TW201800102A - 用於提升clock基因、arntl基因、及／或per2基因之表現的苦瓜萃取物及其應用 - Google Patents

Abstract

一種使用苦瓜萃取物於製造藥劑或食品之用途，其中該藥劑係用於治療、預防或調節與CLOCK基因、ARNTL基因、及／或PER2基因相關之疾病或生理機能，且其中該食品係用於調整生理時鐘、改善睡眠品質及幫助入睡之至少一者。

Description

用於提升CLOCK基因、ARNTL基因、及／或PER2基因之表現的苦瓜萃取物及其應用

本發明係關於苦瓜萃取物之應用，尤其是關於經烘烤之苦瓜之萃取物的應用，包括使用該萃取物於治療或預防與CLOCK 基因、ARNTL 基因、及／或PER2 基因相關之疾病、或是調節與前述基因相關之生理機能，特別是使用該萃取物於調整生理時鐘、改善睡眠品質及幫助入睡之至少一者。

晝夜節律（circadian rhythm）係由晝夜時鐘（circadian clock）所驅動之約以24小時為週期之生命活動（例如動物的攝食、軀體活動、睡眠、覺醒）的變動。當人體的晝夜節律受到擾亂，會導致人體的生理時鐘改變、睡眠品質降低、賀爾蒙分泌失調、及行動能力下降等，使工作效率降低、發生意外的機率增加，並可能引發各種疾病（例如憂鬱症）。

目前臨床上常用來調節晝夜節律以治療失眠症、憂鬱症等相關疾病的藥物有地西泮（Diazepam）及蘿拉西泮（Lorazepam），但患者在使用前述藥物後極易產生成癮性，且可能出現例如嗜睡、噁心、頭痛、嘔吐、胃腸不適、記憶力障礙、反彈性失眠（rebound insomnia）、精神恍惚、運動失調、呼吸抑制、及╱或夢遊等副作用。因此，持續開發可有效調節晝夜節律、且不易產生成癮性與副作用的藥物或方法係有相當的必需性及迫切性。

研究已知，人體的晝夜節律及睡眠週期是由CLOCK （Circadian Locomotor Output Cycles Kaput）、ARNTL （Aryl Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator Like）、及PER2 （Period Circadian Clock 2）等基因的表現來調控。因此，若能增加CLOCK 基因、ARNTL 基因、及PER2基因的表現，即可有效調控晝夜節律，有利於調整生理時鐘、改善睡眠品質及幫助入睡。

本案發明人研究發現，苦瓜萃取物具有調控CLOCK 、ARNTL 、及PER2 等基因的表現的效果，故可用於調整生理時鐘、改善睡眠品質及幫助入睡，且可用於治療或預防與前述基因相關的疾病、或調節與該等基因相關的生理機能。較佳地，該苦瓜萃取物係一經烘烤處理之苦瓜的萃取物。

本發明之一目的，在於提供一種使用苦瓜萃取物以製備藥劑之用途，其中該藥劑係用於提升以下基因之至少一者的表現：CLOCK 、ARNTL 、及PER2 。較佳地，該藥劑係用於治療或預防與前述基因相關的疾病、或用於調節與前述基因相關的生理機能。其中，該與CLOCK 基因、ARNTL 基因、及／或PER2 基因相關之疾病係以下之至少一者：癌症（包含胃癌、肺癌、及卵巢癌）、酒精性肝損傷、憂鬱症、躁鬱症、男性不育症、老化、帕金森氏症、血管疾病、代謝症候群（包含肥胖、高血壓、及糖尿病）、及古柯鹼成癮。該與CLOCK 基因、ARNTL 基因、及／或PER2 基因相關之生理機能係以下之至少一者：肝醣合成、肺病生理學（lung pathophysiology）、骨骼肌之維持與適應、多能幹細胞之維持與分化、葡萄糖恆定、葡萄糖代謝、胰島素釋放、脂肪生成、視網膜功能、類固醇合成、肝臟脂質代謝、血管新生、細胞老化過程的自噬作用（autophagy in aging）、骨體積與骨密度之維持、晝夜時鐘（circadian clock）、晝夜喜好（diurnal preference）、肝醣代謝、脂質代謝、內皮前驅細胞功能（endothelial progenitor cell function）、及氧化性損傷。較佳地，該苦瓜萃取物係一經烘烤處理之苦瓜的萃取物。

