BRPI0410820B1

BRPI0410820B1 - uso de pelo menos um polipeptídeo isolado, método para a produção de um polipeptídeo, aditivo para ração para animal, e, composição de ração para animal.

Info

Publication number: BRPI0410820B1
Application number: BRPI0410820A
Authority: BR
Inventors: Carsten Sjoholm; Peter Rahbek Ostergaard; Seren Flensted Lassen
Original assignee: Novozymes As
Priority date: 2003-06-19
Filing date: 2004-06-21
Publication date: 2016-04-26
Also published as: ES2346654T3; AU2004247802B2; ATE469214T1; CN102505007B; DK1639106T3; DE602004027376D1; CN1809634A; JP4880453B2; WO2004111221A1; CA2526806C; JP2006527584A; AU2004247802A1; EP1639106A1; CA2526806A1; PL1639106T3; CN102505007A; BRPI0410820A; EP1639106B1

Abstract

"polipeptídeo isolado, seqüência de ácido nucleico isolado, construção de ácido nucleico, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira recombinante, método para a produção de um polipeptídeo, planta transgênica, ou parte da planta, animal não humano, transgênico, ou produtos, ou elementos destes, uso de pelo menos um polipeptídeo, aditivo para ração para animal, composição de ração para animal, e, microorganismo". as proteases de atividade específica alta homólogas às proteases derivadas de nocardiopsis, e a produção destas pelo tipo selvagem, e em células hospedeiras recombinantes incluindo as plantas transgênicas e animais transgênicos não humanos. as proteases são eficazes na ração para animal, e em detergentes. os aspectos estruturais característicos de relevância para a atividade específica destas proteases da família de peptidase s2a ou s1e são divulgados.

Description

“USO DE PELO MENOS UM POLIPEPTÍDEO ISOLADO, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM POLIPEPTÍDEO, ADITIVO PARA RAÇÃO PARA ANIMAL, E, COMPOSIÇÃO DE RAÇÃO PARA ANIMAL.” CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito a um polipeptídeo isolado tendo atividade de protease e sendo homólogo às proteases de Nocardiopsis, assim como as seqüências de ácido nucleico isolado que o codificam. A invenção além disso diz respeito às construções de ácido nucleico, vetores, e células hospedeiras, incluindo plantas transgênicas e animais não humanos, que compreendem estas seqüências de ácido nucleico, assim como os métodos para a produção e uso da protease, em particular dentro da ração para animal.

A protease da invenção tem uma atividade específica alta. Os aspectos estruturais característicos de relevância para a atividade específica alta das proteases da família de peptidase S2A ou S1E são divulgados. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

As proteases derivadas de Nocardiopsis sp. NRRL 18262 e Nocardiopsis dassonvillei NRRL 18133 são divulgadas na WO 88/03947. As seqüências de DNA e aminoácido da protease derivada de Nocardiopsis sp. NRRL 18262 são apresentadas no pedido DK N° 1996 00013. A WO 01/58276 divulga o uso na ração para animal de proteases estáveis em ácido relacionadas à protease derivada de Nocardiopsis sp. NRRL 18262, assim como uma protease derivada de Nocardiopsis alba DSM 14010. Estas proteases, entretanto, têm uma atividade específica baixa. A JP 2-255081-A divulga uma protease derivada da cepa de Nocardiopsis sp. OPC-210 (FERM P-10508), entretanto sem informação de seqüência. A cepa não está mais disponível, visto que o depósito foi retirado. A DD 200432|8 divulga uma preparação proteolítica derivada da cepa de Nocardiopsis dassonvillei ZIMET 43647, entretanto sem informação de seqüência. A cepa parece não estar mais disponível. A JP 2003284571-A, publicada depois da primeira data de arquivamento da presente invenção, divulga a seqüência de aminoácido e a seqüência de DNA correspondente de uma protease derivada de Nocardiopsis sp. TOA-1 (FERM P-18676). A seqüência foi introduzida em GENESEQP com o N2 ADF43564. A protease da técnica anterior mais homóloga que não é uma protease de Nocardiopsis é Sapll_Streptomyces_sp_sptrembl_q55353, a parte madura da qual tem uma identidade de aminoácido de 61,5 %, e 63,5 %, respectivamente, às partes maduras das SEQ ID NOs: 2 e 6, respectivamente. As identidades de DNA correspondentes são de 70,3 %, e 72,7 %, para as SEQ ID NOs: 1 e 5, respectivamente. A parte madura de uma protease de Streptomyces relacionada, viz. Sapll_Streptomyces_sp sptrembl_q55352 tem uma identidade percentual levemente mais alta para a parte madura da SEQ ID NO: 1, viz. 70,8 %.

É um objetivo da presente invenção fornecer proteases de uma atividade específica alta homóloga às proteases de Nocardiopsis, em particular com um potencial para o uso na ração para animal e/ou detergentes. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

As proteases de atividade específica alta foram isoladas e caracterizadas, viz. uma protease derivada de Nocardiopsis alba DSM 15647 (ver as SEQ ID NOs: 1 e 2), e uma protease derivada de Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei DSM 43235 (ver as SEQ ID NOs: 5 e 6).

Em um primeiro aspecto, a invenção diz respeito a um polipeptídeo isolado tendo atividade de protease, e tendo uma atividade específica em hemoglobina no pH 7,5 e a 25 °C de pelo menos 39 AU/g, em que o polipeptídeo é selecionado do grupo que consiste de: (a) um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido que tem um grau de identidade para os aminoácidos de 1 a 188 da SEQ ID NO: 2, e/ou para os aminoácidos 1 a 192 da SEQ ID NO: 6, de pelo menos 65 %; (b) um polipeptídeo que é codificado por uma seqüência de ácido nucleico que hibridiza sob condições de estringência baixa com os nucleotídeos 502 a 1065 da SEQ ID NO: 1, e/ou nucleotídeos 568 a 1143 da SEQ ID NO: 5; (c) um polipeptídeo que é codificado por uma seqüência de ácido nucleico que tem um grau de identidade para os nucleotídeos 502 a 1065 da SEQ ID NO: 1, e/ou nucleotídeos 568 a 1143 da SEQ ID NO: 5, de pelo menos 74 %. A invenção também diz respeito às seqüências de ácido nucleico isolado que codificam tais proteases; às construções de ácido nucleico, vetores, e células hospedeiras compreendendo as seqüências de ácido nucleico; assim como aos métodos para a produção e uso das proteases, em particular dentro da ração para animal.

Em um segundo aspecto, a invenção diz respeito a: A. Um polipeptídeo isolado da família de peptidase S2A e/ou família de peptidase S1E tendo atividade de protease, e tendo uma seqüência de amino compreendendo pelo menos um dos aminoácidos seguintes na posição indicada: 25S, 38T, 42P, 44S, 49Q, 54R, 62S, 89S, 91S, 92S, 95A, 99Q, 1001, 114V, 120T, 125Q, 129Q, 131L, 135N, 147F, 151S, 165S, 166F, 171Y, 176N, 179L, 180S, 184L, e/ou 185T; preferivelmente 25S, 38T, 42P, 44S, 54R, 62S, 125Q, 131L, 165S, 171Y, 176N, 179L, 180S, 184L, e/ou 185T; mais preferivelmente junto compelo menos um de 24A, 5IV, 53E, 86A, 87T, 961, e/ou 186L; e/ou junto com (H35 + D61 + S143); em que cada posição corresponde a uma posição da SEQ ID NO: 2. B. O polipeptídeo de A que compreende pelo menos um dos aminoácidos seguintes na posição indicada: 38T, 92S, 120T, 125Q, 131L, 135N, 147F, 151S, 165S, e/ou 171Y. C. O polipeptídeo de A que compreende pelo menos um dos aminoácidos seguintes na posição indicada: 25S, 42P, 44S, 49Q, 54R, 62S, 89S, 91S, 95A, 99Q, 1001, 114V, 129Q, 166F, 176N, 179L, 180S, 184L, e/ou 185T. D. O polipeptídeo de qualquer um de A, B, ou C, que tenha uma Tm de pelo menos 78°C como medido por DSC em 10 mM de fosfato de sódio, 50 mM de cloreto de sódio, pH 7,0; uma atividade relativa no pH 9 e 80°C de pelo menos 0,40; e/ou uma atividade específica em hemoglobina no pH 7,5 e 25°C de pelo menos 39 AU/g. E. O polipeptídeo de qualquer um de A, B, C, ou D, que tenha uma porcentagem de identidade para os aminoácidos -167 a 188, preferivelmente 1 a 188, da SEQ ID NO: 2, e/ou para os aminoácidos -160 a 192, preferivelmente 1 a 192, da SEQ ID NO: 6 de pelo menos 65 %, mais preferivelmente uma porcentagem de identidade para os aminoácidos 1 a 188, ou 167 a 188, da SEQ ID NO: 2 de pelo menos 50 %. F. O polipeptídeo de qualquer um de A, B, C, D, ou E, que é i) uma protease bacteriana; ii) uma protease do filo Actinobacieria; iii) da classe Actinobacteria; iv) da ordem Actinomycetales v) da família Nocardiopsaceae; vi) do gênero Nocardiopsis; e/ou uma protease derivada de vii) espécie Nocardíopsis tal como Nocardiopsis alba, Nocardiopsis antarctica, Nocardiopsis prasina, Nocardiopsis composta, Nocardiopsis exhalans, Nocardiopsis halophila, Nocardiopsis halotolerans, Nocardiopsis kunsanensis, Nocardiopsis listeri, Nocardiopsis lucentensis, Nocardiopsis metallicus, Nocardiopsis synnemataformans, Nocardiopsis trehalosi, Nocardiopsis tropica, Nocardiopsis umidischolae, Nocardiopsis xinjiangensis, ou Nocardiopsis dassonvillei; e, opcionalmente, também da Nocardiopsis alkaliphila, por exemplo, uma protease derivada de Nocardiopsis alba, por exemplo Nocardiopsis alba DSM 15647, ou uma protease derivada de Nocardiopsis dassonvillei, por exemplo Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei DSM 43235, tal como um polipeptídeo com a seqüência de aminoácido dos aminoácidos -167 a 188, preferivelmente 1 a 188, da SEQ ID NO: 2, e/ou aminoácidos -160 a 192, preferivelmente 1 a 192, da SEQ ID NO: 6. G. Uma seqüência de ácido nucleico isolado compreendendo uma seqüência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de qualquer um de A, B, C, D, E, ou F. H. Uma construção de ácido nucleico compreendendo a seqüência de ácido nucleico de G operavelmente ligada a uma ou mais seqüências de controle que conduzem a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão adequado. I. Um vetor de expressão recombinante compreendendo a construção de ácido nucleico de H. J. Uma célula hospedeira recombinante compreendendo a construção de ácido nucleico de H ou do vetor de I. K. Um método para a produção de um polipeptídeo de qualquer um de A, B, C, D, E, ou F, o método compreendendo: (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante de K para produzir um sobrenadante compreendendo o polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo. L. Uma planta transgênica, ou parte da planta, capaz de expressar o polipeptídeo de qualquer um de A, B, C, D, E, ou F. M. Um animal não humano, transgênico, ou produtos, ou elementos destes, sendo capazes de expressar o polipeptídeo de qualquer um de A, B, C, D, E, ou F. N. Uso de pelo menos um polipeptídeo como definido em qualquer um de A, B, C, D, E, ou F, (i) na ração para animal; (ii) na preparação de uma composição para o uso na ração para animal; (iii) para melhorar o valor nutricional de uma ração para animal; (iv) para aumentar a proteína digerível e/ou solúvel em dietas de animais; (v) para aumentar o grau de hidrólise de proteínas em dietas de animais; e/ou (vi) para o tratamento de proteínas. O. Um aditivo para ração para animal compreendendo pelo menos um polipeptídeo como definido em qualquer um de A, B, C, D, E, ou F; e (a) pelo menos uma vitamina solúvel em gordura, e/ou (b) pelo menos uma vitamina solúvel em água, e/ou (c) pelo menos um mineral de traço. P. Uma composição de ração para animal tendo um teor de proteína bruto de 50 a 800 g/kg e compreendendo pelo menos um polipeptídeo como definido em qualquer um de A, B, C, D, E, ou F, ou pelo menos um aditivo de alimentação de O. Q. Uma composição compreendendo pelo menos um polipeptídeo como definido em qualquer um de A, B, C, D, E, ou F, junto com pelo menos uma outra enzima selecionada dentre a alfa-amilase (EC 3.2.1.1), fitase (EC 3.1.3.8 ou 3.1.3.26); xilanase (EC 3.2.1.8); galactanase (EC 3.2.1.89); alfa-galactosidase (EC 3.2.1.22); protease (EC 3.4.-.-), fosfolipase Al (EC 3.1.1.32); fosfolipase A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipase (EC 3.1.1.5); fosfolipase C (3.1.4.3); fosfolipase D (EC 3.1.4.4); e/ou beta-glucanase (EC 3.2.1.4 ou EC 3.2.1.6). R. Uso de pelo menos um polipeptídeo como definido em qualquer um de A, B, C, D, E, ou F, em detergentes.

