CN114317353B - 一种植物乳杆菌zjufyj7及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZJUFYJ7及其应用，属于生物技术领域。所述植物乳杆菌ZJUFYJ7的保藏号为CCTCC NO:M 2020127。本发明提供的植物乳杆菌ZJUFYJ7在胃肠道环境中具有很高的生存率、较强的胃肠粘附力，能显著抑制胃肠道致病菌的繁殖，具有较强的自由基清除能力，提高HepG2肝细胞的摄糖量，促进巨噬细胞分泌IL‑10，具有潜在的抗炎作用。动物试验证明，植物乳杆菌ZJUFYJ7可以显著缓解高脂膳食诱导的高血糖和胰岛素抵抗，通过植物乳杆菌的定植，改善肠道菌群紊乱，调控胆汁酸和短链脂肪酸代谢，从而发挥降血糖的作用。

Description

一种植物乳杆菌ZJUFYJ7及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZJUFYJ7及其应用。

背景技术

随着人们膳食结构的改变，高脂膳食摄入明显增加，并由此引起的胰岛素抵抗呈逐年上升趋势。2型糖尿病是一种慢性代谢紊乱性疾病，临床表现为高血糖，并常伴随低度炎症。研究表明机体的代谢紊乱与免疫细胞产生白细胞介素-10(IL-10)的能力下降密切相关(Vermaetal.,2016)。抑制了IL-10就会促进TNF-α和IL-6等炎症因子的表达，而且胰岛素信号变差，甚至激活糖异生和脂肪生成途径(Gotoh et al.,2017)。

近年来，关于乳酸菌潜在的益生作用研究越来越多，尤其是对糖代谢和免疫功能的调节作用。鼠李糖乳杆菌(LGG)可以显著改善db/db糖尿病小鼠的高血糖症状，并且抑制巨噬细胞的激活(Park et al.,2015)。

植物乳杆菌是一种常见的益生菌菌种，广泛存在于发酵食品中，现有研究表明，植物乳杆菌具备调节胃肠道菌群、调节免疫、降胆固醇等功能。如申请号为2018107243657的中国专利公开了一种分离自酸面团的植物乳杆菌ZJUFT17，该菌株能够抑制胃、肠道致病菌的繁殖；能够显著降低血清中胆固醇含量，优化高密度脂蛋白胆固醇与低密度脂蛋白胆固醇的比例，且能够显著降低血清中的TNF-α含量，具有免疫调节的功能。

另外，植物乳杆菌具有缓解代谢综合征的潜能，申请号为2021108674356的中国专利申请公开了一种从成人粪便中分离筛选的植物乳杆菌BUFX，该菌株能够促进HepG2肝癌细胞葡萄糖消耗，抑制α-淀粉酶活性，并且可以显著降低高脂饮食小鼠的体重和血脂含量。研究表明，α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制剂可以减缓淀粉和寡糖中葡萄糖的释放，从而导致葡萄糖吸收延迟和餐后血糖水平降低。

但是，植物乳杆菌不同菌株的基因组和功能存在很大差异，目前尚未有能够缓解胰岛素抵抗的植物乳杆菌被报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZJUFYJ7，该植物乳杆菌具有优异的益生作用，能够显著改善高脂膳食导致的胰岛素抵抗和高血糖，具有缓解2型糖尿病的潜力。

本发明从泡菜样品中分离筛选得到一菌株YJ7，经鉴定该菌株为植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZJUFYJ7。植物乳杆菌ZJUFYJ7的16S rRNA的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。将植物乳杆菌ZJUFYJ7于2020年5月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉、武汉大学)，保藏号为：CCTCC NO:M 2020127。

体外实验表明，植物乳杆菌ZJUFYJ7具有耐受胃肠道转运液的能力，在模拟人工胃肠道中具有很高的生存率；植物乳杆菌ZJUFYJ7具有较好的肠道黏附和定植的能力，能显著抑制胃肠道致病菌(如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌)的繁殖。另外，动物实验表明，植物乳杆菌ZJUFYJ7能够显著改善高脂膳食导致的肠道菌群紊乱。因此，植物乳杆菌ZJUFYJ7可用于预防或治疗胃肠道菌群失衡。

本发明的另一个目的是提供植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZJUFYJ7在制备预防或治疗胃肠道菌群失衡的药物或调节胃肠道菌群平衡的功能食品中的应用。

进一步的，本发明提供了植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZJUFYJ7在制备抑制胃肠道致病菌的药物或功能食品中应用，所述胃肠道致病菌包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌中的一种或两种。

本发明的另一个目的在于提供所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZJUFYJ7在制备抗炎药物或功能食品中的应用。

进一步的，植物乳杆菌ZJUF YJ7促进巨噬细胞分泌白细胞介素10(IL-10)，减少内毒素脂多糖的产生。

本发明体外实验表明，植物乳杆菌ZJUFYJ7具有较强的自由基清除能力，促进巨噬细胞分泌IL-10，具有潜在的抗炎作用。动物实验表明，植物乳杆菌ZJUFYJ7显著提高高脂膳食小鼠血清中抑炎因子IL-10水平，一定程度缓解高脂膳食诱导的低度系统炎症。

本发明的另一个目的在于提供所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZJUFYJ7在制备预防或治疗糖尿病药物或调节糖尿病患者血糖的功能食品中的应用。所述的糖尿病为高脂膳食引起的代谢异常综合征，尤其为2型糖尿病。