本發明之另一目的，在於提供一種使用苦瓜萃取物以製備一食品之用途，其中該食品係用於調整生理時鐘、改善睡眠品質及幫助入睡。較佳地，該苦瓜萃取物係一經烘烤處理之苦瓜的萃取物。

本發明之又一目的，在於提供一種用於提升CLOCK 基因、ARNTL 基因、及／或PER2 基因之表現的方法，其係包含對一有需要之個體投予一有效量之苦瓜萃取物。該方法係用於治療或預防與前述基因相關的疾病、調節與前述基因相關的生理機能。該方法係用於調整生理時鐘、改善睡眠品質及幫助入睡。較佳地，該苦瓜萃取物係一經烘烤處理之苦瓜的萃取物。

本發明之再一目的，在於提供一種增進苦瓜萃取物之前述效益的方法，其中，係於進行萃取之前，先對苦瓜進行一烘烤處理。較佳地，該烘烤處理係包含階梯式升溫處理。

本發明之詳細技術內容及部分具體實施態樣，將描述於以下內容中，以供本發明所屬領域具通常知識者據以明瞭本發明之特徵。

以下將描述根據本發明之部分具體實施態樣；惟，在不背離本發明精神下，本發明尚可以多種不同形式之態樣來實踐，不應將本發明保護範圍解釋為限於說明書所具體陳述者或後附申請專利範圍所界定者。

除非文中有另外說明，於本說明書中（尤其是在後述專利申請範圍中）所使用之「一」、「該」及類似用語應理解為包含單數及複數形式；所謂「治療」，不應被解釋為治療一個體直至完全恢復，而應包括將一個體之疾病進展或症狀維持在一實質上靜態之程度、增加一個體之恢復速率、改善一具體病況的嚴重性、或提高一患者之生命品質；所謂「預防」係指抑制或防止一具體病況的發作、或維持敏感個體之良好健康狀態或建立該個體對疾病的耐受性；所述「調節」係指正向調控（包括誘導、刺激、及增強）或負向調控（包括抑制、及減弱）以使個體朝向所述生理機能之正常狀態者；所謂「有效量」，係指投予至個體時，可有效地至少部分改善懷疑個體之病情的物質數量；所謂「個體」係指哺乳動物，該哺乳動物可以為人類或非人動物。

苦瓜（Momordica charantia ），又稱涼瓜、半生瓜，是一種葫蘆科植物，原產地一般在熱帶地區，於南亞、東南亞、台灣、中國大陸、與加勒比海群島等地均有廣泛的種植，在台灣則常見分布於台中、彰化、嘉義及高雄等地。

如前述，本案發明人發現苦瓜萃取物具有調控CLOCK 、ARNTL 、及PER2 等基因的表現的效果。針對前述基因，已知CLOCK 基因係與酒精性肝損傷、癌症、憂鬱症、肝醣合成、肺病生理學、男性不育症、肥胖、以及骨骼肌之維持與適應、多能幹細胞之維持與分化之治療、預防或調節為正向相關。因此，若可提升CLOCK 基因的表現，則可治療或預防該與CLOCK 基因相關的疾病、或調節該與CLOCK 基因相關的生理機能。有關CLOCK 基因與前述疾病或生理機能之關聯性，可參見例如：The Molecular Circadian Clock and Alcohol-Induced Liver Injury.Biomolecules . 5: 2504-2537 (2015)、Genetic variation of clock genes and cancer risk: a field synopsis and meta-analysis.Oncotarget . Vol. 8, (No. 14), pp: 23978-23995 (2017)、CLOCK is suggested to associate with comorbid alcohol use and depressive disorders.Journal of Circadian Rhythms . 8:1 (2010)、CLOCK Regulates Circadian Rhythms of Hepatic Glycogen Synthesis through Transcriptional Activation of Gys2.The journal of biological chemistry . Vol. 285, No. 29, pp. 22114–22121 (2010)、Circadian molecular clock in lung pathophysiology.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol . 309: L1056–L1075 (2015)、Genetic Variation in Circadian Rhythm Genes CLOCK and ARNTL as Risk Factor for Male Infertility.PLoS One . 8(3):e59220 (2013)、Altered Clock Gene Expression in Obese Visceral Adipose Tissue Is Associated with Metabolic Syndrome.PLoS One . Nov 3;9(11):e111678 (2014)、Circadian Rhythms, the Molecular Clock, and Skeletal Muscle.Curr Top Dev Biol . 96: 231–271 (2011)、及Role of circadian gene Clock during differentiation of mouse pluripotent stem cells.Protein Cell . 7(11):820–832 (2016)，該等文獻之全文併於此處以供參考。