Em um terceiro aspecto, a invenção diz respeito a: a. Um polipeptídeo isolado tendo atividade de protease, selecionado do grupo que consiste de: (a) um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido que tem um grau de identidade para os aminoácidos 1 a 188 da SEQ ID NO: 2, de pelo menos 86 %, e/ou para os aminoácidos 1 a 192 da SEQ ID NO: 6 de pelo menos 72 %; (b) um polipeptídeo que é codificado por uma seqüência de ácido nucleico que hibridiza sob condições de estringência média a alta com (i) qualquer um dos nucleotídeos 502 a 1065 da SEQ ID NO: 1, e/ou nucleotídeos 568 a 1143 da SEQ ID NO: 5, (ii) uma subseqüência de (i) de pelo menos 100 nucleotídeos; e/ou (iii) um filamento complementar de qualquer um de (i) a (ii); (c) uma variante do polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido dos aminoácidos 1 a 188 da SEQ ID NO: 2, ou aminoácidos 1 a 192 da SEQ ID NO: 6, compreendendo uma substituição, deleção, extensão, e/ou inserção de um ou mais aminoácidos; (d) uma variante alélica de (a), (b), ou (c); e (e) um fragmento de (a), (b), (c), ou (d) que tem atividade de protease; b. Uma seqüência de ácido nucleico isolado compreendendo uma seqüência de ácido nucleico que (a) codifica o polipeptídeo de a; (b) codifica um polipeptídeo tendo atividade de protease, e que hibridiza sob condições de estringência média a alta com (i) qualquer um dos nucleotídeos 502 a 1065 da SEQ ID NO: 1, e/ou nucleotídeos 568 a 1143 da SEQ ID NO: 5, (ii) uma subseqüência de (i) de pelo menos 100 nucleotídeos; e/ou (ii) um filamento complementar de qualquer um de (i) a (ii); e/ou (c) codifica um polipeptídeo tendo atividade de protease e que tem um grau de identidade (i) para os nucleotídeos 502 a 1065 da SEQ ID NO: 1 de pelo menos 86 %, e/ou para os nucleotídeos 568 a 1143 da SEQ ID NO: 5 de pelo menos 82 %; c. Uma seqüência de ácido nucleico isolado produzida (a) hibridizando-se um DNA sob condições de estringência média a alta com (i) qualquer um dos nucleotídeos 502 a 1065 da SEQ ID NO: 1, e/ou nucleotídeos 568 a 1143 da SEQ ID NO: 5; (ii) uma subseqüência de (i) de pelo menos 100 nucleotídeos; e/ou (iii) um filamento complementar de qualquer um de (i) a (ii); e (b) isolando-se a seqüência de ácido nucleico; d. Uma construção de ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico de qualquer um de b, ou c, operavelmente ligada a uma ou mais seqüências de controle que conduzem a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão adequado; e. Um vetor de expressão recombinante compreendendo a construção de ácido nucleico de d; f. Uma célula hospedeira recombinante compreendendo a construção de ácido nucleico de d ou o vetor de e; g. Um método para a produção de um polipeptídeo de a, o método compreendendo: (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante de f para produzir um sobrenadante compreendendo o polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo; h. Um planta transgênica, ou parte da planta, capaz de expressar o polipeptídeo de a; i. Um animal não humano, transgênico, ou produtos, ou elementos deste, sendo capaz de expressar o polipeptídeo de a; j. Um método para a produção de um polipeptídeo de a, o método compreendendo (a) cultivar qualquer um dos filamentos seguintes: (i) Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei DSM 43235, ou Nocardiopsis alba DSM 15647; e (b) recuperar o polipeptídeo; k. Uso de pelo menos um polipeptídeo como definido em a (i) na ração para animal; (ii) na preparação de uma composição para o uso na ração para animal; (iii) para melhorar o valor nutricional de uma ração para animal; (iv) para aumentar a proteína digerível e/ou solúvel em dietas de animais; (v) para aumentar o grau de hidrólise das proteínas em dietas de animais; e/ou (vi) para o tratamento das proteínas; l. Um aditivo para ração para animal compreendendo pelo menos um polipeptídeo como definido em a; e (a) pelo menos uma vitamina solúvel em gordura, e/ou (b) pelo menos uma vitamina solúvel em água, e/ou (c) pelo menos um mineral de traço; m. Uma composição de ração para animal tendo um teor de proteína bruto de 50 a 800 g/kg e compreendendo pelo menos um polipeptídeo como definido em a, ou pelo menos um aditivo de alimentação de 1; n. Uma composição compreendendo pelo menos um polipeptídeo como definido em a, junto com pelo menos uma outra enzima selecionada dentre a alfa-amilase (EC 3.2.1.1), fitase (EC 3.1.3.8 ou 3.1.3.26); xilanase (EC 3.2.1.8); galactanase (EC 3.2.1.89); alfa-galactosidase (EC 3.2.1.22); protease (EC 3.4.-.-), fosfolipase Al (EC 3.1.1.32); fosfolipase A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipase (EC 3.1.1.5); fosfolipase C (3.1.4.3); fosfolipase D (EC 3.1.4.4); e/ou beta-glucanase (EC 3.2.1.4 ouEC 3.2.1.6); assim como o. Uso de pelo menos um polipeptídeo como definido em a nos detergentes.

Em um quarto aspecto, a invenção diz respeito a: um polipeptídeo isolado tendo atividade de protease, selecionado do grupo que consiste de: (a) um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido que tem um grau de identidade para os aminoácidos 1 a 188 da SEQ ID NO: 2 de pelo menos 84 %; (b) um polipeptídeo tem uma seqüência de aminoácido que tem um grau de identidade para os aminoácidos -167 a 188 da SEQ ID NO: 2 de pelo menos 78 %; (c) um polipeptídeo que é codificado por uma seqüência de ácido nucleico que hibridiza sob condições de estringência média a alta com (i) DNA que codifica uma protease obtenível do DNA genômico de Nocardiopsis alba DSM 15647 pelo uso de iniciadores das SEQ ID NOS. 3 e 4; (ii) nucleotídeos 502 a 1065 da SEQ ID NO: 1; (iii) nucleotídeos 1 a 1065 da SEQ ID NO: 1; (iv) uma subseqüência de (i) ou (ii) ou (iii) de pelo menos 100 nucleotídeos; e/ou (v) um filamento complementar de (i), (ii), (iii) ou (iv); (d) uma variante do polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido dos aminoácidos 1 a 188, ou -167 a 188 da SEQ ID NO: 2, compreendendo uma substituição, deleção, extensão, e/ou inserção de um ou mais aminoácidos; (e) uma variante alélica de (a), (b) ou (c); e (f) um fragmento de (a), (b), (c), (d) ou (e) que tem atividade de protease.

Um polipeptídeo isolado tendo atividade de protease, e tendo um temperatura de fusão (Tm) de pelo menos 78°C, como determinado pela Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC) em um 10 mM de fosfato de sódio, 50 mM de tampão de cloreto de sódio, pH 7,0, usando uma taxa de varredura constante de l,5°C/min, em que o polipeptídeo é selecionado do grupo que consiste de: (a) um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido que tem um grau de identidade para os aminoácidos 1 a 188 da SEQ ID NO: 2 de pelo menos 50 %; (b) um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido que tem um grau de identidade para os aminoácidos -167 a 188 da SEQ ID NO: 2; (c) um polipeptídeo que é codificado por uma seqüência de ácido nucleico que hibridiza sob condições de estringência baixa com (i) DNA que codifica uma protease obtenível do DNA genômico de Nocardiopsis alba DSM 15647 pelo uso de iniciadores das SEQ ID NOS. 3 e 4; (ii) nucleotídeos 502 a 1065 da SEQ ID NO: 1; (iii) nucleotídeos 1 a 1065 da SEQ ID NO: 1; (iv) uma subseqüência de (i) ou (ii) ou (iii) de pelo menos 100 nucleotídeos; e/ou (v) um filamento complementar de (i), (ii), (iii) ou (iv); (d) uma variante do polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido dos aminoácidos 1 a 188, ou-167 a 188 da SEQ ID NO: 2, compreendendo uma substituição, deleção, extensão, e/ou inserção de um ou mais aminoácidos; (e) uma variante alélica de (a), (b) ou (c); e (f) um fragmento de (a), (b), (c), (d) ou (e) que tem atividade de protease.

Uma seqüência de ácido nucleico isolado compreendendo uma seqüência de ácido nucleico que (a) codifica o polipeptídeo como definido exatamente acima; (b) codifica um polipeptídeo tendo atividade de protease, e que hibridiza sob condições de estringência média a alta com (i) DNA que codifica uma protease obtenível do DNA genômico de Nocardiopsis alba DSM 15647 pelo uso de iniciadores das SEQ ID NOS. 3 e 4, (ii) nucleotídeos 502 a 1065 ou 1 a 1065 da SEQ ID NO: 1; (iii)uma subseqüência de (i) ou (ii) de pelo menos 100 nucleotídeos; e/ou (iv) um filamento complementar de (i), (ii), ou (iii); (c) codifica um polipeptídeo tendo atividade de protease e que tem um grau de identidade para os nucleotídeos 502 a 1065 da SEQ ID NO: 1 de pelo menos 86 %; e/ou (d) codifica um polipeptídeo tendo atividade de protease e que tem um grau de identidade para os nucleotídeos 1 a 1065 da SEQ ID NO: 1 de pelo menos 82 %.

Uma seqüência de ácido nucleico isolado compreendendo uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo tendo atividade de protease e um temperatura de fusão (Tm) de pelo menos 78°C, como determinado pela Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC) em 10 de mM fosfato de sódio, 50 mM de tampão de cloreto de sódio, pH 7,0, usando uma taxa de varredura constante de l,5°C/min, em que a seqüência de ácido nucleico (a) codifica o polipeptídeo com uma Tm de pelo menos 78°C como definido acima; (b) hibridiza sob condições de estringência baixa com (i) DNA que codifica uma protease obtenível do DNA genômico de Nocardiopsis alba DSM 15647 pelo uso de iniciadores das SEQ ID NOs: 3 e 4; (ii) nucleotídeos 502 a 1065 ou 1 a 1065 da SEQ ID NO: 1; (iii) uma subseqüência de (i) ou (ii) de pelo menos 100 nucleotídeos; e/ou (iv) um filamento complementar de (i), (ii), ou (iii); (c) tem um grau de identidade para os nucleotídeos 502 a 1065 da SEQ ID NO: 1 de pelo menos 50 %; e/ou (d) tem um grau de identidade para os nucleotídeos 1 a 1065 da SEQ ID NO: 1 de pelo menos 50 %.

Uma seqüência de ácido nucleico isolado produzida (a) hibridizando-se um DNA sob condições de estringência média a alta com (i) DNA que codifica uma protease obtenível do DNA genômico de Nocardiopsis alba DSM 15647 pelo uso de iniciadores das SEQ ID NOS. 3 e 4; (ii) nucleotídeos 502 a 1065 ou 1 a 1065 da SEQ ID NO: 1; (iii) uma subseqüência de (i) ou (ii) de pelo menos 100 nucleotídeos; ou (iv) um filamento complementar de (i), (ii) ou (iii); e (b) isolando-se a sequência de ácido nucleico.

Uma construção de ácido nucleico compreendendo qualquer uma das três sequências de ácido nucleico definidas em qualquer um dos três parágrafos imediatamente acima do presente, operavelmente ligadas a uma ou mais seqüências de controle que conduzem à produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão adequado.

Um vetor de expressão recombinante compreendendo a construção de ácido nucleico.

Uma célula hospedeira recombinante compreendendo a construção de ácido nucleico ou o vetor.

Um método para a produção de um polipeptídeo como definido acima, o método compreendendo: (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante da reivindicação 8 para produzir um sobrenadante compreendendo o polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

Uma planta transgênica, ou parte da planta, capaz de expressar o polipeptídeo como definido acima.

Um animal não humano, transgênico, ou produtos, ou elementos deste, sendo capaz de expressar o polipeptídeo acima definido.

Uso de pelo menos um dos polipeptídeos como definido acima (i) na ração para animal; (ii) na preparação de uma composição para o uso na ração para animal; (iii) para melhorar o valor nutricional de uma ração para animal; (iv) para aumentar a proteína digerível e/ou solúvel em dietas de animais; (v) para aumentar o grau de hidrólise das proteínas em dietas de animais; e/ou (vi) para o tratamento de proteínas vegetais.

Um aditivo para ração para animal compreendendo pelo menos um polipeptídeo como definido acima; e (a) pelo menos uma vitamina solúvel em gordura, e/ou (b) pelo menos uma vitamina solúvel em água, e/ou (c) pelo menos um mineral de traço.

Uma composição de ração para animal tendo um teor de proteína bruto de 50 a 800 g/kg e compreendendo pelo menos um polipeptídeo como definido acima, ou pelo menos um aditivo de alimentação como definido acima.

Uma composição compreendendo pelo menos um polipeptídeo como definido acima, junto com pelo menos uma outra enzima selecionada dentre a alfa-amilase (EC 3.2.1.1), fitase (EC 3.1. 3.8 ou 3.1.3.26); xilanase (EC 3.2.1.8); galactanase (EC 3.2.1.89); alfa-galactosidase (EC 3.2.1.22); protease (EC 3.4.-.-), fosfolipase Al (EC 3.1.1.32); fosfolipase A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipase (EC 3.1.1.5); fosfolipase C (3.1.4.3); fosfolipase D (EC 3.1.4.4); e/ou beta-glucanase (EC 3.2.1.4 ou EC 3.2.1.6).

Uso de pelo menos um polipeptídeo como definido acima em detergentes.

As formas de realização dos segundo, terceiro, e quarto aspectos acima, são, independentemente um do outro, assim como os sub-aspectos preferidos do primeiro aspecto da invenção, assim como os sub-aspectos preferidos entre si.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Os polipeptídeos tendo atividade de protease, ou proteases, também são algumas vezes designados peptidases, proteinases, hidrolases peptídicas, ou enzimas proteolíticas. As proteases podem ser do tipo exo que hidrolisa os peptídeos que partem de cada extremidade deste, ou do tipo endo que agem intemamente em cadeias de polipeptídeo (endopeptidases). As endopeptidases apresentam atividade nos substratos de peptídeo terminalmente bloqueados em N e C que são relevantes para a especificidade da protease em questão.

O termo “protease” é definido aqui como uma enzima que hidrolisa as ligações de peptídeo. Ela inclui qualquer enzima que pertence ao grupo de enzima EC 3.4 (incluindo cada uma das treze subclasses deste). O número de EC refere-se a Enzim Nomenclatura 1992 de NC-IUBMB, Academic Press, San Diego, Califórnia, incluindo os suplementos 1 a 5 publicados em Eur. J. Biochem. 1994, 223, 1 a 5; Eur. J. Biochem. 1995, 232, 1 a 6; Eur. J. Biochem. 1996, 237, 1 a 5; Eur. J. Biochem. 1997, 250, 1 a 6; e Eur. J. Biochem. 1999, 264, 610 a 650; respectivamente. A nomenclatura é regularmente suplementada e atualizada; ver por exemplo, o World Wide Web (WWW) na http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/ enzyme/index.html).

As proteases são classificadas na base de seu mecanismo catalítico nos grupos seguintes: Serina proteases (S), Cisteína Proteases (C), Aspártico proteases (a), Metaloproteases (M), e Desconhecido, ou ainda como proteases, não classificadas (U), ver Handbook of Proteolytic Enzymes, A. J. Barrett, N. D. Rawlings, J. F. Woessner (eds), Academic Press (1998), em particular a parte da introdução geral.

Em formas de realização particulares, as proteases da invenção e para o uso de acordo com a invenção são selecionadas do grupo que consiste de: (a) Proteases que pertencem ao grupo de enzima EC 3.4.-.-; (b) Serina protease que pertencem ao grupo S do Handbook acima; (c) Serina protease da família de peptidase S2A; e/ou (d) Serina protease da família de peptidase S1E como descrito em Biochem. J. 290: 205 a 218 (1993) e em MEROPS protease database, release 6.20, 24 de Março, 2003, (www.merops.ac.uk). O bando de dados é descrito em Rawlings, N. D., 0’Brien, E. A. & Barrett, A. J. (2002) MEROPS: the protease database. Nucleic Acids Res. 30, 343 a 346.

