞用Trizol法提取总RNA并反转录成cDNA用于后续试验或者提取细胞中的总蛋白并应用BCA蛋白浓度测定法测量细胞中的总蛋白含量，统一用于后续试验，在后续试验中利用荧光定量PCR法检测原代乳腺上皮细胞中IL-6、TNF-α和IL-1β的基因表达，再利用western blot法检测原代奶牛乳腺上皮细胞中COX2和INOS的蛋白表达；
S6、烟酸对GPR109A的激活作用
将0.3×105个原代奶牛乳腺上皮细胞接种到60mm×15mm细胞培养皿中，分别用烟酸处理0h、1h、3h、6h和12h后收集细胞并提取细胞中的总蛋白，通过western blot的方法检测细胞中GPR109A的表达量。
2.根据权利要求1所述的一种烟酸通过GPR109A受体用于制备治疗奶牛乳腺炎药物的应用，其特征在于：乳汁中体细胞数的检测方法为：首先配制染色液，取40mL四氯乙烷和54mL乙醇，充分混合均匀，然后放置于65℃温水溶液中进行3min加热，再添加0.6g甲基蓝，最后放置于温度调整为4℃的冰箱中2小时，然后加入6mL冰醋酸，放于常温保存；再取一块干净的载玻片，滴入10μL的生鲜乳样品，放入恒温箱中干燥，再浸入染色液中，最后形成均匀的玻片；将制备好的样品放在计数板中进行染色细胞计数。
3.根据权利要求1所述的一种烟酸通过GPR109A受体用于制备治疗奶牛乳腺炎药物的应用，其特征在于：血液中血清的提取方法为：将步骤S2中采好的血液呈45度角放置于4℃冰箱中1小时，然后用3000转的速度离心5分钟，收集上清液并应用ELISA法检测血清中IL-6、TNF-α和IL-1β的蛋白表达。
4.根据权利要求1所述的一种烟酸通过GPR109A受体用于制备治疗奶牛乳腺炎药物的应用，其特征在于：乳腺上皮细胞总蛋白的提取方法：利用蛋白提取试剂收集原代乳腺上皮细胞并提取总蛋白，应用western blot的方法检测奶牛乳腺上皮细胞中iNOS、COX-2和GPR109A的相对表达量。
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