此外，已知ARNTL 基因係與肥胖、脂肪生成、老化、躁鬱症、癌症、葡萄糖恆定、葡萄糖代謝、高血壓、胰島素釋放、男性不育症、帕金森氏症、視網膜功能、類固醇合成、第二型糖尿病、及血管疾病之治療、預防或調節為正向相關。因此，若可提升ARNTL 基因的表現，則可治療或預防該與ARNTL 基因相關的疾病、或調節該與ARNTL 基因相關的生理機能。有關ARNTL 基因與前述疾病或生理機能之關聯性，可參見例如：Obesity in mice with adipocyte-specific deletion of clock component Arntl.Nat Med . 18(12): 1768–1777 (2012)、Brain and muscle Arnt-like protein-1 (BMAL1), a component of the molecular clock, regulates adipogenesis.Proc Natl Acad Sci U S A . 102(34):12071-6 (2005)、Early aging and age-related pathologies in mice deficient in BMAL1, the core component of the circadian clock.Genes Dev . 20(14):1868-73 (2006)、Suggestive evidence for association of the circadian genes PERIOD3 and ARNTL with bipolar disorder.Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet . 141B(3): 234–241 (2006)、A Large Scale shRNA Barcode Screen Identifies the Circadian Clock Component ARNTL as Putative Regulator of the p53 Tumor Suppressor Pathway.PLoS One . 4(3):e4798 (2009)、BMAL1 and CLOCK, Two Essential Components of the Circadian Clock, Are Involved in Glucose Homeostasis.PLoS Biol. Nov . 2(11):e377 (2004)、Global Loss of Bmal1 Expression Alters Adipose Tissue Hormones, Gene Expression and Glucose Metabolism.PLoS One . Jun 4;8(6):e65255 (2013)、Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like (BMAL1) is associated with susceptibility to hypertension and type 2 diabetes.Proc Natl Acad Sci U S A . 104(36):14412-7 (2007)、Aryl Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator/Hypoxiainducible Factor-1β Plays a Critical Role in Maintaining Glucose-stimulated Anaplerosis and Insulin Release from Pancreatic β-Cells.J Biol Chem . 286(2):1014-24 (2011)、Genetic variation in circadian rhythm genes CLOCK and ARNTL as risk factor for male infertility.PLoS One . 8(3):e59220 (2013)、Association of ARNTL and PER1 genes with Parkinson's disease: a case-control study of Han Chinese.Sci Rep . 5:15891 (2015)、Intrinsic circadian clock of the mammalian retina: importance for retinal processing of visual information.Cell . 130(4):730-41 (2007)、Impaired steroidogenesis and implantation failure in Bmal1-/- mice.Endocrinology . Apr;150(4):1879-85 (2009)、Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like (BMAL1) is associated with susceptibility to hypertension and type 2 diabetes.Proc Natl Acad Sci U S A . Sep 4;104(36):14412-7 (2007)、及Vascular disease in mice with a dysfunctional circadian clock.Circulation . 119(11):1510-7 (2009)，該等文獻之全文併於此處以供參考。