Para determinar se uma protease dada é uma Serina protease, e uma protease da família S2A, a referência é feita ao Handbook acima e aos princípios indicados nesta. Tal determinação pode ser realizada para todos os tipos de proteases, sejam elas proteases que ocorrem naturalmente ou do tipo selvagem; ou geneticamente proteases engenhei radas ou sintéticas. A atividade de protease pode ser medida usando qualquer ensaio, em que um substrato é utilizado, que inclui as ligações de peptídeo relevantes para a especificidade da protease em questão. O pH do ensaio e a temperatura do ensaio devem ser desse modo adaptados à protease em questão. Os exemplos de valores de pH do ensaio são pH 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12. Os exemplos de temperaturas do ensaio são 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90, ou 95°C.

Os exemplos não limitantes dos substratos de protease são caseína, tal como Caseína Reticulada à Azurina (caseína AZCL), e hemoglobina. Para os propósitos de determinar a atividade específica da protease da invenção o substrato é a hemoglobina, e um ensaio adequado divulgado no Exemplo 3. Dois outros ensaios de protease são descritos no Exemplo 2, cada um dos quais pode ser usado para determinar a atividade de protease no geral. Para os propósitos outros que não de determinações de atividade específica, o Ensaio de pNA assim chamado é um ensaio preferido. A protease da invenção exibe uma atividade específica na hemoglobina no pH 7,5 e 25°C de pelo menos 39 AU/g. A atividade específica pode ser determinada como descrito no Exemplo 3. A protease da invenção pode exibir uma atividade específica de pelo menos 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47,48, 49, 50, 51, 52, 53, ou pelo menos 54 AU/g. É bem conhecido que a determinação da atividade específica inclui a determinação do teor de proteína, assim como a atividade de protease, da protease purificada.

Em uma forma de realização particular, o teor de proteína é determinado pela análise de aminoácido, por exemplo por hidrólise ácida da protease, e separação e quantificação subseqüentes dos aminoácidos liberados, preferivelmente em um Analisador de Aminoácido Biochrom 20 Plus.

Os seguintes são aspectos particulares, opcionais da determinação da atividade de protease: (i) o substrato de hemoglobina é desnaturado; (ii) o substrato de hemoglobina é usado em uma quantidade de 0,65 % p/p; (ii) o tampão de ensaio é o tampão de KELPOVNaOH, pH 7,50; (ii) o tempo de reação para a protease é de 10 minutos; (iii) depois da reação enzimática, a hemoglobina não digerida é precipitada com ácido tricloroacético (TCA) e removida, preferivelmente por filtração; (iv) os produtos de degradação de hemoglobina solúveis em TCA no filtrado são determinados, preferivelmente com o reagente de fenol de Folin & Ciocalteu; (v) a unidade de atividade (AU) é medida e definida por referência a um padrão de enzima ALCALASE®; (vi) a unidade de atividade (AU) é medida usando o ensaio EB-SM-0349, preferivelmente EB-SM-0349 02/01; e/ou (vii) o ensaio usado é o “Ensaio de Atividade de Protease (AU/ml)” como divulgado no Exemplo 3. O padrão ALCALASE® e o ensaio EB-SM-0349 está disponível da Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Dinamarca (quoting “your ref. patent 10476” e “EB-SM-0349”, ou “EB-SM-034902/01”, respectivamente).

Uma triagem para as proteases de atividade específica alta relacionada às proteases das SEQ ID NOs: 2 e 6 pode ser realizada como segue: Em uma primeira etapa, uma biblioteca de DNA é triada com os iniciadores, por exemplo, das SEQ ID NOs: 3, 4, 7, ou 8, ou preferivelmente com o peptídeo maduro que codifica partes de cada uma das SEQ ID NOs: 1 e 5; e os clones de hibridização são expressados em uma cepa adequada, por exemplo, uma cepa de Bacillus ou E. coli. Em uma etapa seguinte, as proteases expressadas relacionadas às SEQ ID NOs: 2 e/ou 6 são purificadas, preferivelmente em um processo de micro-purificação (ver por exemplo, a WO 03/037914), e em uma etapa seguinte, a quantidade de protease ativa é determinada para cada candidato pelo uso do princípio bem conhecido de titulação de sítio ativo (AST) com um inibidor forte da enzima. Isto é com a finalidade de ser capaz de comparar as quantidades equimolares de cada protease na etapa final subsequente, que é uma determinação da atividade de protease da quantidade agora conhecida da protease por qualquer ensaio adequado, por exemplo o ensaio pNA do Exemplo 2 aqui. Uma parte maior deste procedimento pode ser automatizada, e se desejado realizada com a assistência de robôs. A verificação da atividade específica alta é por exemplo, feita por purificação da protease, e estabelecimento da atividade específica como descrito na parte experimental aqui. Não existem limitações na origem da protease da invenção e/ou para o uso de acordo com a invenção. Assim, o termo protease inclui não apenas as proteases naturais ou do tipo selvagem obtidas de microorganismos de qualquer gênero, mas também quaisquer mutantes, variantes, fragmentos etc. destes que exibem atividade de protease, assim como as proteases sintéticas, tais como proteases misturadas, e proteases de consenso. Tais proteases geneticamente engenheiradas podem ser preparadas como no geral é conhecido na técnica, por exemplo por Mutagênese direcionada por sítio, por PCR (usando um fragmento de PCR contendo a mutação desejada como um dos iniciadores nas reações de PCR), ou pela Mutagênese Aleatória. A preparação das proteínas de consenso é descrita por exemplo, na EP 897985. A mistura de gene no geral é descrita por exemplo, nas WO 95/22625 e WO 96/00343. A recombinação dos genes de protease pode ser feita independentemente da sequência específica dos precursores por mistura sintética como descrito em Ness, J. E. et al, em Nature Biotechnology, Vol. 20 (12), páginas 1251 a 1255, 2002. Os oligonucleotídeos sintéticos degenerados em sua seqüência de DNA fornecem a possibilidade de todos os aminoácidos encontrados no grupo de proteases precursoras serem projetados e os genes montados de acordo com a referência. A mistura pode ser realizada para a seqüência de tamanho natural ou apenas para parte da seqüência e depois combinada mais tarde com o restante do gene para fornecer uma seqüência de tamanho natural. As proteases tendo uma. seqüência de aminoácido compreendendo as partes maduras de cada uma das SEQ ID NOs: 2 e 6 são exemplos particulares de tais proteases precursoras que podem ser submetidos à mistura como descrito acima, se desejado junto com, por exemplo, a protease derivada de Nocardiopsis sp. NRRL 18262, para fornecer as proteases adicionais da invenção. O termo “obtida de” como aqui usado com relação a uma fonte dada deve significar que o polipeptídeo codificado pela seqüência de ácido nucleico é produzido pela fonte ou por uma célula em que a seqüência de ácido nucleico da fonte está presente. Em uma forma de realização preferida, o polipeptídeo é secretado extracelularmente.

Em uma forma de realização específica, a protease é uma variante alergênica baixa, designada para invocar uma resposta imunológica reduzida quando exposta aos animais, incluindo o ser humano. O termo resposta imunológica dever ser entendido como qualquer reação pelo sistema imune de um animal exposto à protease. Um tipo de resposta imunológica é uma resposta alérgica que leva a níveis aumentados de IgE no animal exposto. As variantes alergênicas baixas podem ser preparadas usando técnicas conhecidas no ramo. Por exemplo a protease pode ser conjugada com porções poliméricas que protegem as porções ou epítopos da protease envolvida em uma resposta imunológica. A conjugação com os polímeros pode envolver a ligação química in vitro do polímero à protease, por exemplo, como descrito nas WO 96/17929, WO 98/30682, WO 98/35026, e/ou WO 99/00489. A conjugação além disso ou altemativamente também pode envolver a ligação in vivo dos polímeros às protease. Tal conjugação pode ser obtida pela engenharia genética da seqüência de nucleotídeo que codifica a protease, inserindo seqüências de consenso que codificam os sítios de glicosilação adicionais na protease e expressando a protease em um hospedeiro capaz de glicosilar a protease, ver por exemplo, a WO 00/26354. Um outro caminho de fornecer variantes alergênicas baixas é a engenharia genética da seqüência de nucleotídeo que codifica a protease de modo a fazer com que a protease se auto-oligomerize, na finalidade de que os monômeros da protease possam proteger os epítopos de outros monômeros da protease e desse modo diminuindo a antigenicidade dos oligômeros. Tais produtos e sua preparação são descritos por exemplo, na WO 96/16177. Os epítopos envolvidos em uma resposta imunológica podem ser identificados por vários métodos tais como o método de exibição de fago descrito nas WO 00/26230 e WO 01/83559, ou a aproximação aleatória descrita na EP 561907. Uma vez que um epítopo foi identificado, sua sequência de aminoácido pode ser alterada para produzir propriedades imunológicas alteradas da protease por técnicas de manipulação de gene conhecidas tais como a mutagênese direcionada por sítio (ver por exemplo, WO 00/26230, WO 00/26354 e/ou WO 00/22103) e/ou a conjugação de um polímero podem ser feitas em proximidade suficiente ao epítopo para o polímero proteger o epítopo.

Um polipeptídeo de acordo com cada aspecto da presente invenção pode compreender uma seqüência de aminoácido que tem um grau de identidade para a parte de peptídeo madura de cada uma das SEQ ID NOs: 2, ou 6, por exemplo para os aminoácidos 1 a 188 da SEQ ID NO: 2, e/ou para os aminoácidos 1 a 192 da SEQ ID NO: 6 (as partes do peptídeo maduras), de, por exemplo, pelo menos cerca de 65 %, e que têm atividade de protease (em seguida de “polipeptídeos homólogos”). Em formas de realização particulares, o grau de identidade para cada uma das partes de peptídeo maduras de cada uma das SEQ ID NOs: 2, ou 6, é pelo menos cerca de 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 °/o, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou pelo menos 99 %. Em formas de realização alternativas, o grau de identidade é pelo menos cerca de 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, ou pelo menos cerca de 64 %. A presente invenção também diz respeito aos polipeptídeos isolados compreendendo uma seqüência de aminoácido que tem um grau de identidade para os aminoácidos -167 a 188 da SEQ ID NO: 2, e/ou para os aminoácidos -160 a 192 da SEQ ID NO: 6, de, por exemplo, pelo menos cerca de 78 %, e que têm atividade de protease. Em formas de realização particulares, o grau de identidade para os aminoácidos -167 a 188 da SEQ ID NO: 2, é pelo menos cerca de 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou pelo menos 99 %. Em formas de realização alternativas, o grau de identidade é pelo menos cerca de 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, ou pelo menos 84 %.

Em formas de realização particulares, os polipeptídeos da invenção i) têm; ou ii) consistem de uma seqüência de aminoácido com qualquer um dos graus de identidade como mencionado acima.

Para os propósitos da presente invenção, o grau de identidade entre as duas sequências de aminoácido, assim como o grau de identidade entre as duas seqüências de nucleotídeo, é determinado pelo programa “align” que é um alinhamento de Needleman-Wunsch (isto é, um alinhamento global). O programa é usado para o alinhamento do polipeptídeo, assim como das seqüências de nucleotídeo. A matriz de contagem padrão BLOSUM50 é usada para os alinhamentos de polipeptídeo, e a matriz de identidade padrão é usada para os alinhamentos de nucleotídeo. A penalidade para o primeiro resíduo de um intervalo é de -12 para os polipeptídeos e -16 para os nucleotídeos. As penalidades para outros resíduos de um intervalo são de -2 para os polipeptídeos, e de -4 para o nucleotídeo. “Align” é a parte do acondicionamento FASTA versão v20u6 (ver W. R. Pearson e D. J. Lipman (1988), “Improved Tools for Biological Sequence Analysis”, PNAS 85: 2444 a 2448, e, W. R. Pearson (1990*) “Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA, “Methods in Enzymology 183: 63 a 98). Os alinhamentos de proteína de FASTA usam o algorítimo de Smith-Waterman sem nenhuma limitação no tamanho do intervalo (ver “Smith-Waterman algorithm”, T. F. Smith e M. S. Waterman (1981) J. Mol. Biol. 147: 195 a 197).

Em uma forma de realização particular, as partes de peptídeo maduras, ou as partes de peptídeo maduras prognosticadas ou esperadas, das duas seqüências de aminoácido são usadas para o alinhamento. Na alternativa, esta parte da sequência, cuja identidade para a parte de peptídeo madura da SEQ ID NO: 2 está sendo examinada, é escolhida, que de acordo com um alinhamento múltiplo feito como descrito abaixo é a mais similar à parte de peptídeo madura da SEQ ID NO: 2, isto é, os resíduos de aminoácido correspondentes como identificado pelo alinhamento múltiplo.

No presente contexto, a base para numerar os resíduos de aminoácido (ou determinar os números de posição, cf. o segundo aspecto da invenção) é a SEQ ID NO: 2 partindo com Ale terminando com TI 88. Na alternativa, a base é os aminoácidos 1 a 188 da protease derivada de Nocardiopsis sp. NRRL 18262 (SEQ ID NO: 1 como divulgado na WO 01/58276, preferivelmente SEQ ID NO: 1 como divulgado na WO 01/58276 em que A87 é substituído com T87).

As proteases podem compreender as extensões como comparadas às partes de peptídeo maduras, viz. nas extremidades de terminal N, e/ou terminal C destas. Os aminoácidos de tais extensões, se nenhum, devem ser numerados como é usual na técnica, isto é, para uma extensão de terminal C: 189, 190, 191 e assim por diante, e para uma extensão de terminal N -1, -2, -3 e assim por diante.

Para cada resíduo de aminoácido em cada protease alinhada à seqüência de referência, por exemplo, SEQ ID NO: 2, como explicado acima (para os propósitos de determinar o grau de identidade), é possível determinar direta e não ambiguamente um resíduo de aminoácido na seqüência de referência, por exemplo, SEQ ID NO: 2, à qual ele corresponde. Os resíduos correspondentes são determinados na mesma posição, ou número, por referência, por exemplo, à SEQ ID NO: 2.