具体的，植物乳杆菌ZJUF YJ7具有改善胰岛素抵抗和降低血糖的作用。

本发明研究表明，植物乳杆菌ZJUF YJ7能够显著改善高脂膳食小鼠的空腹血糖和胰岛素抵抗，另外，乳杆菌可以定植在小鼠肠道，通过调控肠道菌群来发挥益生作用。

具体的，体外实验表明，植物乳杆菌ZJUF YJ7提高正常HepG2肝细胞以及胰岛素抵抗HepG2肝细胞的摄糖量。动物实验表明，植物乳杆菌ZJUFYJ7能够显著改善高脂膳食导致的胰岛素抵抗和高血糖。进一步机理研究表明，植物乳杆菌ZJUF YJ7可能是通过刺激胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的分泌达到改善胰岛素抵抗的效果。另外，通过测定肝脏糖脂代谢以及糖异生相关基因的表达水平，推测植物乳杆菌ZJUF YJ7通过抑制肝脏脂肪酸合成酶(FAS)、固醇调节元件结合转录因子(SREBP-1c)和肝脏过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)基因的表达，改善高脂膳食诱导的肝脏脂质代谢紊乱；植物乳杆菌ZJUF YJ7通过抑制高脂膳食引起肝脏磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶(PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基(G6PC)的高表达，调节糖异生途径改善糖代谢稳态。

本发明的另一个目的在于提供所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZJUFYJ7在制备降低动物或人体内低密度脂蛋白胆固醇浓度的药物或功能食品中的应用。

本发明的另一个目的在于提供所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZJUFYJ7在制备提高动物或人体内胆汁酸浓度的药物或功能食品中的应用。

胆汁酸除了可以参与脂代谢，还可以调控机体糖代谢稳态。本发明研究表明，植物乳杆菌ZJUF YJ7可以促进高脂膳食小鼠的胆汁酸代谢，进而发挥降血糖的作用。

本发明的另一个目的在于提供所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZJUFYJ7在制备改善短链脂肪酸代谢药物或功能食品中的应用。

短链脂肪酸(SCFAs)是由肠道微生物利用非消化性碳水化合物代谢产生的一类小于6个碳原子的脂肪酸，它可以调控机体的糖脂代谢和能量代谢。植物乳杆菌ZJUF YJ7可以促进高脂膳食小鼠的短链脂肪酸代谢，进而发挥降血糖的作用。

作为优选，所述药物由植物乳杆菌ZJUF YJ7菌剂与在药学上可接受的载体组成。

作为优选，所述功能食品由植物乳杆菌ZJUF YJ7菌剂与食品辅料组成。

所述植物乳杆菌ZJUF YJ7菌剂为将含有所述植物乳杆菌ZJUF YJ7的菌液通过冷冻干燥制得的粉剂，其中含有＞10¹¹CFU/g的活性植物乳杆菌ZJUF YJ7。

作为优选，所述药物的剂型为颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液剂型。

本发明具备的有益效果：

本发明提供了一种体外益生特性(耐模拟肠胃液、粘附性能、抗氧化和抑炎特性等)优异的植物乳杆菌YJ7。本发明利用植物乳杆菌YJ7干预高脂膳食饲喂小鼠，从生长性能、脂代谢、糖稳态、炎症因子、胆汁酸和粪便短链脂肪酸等六个方面，探究植物乳杆菌YJ7对HFD诱导小鼠糖脂代谢紊乱的缓解作用，研究表明，植物乳杆菌YJ7可以显著缓解高脂膳食诱导的高血糖和胰岛素抵抗，可能是通过植物乳杆菌的定植，改善肠道菌群紊乱，调控胆汁酸和短链脂肪酸代谢，从而发挥降血糖的作用。

附图说明

图1为植物乳杆菌YJ7体外刺激巨噬细胞分泌IL-10能力的检测结果。

图2为植物乳杆菌YJ7对高脂膳食小鼠血脂四项的影响，其中A为甘油三酯(TG)、B为总胆固醇(TCHO)、C为低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、D为高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。

图3为植物乳杆菌YJ7对高脂膳食小鼠糖耐量的影响。

图4为植物乳杆菌YJ7对HFD饲喂小鼠胰岛素抵抗的影响，其中A为血清中空腹血糖；B为胰岛素抵抗评价指数。

图5为植物乳杆菌YJ7对HFD饲喂小鼠糖代谢相关指标的影响，其中A为糖基化血红蛋白(Hb1Ac)，B为胰高血糖素样肽-1(GLP-1)，C为YY肽(PYY)。

图6为植物乳杆菌YJ7对HFD饲喂小鼠炎症相关指标的影响，其中A为促炎因子IL-6，B为抑炎因子IL-10，C为脂多糖LPS。

图7为植物乳杆菌YJ7对HFD饲喂小鼠胆汁酸代谢的影响，其中A为血清中胆汁酸含量，B为肝脏中胆汁酸含量，C为粪便中胆汁酸含量。

图8为植物乳杆菌YJ7对HFD饲喂小鼠短链脂肪酸的影响，其中A为乙酸，B为丙酸，C为异丁酸，D为丁酸，E为异戊酸，F为戊酸，G为己酸，H为总短链脂肪酸。

图9为植物乳杆菌YJ7对HFD饲喂小鼠肠道菌群属水平组成的影响。

图10为小鼠肠道菌群差异菌属LEfSe分析。

图11为植物乳杆菌YJ7对HFD饲喂小鼠肠道菌群中特征菌属丰度的影响，其中A为g_unclassified_Porphyromonadaceae；B为g_unclassified_f_Erysipelotrichaceae；C为Alloprevotella；D为Oscillibacter；E为Alistipes；F为Pseudoflavonifractor；G为Helicobacter；H为Mucispirillum；I为Saccharibacteria_genera_incertae_sedis。