再者，已知PER2 基因則與肝臟脂質代謝、代謝症候群（metabolic syndrome）、血管新生、細胞老化過程的自噬作用、骨體積與骨密度、老化、晝夜時鐘、古柯鹼成癮、糖尿病、晝夜喜好、內皮前驅細胞功能、胃癌、肝醣代謝、肺癌、卵巢癌、及氧化損傷之治療、預防或調節為正向相關。因此，若可提升PER2 基因的表現，則可治療或預防該與PER2 基因相關的疾病、或調節該與PER2 基因相關的生理機能。有關PER2 基因與前述疾病或生理機能之關聯性，可參見例如：KSRP is critical in governing hepatic lipid metabolism through controllingPer2 expression.J Lipid Res . 56(2):227-40. (2015)、NPAS2 and PER2 are linked to risk factors of the metabolic syndrome.J Circadian Rhythms . 26;7:5. (2009)、Period 2 is essential to maintain early endothelial progenitor cell function in vitro and angiogenesis after myocardial infarction in mice.J Cell Mol Med . 18(5):907-18 (2014)、Crosstalk of clock gene expression and autophagy in aging.Aging (Albany NY) . 8(9):1876-1895 (2016)、Decreased Bone Volume and Bone Mineral Density in the Tibial Trabecular Bone Is Associated with Per2 Gene by 405 nm Laser Stimulation.Int J Mol Sci . 16(11):27401-10 (2015)、Negative reciprocal regulation between Sirt1 and Per2 modulates the circadian clock and aging.Sci Rep . 6:28633. (2016)、Repeat variation in the human PER2 gene as a new genetic marker associated with cocaine addiction and brain dopamine D2 receptor availability.Transl Psychiatry . 2:e86. (2012)、Per2 mutation recapitulates the vascular phenotype of diabetes in the retina and bone marrow.Diabetes . 62(1):273-82. (2013)、PER2 Variation is Associated with Diurnal Preference in a Korean Young Population.Behav Genet . 41(2):273-7. (2011)、Period 2 is essential to maintain early endothelial progenitor cell function in vitro and angiogenesis after myocardial infarction in mice.J Cell Mol Med . 18(5):907-18. (2014)、Prognostic relevance of Period1 (Per1) and Period2 (Per2) expression in human gastric cancer.Int J Clin Exp Pathol . 15;7(2):619-30. (2014)、PER2 promotes glucose storage to liver glycogen during feeding and acute fasting by inducing Gys2 PTG and G L expression.Mol Metab . 2(3):292-305. (2013)、PER2 controls lipid metabolism by direct regulation of PPARγ.Cell Metab . 12(5):509-20. (2010)、Aberrant expression of Per1, Per2 and Per3 and their prognostic relevance in non-small cell lung cancer.Int J Clin Exp Pathol . 7(11):7863-71 (2014)、Effects of Per2 overexpression on growth inhibition and metastasis, and on MTA1, nm23-H1 and the autophagy-associated PI3K/PKB signaling pathway in nude mice xenograft models of ovarian cancer.Mol Med Rep . 13(6):4561-8. (2016)、The Mammalian circadian clock gene per2 modulates cell death in response to oxidative stress.Front Neurol . 5:289. (2015)、及Loss of corepressor PER2 under hypoxia up-regulates OCT1-mediated EMT gene expression and enhances tumor malignancy.Proc Natl Acad Sci U S A . 110(30):12331-6 (2013)，該等文獻之全文併於此處以供參考。

因此，本發明係提供一種使用苦瓜萃取物於製備一藥劑的用途，其中該藥劑係用於提升以下基因之至少一者的表現：CLOCK 、ARNTL 、及PER2 。較佳地，該藥劑係用於治療或預防與前述基因相關的疾病、或用於調節與前述基因相關的生理機能。

其中，該與CLOCK 基因、ARNTL 基因、及／或PER2 基因相關之疾病係以下之至少一者：癌症（包含胃癌、肺癌、及卵巢癌）、酒精性肝損傷、憂鬱症、躁鬱症、男性不育症、老化、帕金森氏症、血管疾病、代謝症候群（包含肥胖、高血壓、及糖尿病）、及古柯鹼成癮。

該與CLOCK 基因、ARNTL 基因、及／或PER2 基因相關之生理機能係以下之至少一者：肝醣合成、肺病生理學、骨骼肌之維持與適應、多能幹細胞之維持與分化、葡萄糖恆定、葡萄糖代謝、胰島素釋放、脂肪生成、視網膜功能、類固醇合成、肝臟脂質代謝、血管新生、細胞老化過程的自噬作用、骨體積與骨密度之維持、晝夜時鐘、晝夜喜好、肝醣代謝、脂質代謝、內皮前驅細胞功能、及氧化性損傷。

此外，本案發明人發現，於根據本發明之應用中，若所採用之苦瓜萃取物係一經烘烤處理之苦瓜的萃取物（即，於進行萃取操作之前，先對苦瓜進行一烘烤處理），則可進一步增進所欲之提升CLOCK 基因、ARNTL 基因、及／或PER2 基因表現的效益。因此，較佳地，係於前述用途中，採用經烘烤處理之苦瓜的萃取物。

因此，本發明亦提供一種增進苦瓜萃取物效益之方法，其中，係於進行萃取操作之前，先對苦瓜進行一烘烤處理。較佳地，該烘烤處理係一高溫烘烤處理，例如，於80至200℃之溫度下進行之烘烤處理。更佳地，該烘烤處理係包括階梯式升溫處理。例如，包含一於溫度T1進行之第一階段烘烤以及一於第一階段烘烤之後、在溫度T2進行之第二階段烘烤之至少二階段的階梯式升溫處理，其中，T1 ＜ T2；較佳地，T1 ＜ T2，且 80℃≦T1＜200℃，80℃＜T2≦200℃；更佳地，T1 ＜ T2，且80℃≦T1≦135℃，135℃≦T2≦200℃。