Para cada resíduo de aminoácido em uma outra protease, a posição correspondente da seqüência de referência, por exemplo, SEQ ID NO: 2, pode ser encontrada, como segue: A seqüência de aminoácido da outra protease é designada SEQ X. Uma posição correspondendo à posição N da SEQ ID NO: 2 é encontrada como segue: a SEQ X é alinhada com a SEQ ID NO: 2 como especificado acima. A partir do alinhamento, a posição na seqüência SEQ X correspondendo à posição N da SEQ ID NO: 2 pode ser clara e não ambiguamente derivada, usando os princípios descritos abaixo. A SEQ X pode ser uma parte madura da protease em questão, ou ela também pode incluir um parte de peptídeo evidente, ou ela pode ser um fragmento da protease madura que tem atividade de protease, por exemplo, um fragmento do mesmo comprimento como a SEQ ID NO: 2, e/ou ela pode ser o fragmento que se estende de Al aT188 quando alinhada com a SEQ ID NO: 2 como aqui descrito.

Três alinhamentos são inseridos abaixo como as Tabelas I, II e 111. Os alinhamentos foram preparados como descrito acima, alinhando a parte madura de uma outra protease (SEQ XI, SEQ X2, e SEQ X3, respectivamente) à SEQ ID NO: 2. Aproximadamente 50 resíduos de aminoácido de cada protease são mostrados.

Observando primeiro no alinhamento da Tabela I, está claro que, por exemplo, a P42 da SEQ ID NO: 2 corresponde a Q42 da SEQ XI, visto que estes resíduos estão no topo entre si no alinhamento. Eles são ambos determinados número 42, viz. o número do resíduo correspondente na SEQ ID NO: 2. Também é evidente a partir deste alinhamento que por exemplo a SEQ XI não compreende qualquer um de 25 S, 3ST, 4ZJt% 44S, ou 49Q.

Tabela I jyjIISSMLYT MGGKCSVGFA, âm&SSQPGF VTAGHÇSrVG TCTSIGMGQG SEQ XD NO; 2 MJII&SLAVT MGGRCSVGFA. ATKAAGQPGF VTASHCSSRVG TQVTIGNGRG SEQ XI ao 20 30 40 50 As tabelas II e III são exemplos de alinhamentos que produzem intervalos em cada uma das duas sequências.

No alinhamento da Tabela II, um intervalo é produzido na SEQ X2. O resíduo de aminoácido realçado P da SEQ X2, para os presentes propósitos, é designado P28, embora na SEQ X como tal ele seja P25.

Tabela II ADII<3<3£AYT Í4GGRCSVGFA ATHaSGQEGF VTAGHCGTVG TFVSICKGQG SEQ ID NO: 2 ADIXGGL-MT MGGB.CSVGFA ΑΪΜΆ--BfSF VTAGHCGRVG TQVTIGNGRG SEQ X2 10 20 “30 40 50 No alinhamento da Tabela III, um intervalo é produzido na SEQ X3. Quando um intervalo é produzido entre os aminoácidos tendo o número de posição nn e (nn + 1) da SEQ ID NO: 2, cada posição do intervalo é determinada um letra minúscula ou letra subscrita: a, b, c etc. para o número de posição anterior, isto é, nn. Consequentemente, cada posição do intervalo é numerada nna, nnb etc. O resíduo de aminoácido realçado R da SEQ X3 é, para os presentes propósitos, designado R33a, embora na SEQ X3 como tal ele seja R34.

Tabela III ADIIGGIsAYI KGGRCSVGFÃ ATNASGQPGF VTA—GHCGT VGTPVSIGNGQG SEQ XJ> NO; 2 ADIIGGItA-YT MGGRCSVGFA ASHâAGQPGF VTARSGHCGR VGTQVTIGNGRG SEQ X3 10 20 30 “ 40 50 Em outras formas de realização particulares de cada aspecto da invenção, o polipeptídeo da invenção tem uma temperatura de fusão Tm de pelo menos 75°C, 76°C, 77°C, 78°C, 79°C, 80°C, 81°C, 82°C, 83°C, 84°C, 85°C, 86°C, 87°C, 88°C, 89°C, 90°C, 91°C, 92°C, 93°C, 94°C, ou pelo menos 95°C, como determinado pela Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC). A DSC é realizada em um tampão de 10 mM de fosfato de sódio, 50 mM de cloreto de sódio, pH 7,0. A taxa de varredura é constante, por exemplo, l,5°C/min. O intervalo varrido pode ser de 20 a 100°C. Não existe nenhuma limitação superior na Tm, entretanto, é presentemente considerado que a Tm possa estar abaixo de 150°C, 145°C, 140°C, 135°C, 130°C, 125°C, 120°C, 115°C, 110°C,105°C, ou abaixo de 100°C.

Em uma forma de realização alternativa, um outro tampão é selecionado para a varredura, por exemplo, um tampão de pH 5,0, 5,5, 6,0, ou pH 6,5.

Em outras formas de realização alternativas, uma taxa de varredura mais alta ou mais baixa pode ser usada, por exemplo, uma mais baixa que um de l,4°C/min, l,3°C/min, l,2°C/min, l,l°C/min, l,0°C/min, ou 0,9°C/min. A referência é feita ao Exemplo 2 para outros detalhes a cerca do procedimento de varredura.

Em uma forma de realização particular, a protease da invenção exibe um perfil de atividade de temperatura apurado como comparado à protease derivada de Nocardiopsis sp. NRRL 18262. Por exemplo, a protease da invenção pode exibir uma atividade relativa no pH 9 e 80°C de pelo menos 0,40, preferivelmente pelo menos 0,45, 0,50, 0,55, 0,60, 0,65, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, ou pelo menos 0,95, o termo “relativo” referindo-se à atividade máxima medida para a protease em questão. Para a protease derivada de Nocardiopsis sp. NRRL 18262, a atividade a 70°C é ajustada para 1.000 (100 %), ver o Exemplo 2. Como um outro exemplo, a protease da invenção exibe uma atividade relativa no pH 9 e 90°C de pelo menos 0,10, preferivelmente pelo menos 0,15, 0,20, 0,25, 0,30, ou de pelo menos 0,35. Em uma forma de realização particular, a atividade de protease é medida usando o ensaio Protazyme AK do Exemplo 2. A presente invenção também diz respeito ao uso de ração para animal dos polipeptídeos da invenção. O grau de identidade entre as duas seqüências de aminoácido também pode ser determinado pelo método Clustal (Higgins, 1989, CABIOS 5: 151 a 153) usando o software LASERGENE® MEGALIGN® (DNASTAR, Inc., Madison,WI) com uma tabela de identidade e os parâmetros múltiplos de alinhamento seguintes: Penalidade de descontinuidade de 10, e penalidade de comprimento de descontinuidade de 10. Os parâmetros de alinhamento aos pares são Ktuple = 1, penalidade de descontinuidade = 3, janelas = 5, e diagonais = 5.0 grau de identidade entre as duas seqüências de nucleotídeo pode ser determinado usando o mesmo algorítimo e pacote de software como descrito acima com os ajustes seguintes: Penalidade de descontinuidade de 10, e penalidade de comprimento de descontinuidade de 10. Os parâmetros de alinhamento aos pares são Ktuple = 3, penalidade de descontinuidade = 3 e janelas = 20.

Em uma forma de realização particular, os polipeptídeos homólogos têm uma seqüência de aminoácido que difere (a) das partes de peptídeo maduras de cada uma das SEQ ID NOs: 2, ou 6, ou (b) das pró formas destes (excluindo parte de peptídeo evidentes, incluindo partes de peptídeo maduras), em (i) não mais do que 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, ou não mais do que 20 aminoácidos; (ii) não mais do que vinte, dezenove, dezoito, dezessete, dezesseis, quinze, quatorze, treze, doze, ou não mais do que onze aminoácidos; (iii) não mais do que dez, nove, oito, sete, seis, cinco, quatro, três, dois, ou não mais do que um aminoácido; (iv) dez, ou em nove, ou em oito, ou em sete, ou em seis, ou em cinco aminoácidos; ou (v) quarto, ou em três, ou em dois aminoácidos, ou em um aminoácido.

Em uma forma de realização particular, os polipeptídeos da presente invenção compreende a seqüência de aminoácido da parte de peptídeo madura de cada uma das SEQ ID NOs: 2 e 6, ou variantes alélicas destes; ou fragmentos destes que têm atividade de protease Em uma outro forma de realização preferida, os polipeptídeos da presente invenção consistem da parte de peptídeo madura de cada uma das SEQ ID NO: 2, ou 6, ou variantes alélicas destes; ou fragmentos destes que têm atividade de protease.

Um fragmento é um polipeptídeo tendo um ou mais aminoácidos suprimidos do término amino e/ou carboxila destas seqüências de aminoácido. Em uma forma de realização um fragmento contém pelo menos 75 resíduos de aminoácido, ou pelo menos 100 resíduos de aminoácido, ou pelo menos 125 resíduos de aminoácido, ou pelo menos 150 resíduos de aminoácido, ou pelo menos 160 resíduos de aminoácido, ou pelo menos 165 resíduos de aminoácido, ou pelo menos 170 resíduos de aminoácido, ou pelo menos 175 resíduos de aminoácido.

Uma variante alélica denota qualquer um de duas ou mais formas alternativas de um gene que ocupa o mesmo locos cromossômico. A variação alélica eleva-se naturalmente através de mutação, e pode resultar no polimorfismo dentro das populações. As mutações genéticas podem ser silenciosas (nenhuma mudança no polipeptídeo codificado) ou podem codificar os polipeptídeos tendo seqüências de aminoácido alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene. A presente invenção também diz respeito aos polipeptídeos isolados tendo atividade de protease e que são codificados por seqüências de ácido nucleico que hibridiza sob condições de estringência muito baixa, ou baixa, ou média, ou média a alta, ou alta, ou muito alta com uma sonda de ácido nucleico que hibridiza sob as mesmas condições com (a) nucleotídeos 1 a 1065, preferivelmente 502 a 1065, ou da SEQ ID NO: 1, e/ou nucleotídeos 1 a 1143, preferivelmente 568 a 1143 da SEQ ID NO: 5; (b) uma subseqüência de (a), ou (c) um filamento complementar de (a), ou (b) (J. Sambrook, E. F.

Fritsch, e T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2â edição, Cold Spring Harbor, Nova Iorque). Em uma forma de realização particular a sonda de ácido nucleico é selecionada dentre as sequências de ácido nucleico de (a), (b), ou (c) acima. A subseqüência dos nucleotídeos mencionados sob (a) acima pode ser pelo menos de 100 nucleotídeos, ou em uma outra forma de realização pelo menos de 200 nucleotídeos. Além disso, a subseqüência pode codificar um fragmento de polipeptídeo que tem atividade de protease.

As seqüências de ácido nucleico de (a) acima, ou uma subseqüência destes, assim como as partes correspondentes das seqüências de aminoácido das SEQ ID NO: 2, ou 6, ou um fragmento destes, podem ser usadas para projetar uma sonda de ácido nucleico para identificar e clonar o DNA que codifica os polipeptídeos tendo atividade de protease a partir de filamentos de gêneros ou espécies diferentes de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Em particular, tais sondas podem ser usadas para a hibridização com o genômico ou cDNA do gênero ou espécie de interesse, seguindo os procedimentos de Southern blotting padrão, de modo a identificar e isolar o gene correspondente nestas. Tais sondas podem ser consideravelmente mais curtas do que a seqüência inteira, mas deve ser de pelo menos 15, preferivelmente pelo menos 25, e mais preferivelmente pelo menos 35 nucleotídeos em comprimento. As sondas mais longas também podem ser usadas. Tanto as sondas de DNA quanto de RNA podem ser usadas. As sondas são tipicamente rotuladas para detectar o gene correspondente (por exemplo, com 32P, 3H, 35S, biotina, ou avidina). Tais sondas são abrangidas pela presente invenção.

Assim, um DNA genômico ou biblioteca de cDNA preparados a partir de tais outros organismos podem ser triados quanto ao DNA que hibridiza com as sondas descritas acima e que codifica um polipeptídeo tendo atividade de protease. Genômico ou outro DNA a partir dos quais outros organismos podem ser separados por agarose ou eletrotroforese de gel de poliacrilamida, ou outras técnicas de separação. O DNA da biblioteca ou o DNA separado podem ser transferidos a e imobilizados em nitrocelulose ou outro material veículo adequado. De modo a identificar um clone ou DNA que é homólogo com cada uma das SEQ ID NOs: 1 ou 5, ou uma subseqüência destes, o material veículo é usado em um Southern blot. Para propósitos da presente invenção, a hibridização indica que a seqüência de ácido nucleico hibridiza a uma sonda de ácido nucleico rotulada correspondendo à seqüência de ácido nucleico mostrada em cada uma das SEQ ID NOs: 1, ou 5; os filamentos complementares destes, ou subseqüências destes, sob condições de estringência muito baixa a muito alta. As moléculas às quais a sonda de ácido nucleico hibridiza sob estas condições são detectadas usando a película de raio X.

Para as sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, as condições de estringência muito baixa a muito alta são definidas como pré hibridização e hibridização a 42°C em 5X de SSPE, 0,3 % de SDS, 200 pg/ml de DNA de esperma de salmão cortado e desnaturado, e 25 % de formamida para as estringências muito baixas e baixas, 35 % de formamida para as estringências médias e médias a altas, ou 50 % de formamida para as estringências altas e muito altas, seguindo os procedimentos de Southern blotting padrão.

Para as sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, o material veículo é finalmente lavado três vezes cada durante 15 minutos usando 0,2 x de SSC, 0,2 % de SDS, 20 % de formamida preferivelmente pelo menos a 45°C (estringência muito baixa), mais preferivelmente pelo menos a 50°C (estringência baixa), mais preferivelmente pelo menos a 55°C (estringência média), mais preferivelmente pelo menos a 60°C (estringência média a alta), ainda mais preferivelmente pelo menos a 65°C (estringência alta), e o mais preferivelmente pelo menos a 70°C (estringência muito alta).

Para as sondas curtas de cerca de 15 nucleotídeos a cerca de 70 nucleotídeos em comprimento, as condições de estringência são definidas como pré hibridização, hibridização, e pós hibridização com lavagem a 5°C a 10°C abaixo da Tm calculada usando o cálculo de acordo com Bolton e McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48: 1390) em 0,9 M de NaCl, 0,09 M de Tris-HCl pH 7,6, 6 mM de EDTA, 0,5 % de NP-40, IX de solução de Denhardt, 1 mM de pirofosfato de sódio, 1 mM de fosfato de sódio monobásico, 0,1 mM de ATP, e 0,2 mg de RNA de levedura por ml seguindo os procedimentos de Southern blotting padrão.