图12为差异菌群的STAMP分析，其中A，HFD与YJ7；B，NCD与YJ7；C，NCD与HFD。Wilcoxon秩和检验鉴别差异物种。

图13为植物乳杆菌YJ7对HFD饲喂小鼠肠道菌群中特征种丰度的影响，A为Lactobacillus plantarum；B为Saccharibacteria_genera_incertae_sedis spp；C为Alistipes spp；D为Flexistipes spp。

图14为植物乳杆菌YJ7对肝脏中糖脂代谢相关基因的表达，其中A为脂肪酸合成酶(FAS)、B为固醇调节元件结合转录因子1c(SREBP-1c)、C和D为肝脏过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ和PPARα)、E为磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶(PEPCK)、F为葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基(G6PC)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的适用范围。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1 菌株分离鉴定

1、菌株的筛选及分离

材料：泡菜，南方常食用的传统发酵食品，本发明采用来自四川的样品。

称取5g泡菜加入到45mL 0.85％的灭菌生理盐水中，振荡制成悬液，进行系列梯度稀释，稀释后取10^-5、10^-6、10^-7三个梯度涂布于MRS培养基上，每个梯度做三个平行。将涂布后的平板放入37℃厌氧培养箱中培养24-48h。挑选差异明显的菌落进行MRS培养基上划线分离，将平板放入37℃厌氧培养箱中培养24-48h。连续划线3-5次后，取一滴现配的5％的过氧化氢滴于载玻片上，挑取固体培养基上单菌落接入5％的过氧化氢液滴中并混匀，产生气泡为过氧化氢酶试验阳性，未产生气泡为过氧化氢酶试验阴性，过氧化氢酶试验阴性菌株为疑似益生菌株。

将筛选得到的疑似益生菌株分别以1％接种量接入MRS-THIO液体培养基(MRS中添加0.2％的巯基乙酸钠)和含0.3％(w/v)的猪胆盐的MRS-THIO培养基中上述处理放置在37℃厌氧培养箱中培养24h，取样在600nm下测定吸光值，计算24h的OD值差值，检测菌株的生长能力。

将上述筛选得到的疑似益生菌株以1％接种量接种到pH3.0的MRS培养基中，37℃厌氧培养箱中培养24h，取样在600nm下测定吸光值，计算24h的OD值差值，检测菌株的生长能力，筛选得到了YJ7。

2、菌株的鉴定

将YJ7进行革兰氏染色，并进行了16S rRNA基因菌种鉴定，此鉴定送样上海派森诺生物有限公司进行，16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示。经过16S rRNA基因比对，该菌株与Gene Bank数据库中已知植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的同源性最高达99.87％。

结合上述分析，鉴定YJ7为一株植物乳杆菌，命名为Lactobacillus plantarumZJUFYJ7。将植物乳杆菌ZJUF YJ7于2020年5月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉、武汉大学，保藏号为：CCTCC NO:M 2020127。该培养物的存活性于2020年6月2日检测为存活。

3、样品的制备

(1)活菌的制备：将活化好的菌体接种于MRS液体培养基中在37℃下培养18h，8000rpm 4℃条件下离心15min，然后无菌PBS洗2遍，PBS重悬，调整活菌量约为1.0×10⁹CFU/mL(根据OD₆₀₀与倾注平板计数结果调整)，备用。

(2)死菌(Heat-killed bacteria，HKB)的制备：将活化好的菌体接种于MRS液体培养基中在37℃下培养18h，8000rpm 4℃条件下离心15min，然后无菌PBS洗2遍，接着蒸馏水洗2遍，重悬于蒸馏水中，75℃下60min进行热致死处理，最后冻干。

(3)发酵上清(CFS)：按照2％的接种量将菌株接种于MRS液体培养基中置于37℃下培养18h，然后在8000rpm 4℃条件下冷冻离心15min，取上清，过0.22μm滤膜后存于-80℃下备用。

(4)无细胞提取物(CFE)：按照2％的接种量将菌株接种于MRS液体培中置于37℃下培养18h，然后在8000rpm 4℃条件下冷冻离心15min，PBS洗2遍，PBS重悬，调整菌量约为5.0×10¹⁰CFU/mL。超声细胞破碎(冰浴上)，50％功率，8s脉冲，超声20min。然后8000rpm 4℃冷冻离心15min，取上清，过0.22μm滤膜后存于-80℃下备用。

实施例2 模拟人工胃肠液耐受性

人工模拟胃肠液需新鲜配制，且必须过膜(0.22μm)除菌。

模拟胃液(GJ)：胃蛋白酶(1:10000)加入PBS(pH2.5)中，浓度为3.5g/L。

模拟肠液(IJ)：NaHCO₃ 11g/L，NaCl 2g/L，胰蛋白酶1g/L，猪胆盐18g/L，调整pH值为8.0，0.22μm膜过滤除菌备用。

经冷冻离心后得到活菌体，PBS(pH7.4)洗两次，调整活菌浓度约为10⁹CFU/mL，将0.5mL菌悬液加入4.5mL模拟胃液中，置于厌氧培养箱中37℃培养。分别于0、1.5h、3h时，采用MRS琼脂倾注平板法计数。

待GJ处理3h后，取0.5mL的GJ培养液加入4.5mL的IJ中，4h、8h后采用MRS琼脂倾注平板法计数，置于厌氧培养箱中37℃下培养24-48h后计数。每个菌株做三个平行。按照如下公式计算存活率，结果如表1所示。

存活率(％)＝logα/logβ×100％

其中：α＝经过模拟胃肠液处理之后的乳酸菌活菌数，β＝未处理前的活菌数。

表1植物乳杆菌模拟胃肠液转运耐受力和粘附特性

如表1所示，Lactobacillus plantarum ZJUF YJ7可耐受胃肠液转运，胃液处理3h后，实验结束时存活率为72.01％，肠液处理8h后存活率为43.80％。这说明菌株YJ7可耐受pH2.5的胃液转运，并且在肠液中的耐受性也很高。