於根據本發明之提升苦瓜萃取物效益的方法中，可視需要調整烘烤的時間，只要可以降低苦瓜之含水量即可。於本發明之部分具體實施態樣中，係採用二階段的階梯式升溫處理，於90至120℃之環境下對苦瓜進行第一階段烘烤，歷時2至24小時，接著，於150至180℃之環境下對苦瓜進行第二階段烘烤，歷時20至100分鐘。

於根據本發明之方法與用途中，可採用任何合宜之萃取方式以進行苦瓜之萃取，提供本發明所需之苦瓜萃取物。舉例言之，可直接以水進行萃取，其後再經例如過濾等固液分離手段留下萃取液，再視需要經由濃縮及╱或乾燥等處理以得到液態或固態之苦瓜萃取物。

根據本發明所提供之藥劑係可呈現任何合宜的形式，並無特殊限制，端視所欲之用途而呈對應之合宜劑型。舉例言之，但不以此為限，該藥物可以適於口服或非經口服（例如：經皮膚投予、經鼻腔投予、皮下注射、靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下植入、或組織間植入）之投藥方式施用至有需要之個體上。其中，視所使用之形式及用途而定，可選用合宜之載劑以提供該載劑，只要該載劑對本發明之苦瓜萃取物之所欲效益沒有不利的影響即可。舉例言之，該載劑可為例如：賦形劑、稀釋劑、輔助劑、安定劑、吸收延遲劑、崩散劑、增溶劑、乳化劑、抗氧化劑、黏合劑、結合劑、增黏劑、分散劑、懸浮化劑、潤滑劑、吸濕劑等，但不以此為限。

以適於口服投藥之劑型為例，該載劑的例子包括，但不限於，水、食鹽水、葡萄糖（dextrose）、甘油、乙醇或其類似物、纖維素、澱粉、糖膨潤土（sugar bentonite）、及前述之組合。可採用任何合宜的方法，以適於口服投藥的劑型提供該藥劑，例如固體形式之錠劑、丸劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑等、或是液體形式之口服液、糖漿劑、醑劑（spirit）、酏劑（elixir）、酊劑等，但不以此為限。

有關適於皮下、靜脈內、肌肉、或腹腔注射之針劑或點滴劑，則可於根據本發明所提供之藥劑中含有一或多種例如等張溶液、鹽類緩衝液（如磷酸鹽緩衝液或檸檬酸鹽緩衝液）、增溶劑、乳化劑、5%糖溶液、以及其他載劑等成分，以靜脈輸注液、乳劑靜脈輸注液、乾粉注射劑、懸液注射劑、或乾粉懸液注射劑等劑型提供該藥劑。或者，將該藥劑製備成一注射前固體，以可溶於其他溶液或懸浮液中之劑型、或可乳化之劑型提供該注射前固體，並於投予至有需要之個體之前，將該注射前固體溶於其他溶液或懸浮液中或將其乳化，提供所欲之注射劑。此外，適於經鼻腔或經皮膚投予之外用劑型，則例如塗抹劑（例如乳液、乳霜、凝膠、分散膏、軟膏）、噴劑、貼劑、或溶液（例如洗液、懸浮液）。

於根據本發明應用所提供之藥劑中，可視實際應用需求，調整藥劑中之苦瓜萃取物的含量比例。

視需要地，可於根據本發明所提供之藥劑中另含有合宜用量之添加劑，例如可提高該藥劑於服用時的口適感及視覺感受之調味劑、調色劑、著色劑等，以及可改善該藥劑的穩定性及儲存性之緩衝劑、保存劑、防腐劑、抗菌劑、抗真菌劑等。此外，該藥劑可視需要另含一或多種其他活性成分，或者與含該一或多種其他活性成分之藥物併用，以進一步加強該藥劑之功效或增加製劑配方的運用靈活性與調配度，只要該其他活性成分對苦瓜萃取物之所欲效益沒有不利的影響即可。