Para as sondas curtas de cerca de 15 nucleotídeos a cerca de 70 nucleotídeos em comprimento, o material veículo é lavado uma vez em 6X de SSC mais 0,1 % de SDS durante 15 minutos e duas vezes cada durante 15 minutos usando 6X de SSC a 5°C a 10°C abaixo da Tm calculada. A presente invenção também diz respeito às variantes do polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido da parte madura de cada uma das SEQ ID NOs: 2 e 6, compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção de um ou mais aminoácidos.

As seqüências de aminoácido dos polipeptídeos variantes podem diferir da seqüência de aminoácido da parte madura de cada uma das SEQ ID NOs: 2 ou 6, por uma inserção ou deleção de um ou mais resíduos de aminoácido e/ou a substituição de um ou mais resíduos de aminoácido por resíduos de aminoácido diferentes. Em uma forma de realização particular, as mudanças de aminoácido são de uma natureza menor, isto é, as substituições de aminoácido conservativas que não afetam significantemente a dobra e/ou atividade da proteína; supressões pequenas, tipicamente de um a cerca de 30 aminoácidos; extensões de terminal amino ou carboxila pequenas, tais como um resíduo de metionina de terminal amino; um peptídeo pequeno de até cerca de 20 a 25 resíduos; ou uma extensão pequena que facilita a purificação alterando-se a carga líquida ou uma outra função, tal como um trato de pol i-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

Os exemplos de substituições conservativas estão dentro do grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina), e aminoácidos pequenos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). Consequentemente, por exemplo, a invenção diz respeito a um polipeptídeo tendo, ou compreendendo, uma seqüência como demonstrado em cada uma das SEQ ID NOs: 2, ou 6, preferivelmente as partes maduras destas, em que as substituições de aminoácido conservativas compreendem as substituições, uma após outra, entre os aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), entre os aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), entre os aminoácidos polares (glutamina e asparagina), entre os aminoácidos hidrofóbicos (alanina, leucina, isoleucina, e valina), entre os aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina), e entre os aminoácidos pequenos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina), ou qualquer combinação destes, ou fragmentos ativos destes.

As substituições de aminoácido que no geral não alteram a atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R. L. Hill, 1979, em, The Proteins, Academic Press, Nova Iorque. As trocas que mais comumente ocorrem são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Vai, Ala/Glu, e Asp/Gly assim como estas ao contrário.

Em uma forma de realização particular, os polipeptídeos da invenção e para o uso de acordo com a invenção são estáveis em ácido. Para os presentes propósitos, o termo estável em ácido significa que a atividade residual depois de 2 horas de incubação no pH 2,0, pH 2,5 ou pH 3>0 e a 37°C, é de pelo menos 50 %, quando comparada à atividade residual de uma amostra correspondente incubada durante 2 horas no pH 9,0 e a 5°C. Em uma forma de realização particular, a atividade residual é pelo menos 60 %, 70 %, 80 % ou pelo menos 90 %. Um ensaio adequado para determinar a estabilidade em ácido é o ensaio de estabilidade de pH do Exemplo 2.

Em uma outra forma de realização particular, os polipeptídeos da invenção e para o uso de acordo com a invenção têm uma atividade relativa no pH 7,0 de pelo menos 0,10, 0,15, 0,20, 0,25, 0,30 ou pelo menos 0,35. O teste de perfil de pH do Exemplo 2 é usado para a determinação.

Ainda em outras formas de realização particulares, os polipeptídeos da invenção e para o uso de acordo com a invenção têm i) uma atividade relativa a 60°C e no pH 9 de pelo menos 0,05, 0,10, 0,15 ou pelo menos 0,20; e/ou ii) uma atividade relativa a 70°C de pelo menos 0,40, 0,50, ou pelo menos 0,56. O teste de perfil de temperatura do Exemplo 2 é usado para estas determinações.

Ainda em outras formas de realização particulares, os polipeptídeos da invenção e para o uso de acordo com a invenção têm uma Tm, como determinado por DSC, de pelo menos 78°C ou de pelo menos 79, 80, 81, 82, ou de pelo menos 83°C. A Tm é determinada no pH 7,0 como descrito no Exemplo 2. O polipeptídeo da invenção e para o uso de acordo com a invenção pode ser um polipeptídeo bacteriano ou fungico. O polipeptídeo fungico pode ser derivado de um fungo filamentoso ou de uma levedura.

Em formas de realização particulares, o polipeptídeo da invenção é i) uma protease bacteriana; ii) uma protease do filo Actinobacteria; iii) da classe Actinobacteria; iv) da ordem Actinomycetales v) da família Nocardiopsaceae; vi) do gênero Nocardiopsis; e/ou uma protease derivada das vii) espécies Nocardiopsis tais como, Nocardiopsis dassonvillei, Nocardiopsis alkaliphila, Nocardiopsis antarctica, Nocardiopsis prasina, Nocardiopsis composta, Nocardiopsis exhalans, Nocardiopsis halophila, Nocardiopsis halotolerans, Nocardiopsis kunsanensis, Nocardiopsis listeri, Nocardiopsis lucentensis, Nocardiopsis metallicus, Nocardiopsis synnemataformans, Nocardiopsis trehalosi, Nocardiopsis tropica, Nocardiopsis umidischolae, Nocardiopsis xinjiangensis, ou Nocardiopsis alba, por exemplo Nocardiopsis alba DSM 15647, tal como um polipeptídeo com a seqüência de aminoácido dos aminoácidos 1 a 188, ou -167 a 188, da SEQ ID NO: 2, ou de Nocardiopsis dassonvülei subsp. dassonvillei DSM 4235, tal como um polipeptídeo com a seqüência de aminoácido dos aminoácidos 1 a 192, ou -160 a 192 da SEQ ID NO: 6. Em uma forma de realização particular, a protease deriva de Nocardiopsis alba. A taxonomia acima é de acordo com o capítulo: The road map to the Manual by G. M. Garrity & J. G. Holt em Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, 2001, segunda edição, volume 1, David R. Bone, Richard W. Castenholz.

Será entendido que para as espécies anteriormente mencionadas, a invenção abrange tanto os estados perfeitos quanto imperfeitos, e outros equivalentes taxonômicos, por exemplo, anamorfos, independente do nome das espécies pelo qual elas são conhecidas. Aqueles habilitados na técnica reconhecerão facilmente a identidade dos equivalentes apropriados.

Os filamentos destas espécies são facilmente acessíveis ao público em várias coleções de cultura, tais como the American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammiung von Mikroorganismoen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL). Por exemplo, a Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei DSM 43235 está publicamente disponível da DSMZ (Deutsche Sammiung von Mikroorganismoen und Zellkulturen GmbH, Brauhschweig, Alemanha). Esta cepa também foi depositada em outras instituições depositárias como segue: ATCC 23219, IMRU 1250, NCTC 10489.

Além disso, tais polipeptídeos podem ser identificados e obtidos a partir de outras fontes incluindo os microorganismos isolados da natureza (por exemplo, solo, compostos, água, etc.) usando as sondas acima mencionadas. As técnicas para isolar os microorganismos dos habitais naturais são bem conhecidas no ramo. A seqüência de ácido nucleico depois pode ser derivada triando-se semelhantemente uma biblioteca genômica ou de cDNA de um outro microorganismo. Uma vez que uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo foi detectada com a(s) sonda(s), a seqüência pode ser isolado ou clonada utilizando-se técnicas que são conhecidas àqueles de habilidade comum no ramo (ver, por exemplo, Sambrook et aL, 1989, supra).

Como aqui definido, um polipeptídeo “isolado”, ou “purificado”, é um polipeptídeo que é essencialmente isento de outros polipeptídeos, por exemplo, pelo menos cerca de 20 % de pureza, preferivelmente pelo menos cerca de 40 % de pureza, mais preferivelmente cerca de 60 % de pureza, ainda mais preferivelmente cerca de 80 % de pureza, o mais preferivelmente cerca de 90 % de pureza, e ainda o mais preferivelmente cerca de 95 % de pureza, como determinado por SDS-PAGE.

Os polipeptídeos codificados pelas seqüências de ácido nucleico da presente invenção também incluem os polipeptídeos fundidos ou polipeptídeos de fusão clivável em que um outro polipeptídeo é fundido no término N ou no término C do polipeptídeo ou fragmento deste. Um polipeptídeo fundido é produzido fundindo-se uma seqüência de ácido nucleico (ou uma porção desta) que codifica um outro polipeptídeo a uma seqüência de ácido nucleico (ou uma porção desta) da presente invenção. As técnicas para a produção de polipeptídeos de fusão são conhecidas no ramo, por exemplo, PCR, ou ligando-se as seqüências de codificação que codificam os polipeptídeos de modo que elas estejam em estrutura e cuja expressão do polipeptídeo fundido esteja sob controle do mesmo(s) promotor(es) e terminador.

Ainda em outras formas de realização particulares, a invenção exclui uma ou mais das proteases derivadas de (i) Nocardiopsis dassonvillei NRRL 18133 que é divulgada na WO 88/03947; (ii) cepa de Nocardiopsis sp. OPC-210 (FERM P-10508) que é divulgada na JP 2- 255081-A; (iii) cepa ZIMET 43647 da espécie Nocardiopsis dassonvillei que é divulgada em DD 20043218; (iv) Nocardiopsis sp. TOA-1 (FERM-P-18676) que é divulgada em JP 2003284571; e/ou (v) o DNA correspondente.

Seqüências de ácido nucleico A presente invenção também diz respeito às seqüências de ácido nucleico isolado que codificam um polipeptídeo da presente invenção. As seqüências de ácido nucleico particulares da invenção são os nucleotideos 502 a 1065, ou 1 a 1065, da SEQ ID NO: 1, dos quais os nucleotideos 502 a 1065 da SEQ ID NO: 1, correspondem ao polipeptídeo maduro que codifica a região, assim como os nucleotideos 1 a 1143, preferivelmente 568 a 1143, da SEQ ID NO: 5. A presente invenção também abrange as seqüências de ácido nucleico que codificam um polipeptídeo tendo a seqüência de aminoácido dos aminoácidos -167 a 188, preferivelmente 1 a 188, da SEQ ID NO: 2, ou os aminoácidos -160 a 192, preferivelmente 1 a 192, da SEQ ID NO: 6, que diferem das partes correspondentes da SEQ ID NO: 1 em virtude da degeneração do código genético. A presente invenção também diz respeito às subseqüências das SEQ ID NOs: 1, ou 5, que codificam os fragmentos das SEQ ID NOs: 2 e 6, respectivamente, que têm atividade de protease.

Uma subseqüência de cada uma das SEQ ID NOs: 1 ou 5 é uma seqüência de ácido nucleico abrangida por cada uma das SEQ ID NOs: 1 ou 5, exceto que um ou mais nucleotideos da extremidade 5’ e/ou 3’ foram suprimidos. Preferivelmente, uma subseqüência contem pelo menos 225 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 300 nucleotídeos, ainda mais preferivelmente pelo menos 375, 450, 500, 531, 600, 700, 800, 900 ou 1000 nucleotídeos. A presente invenção também diz respeito às seqüências de nucleotídeo que têm um grau de identidade para (i) os nucleotídeos 502 a 1065 da SEQ ID NO: 1, e/ou os nucleotídeos 568 a 1143 da SEQ ID NO: 5, ou para (ii) os nucleotídeos 1 a 1065 da SEQ ID NO: 1, e/ou os nucleotídeos 88 a 1143 da SEQ ID NO: 5, de pelo menos 74 %. Em formas de realização particulares, o grau de identidade para cada um dos nucleotídeos de (i) ou (ii) é pelo menos de 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou pelo menos 99 %. Em outras formas de realização particulares, o grau de identidade para cada um dos nucleotídeos de (i) ou (ii) é pelo menos de 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, ou pelo menos 73 %. A presente invenção também diz respeito às seqüências de ácido nucleico mutantes compreendendo pelo menos uma mutação em cada uma das SEQ ID NOs: 1 ou 5, preferivelmente no peptídeo maduro que codifica as partes, em que a seqüência de ácido nucleico mutante codifica um polipeptídeo que (i) consiste dos aminoácidos -167 a 188, preferivelmente 1 a 188, da SEQ ID NO: 2, ou os aminoácidos -160 a 192, preferivelmente 1 a 192, da SEQ ID NO: 6; ou (ii) é uma variante de qualquer uma das seqüências de (i), em que a variante compreende uma substituição, deleção, e/ou inserção de um ou mais aminoácidos, ou (iii) é uma variante alélica de qualquer uma das seqüências de (i), ou (iv) é um fragmento de qualquer uma das seqüências de (i).

As técnicas usadas para isolar ou clonar uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo são conhecidas no ramo e incluem o isolamento do DNA genômico, a preparação do cDNA, ou uma combinação destes. A clonagem das seqüências de ácido nucleico da presente invenção a partir das quais o DNA genômico pode ser produzido, por exemplo, usando-se a reação de cadeia de polimerase bem conhecida (PCR) ou triagem de anticorpo da biblioteca de expressão para detectar os fragmentos de DNA clonados com aspectos estruturais compartilhados. Ver, por exemplo, Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, Nova Iorque. Outros procedimentos de amplificação de ácido nucleico tais como reação de cadeia de ligase (LCR), transcrição ativada ligada (LAT) e amplificação com base em seqüência de ácido nucleico (NASBA) podem ser usados. As seqüência de ácido nucleico pode ser clonada a partir de uma cepa de Nocardiopsis ou uma outra ou organismo relacionado e assim, por exemplo, podem ser uma variante alélica ou de espécie do polipeptídeo que codifica a região da seqüência de ácido nucleico. O termo “seqüência de ácido nucleico isolado” como aqui usado refere-se a uma seqüência de ácido nucleico que é essencialmente isenta de outras seqüências de ácido nucleico, por exemplo, pelo menos de cerca de 20 % de pureza, preferivelmente pelo menos cerca de 40 % de pureza, mais preferivelmente pelo menos cerca de 60 % de pureza, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 80 % de pureza, e o mais preferivelmente pelo menos cerca de 90 % de pureza como determinado pela eletrotroforese de agarose. Por exemplo, uma seqüência de ácido nucleico isolado pode ser obtida por procedimentos de clonagem padrão usados na engenharia genética para transferir a seqüência de ácido nucleico de seu local natural a um sítio diferente onde ela será reproduzida. Os procedimentos de clonagem podem envolver a excisão e o isolamento de um fragmento de ácido nucleico desejado compreendendo a seqüência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo, a inserção do fragmento em uma molécula vetorial, e a incorporação do vetor recombinante em uma célula hospedeira onde as cópias ou clones múltiplos da seqüência de ácido nucleico serão duplicados. A seqüência de ácido nucleico podem ser de origem genômica, de cDNA, de RNA, semissintética, sintética, ou qualquer combinações destes. A modificação de uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da presente invenção pode ser necessária para a síntese de polipeptídeos substancialmente similares ao polipeptídeo. O termo “substancialmente similar” ao polipeptídeo refere-se às formas que não ocorrem naturalmente do polipeptídeo. Estes polipeptídeos podem diferir em algum caminho engendrado do polipeptídeo isolado a partir de sua fonte natural, por exemplo, as variantes que diferem em atividade específica, estabilidade térmica, condição mais favorável de pH, alergenicidade, ou coisa parecida. A seqüência variante pode ser construída na base da seqüência de ácido nucleico apresentada como o polipeptídeo que codifica parte das SEQ ID NOs: 1 e/ou 5, por exemplo,, uma subseqüência deste, e/ou por introdução de substituições de nucleotídeo que não origina uma outra seqüência de aminoácido do polipeptídeo codificado pela seqüência de ácido nucleico, mas que corresponde ao uso do códon do organismo hospedeiro intencionado para a produção da protease, ou por introdução de substituições de nucleotídeo que podem originar uma seqüência de aminoácido diferente. Para uma descrição geral da substituição de nucleotídeo, ver, por exemplo, Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95 a 107. Os polipeptídeos alergênicos baixos por exemplo, podem ser preparados como descrito acima.