实施例3 黏附能力测定

Caco-2细胞生长于含有15％胎牛血清和1％双抗的IMDM培养液中，37℃和5％CO₂的培养箱中进行培养，每天更换一次培养液，待细胞增殖融合率达80％左右时，以含0.02％EDTA的0.25％胰酶消化细胞，按1:3传代。取对数生长期细胞进行试验。

Caco-2细胞以2.5×10⁵cells/孔种板于24孔板中，每天换液，37℃5％CO₂培养5天，达到单层细胞。菌株培养过夜后，在4℃和8000rpm条件下离心10min，用无菌的PBS清洗菌体2遍，用IMDM细胞培养液(不含双抗)调整菌浓度约为1×10⁸CFU/mL，并琼脂平板计数。PBS洗板5次，去除板上残留的双抗，然后添加配制好的含有活菌的细胞培养悬液1mL加入到Caco-2细胞单层中，37℃培养1h。用PBS将细胞单层冲洗3次以移除未粘附的菌体，以1mL1％的曲拉通来溶解细胞，然后在合适的稀释梯度下采用MRS琼脂倾注平板法计数。按照如下公式计算粘附率，结果如表2所示。

粘附率(％)＝log L₀/log L₁×100％

注：L₀＝添加的乳酸菌活菌数，L₁＝1h后乳酸菌的活菌数。

表2植物乳杆菌模拟粘附特性

菌株	粘附率(％)
		YJ7	82.25±0.82

如表2所示，植物乳杆菌ZJUFYJ7的粘附率达到82.25％，说明此植物乳杆菌ZJUFYJ7的细胞粘附性能较好，具有较好的肠道黏附和定植的潜力。

实施例4 抑菌特性研究

使用琼脂孔扩散法测定菌株的抑菌能力。取20mL灭菌冷却45℃的MRS培养基与200μL致病菌液(10⁵-10⁶CFU/mL)一起倒入平板混匀，待凝固后于平板上打孔，孔径为7mm。将已制备好的无菌上清液(将培养好的菌液离心，取上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，置于-80℃备用，100μL分别加入孔中，以等体积已灭菌的PBS为对照，置于4℃下扩散12h，取出放入37℃培养24h。测量其抑菌圈直径。

Lactobacillus plantarum ZJUFYJ7对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌2种常见致病菌具有一定的抑制能力(见表3)，其中对金黄色葡萄球菌的抑制能力优于大肠杆菌的抑制能力，YJ7均优于阳性对照菌株鼠李糖乳杆菌LGG。

表3植物乳杆菌ZJUF YJ7抑制致病菌能力

实施例5 抗氧化活力评价

DPPH自由基清除率：1mL活菌样品加到1mL的DPPH-乙醇溶液(0.02mmol/L)中，混合在室温下暗反应30min，8000rpm离心10min，取上清在517nm处测定吸光值。离心对照组包括PBS和DPPH-乙醇溶液，空白组包含样品和乙醇，每组设置3个平行，LGG为阳性对照组。按照如下公式计算DPPH自由基清除率，结果如表4所示。

羟自由基清除能力：0.5mL的2.5mmol/L的1,10-邻菲罗啉，1mL的PBS(20mmol/L，pH7.4)充分混匀后，再加入0.5mL2.5 mmol/L的FeSO₄，充分混匀后，加入0.5mL2.5 mmol/L的H₂O₂，加入0.5mL活菌样品，37℃中孵育1h，8000rpm离心10min，取上清在536nm处测定OD值，将0.5mL的样品替换成水为对照组，将0.5mL的H₂O₂和样品替换成水的为空白组，每组设置3个平行，LGG为阳性对照组。按照如下公式计算羟自由基清除率，结果如表4所示。

表4植物乳杆菌ZJUF YJ7的DPPH和羟自由基清除率

菌株	DPPH自由基清除率(％)	羟自由基清除率(％)
			LGG	17.09±3.38	23.55±5.66
YJ7	22.27±2.82*	8.70±3.43*

注：*代表与LGG比较，p<0.05。

如表4所示，植物乳杆菌YJ7对DPPH自由基的清除率显著高于鼠李糖乳杆菌LGG(17.09％)，为22.27％。与对照LGG(23.55％)相比，植物乳杆菌YJ7对羟自由基的清除率显著低于LGG(p<0.05)，仅为8.70％。这说明YJ7在有机溶剂中具有一定的抗氧化优势。

实施例6 正常HepG2肝细胞摄糖的测定

HepG2细胞复苏及传代同Caco-2细胞，培养液用低糖DMEM完全培养基，37℃5％CO₂条件下培养。按照10⁵cells/mL密度种板于96孔板中，每孔100μL，铺板24h后弃去原有的培养液并用无菌PBS清洗2遍，然后每个孔中加入等体积的相同培养液(含0.2％的BSA的RPMI1640培养基)继续培养24h，同时设置空白，给药。

试验设置如下，a无细胞培养基孔：不加细胞只加培养基；b对照(CK)孔：加入细胞和等体积培养基；c样品CFS组：含0.2％BSA的1640培养基稀释10³倍；d样品CFE组：含0.2％BSA的1640培养基稀释10³倍。

移取细胞培养上清测定葡萄糖含量，并用CCK-8法检测细胞的存活率来矫正数据。葡萄糖含量测定采用南京建成葡萄糖氧化酶法试剂盒。按照如下公式计算葡萄糖消耗量，结果如表5所示。