根據本發明所提供之藥劑可以一日一次、一日多次、或數日一次等不同投藥頻率施用，端視投予個體之需求、年齡、體重、及健康況狀而異。

如前述，本案發明人發現苦瓜萃取物具有調控CLOCK 、ARNTL 、及PER2 等基因的表現的效果，故可用於調整生理時鐘、改善睡眠品質及幫助入睡。因此，本發明亦提供一種使用經苦瓜萃取物於製造一食品之用途，其中該食品係用於調整生理時鐘、改善睡眠品質及幫助入睡之至少一者。

根據本發明所提供之食品可以是保健食品、營養補充食品或特殊營養食品，且可以製成例如乳製品、肉類加工品、麵包類、麵食品、餅乾、口含錠、膠囊、果汁類、茶類、運動飲料、營養飲料等產品，但不以此為限。較佳地，根據本發明之應用的食品係以保健食品的型式提供。

根據本發明所提供之保健食品、營養補充食品、及特殊營養食品係可以一日一次、一日多次、或數日一次等不同頻率食用，端視投予個體之年齡、體重、及健康狀況而異。亦可針對特定族群調整根據本發明所提供之保健食品、營養補充食品及特殊營養食品中苦瓜萃取物的含量，較佳為調整至每日應服用的量。

可於本發明保健食品、營養補充食品及／或特殊營養食品之外包裝標示建議使用量、特定族群（例如失眠症、生理時鐘失調等）的使用標準及條件、或與其他食品或醫藥共同服用的建議事項，以利使用者在無醫師、藥師或相關執事人員指導下可在家自行服用而無安全疑慮。於根據本發明所提供之食品中，有關該苦瓜萃取物之態樣、適用劑量、以及相關之應用，均如上述之說明。

本發明亦提供一種用於提升CLOCK 基因、ARNTL 基因、及／或PER2 基因之表現的方法，其係包含對一有需要之個體投予一有效量之苦瓜萃取物。有關該苦瓜萃取物之態樣、投予途徑、投予形式、施用頻率、以及相關之應用，均如上述之說明。

茲以下列實施例進一步例示說明本發明。其中該等實施例僅提供作為說明，而非用以限制本發明之保護範圍。本發明保護範圍係如後附申請專利範圍所示。

實施例

[ 製備實施例 ]

A. 未經烘烤苦瓜萃取物之製備

將苦瓜清洗後，以約1：5（苦瓜：水）之重量比將苦瓜浸泡於水中，並置於80℃下加熱進行萃取（歷時30分鐘），以獲得一粗萃取液。接著，以200網目之篩網過濾該粗萃取液，獲得一萃取液。最後，將萃取液濃縮四倍，以提供一萃取物（下稱「未經烘烤苦瓜萃取物」）。

B. 經烘烤苦瓜萃取物之製備

將苦瓜清洗後分為五組，並分別以下表1之條件進行烘烤（儀器：OV-80烘箱，購自Firstek公司）：

表1

接著，以[製備實施例A]之萃取、過濾、濃縮操作步驟對上述各組經烘烤之苦瓜進行處理，以提供萃取物（下稱「經烘烤苦瓜萃取物」）。

C. 細胞之處理

將HepG2細胞（由美國典型培養物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）提供；編號ATCC^® HB-8065）培養於含有10%胎牛血清（購自Gibco公司）之杜氏改良Eagle培養基（DMEM，購自Gibco公司）中24小時後，供後續實驗使用。

實施例 1 ：苦瓜萃取物對 CLOCK 、 ARNTL 及 PER2 基因表現量之影響

（ 1-1 ）未經烘烤苦瓜萃取物之效益

取[製備實施例C]所獲得之HepG2細胞，將其分為四組，並於5%CO₂ 、37°C之條件下進行以下處理： (A) 「控制組」：將細胞培養於含有10%胎牛血清之DMEM培養基中（即，不含苦瓜萃取物的培養液）中，歷時48小時； (B) 「6小時組」：如「控制組」之操作，但於培養24小時之後，加入[製備實施例A]提供之未經烘烤苦瓜萃取物，使其於培養液中的最終濃度為2毫克／毫升，繼續培養6小時； (C) 「24小時組」：如「控制組」之操作，但於培養24小時之後，加入[製備實施例A]提供之未經烘烤苦瓜萃取物，使其於培養液中的最終濃度為2毫克／毫升，繼續培養24小時；以及 (D) 「48小時組」：於含有10%胎牛血清之DMEM培養基中加入[製備實施例A]提供之未經烘烤苦瓜萃取物，使其於培養液中的最終濃度為2毫克／毫升，以進行培養，歷時48小時。