Estará evidente àqueles habilitados na técnica que tais substituições podem ser feitas fora das regiões críticas à função da molécula e ainda resultam em um polipeptídeo ativo. Os resíduos de aminoácido essenciais à atividade do polipeptídeo codificados pela seqüência de ácido nucleico isolado da invenção, e portanto preferivelmente não são submetidos à substituição, podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tais como a mutagênese direcionada por sítio ou mutagênese de varredura de alanina (ver, por exemplo, Cimnmgham e Wells, 1989, Science 244: 1081 a 1085). Na técnica posterior, as mutações são introduzidas em cada resíduo positivamente carregado na molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas quanto à atividade de protease para identificar os resíduos de aminoácido que são críticos à atividade da molécula. Os sítios de interação substrato-protease também podem ser determinados pela análise da estrutura tridimensional como determinado por tais técnicas como análise de ressonância magnética nuclear, cristalografia ou rotulagem de fotoafinidade (ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306 a 312; Smith et al., 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899 a 904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309: 59 a 64). A presente invenção também diz respeito às seqüências de ácido nucleico isolado que codificam um polipeptídeo da presente invenção, que hibridiza sob condições de estringência muito baixa, preferivelmente condições de estringência baixa, mais preferivelmente condições de estringência média, mais preferivelmente condições de estringência média a alta, ainda mais preferivelmente condições de estringência alta, e o mais preferivelmente condições de estringência muito alta com uma sonda de ácido nucleico que hibridiza sob as mesmas condições com a seqüência de ácido nucleico das SEQ ID NO: 1 e/ou 5, ou seus filamentos complementares; ou variantes alélicas e subseqüências destes (Sambrook et al., 1989, supra), como aqui definido. A presente invenção também diz respeito às seqüências de ácido nucleico isolado produzidas (a) hibridizando-se um DNA sob condições de estringência muito baixa, baixa, média, média a alta, alta, ou muito alta com (i) os nucleotídeos 1 a 1065, preferivelmente 502 a 1065, da SEQ ID NO: 1, ou os nucleotídeos 1 a 1143, ou 88 a 1143, preferivelmente 568 a 1143 da SEQ ID NO: 5, (ii) uma subseqüência de (i), ou (iii) um filamento complementar de (i), ou (ii); e (b) isolando-se a seqüência de ácido nucleico. A subseqüência é preferivelmente uma sequência de pelo menos .100 nucleotídeos tal como uma sequência que codifica um fragmento ae polipeptídeo que tem atividade de protease. Métodos para a Produção de Seqüências de Ácido Nucleico Mutantes A presente invenção diz respeito ainda aos métodos para a produção de uma seqüência de ácido nucleico mutante, que compreende introduzir pelo menos uma mutação no polipeptídeo maduro que codifica a seqüência da SEQ ID NO: 1 e/ou 5, ou uma subseqüência deste, em que a seqüência de ácido nucleico mutante codifica um polipeptídeo que consiste dos aminoácidos -167 a 188, preferivelmente 1 a 188, da SEQ ID NO: 2, ou os aminoácidos -160 a 192, preferivelmente 1 a 192, da SEQ ID NO: 6; ou um fragmento deste que tem atividade de protease. A introdução de uma mutação na seqüência de ácido nucleico para trocar um nucleotídeo por um outro nucleotídeo pode ser realizada pela mutagênese direcionada por sítio usando qualquer um dos métodos conhecidos na técnica. Particularmente útil é o procedimento que utiliza um vetor de DNA de filamento duplo, superespiralado com uma inserção de interesse e dois iniciadores sintéticos contendo a mutação desejada. Os iniciadores de oligonucleotídeo, cada um complementar aos filamentos opostos do vetor, se estendem durante o ciclo de temperatura por meios de Pfú DNA polimerase. Na incorporação dos iniciadores, um plasmídeo mutado contendo cortes escalonados é gerado. Seguindo o ciclo de temperatura, o produto é tratado com Dpnl que é específico para o DNA metilado e semimetilado para digerir o modelo de DNA parenteral e para selecionar quanto ao DNA sintetizado contendo mutação. Outros procedimentos conhecidos na técnica também podem ser usados.

Construções de Ácido Nucleico A presente invenção também diz respeito às construções de ácido nucleico compreendendo uma seqüência de ácido nucleico da presente invenção operavelmente ligada a uma ou mais seqüências de controle que conduzem a expressão da sequência de codificação em uma célula hospedeira adequada sob condições compatíveis com as seqüências de controle. A expressão será entendida incluir qualquer etapa envolvida na produção do polipeptídeo incluindo, mas não limitada a, transcrição, modificação pós transcricional, tradução, modificação pós translacional, e secreção. A “construção de ácido nucleico” é aqui definida como uma molécula de ácido nucleico, de filamento simples ou duplo, que é isolada a partir de um gene que ocorrem naturalmente ou que foi modificada para conter os segmentos de ácido nucleico combinados e justapostos em uma maneira que de outro modo não existiría na natureza. O termo construção de ácido nucleico é sinônimo com o termo cassete de expressão quando a construção de ácido nucleico contém todas as seqüências de controle necessárias para a expressão de uma seqüência de codificação da presente invenção. O termo “seqüência de codificação” é aqui definido como uma seqüência de ácido nucleico que especifica diretamente a seqüência de aminoácido de seu produto de proteína. Os limites da seqüência de codificação no geral são determinados por um sítio de ligação de ribossomo (procariotas) ou pelo códon de início de ATG (eucariotas) localizados exatamente a montante da estrutura de leitura aberta na extremidade 5’ do mRNA e uma seqüência terminadora de transcrição localizada exatamente a jusante da estrutura de leitura aberta na extremidade 3’ do mRNA. Uma seqüência de codificação pode incluir, mas não é limitada a, DNA, cDNA, e seqüências de ácido nucleico recombinantes.

Uma seqüência de ácido nucleico isolado que codifica um polipeptídeo da presente invenção pode ser manipulada em uma variedade de caminhos para fornecer a expressão do polipeptídeo. A manipulação da seqüência de ácido nucleico antes de sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificar as seqüências de ácido nucleico que utilizam os métodos de DNA recombinante são bem conhecidas no ramo. O termo “seqüências de controle” é aqui definido a incluir todos os componentes que são necessários ou vantajosos para a expressão de um polipeptídeo da presente invenção. Cada seqüência de controle pode ser natural ou estranha à seqüência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo. Tais seqüências de controle incluem, mas não são limitadas a, um líder, seqüência de poliadenilação, seqüência de propeptídeo, promotora, seqüência de peptídeo de sinal, e terminadora de transcrição. Em um mínimo, as seqüências de controle incluem uma promotora, e sinais de interrupção transcricional e translacional. As seqüências de controle podem ser fornecidas com ligadores para o propósito de introduzir sítios de restrição específicos que facilitam a ligação das seqüências de controle com a região de codificação da seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo. O termo “operavelmente ligado” é aqui definido como uma configuração em que uma seqüência de controle é apropriadamente colocada em uma posição relativa à seqüência de codificação da seqüência de DNA tal que a seqüência de controle conduz a expressão de um polipeptídeo. A seqüência de controle pode ser uma seqüência promotora apropriada, uma seqüência de ácido nucleico que é reconhecida por uma célula hospedeira para a expressão da seqüência de ácido nucleico. A seqüência promotora contém seqüências de controle transcricionais que medeiam a expressão do polipeptídeo. A promotora pode ser qualquer seqüência de ácido nucleico que apresenta atividade transcricional na célula hospedeira de escolha incluindo as promotoras mutantes, truncadas, e híbridas, e podem ser obtidas a partir de genes que codificam os polipeptídeos extracelulares ou intracelulares homólogos ou heterólogos à célula hospedeira.

Os exemplos de promotoras adequadas para conduzir a transcrição das construções de ácido nucleico da presente invenção, especialmente em uma célula hospedeira bacteriana, são as promotoras obtida a partir do operon lac da E coli, gene de agarase de Streptomyces coelicolor (dagA), gene de levansucrase de Bacillus subtilis (sacB), gene de alfa-amilase de Bacillus licheniformis (amyL), gene de amilase maltogênica de Bacillus stearothermophilus (amyM), gene de alfa-amilase de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), gene de penincilinase de Bacillus licheniformis (penP), genes de xylA e xylB de Bacillus subtilis, e gene de beta-lactamase procariótico (Yilla-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727 a 3731), assim como The Tac Promoter (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21 a 25). Outras promotoras são descritas em “Useful proteins from recombinant bactéria” em Scientific American, 1980, 242: 74 a 94; e em Sambrook et al., 1989, supra.

Os exemplos de promotoras adequadas para conduzir a transcrição das construções de ácido nucleico da presente invenção em uma célula hospedeira fungica filamentosa são promotoras obtidas dos genes para amilase de Aspergillus oryzae TAKA, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilase estável em ácido de Aspergillus niger, glucoamilase de Aspergillus niger ou Aspergillus awamori (glaA), lipase de Rhizomucor miehei, protease alcalina de Aspergillus oryzae, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae, acetamidase de Aspergillus nidulans, e protease tipo tripsina Fusarium oxysporum (WO 96/00787), assim como a promotora de NA2-tpi (um híbrido das promotoras dos genes para a alfa-amilase neutra de Aspergillus niger e triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae), e as promotoras mutantes, truncadas, e híbridas destes.

Em um hospedeiro de levedura, as promotoras úteis são obtidas a partir dos genes para enolase de Saccharomyces cerevisiae (ENO- 1), galactocinase de Saccharomyces cerevisiae (GAL1), desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase alcoólica de Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP), e 3-fosfoglicerato cinase de Saccharomyces cerevisiae. Outras promotoras úteis para as células hospedeiras de levedura são descritas por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423 a 488. A seqüência de controle também pode ser uma seqüência terminadora de transcrição adequada, uma seqüência reconhecida por uma célula hospedeira para terminar a transcrição. A seqüência terminadora é operavelmente ligada ao término 3’ da seqüência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo. Qualquer terminadora que é funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usada na presente invenção.

Os terminadores preferidos para as células hospedeiras füngicas filamentosas são obtidas a partir dos genes para amilase de Aspergillus oryzae TAKA, glucoamilase de Aspergillus niger, antranilato sintase de Aspergillus nidulans, alfa-glicosidase de Aspergillus niger, e protease tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

Os terminadores preferidos para as células hospedeiras de levedura são obtidas a partir dos genes para enolase de Saccharomyces cerevisiae, citocroma de Saccharomyces cerevisiae C(CYC1), e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae. Outros terminadores úteis para as células hospedeiras de levedura são descritas por Romanos et al., 1992, supra.

Os terminadores preferidos para as células hospedeiras bacterianas, tais como uma célula hospedeira de Bacillus, são os terminadores do gene de alfa-amilase de Bacillus licheniformis (amyL), o gene de amilase maltogênica de Bacillus stearothermophilus (amyM), ou o gene de alfa-amilase de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ). A seqüência de controle também pode ser uma seqüência líder adequada, uma região não traduzida de um mRNA que é importante para a tradução pela célula hospedeira. A sequência líder é operavelmente ligada ao término 5’ da seqüência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo. Qualquer seqüência líder que é funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usada na presente invenção.

Os líderes preferidos para as células hospedeiras fungicas filamentosas são obtidas a partir dos genes para amilase de Aspergillus oryzae TAKA e triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans.

Os líderes adequados para as células hospedeiras de levedura são obtidas a partir dos genes para enolase de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), 3-fosfoglicerato cinase de Saccharomyces cerevisiae, fator alfa de Saccharomyces cerevisiae, e desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase alcoólica de Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP). A seqüência de controle também pode ser uma seqüência de poliadenilação, uma seqüência operavelmente ligada ao término 3’ da seqüência de ácido nucleico e que, quando transcrita, é reconhecida pela célula hospedeira como um sinal para adicionar os resíduos de poliadenosina ao mRNA transcrito. Qualquer seqüência de poliadenilação que é funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usada na presente invenção.

As seqüências de poliadenilação preferidas para as células hospedeiras fungicas filamentosas são obtidas a partir dos genes para amilase de Aspergillus oryzae TAKA, glucoamilase de Aspergillus niger, antranilato sintase de Aspergillus nidulans, protease tipo tripsina de Fusarium oxysporum, e alfa-glicosidase de Aspergillus niger.

As seqüências de poliadenilação úteis para as células hospedeiras de levedura são descritas por Guo e Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983 a 5990. A seqüência de controle também pode ser uma região de codificação de peptídeo de sinal que codifica uma seqüência de aminoácido ligada ao término amino de um polipeptídeo e ccmduz o polipeptídeo codificado na via secretória da célula. A extremidade 5’ da sequência de codificação da seqüência de ácido nucleico pode conter inerentemente uma região de codificação de peptídeo de sinal naturalmente ligada na estrutura de leitura de tradução com o segmento da região de codificação que codifica o polipeptídeo secretado. Altemativamente, a extremidade 5’ da seqüência de codificação pode conter uma região de codificação de peptídeo de sinal que é estranha à seqüência de codificação. A região de codificação de peptídeo de sinal estranha pode ser necessária onde a seqüência de codificação não contém naturalmente uma região de codificação de peptídeo de sinal. Altemativamente, a região de codificação de peptídeo de sinal estranha pode substituir simplesmente a região de codificação de peptídeo de sinal natural de modo a realçar a secreção do polipeptídeo. Entretanto, qualquer região de codificação de peptídeo de sinal que conduz o polipeptídeo expressado na via secretória de uma célula hospedeira de escolha pode ser usada na presente invenção.