葡萄糖消耗量(mmol/L)＝A-B

注：A为无细胞培养孔中RPMI1640培养液的葡萄糖浓度；B为待测孔中培养液的葡萄糖浓度

表5植物乳杆菌ZJUF YJ7对正常HepG2肝细胞摄糖量的影响

在未造模的HepG2细胞模型中，两株菌的CFS表现了一定的促进细胞葡萄糖消耗水平，但并无显著差异，其中YJ7的摄糖量最高，达到6.99mmol/L，高于LGG组，较CK组(6.14mmol/L)高。在CFE中，LGG和YJ7的摄糖量均明显高于CK组(6.00mmol/L)，分别为7.16mmol/L和6.96mmol/L。这说明，YJ7具有很强的体外降血糖潜力。

实施例7 胰岛素抵抗HepG2肝细胞摄糖的测定

首先使用含10％胎牛血清FBS和1％双抗的低糖DMEM培养基培养HepG2细胞，置于37℃和5％CO₂的条件下培养。待对数成长期时，按照5×10⁴cells/孔接种到24孔板中，待细胞培养24h后达到70-80％的融合度，用PBS缓冲液清洗2遍。然后造模组用0.2mmol/L棕榈酸(PA)诱导细胞形成胰岛素抵抗，药物组分别用含有稀释10³倍的不同菌株的CFS或CFE和0.2mmol/L棕榈酸的高糖DMEM培养基，对照组用高糖DMEM培养基，均含有0.2％BSA，处理24h。用PBS缓冲液清洗2遍，用含0.2％牛血清白蛋白(BSA)的RPMI1640培养基培养24h后，移取细胞培养上清测定葡萄糖含量，并用CCK-8法检测细胞的存活率来矫正数据。结果如表6所示。

甘油三酯(TG)测定：用1.5％曲拉通X-100裂解细胞40min后，12000rpm 4℃离心取上清，用BCA法测定蛋白浓度，根据试剂盒说明书操作，测定TG含量。结果如表6所示。

肝酯酶活(HL)活性：取细胞培养上清后，用BCA法测定蛋白浓度，使用HL比色法试剂盒检测细胞的HL活性，根据试剂盒说明书操作，测定HL活力。结果如表6所示。

表6植物乳杆菌ZJUF YJ7对胰岛素抵抗HepG2肝细胞摄糖量、TG和HL的影响

注：*代表与模型组比较，p<0.05。

如表6所示，PA组显著降低了细胞的摄糖量(p<0.05)，证明造模成功。与PA组相比，LGG和YJ7的CFS提高了细胞的摄糖量。在CFE中，与PA组相比，YJ7显著(p<0.01)提高了胰岛素抵抗细胞的摄糖量。这说明YJ7具有潜在的改善胰岛素抵抗的潜力。

与PA组相比，各个菌的CFS并未显著(p>0.05)改变PA诱导HepG2细胞的甘油三酯(TG)含量。在CFE处理组中，与PA相比，各组均有降低TG含量的趋势但无显著差异。

与CK组相比，PA组肝脂酶活增加，这可能是由于PA的添加刺激了细胞分泌肝脂酶(HL)。与PA组相比，CFS和CFE中，YJ7明显增强了HL酶活，这说明YJ7可能具有促进脂肪代谢的能力。

实施例8 死菌刺激腹腔巨噬细胞(PR)分泌IL-10的能力

选取6-8周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠3只，提前3天腹腔注射4％巯基乙酸盐肉汤2mL/只小鼠，引颈处死小鼠后，腹腔注入5mL含1％FBS的RMPI1640培养基，按摩大于15min，使腹腔的巨噬细胞尽可能多地悬浮于RMPI1640培养基中。剪开腹腔，小心抽出细胞悬液，快速转移至15mL离心管中，3000rpm离心8min，弃去上清，用含3％FBS的PBS洗涤2遍，加入2mLRPMI 1640培养基(含10％FBS和1％双抗)重悬细胞，调整密度1×10⁶cells/mL，种板于96孔板中，每孔100μL，置于37℃的CO₂培养箱中贴壁2h，用PBS洗去未贴壁的细胞，加入200μL的RMPI1640培养基(含10％FBS和1％双抗)，每天换液，7天内使用。

实验时，吸去96孔板中的培养液，PBS洗2遍，用含10μg/mL死菌的菌悬培养液，培养24h后，取上清，测定IL-10含量，每个样品设置3个平行。结果如图1所示。

由图1可知，2株菌均提高了PR细胞分泌IL-10的产量，且植物乳杆菌YJ7组的IL-10含量最高。与CK组比较，仅YJ7明显提高了IL-10的产量(p＝0.07)。这说明植物乳杆菌ZJUFYJ7具有一定的抑炎效果。

实施例9 植物乳杆菌YJ7对高脂膳食小鼠血脂四项的影响

将6周龄雄性C57BL/6小鼠放入动物房内饲喂普通饲料平衡7d，使其适应实验环境(12h白天/黑夜)。平衡期结束后，随机分成4组，分组信息和给药方式(根据课题组前期研究结果，设置灌胃剂量为10⁹CFU/只/天)如下表7。小鼠每组12只，分为3笼，每笼4只，环境(22±2℃)，湿度30-70％，小鼠自由摄食和饮水，试验历时16周，每周记录1次体重，每周记录2次小鼠的采食量。16周后，小鼠禁食12h，称重，随后眼眶取血、颈椎脱臼处死，快速取肝脏、附睾脂肪和肠道等组织液氮速冻，干冰运输并放置于-80℃冰箱中保存备用。血液样本3000rpm离心10min得到血清。样品用于实施例9-17各项的检测。本实验获得浙江中医药大学伦理委员会批准，编号为ZSLL-2019-10947。