其後，收集上述各組細胞，以RNA Lysis buffer（購自Geneaid公司）進行RNA萃取，再以SuperScript™ Reverse Transcriptase kit（購自Invitrogen公司）將RNA轉錄為cDNA。接著，以ABI StepOnePlus™系統（購自Applied Biosystems）對前述cDNA進行即時定量聚合酶鏈鎖反應（Q-PCR），以測定各組細胞CLOCK 、PER2 、ARNTL 、RPLP0 基因之表現量，並以RPLP0 基因的表現量為基準作為參考基因標準化其他基因表現量。最後，再以控制組的基因表現量為基準以標準化各組之基因表現量。結果示於第1圖。

由第1圖可知，相較於控制組細胞（基因表現量設定為1倍），48小時組細胞之CLOCK 基因表現量為控制組之1.35倍，ARNTL 基因表現量為控制組之4.36倍，PER2基因表現量則為控制組之2.83倍。前述結果顯示，苦瓜萃取物可顯助提升肝細胞CLOCK 、ARNTL 及PER2 基因之表現，故可用於調節人體生理時鐘及晝夜節律。

（ 1-2 ）經烘烤苦瓜萃取物之效益

取[製備實施例C]所獲得之HepG2細胞，將其分為六大組，並於5%CO₂ 、37°C之條件下進行以下處理： (A) 「未烘烤組」：進一步將細胞分為三小組，分別於含有10%胎牛血清之DMEM培養基中培養24小時之後，加入[製備實施例A]提供之未經烘烤苦瓜萃取物，使其於培養液中的最終濃度為2毫克／毫升，分別繼續培養6小時、24小時及48小時； (B) 「烘烤條件1組」：如「未烘烤組」之操作，但以[製備實施例B]提供之第1組經烘烤苦瓜萃取物取代[製備實施例A]提供之未經烘烤苦瓜萃取物； (C) 「烘烤條件2組」：如「未烘烤組」之操作，但以[製備實施例B]提供之第2組經烘烤苦瓜萃取物取代[製備實施例A]提供之未經烘烤苦瓜萃取物； (D) 「烘烤條件3組」：如「未烘烤組」之操作，但以[製備實施例B]提供之第3組經烘烤苦瓜萃取物取代[製備實施例A]提供之未經烘烤苦瓜萃取物； (E) 「烘烤條件4組」：如「未烘烤組」之操作，但以[製備實施例B]提供之第4組經烘烤苦瓜萃取物取代[製備實施例A]提供之未經烘烤苦瓜萃取物；以及 (F) 「烘烤條件5組」：如「未烘烤組」之操作，但以[製備實施例B]提供之第5組經烘烤苦瓜萃取物取代[製備實施例A]提供之未經烘烤苦瓜萃取物。

收集上述各組細胞，依序進行（1-1）所述之RNA萃取、cDNA製備、以及即時定量聚合酶鏈鎖反應（Q-PCR），以測定各組細胞CLOCK 、PER2 、ARNTL 之表現量。結果示於第2圖至第4圖，其中亦顯示，以控制組（即，未經苦瓜萃取物處理之細胞）的基因表現量為基準進行標準化的結果。

由第2圖至第4圖可知，未經烘烤苦瓜萃取物或經烘烤苦瓜萃取物對肝細胞之CLOCK 、ARNTL 及PER2 等基因之調控，皆以48小時之處理時間效果為最佳。

此外，CLOCK 、ARNTL 及PER2 等基因之表現量係隨苦瓜之烘烤條件不同而有不同趨勢之變化。如第2圖所示，相較於未烘烤組，烘烤條件1組至烘烤條件5組之細胞的CLOCK 基因表現量皆顯著提升。以處理48小時之結果為例，未烘烤組細胞之CLOCK 表現量為控制組的1.35倍，烘烤條件1組至烘烤條件5組之細胞的CLOCK 基因表現量則依序為控制組的2.12、2.26、1.50、1.60及2.07倍。

如第3圖所示，以處理48小時之結果為例，未烘烤組細胞之ARNTL 基因表現為控制組的4.36倍，烘烤條件1組至烘烤條件5組之細胞的ARNTL 基因表現量則依序為控制組的7.24、8.41、6.61、6.01及8.19倍。

如第4圖所示，以處理48小時之結果為例，未烘烤組細胞之PER2 基因表現為控制組的2.83倍，烘烤條件1組至烘烤條件5組之細胞的PER2 基因表現則依序為控制組的3.14、3.62、2.24、2.06及2.27倍。