As regiões de codificação de peptídeo de sinal eficaz para as células hospedeiras bacterianas são as regiões de codificação de peptídeo de sinal obtidas dos genes de amilase maltogênica de Bacillus NCIB 11837, alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, subtilisina de Bacillus licheniformis, alfa-amilase de Bacillus licheniformis, proteases neutras de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM), e prsA de Bacillus subtilis. Outros peptídeos de sinal são descritos por Simonen e Paiva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109 a 137.

As regiões de codificação de peptídeo de sinal eficaz das células hospedeiras fungicas filamentosas são as regiões de codificação de peptídeo de sinal obtidas dos genes de amilase de Aspergillus oryzae TAKA, amilase neutra Aspergillus niger, glucoamilase de Aspergillus niger, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, celulase de Humicola insolens, e lipase de Humicola lanuginosa.

Os peptídeos de sinal úteis das células hospedeiras de levedura são obtidas dos genes de fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertase de Saccharomyces cerevisiae. Outras regiões de codificação de peptídeo de sinal úteis são descritas por Romanos et al., 1992, supra. A seqüência de controle também pode ser uma região de codificação de propeptídeo que codifica uma seqüência de aminoácido posicionada no término amino de um polipeptídeo. O polipeptídeo resultante é conhecido como uma proenzima ou propolipeptídeo (ou um zimogênio em alguns casos). Um propolipeptídeo no geral é inativo e pode ser convertido a um polipeptídeo ativo maduro por divagem catalítica ou autocatalítica do propeptídeo a partir do propolipeptídeo. A região de codificação de propeptídeo pode ser obtida a partir dos genes de protease alcalina de Bacillus subtilis (aprE), protease neutra de Bacillus subtilis (nprT), fator alfa de Saccharomyces cerevisiae, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, e lacase de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836).

Em uma forma de realização preferida, a região de codificação de propeptídeo é os nucleotídeos 1 a 501 da SEQ ID NO: 1, ou os nucleotídeos 30 a 189 da SEQ ID NO: 6.

Onde tanto as regiões de peptídeo de sinal quanto de propeptídeo estão presentes no término amino de um polipeptídeo, a região de propeptídeo está posicionada próxima ao término amino de um polipeptídeo e a região de peptídeo de sinal está posicionada próxima ao término amino da região de propeptídeo.

Também pode ser desejável adicionar seqüências reguladoras que permitem a regulação da expressão do polipeptídeo relativa ao crescimento da célula hospedeira. Os exemplos de sistemas reguladores são aqueles que causam a expressão do gene a ser ligado ou desligado em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulador. Os sistemas reguladores em sistemas procarióticos incluem os sistemas operadores de lac, tac, e trp. Em levedura, o sistema ADH2 ou sistema GAL1 podem ser usados. Em fungos filamentosos, a promotora de alfa-amilase de TAKA, promotora de glucoamilase de Aspergillus niger, e promotora de glucoamilase de Aspergillus oryzae podem ser usadas como seqüências reguladoras. Outros exemplos de seqüências reguladoras são aquelas que permitem a amplificação de gene. Em sistemas eucarióticos, estas incluem o gene da diidrofolato redutase que é amplificado na presença de metotrexato, e os genes da metalotioneína que são amplificados com metais pesados. Nestes casos, a seqüência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo seria operavelmente ligada com a seqüência reguladora.

Vetores de expressão A presente invenção também diz respeito aos vetores de expressão recombinantes compreendendo uma seqüência de ácido nucleico da presente invenção, uma promotora, e sinais de interrupção transcricional e translacional. As várias seqüências de ácido nucleico e de controle descritas acima podem ser unidas juntas para produzir um vetor de expressão recombinante que pode incluir um ou mais sítios de restrição convenientes para permitir a inserção ou substituição da seqüência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo em tais sítios. Altemativamente, a seqüência de ácido nucleico da presente invenção pode ser expressada inserindo-se a seqüência de ácido nucleico ou uma construção de ácido nucleico compreendendo a seqüência em um vetor apropriado para a expressão. Na criação do vetor de expressão, a seqüência de codificação está localizada no vetor de modo que a seqüência de codificação é operavelmente ligada com as seqüências de controle apropriadas para a expressão. O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (por exemplo, um plasmídeo ou vírus) que pode ser convenientemente submetido aos procedimentos de DNA recombinante e pode levar a cerca da expressão da seqüência de ácido nucleico. A escolha do vetor dependerá tipicamente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor dever ser introduzido. Os vetores podem ser plasmídeos lineares ou circulares fechados. O vetor pode ser um vetor autonomamente de replicação, isto é, um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, a replicação da qual é independente da replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossomo, ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter qualquer meio para garantir a auto-replicação. Altemativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, é integrado no genoma e duplicado junto com o(s) cromossomo(s) no(s) qual(is) ele foi integrado. Além disso, um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que contém juntos o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um transposon podem ser usados.

Os vetores da presente invenção contêm preferivelmente um ou mais marcadores selecionáveis que permitem a seleção fácil de células transformadas. Um marcador selecionável é um gene do produto do qual fornece resistência biocida ou viral, resistência aos metais pesados, fototrofia aos auxotrofos, e outros. Os exemplos de marcadores selecionáveis bacterianos são os genes de dal de Bacillus subtilis ou Bacillus licheniformis. Os marcadores adequados para as células hospedeiras de levedura são ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, e URA3. Os marcadores selecionáveis para o uso em uma célula hospedeira fungica filamentosa incluem, mas não são limitados a, amdS (acetamidase), argB (omitina carbamoiltransferase), bar (fosfinotricina acetiltransferase), hygB (higromicina fosfotransferase), niaD (nitrato redutase), pyrG (orotidina-55 -fosfato descarboxilase), sC (sulfato adeniltransferase), trpC (antranilato sintase), assim como os equivalentes destes. Preferidos para o uso em uma célula de Aspergillus são os genes amdS e pyrG de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae e o gene bar de Streptomyces hygroscopicus.

Os vetores da presente invenção contêm preferivelmente um elemento que permite a integração estável do vetor no genoma da célula hospedeira ou replicação autônoma do vetor na célula independente do genoma.

Para a integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode confiar na seqüência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo ou qualquer outro elemento do vetor para a integração estável do vetor no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga. Altemativamente, o vetor pode conter seqüências de ácido nucleico adicionais para conduzir a integração pela recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira. As seqüências de ácido nucleico adicionais permitem que o vetor seja integrado no genoma da célula hospedeira em um local preciso no(s) cromossomo(s). Para aumentar a probabilidade de integração em um local preciso, os elementos integracionais devem conter preferivelmente um número suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 1.500 pares de base, preferivelmente 400 a 1.500 pares de base, e o mais preferivelmente 800 a 1.500 pares de base, que são altamente homólogos com a seqüência alvo correspondente para realçar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos integracionais podem ser qualquer seqüência que é homóloga com a seqüência alvo no genoma da célula hospedeira. Além disso, os elementos integracionais podem ser as seqüências de ácido nucleico de não codificação ou de codificação. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não homóloga.

Para a replicação autônoma, o vetor pode compreender ainda uma origem de replicação que permite que o vetor se replique autonomamente na célula hospedeira em questão. Os exemplos de origens bacterianas de replicação são as origens de replicação dos plasmídeos pBR322 pUC19, pACYC177, e pACYC184 que permitem a replicação em E. coli, e pUBl 10, pE194, pTA1060, e ρΑΜβΙ que permitem a replicação em Bacillus. Os exemplos de origens de replicação para o uso em uma célula hospedeira de levedura são a origem de 2 mícrons de replicação, ARS1, ARS4, a combinação de ARS1 e CEN3, e a combinação de ARS4 e CEN6. A origem de replicação pode ser uma que tem uma mutação que a faz funcionar na temperatura sensível na célula hospedeira (ver, por exemplo, Ehrlich, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1433).

Mais do que uma cópia de uma seqüência de ácido nucleico da presente invenção pode ser inserida na célula hospedeira para aumentar a produção do produto genético. Um aumento no número de cópia da seqüência de ácido nucleico pode ser obtido integrando-se pelo menos uma cópia adicional da seqüência no genoma da célula hospedeira ou incluindo-se um gene de marcador selecionável ampliável com a seqüência de ácido nucleico onde as células contendo as cópias amplificadas do gene de marcador selecionável, e desse modo as cópias adicionais da seqüência de ácido nucleico, podem ser selecionadas cultivando-se as células na presença do agente selecionável apropriado.

Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos acima para construir os vetores de expressão recombinantes da presente invenção são bem conhecidos a uma pessoa habilitada na técnica (ver, por exemplo, Sambrook etal., 1989, supra). A protease também pode ser co-expressada junto com pelo menos uma outra enzima de interesse para a ração para animal, tal como uma amilase, por exemplo alfa-amilase (EC 3.2.1.1), fitase (EC 3.1.3.8 ou 3.1.3.26); xilanase (EC 3.2.1.8); galactanase (EC 3.2.1.89); alfa-galactosidase (EC 3.2.1.22); protease (EC 3.4.-.-), fosfolipase Al (EC 3.1.1.32); fosfolipase A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipase (EC 3.1.1.5); fosfolipase C (3.1.4.3); fosfolipase D (EC 3.1.4.4); e/ou beta-glucanase (EC 3.2.1.4 ou EC 3.2.1.6).

As enzimas podem ser co-expressadas a partir de vetores diferentes, a partir de um vetor, ou usando um mistura de ambas as técnicas. Quando do uso de vetores diferentes, os vetores podem ter marcadores selecionáveis diferentes, e origens diferentes de replicação. Quando do uso de apenas um vetor, os genes podem ser expressados a partir de uma ou mais promotoras. Se clonados sob a regulação de uma promotora (di- ou multi-cistrônica), a ordem em que os genes são clonados pode afetar os níveis expressão das proteínas. A protease também pode ser expressada como uma proteína de fusão, isto é, que o gene que codifica a protease foi fundido na estrutura ao gene que codifica uma outra proteína. Esta proteína pode ser uma outra enzima ou um domínio funcional a partir de uma outra enzima. Células hospedeiras A presente invenção também diz respeito às células hospedeiras recombinantes, compreendendo uma seqüência de ácido nucleico da invenção, que são vantajosamente usadas na produção recombinante dos polipeptídeos. Um vetor compreendendo uma seqüência de ácido nucleico da presente invenção é introduzido em uma célula hospedeira de modo que o vetor é mantido como um integrante cromossômico ou como um vetor extra-cromossômico de auto-replicação como descrito mais no início. O termo “célula hospedeira” abrange qualquer progênie de uma célula precursora que não é idêntica à célula precursora devido às mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira em uma grande proporção dependerá do gene que codifica o polipeptídeo e da sua fonte. A célula hospedeira pode ser um microorganismo unicelular, por exemplo, um procariota, ou um microorganismo não unicelular, por exemplo, um eucariota.

As células unicelulares úteis são células bacterianas tais como as bactérias gram positivas incluindo, mas não limitadas a, uma célula de Bacillus, ou uma célula de Streptomyces, ou células de bactérias de ácido láctico; ou bactérias gram negativas tais como E. coli e Pseudomonas sp. As bactérias de ácido láctico incluem, mas não são limitadas, às espécies dos gêneros Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus, Pediococcus, e Enterococcus. A introdução de um vetor em uma célula hospedeira bacteriana, por exemplo, pode ser efetuada por transformação de protoplasta (ver, por exemplo, Chang e Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111 a 115), usando as células competentes (ver, por exemplo, Young e Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823 a 829, ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209 a 221), eletroporação (ver, por exemplo, Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742 a 751), ou conjugação (ver, por exemplo, Koehler e Thome, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771 a 5278). A célula hospedeira pode ser um eucariota, tal como uma célula animal não humana, uma célula de inseto, uma célula vegetal, ou uma célula fungica.

Em uma forma de realização particular, a célula hospedeira é uma célula fungica. “Fungos” como aqui usado inclui os filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, e Zygomycota (como definido por Hawksworth et al., em, Ainsworth e Bisby’s Dictionary of The Fungi, 8~ edição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK) assim como o Oomycota (como citado em Hawksworth et al., 1995, supra, página 171) e todos os fungos mitospóricos (Hawksworth et al., 1995, supra).

Em uma outra forma de realização particular, a célula hospedeira fungica é uma levedura célula. “Levedura” como aqui usado inclui a levedura ascoesporogenosa (Endomycetales), levedura basidioesporogenosa, e a levedura que pertence ao Fungi Imperfecti (Blastomycetes). Visto que a classificação da levedura pode alterar no futuro, para os propósitos desta invenção, a levedura deve ser definida como descritos em Biology and Activities of Yeast (Skinner, F. A., Passmore, S. M. , e Davenport, R. R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Série N° 9.1980). A célula hospedeira de levedura pode ser uma cálula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou Yarrowia. A célula hospedeira fungica pode ser uma célula fungica filamentosa. Os “fungos filamentosos” incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota (como definido por Hawksworth et al., 1995, supra). Os fungos filamentosos são caracterizados por uma parede micelial composta de quitina, celulose, glicano, quitosano, manana, e outros polissacarídeos complexos. O crescimento vegetativo é por prolongação hifal e o catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbico. Ao contrário, o crescimento vegetativo pelas leveduras tais como Saccharomyces cerevisiae é por germinação de um talo unicelular e o catabolismo do carbono pode ser fermentativo.

Os exemplos de células hospedeiras fungicas filamentosas são as células das espécies de, mas não limitadas a, Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolypocladium, ou Trichoderma.