表7实验动物分组信息

组别(n＝12)	饲料	给药(灌胃200μL)
			NCD	普通饲料	含有等量的冻干保护剂的生理盐水
HFD	高脂45％	含有等量的冻干保护剂的生理盐水
			HFD+YJ7	高脂45％	109CFU/只/天(无菌生理盐水重悬)
HFD+LGG	高脂45％	109CFU/只/天(无菌生理盐水重悬)

按照商业试剂盒的操作步骤分别检测小鼠血清中血糖、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TCHO)、高密度脂蛋白固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白固醇(LDL-C)的含量。结果如图2所示。

由图2可知，摄入YJ7均提高了HFD饲喂小鼠血清中的TG水平(p<0.05)，其余各组均无显著差异(p>0.05；图2A)。在TCHO方面，饲喂HFD组的小鼠血清中TCHO的水平显著高于NCD组，而与HFD组相比，LGG组有升高TCHO的趋势，但均不显著(p>0.05；图2B)。此外，饲喂HFD的四组小鼠血清的HDL-C和LDL-C水平均显著高于NCD组(p<0.05；图2C和2D)，而HFD饲喂小鼠三组间的HDL-C水平并无显著差异(p>0.05；图2D)，YJ7组小鼠血清中LDL-C的水平显著低于LGG组(p<0.05)，且低于HFD组(图2C)。综上，YJ7对HFD饲喂小鼠血脂代谢有一定的促进作用。

实施例10 植物乳杆菌YJ7对高脂膳食小鼠糖耐量的影响

实施例9的各组实验小鼠在喂养15周后进行葡萄糖耐受实验，腹腔注射2g/kg体重的葡萄糖溶液，分别测0、30、60、90和120min时小鼠的血糖。

腹腔注射葡萄糖耐量(GTT)的实验结果如图3所示。HFD饲喂的四组小鼠在腹腔注射葡萄糖后各时间点的血糖值均高于NCD组，其中HFD组小鼠在0min、30min、90min和120min的血糖均显著高于NCD组小鼠。不难发现，YJ7组在0min(p<0.05)和120min(p<0.05)时的血糖值明显低于HFD组，且降血糖效果由于LGG组，这说明YJ7对缓解HFD诱导的高血糖具有显著作用。

实施例11 植物乳杆菌YJ7对HFD饲喂小鼠胰岛素抵抗的影响

按照商业试剂盒的操作步骤分别检测小鼠血清中空腹血糖(FBG)、胰岛素(FI)。

胰岛素抵抗评价指数(HOMA-IR)计算公式：

HOMA-IR＝FI×FBG/22.5

注：空腹胰岛素(Fasting insulin，FI，mU/L)和空腹血糖(Fasting bloodglucose，FBG，mmol/L)

由图4可知，与NCD组相比，HFD组小鼠空腹血糖和胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)显著高(p<0.05)，这说明HFD组小鼠已经产生了明显的胰岛素抵抗。与HFD组相比，仅YJ7显著降低了高脂膳食诱导的高血糖和HOMA-IR(p<0.05)，LGG也有降低的趋势，但不显著(p>0.05)。这说明YJ7可以显著改善高脂膳食诱导的胰岛素抵抗和高血糖。

实施例12 植物乳杆菌YJ7对HFD饲喂小鼠糖代谢相关指标的影响

按照说明书利用双夹心法ELISA试剂盒测定血清中的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、YY肽、糖基化血红蛋白(Hb1Ac)。

糖基化血红蛋白(HbA1c)是指示糖代谢紊乱的一个重要指标，而胰高血糖素样肽1(GLP-1)是促进糖代谢的一个重要因子。由图5可知，与NCD组相比，LGG显著提高了HbA1c的水平(p<0.05)。与NCD和HFD相比，LGG和YJ7显著提高了血清中GLP-1水平(p<0.05)。结合胰岛素抵抗结果，这说明LGG可能产生一定的GLP-1抵抗。而YJ7可能是通过刺激GLP-1的分泌达到改善胰岛素抵抗的效果。YY肽(PYY)是肠道细胞释放的一种短肽，它可以抑制食欲。摄入LGG和YJ7对高脂膳食小鼠的PYY水平几乎无影响，这与小鼠能量摄入的结果一致。

实施例13 植物乳杆菌YJ7对HFD饲喂小鼠炎症相关指标的影响

按照说明书利用双夹心法ELISA试剂盒测定血清中的炎症因子(IL-6、IL-10)，脂多糖(内毒素，LPS)检测试剂盒测定血清中LPS的含量。

由图6可知，在促炎因子IL-6方面(图6A)，各组间无显著差异。HFD组的IL-6水平略高于NCD组，而YJ7组的IL-6水平明显低于HFD组。在抑炎因子方面(图6B)，与NCD和HFD组相比，LGG和YJ7显著提高IL-10水平(p<0.05)。在血清内毒素LPS方面(图6C)，YJ7组明显低于HFD组。这说明，YJ7可以一定程度缓解高脂膳食诱导的低度系统炎症。

实施例14 植物乳杆菌YJ7对HFD饲喂小鼠胆汁酸代谢的影响

按照商业试剂盒的操作步骤分别检测小鼠血清、肝脏和粪便中总胆汁酸(TBA)的含量。

胆汁酸除了可以参与脂代谢，还可以调控机体糖代谢稳态。本试验测定了小鼠血清、肝脏和粪便中的总胆汁酸(TBA)，结果如图7所示。

YJ7组小鼠血清中的TBA明显高于NCD、HFD和LGG组，其余各组无显著差异。在肝脏中，YJ7组小鼠的TBA水平显著高于NCD组，略高于HFD和LGG组，其余各组也无显著差异。在粪便中，虽然各组小鼠的TBA无显著差异，但LGG明显低于其他组，而YJ7组小鼠TBA的含量明显高于HFD组，略高于NCD组。