上述結果顯示，將較於未經烘烤苦瓜萃取物，經烘烤苦瓜萃取物於提升肝細胞中CLOCK 、ARNTL 及PER2 等基因表現的效果更為優異，更可用於治療或預防與CLOCK 、ARNTL 及PER2 等基因相關之疾病、或是調節與前述基因相關之生理機能，尤其是用於調整生理時鐘、改善睡眠品質及幫助入睡。

第1圖所示為不同組別HepG2細胞之CLOCK 、ARNTL 、及PER2 基因的表現量（相對於控制組之表現量），其中，「控制組」係於不含苦瓜萃取物的培養液中培養48小時，「6小時組」、「24小時組」係比照「控制組」之操作，但於培養24小時之後，在培養液中添加未經烘烤苦瓜萃取物，以分別繼續培養6小時及24小時，「48小時組」則於含有未經烘烤苦瓜萃取物的培養液中培養48小時；

第2圖所示為不同組別HepG2細胞之CLOCK 基因的相對表現量（相對於控制組之表現量），其中，「未經烘烤組」係於培養過程中在培養液中添加未經烘烤苦瓜萃取物以續行培養，「烘烤條件1組」至「烘烤條件5組」則係於培養過程中在培養液中添加經烘烤苦瓜萃取物以續行培養；

第3圖所示為上述「未經烘烤組」、及「烘烤條件1組」至「烘烤條件5組」之HepG2細胞的ARNTL 基因的表現量（相對於控制組之表現量）；以及

第4圖所示為上述「未經烘烤組」、及「烘烤條件1組」至「烘烤條件5組」之HepG2細胞的PER2 基因的表現量（相對於控制組之表現量）。

Claims (13)

1. 一種使用苦瓜（Momordica charantia ）萃取物於製造一藥劑之用途，其中該藥劑係用於提升以下基因之至少一者表現：CLOCK （Circadian Locomotor Output Cycles Kaput）、ARNTL （Aryl Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator Like）、及PER2 （Period Circadian Clock 2）。
2. 如請求項1之用途，其中該藥劑係用於治療或預防以下之至少一者：癌症、酒精性肝損傷、憂鬱症、躁鬱症、男性不育症、老化、帕金森氏症、血管疾病、代謝症候群、及古柯鹼成癮。
3. 如請求項2之用途，其中該癌症係包含胃癌、肺癌、及卵巢癌。
4. 如請求項2之用途，其中該代謝症候群係包含肥胖、高血壓、及糖尿病。
5. 如請求項1之用途，其中該藥劑係用於調節以下至少一者：肝醣合成、肺病生理學（lung pathophysiology）、骨骼肌之維持與適應、多能幹細胞之維持與分化、葡萄糖恆定、葡萄糖代謝、胰島素釋放、脂肪生成、視網膜功能、類固醇合成、肝臟脂質代謝、血管新生、細胞老化過程的自噬作用（autophagy in aging）、骨體積與骨密度之維持、晝夜時鐘（circadian clock）、晝夜喜好（diurnal preference）、肝醣代謝、脂質代謝、內皮前驅細胞功能（endothelial progenitor cell function）、及氧化性損傷。
6. 一種使用苦瓜萃取物於製造一食品之用途，其中該食品係用於以下之至少一者：調整生理時鐘、改善睡眠品質及幫助入睡。
7. 如請求項6之用途，其中該苦瓜萃取物係一經烘烤處理之苦瓜的萃取物。
8. 如請求項6之用途，其中該食品係保健食品、特殊營養品或營養補充食品。
9. 一種增進苦瓜萃取物於提升CLOCK 基因、ARNTL 基因、及／或PER2 基因表現之效益的方法，其係包含於進行萃取之前，先對苦瓜進行一烘烤處理。
10. 如請求項9之方法，其中該烘烤處理係於80至200℃之溫度進行。
11. 如請求項9之方法，其中該烘烤處理係包括一階梯式升溫處理。
12. 如請求項11之方法，其中該階梯式升溫處理係包括一於T1進行之第一階段烘烤及一於第一階段之後、在T2進行之第二階段烘烤，其中，T1＜T2，80℃≦T1＜200℃，80℃＜T2≦200℃。
13. 如請求項12之方法，其中，80℃≦T1≦135℃，135℃≦T2≦200℃。