综上，YJ7促进了HFD饲喂小鼠的胆汁酸代谢，而LGG可能抑制了胆汁酸代谢。

实施例15 植物乳杆菌YJ7对HFD饲喂小鼠短链脂肪酸的影响

样品制备：精准称取约50mg的小鼠粪便，加入250μL的无菌超纯水，涡旋振荡5min，然后加入10μL 5mol/L盐酸溶液调节悬浊液pH为2-3，涡旋振荡1min后置于室温下静置5min，然后在4℃、12000rpm条件下离心30min，取200μL上清液置于装有0.5μL稀释20倍后的2-乙基丁酸(内标)的1.5mL离心管中，涡旋振荡1min，并于4℃、12000rpm条件下离心5min，取150μL上清用于气相色谱分析。

气相色谱条件：Agilent DB-FFAP125-3237(30m×0.52mm×0.50mm)气相柱；气相柱程序升温条件为起始温度100℃维持0.5min，然后以8℃/min程序升温到180℃并维持1min，最后以20℃/min程序升温至240℃并维持15min；进样口温度和氢离子火焰检测器温度分别为200℃和240℃；氢气、空气和氮气流速分别设为30mL/min、300mL/min和20mL/min；进样量为1μL。

短链脂肪酸(SCFAs)是由肠道微生物利用非消化性碳水化合物代谢产生的一类小于6个碳原子的脂肪酸，它可以调控机体的糖脂代谢和能量代谢。由图8可知，与NCD组相比，HFD组小鼠粪便中的乙酸、丙酸、丁酸显著降低(p<0.05)。与HFD组相比，LGG、YJ7显著提高了粪便中乙酸的含量(p<0.05)。LGG和YJ7提高了HFD饲喂小鼠粪便中丙酸和丁酸的含量，但没有显著性。LGG和YJ7组小鼠粪便中戊酸的含量显著高于HFD组(p<0.05)。此外，LGG和YJ7提高了HFD喂养小鼠粪便中SCFAs的含量(p<0.05)。

实施例16 植物乳杆菌YJ7对HFD饲喂小鼠肠道菌群的影响

从属水平分析(图9)可知，摄入YJ7显著降低了HFD饲喂小鼠肠道菌Alistipes和Bacteroides拟杆菌属的丰度，显著增加了Saccharibacteria_genera_incertae_sedis、Desulfovibrio、Bilophila、Parvibacter和Staphylococcus的丰度。

为了鉴别各组样本的特征菌属，本试验采用了LEfSe(LDA Effect Size)分析法来做线性判别分析(LDA)，结果如图10所示。总共有33个属对3组小鼠的菌群有显著差异，NDC组有12个属，HFD饲喂小鼠共有21个属。

结合LEfSe集合和差异物种分析，发现NCD组富集的g_unclassified_Porphyromonadaceae、g_unclassified_f_Erysipelotrichaceae和Alloprevotella菌属的丰度显著高于HFD组和HFD组(图11A-C)。HFD组富集的Oscillibacter和Pseudoflavonifractor菌属显著高于NCD组(图11D和图11F)，而摄入YJ7降低了HFD饲喂小鼠肠道中这两个菌属的丰度。同样地，YJ7组Alistipes菌的丰度明显低于HFD组(p<0.14；图11E)。YJ7组富集的差异特征菌属分别为Helicobacter、Mucispirillum和Saccharibacteria_genera_incertae_sedis。与NCD组相比，HFD组和YJ7组肠道中的Helicobacter的丰度显著升高。YJ7组小鼠粪便中Mucispirillum和Saccharibacteria_genera_incertae_sedis的丰度显著高于HFD组和NCD组。这说明了植物乳杆菌YJ7显著上调了肠道菌中Mucispirillum和Saccharibacteria_genera_incertae_sedis的丰度。

为了进一步分析各组小鼠肠道菌的差异物种，我们采用STAMP分析进行两组间比较来寻找种水平的差异菌，结果如图12所示。根据差异物种分析结果筛选到4个种水平上差异显著的肠道微生物，为Lactobacillus plantarum、Alistipes spp、Flexistipes spp和Saccharibacteria_genera_incertae_sedis spp(图13)。分析结果发现，NCD和HFD组小鼠的肠道菌中未发现Lactobacillus plantarum，而YJ7显著提高了肠道菌中Lactobacillusplantarum的丰度，这说明了植物乳杆菌YJ7可能有一定的肠道定植能力。与在属水平发现的结果一致，YJ7组Mucispirillum属下的Flexistipes spp和Saccharibacteria_genera_incertae_sedis spp的丰度显著高于NCD组和HFD组，而YJ7明显降低了HFD饲喂小鼠中Alistipes spp的丰度。综合YJ7对不同水平肠道菌组成影响的结果发现，摄入YJ7能改善HFD引起的肠道菌群紊乱。

实施例17 植物乳杆菌YJ7对HFD饲喂小鼠肝脏糖代谢相关mRNA的影响

YJ7显著改善了HFD饲喂小鼠的胰岛素抵抗和糖脂代谢相关指标。为了揭示YJ7改善胰岛素抵抗的作用机理，本试验测定了小鼠肝脏糖脂代谢相关基因的表达水平，结果如图14所示。

脂肪酸合成酶(FAS)是合成脂肪酸的一个关键酶。HFD显著上调了FAS基因的表达，而YJ7明显下调了HFD诱导的高表达(p＝0.13；图14A)。固醇调节元件结合转录因子1c(SREBP-1c)，是一种产于脂质从头合成的转录因子，HFD组小鼠肝脏SREBP-1c基因的表达明显高于NCD组(p＝0.057；图14B)，而摄入YJ7显著减低了HFD引起的SREBP-1c基因的高表达(p＝0.052)。肝脏过氧化物酶体增值物激活受体(PPAR)，PPARγ和PPARα是一种配体依赖型的转录因子，在调节糖脂代谢方面发挥着重要的作用。HFD上调了小鼠肝脏PPARγ基因的表达水平(图14D)，有研究报道肝脏PPARγ基因在非酒精性脂肪肝小鼠中表达水平较高。而摄入YJ7显著下调了PPARγ基因的表达。在PPARα基因表达方面(图14C)，各组无显著差异。由此推测，YJ7能通过抑制肝脏FAS、SREBP-1c和PPARγ基因的表达，从而改善HFD诱导的肝脏脂质代谢紊乱。

为了验证YJ7对HFD饲喂小鼠糖稳态的影响，揭示YJ7改善胰岛素抵抗的作用机理，本试验测定了小鼠肝脏糖异生相关的两个基因磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶(PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基(G6PC)的表达水平。与NCD组相比，HFD组小鼠肝脏PEPCK表达水平明显上调(p＝0.12)，摄入YJ7显著降低了HFD引起肝脏PEPCK的高表达(图14E)。在肝脏G6PC基因的表达方面，也有类似的趋势，但不显著(图14F)。综上，YJ7能通过调节糖异生途径改善HFD饲喂小鼠的糖稳态。

序列表

<110> 浙江大学

杭州康源食品科技有限公司

<120> 一种植物乳杆菌ZJUFYJ7及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1488

<212> DNA

<213> 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum ZJUFYJ7)

<400> 1

aggcggctgg ttcctaaaag gttaccccac cgactttggg tgttacaaac tctcatggtg 60

tgacgggcgg tgtgtacaag gcccgggaac gtattcaccg cggcatgctg atccgcgatt 120

actagcgatt ccgacttcat gtaggcgagt tgcagcctac aatccgaact gagaatggct 180

ttaagagatt agcttactct cgcgagttcg caactcgttg taccatccat tgtagcacgt 240

gtgtagccca ggtcataagg ggcatgatga tttgacgtca tccccacctt cctccggttt 300

gtcaccggca gtctcaccag agtgcccaac ttaatgctgg caactgataa taagggttgc 360

gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacaac catgcaccac 420

ctgtatccat gtccccgaag ggaacgtcta atctcttaga tttgcatagt atgtcaagac 480

ctggtaaggt tcttcgcgta gcttcgaatt aaaccacatg ctccaccgct tgtgcgggcc 540

cccgtcaatt cctttgagtt tcagccttgc ggccgtactc cccaggcgga atgcttaatg 600

cgttagctgc agcactgaag ggcggaaacc ctccaacact tagcattcat cgtttacggt 660

atggactacc agggtatcta atcctgtttg ctacccatac tttcgagcct cagcgtcagt 720

tacagaccag acagccgcct tcgccactgg tgttcttcca tatatctacg catttcaccg 780

ctacacatgg agttccactg tcctcttctg cactcaagtt tcccagtttc cgatgcactt 840

cttcggttga gccgaaggct ttcacatcag acttaaaaaa ccgcctgcgc tcgctttacg 900

cccaataaat ccggacaacg cttgccacct acgtattacc gcggctgctg gcacgtagtt 960

agccgtggct ttctggttaa ataccgtcaa tacctgaaca gttactctca gatatgttct 1020

tctttaacaa cagagtttta cgagccgaaa cccttcttca ctcacgcggc gttgctccat 1080

cagactttcg tccattgtgg aagattccct actgctgcct cccgtaggag tttgggccgt 1140

gtctcagtcc caatgtggcc gattaccctc tcaggtcggc tacgtatcat tgccatggtg 1200

agccgttacc ccaccatcta gctaatacgc cgcgggacca tccaaaagtg atagccgaag 1260

ccatctttca aactcggacc atgcggtcca agttgttatg cggtattagc atctgtttcc 1320

aggtgttatc ccccgcttct gggcaggttt cccacgtgtt actcaccagt tcgccactca 1380

ctcaaatgta aatcatgatg caagcaccaa tcaataccag agttcgttcg acttgcatgt 1440

attaggcacg ccgccagcgt tcgtcctgag ccaggatcca aaactctc 1488

Claims (10)

1.一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) ZJUFYJ7，其特征在于，该植物乳杆菌的保藏号为CCTCC NO: M 2020127。

2.如权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) ZJUFYJ7在制备预防或治疗胃肠道菌群失衡的药物或调节胃肠道菌群平衡的功能食品中的应用。

3.如权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) ZJUFYJ7在制备抑制胃肠道致病菌的药物或功能食品中的应用，其特征在于，所述胃肠道致病菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌中的一种或两种。

4.如权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) ZJUFYJ7在制备抗炎药物或功能食品中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，植物乳杆菌ZJUFYJ7促进巨噬细胞分泌白细胞介素10，并减少内毒素脂多糖的产生。

6.如权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) ZJUFYJ7在制备预防或治疗糖尿病药物或调节糖尿病患者血糖的功能食品中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，植物乳杆菌ZJUFYJ7具有改善胰岛素抵抗和降低血糖的作用。

8.如权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) ZJUFYJ7在制备降低动物或人体内低密度脂蛋白胆固醇浓度的药物或功能食品中的应用。

9.如权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) ZJUFYJ7在制备提高动物或人体内胆汁酸浓度的药物或功能食品中的应用。

10.如权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) ZJUFYJ7在制备改善短链脂肪酸代谢药物或功能食品中的应用。