As células fungicas podem ser transformadas por um processo que envolve a formação de protoplasta, transformação dos protoplastos, e regeneração da parede celular em uma maneira conhecida por si. Os procedimentos adequados para a transformação das células hospedeiras de Aspergillus são descritos na EP 238 023 e Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470 a 1474. Os métodos adequados para transformar as espécies de Fusarium são descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147 a 156 e WO 96/00787. A levedura pode ser transformada usando os procedimentos descritos por Becker e Guarente, em Abelson, J. N. e Simon, M. I., editores, Guide to Yéast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, páginas 182 a 187, Academic Press, Inc., Nova Iorque; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920. Métodos de Produção A presente invenção também diz respeito aos métodos para a produção de um polipeptídeo da presente invenção compreendendo (a) cultivar uma cepa, que em sua forma do tipo selvagem é capaz de produzir o polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo. Preferivelmente, a cepa é do gênero Nocardiopsis, mais preferivelmente Nocardiopsis prasina, Nocardiopsis antarctica, Nocardiopsis dassonvillei ou Nocardiopsis alba, o mais preferivelmente Nocardiopsis alba DSM 15647, ou Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei DSM 43235. A presente invenção também diz respeito aos métodos para a produção de um polipeptídeo da presente invenção compreendendo (a) cultivar uma célula hospedeira sob condições conducentes para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo. A presente invenção também diz respeito aos métodos para a produção de um polipeptídeo da presente invenção compreendendo (a) cultivar uma célula hospedeira sob condições conducentes para a produção do polipeptídeo, em que a célula hospedeira compreende uma seqüência de ácido nucleico mutante compreendendo pelo menos uma mutação nos nucleotídeos 502 a 1065, ou 1 a 1065, da SEQ ID NO: 1, ou nos nucleotídeos 1 a 1143, 88 a 1143, preferivelmente 568 a 1143 da SEQ ID NO: 5, em que a seqüência de ácido nucleico mutante codifica um polipeptídeo que (i) consiste dos aminoácidos 1 a 188, ou -167 a 188, da SEQ ID NO: 2, ou os aminoácidos -160 a 192, preferivelmente 1 a 192, da SEQ ID NO: 6, ou (ii) é uma variante de qualquer uma das sequências de (i), em que a variante compreende uma substituição, deleção, e/ou inserção de um ou mais aminoácidos, ou (iii) é uma variante alélica de qualquer uma das seqüências de (i), ou (iv) é um fragmento de qualquer uma das seqüências de (i).

Nos métodos de produção da presente invenção, as células são cultivadas em um meio nutriente adequado para a produção do polipeptídeo usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada por cultivo em frasco de agitação, fermentação em escala pequena ou escala grande (incluindo as fementações contínua, em lote, em lote alimentado, ou de estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industriais realizados em um meio adequado e sob condições que permitem que o polipeptídeo seja expressado e/ou isolado. O cultivo ocorre em um meio nutriente adequado compreendendo fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica. Os meios adequados estão disponíveis de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com as composições publicadas (por exemplo, em catálogos da American Type Culture Collection). Se o polipeptídeo é secretado no meio nutriente, o polipeptídeo pode ser recuperado diretamente a partir do meio. Se o polipeptídeo não é secretado, ele pode ser recuperado a partir de lisatos celulares.

Os polipeptídeos podem ser detectados usando métodos conhecidos na técnica que são específicos para os polipeptídeos. Estes métodos de detecção podem incluir o uso de anticorpos específicos, a formação de um produto, ou o desaparecimento de um substrato. Por exemplo, um ensaio de protease pode ser usado para determinar a atividade do polipeptídeo como aqui descrito. O polipeptídeo resultante pode ser recuperado por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser recuperado a partir do meio nutriente por procedimentos convencionais incluindo, mas não limitados a, centrifugação, filtração, extração, secagem por pulverização, evaporação, ou precipitação.

Os polipeptídeos da presente invenção podem ser purificados por nma variedade de procedimentos conhecidos na técnica incluindo, mas não limitados a, cromatografia (por exemplo, de troca de íon, de afinidade, hidrofóbica, de cromatofocalização, e de exclusão de tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focalização isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação de sulfato de amônio), SDS-PAGE, ou extração (ver, por exemplo, Protein Purification, J. C. Janson e Lars Ryden, editors, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989).

Plantas A presente invenção também diz respeito a uma planta transgênica, parte da planta, ou célula vegetal que foi transformada com uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo tendo atividade de protease da presente invenção de modo a expressar e produzir o polipeptídeo em quantidades recuperáveis. O polipeptídeo pode ser recuperado a partir da planta ou parte da planta. Altemativamente, a planta ou parte da planta contendo o polipeptídeo recombinante pode ser usada como tal para melhorar a qualidade de um alimento ou alimentação, por exemplo, melhorando o valor nutricional, palatabilidade, e propriedades reológicas, ou para destruir um fator antinutritivo.

Em uma forma de realização particular, o polipeptídeo é alvejado aos vacúolos de armazenamento de endosperma nas sementes. Isto pode ser obtido sintetizando-o como um precursor com um peptídeo de sinal adequado, ver Horvath et al em PNAS, 15 de Fev., 2000, vol. 97, Na 4, páginas 1914 a 1919. A planta transgênica pode ser dicotiledônea (um dicot) ou monocotiledônea (um monocot) ou variantes engenheiradas destas. Os exemplos de plantas monocot são gramas, tais como grama do prado (grama azul, Poa), grama de forragem tal como Festuca, Lolium, grama de clima temperado, tal como Agrostis, e cereais, por exemplo, trigo, aveias centeio, cevada, arroz, sorgo, triticale (hibrido estabilizado de trigo (Triticum) e centeio (Secale), e milho (milho). Os exemplos de plantas dicot são tabaco, legumes, tais como tremoços, batata, beterraba, ervilha, feijão e soja, e plantas crucíferas (família Brassicaceaé), tais como girassol (Helianthus), algodão (<Gossypium), couve-flor, semente de colza, e o organismo modelo rigorosamente relacionado Arabidopsis thaliana. As plantas de fitato baixas como descrito por exemplo, na Patente US N- 5.689.054 e Patente US Na 6.111.168 são exemplos de plantas engenheiradas.

Os exemplos de partes da planta são caule, calo, folhas, raiz, frutas, sementes, e tubérculos, assim como os tecidos individuais que compreendem estas partes, por exemplo, epiderme, mesófilo, parênquima, tecidos vasculares, meristemas. Também os compartimentos da célula vegetal específicos, tais como cloroplasto, apoplasto, mitocôndria, vacúolo, peroxissomas, e citoplasma são considerados serem uma parte da planta. Além disso, qualquer célula vegetal, tudo quanto a origem de tecido, é considerada ser uma parte da planta. Desse modo, as partes da planta tais como tecidos e células específicas isoladas para facilitar a utilização da invenção também são considerados partes da planta, por exemplo, embriões, endospermas, aleurona e tegumentos.

Também incluída dentro do escopo da presente invenção está a progênie de tais plantas, partes da planta e células vegetais. A planta transgênica ou célula vegetal que expressa um polipeptídeo da presente invenção pode ser construída de acordo com métodos conhecido na técnica. Brevemente, a planta ou célula vegetal é construída incorporando-se uma ou mais construções de expressão que codificam um polipeptídeo da presente invenção no genoma hospedeiro vegetal e propagando-se a planta modificada resultante ou célula vegetal em uma planta transgênica ou célula vegetal.

Convenientemente, a construção de expressão é uma construção de ácido nucleico que compreende uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da presente invenção operavelmente ligado com seqüências reguladoras apropriadas necessárias para a expressão da seqüência de ácido nucleico na planta ou parte da planta de escolha. Além disso, a construção de expressão pode compreender um marcador selecionável útil para identificar as células hospedeiras nas quais a construção de expressão foi integrada e as seqüências de DNA necessárias para a introdução da construção na planta em questão (as últimas dependem do método de introdução de DNA a ser usado). A escolha de seqüências reguladoras, tais como as seqüências promotoras e terminadores e opcionalmente as seqüências de sinal ou trânsito são determinadas, por exemplo, na base de quando, onde, e como o polipeptídeo é desejado para ser expressado. Por exemplo, a expressão do gene que codifica um polipeptídeo da presente invenção pode ser constitutiva ou induzível, ou pode ser desenvolvente, de estágio ou específica de tecido, e o produto genético pode ser alvejado a um tecido ou parte da planta específicos tais como sementes ou folhas. As seqüências reguladoras são, por exemplo, descritas por Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506.

Para a expressão constitutiva, as promotoras seguintes podem ser usadas: a promotora 35S-CaMV (Franck et al., 1980, Cell 21: 285 a 294), a übiquitina de milho 1 (Christensen AH, Sharrock RA e Quail 1992. Genes de poliubiquitina de milho: estrutura, perturbação térmica da expressão e recomposição do transcrito, e atividade promotora seguindo a transferência aos protoplastos por eletroporação), ou a promotora de actina de arroz 1 (Plant Mo. Biol. 18, 675 a 689.; Zhang W, McElroy D. e Wu R 1991, Analysis of rice Actl 5’ region activity in transgenic rice plants. Plant Cell 3, 1155 a 1165). As promotoras específicas de órgão podem ser, por exemplo, uma promotora dos tecidos perecíveis em armazenagem tais como sementes, tubérculos de batata, e frutas (Edwards 8c Coruzzi, 1990, Am. Rev· Genet. 24: 275 a 303), ou dos tecidos perecíveis metabólicos tais como os meristemas (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863 a 878), uma promotora específica de semente tal como a promotora de glutelina, prolamina, globulina, ou albumina do arroz (Wu et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 885 a 889), um promotora de Vicia faba da legumina B4 e o gene de proteína da semente desconhecido de Vicia faba (Conrad et al., 1998, Journal of Plant Physiology 152: 708 a 711), uma promotora de uma proteína corpórea de óleo de semente (Chen et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 935 a 941), a promotora de proteína napA de armazenagem de Brassica napus, ou qualquer outra promotora específica de semente conhecida na técnica, por exemplo, como descrito na WO 91/14772. Além disso, a promotora pode ser uma promotora específica de folha tal como a promotora de rbcs de arroz ou tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiology 102: 991 a 1000, a promotora do gene de adenina metiltransferase do vírus chlorella (Mitra e Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26: 85 a 93), ou a promotora do gene de aldP de arroz (Kagaya et al., 1995, Molecular and General Genetics 248: 668 a 674), ou uma promotora induzível por ferimento tal como a promotora de pin2 de batata (Xu et al., 1993, Plant Molecular Biology 22: 573 a 588). Desse modo, a promotora pode ser induzível por tratamentos abióticos tais como temperatura, seca ou alterações em salinidade ou indutível por substâncias aplicadas exogenamente que ativam a promotora, por exemplo, etanol, estrógenos, hormônios vegetais como etileno, ácido ábscísico, ácido giberélico, e/ou metais pesados.

Um elemento realçador promotor também pode ser usado para obter expressão mais alta da protease na planta. Por exemplo, o elemento realçador promotor pode ser um intron que é colocado entre a sequência promotora e de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção. Por exemplo, Xu et al., 1993, supra divulga o uso do primeiro intron do gene de actina 1 de arroz para realçar a expressão Ainda mais, o uso do códon pode ser otimizado para as espécies vegetais em questão para melhorar a expressão (ver Horvath et al referido acima). O gene marcador selecionável e quaisquer outras partes da construção de expressão podem ser escolhidos a partir daqueles disponíveis na técnica. A construção de ácido nucleico é incorporada no genoma da planta de acordo com técnicas convencionais conhecidas no ramo, incluindo transformação mediada por Agrobacterium, transformação mediada por vírus, microinjeção, bombardeamento de partícula, transformação biolística, e eletroporação (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).

Presentemente, a transferência de gene mediada por Agrobacterium tumefaciens é o método de escolha para gerar dicots transgênicas (para uma revisão, ver Hooykas e Schilperoort, 1992, Plant Molecular Biology 19: 15 a 38), e ela também pode ser usado para transformar monocots, embora outros métodos de transformação no geral sejam preferidos para estas plantas. Presentemente, o método de escolha para gerar monocots transgênicas, suplementando o método da Agrobacterium, é o bombardeamento de partícula (partículas de ouro ou tungstênio microscópicas revestidas com o DNA de transformação) de calos embrionários ou o desenvolvimento de embriões (Christou, 1992, Plant Journal 2: 275 a 281; Shimamoto, 1994, Current Opinion Biotechnology 5: 158 a 162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667 a 674). Um método alternativo para a transformação de monocots é fundamentado na transformação de protoplasta como descrito por Omimlleh et al., 1993, Plant Molecular Biology 21: 415 a 428.

Seguindo a transformação, os transformantes tendo incorporada nesta a construção de expressão selecionados e regenerados em plantas inteiras de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. A presente invenção também diz respeito aos métodos para a produção de um polipeptídeo da presente invenção compreendendo (a) cultivar uma planta transgênica ou uma célula vegetal compreendendo uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo tendo atividade de protease da presente invenção sob condições conducentes para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

Animais A presente invenção também diz respeito a um animal não humano, transgênico e produtos ou elementos deste, os exemplos dos quais são fluidos corporais tais como células do leite e sangue, de órgãos, do corpo, e de animal. As técnicas para expressar as proteínas, por exemplo, em células mamíferas, são conhecidas no ramo, ver por exemplo, o manual Protein Expression: A Practical Approach, Higgins e Hames (eds), Oxford University Press (1999), e os três outros manuais nesta série que dizem respeito a Transcrição de Gene, Processamento de RNA, e Processamento Pós Translacional. Em geral, para preparar um animal transgênico, as células selecionadas de um animal selecionado são transformadas com uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo tendo atividade de protease da presente invenção de modo a expressar e produzir o polipeptídeo. O polipeptídeo pode ser recuperado do animal, por exemplo, a partir do leite dos animais fêmeas, ou o polipeptídeo pode ser expressado para o benefício do próprio animal, por exemplo, para auxiliar a digestão do animal. Os exemplos de animais são mencionados abaixo na seção liderada Ração para animal.

Para produzir um animal transgênico com a finalidade de recuperar a protease do leite do animal, um gene que codifica a protease pode ser inserido nos óvulos fertilizados de um animal em questão, por exemplo, pelo uso de um vetor de expressão de transgene que compreende uma promotora de proteína do leite adequada, e o gene que codifica a protease. O vetor de expressão de transgene é microinjetado nos óvulos fertilizados, e preferível permanentemente integrado no cromossomo. Uma vez que o óvulo começa a desenvolver e dividir, o embrião potencial é implantado em uma mãe sub-rogada, e os animais que carregam o transgene são identificados. O animal resultante depois pode ser multiplicado pela procriação convencional. O polipeptídeo pode ser purificado a partir do leite do animal, ver por exemplo, Meade, Η. M. et al (1999): Expression of recombinant proteins in the milk of transgenic animais, Gene expression systems: Using nature for the art of expression. J. M. Femandez e J. P. Hoeffler (eds.), Academic Press.

Na alternativa, de modo a produzir um animal não humano transgênico que carrega no genoma de suas células somáticas e/ou germinativas uma sequência de ácido nucleico incluindo uma construção de transgene heterólogo incluindo um transgene que codifica a protease, o transgene pode ser operavelmente ligado a uma primeira seqüência reguladora para a expressão específica da glândula salivar da protease, como divulgado na WO 2000064247.

Composições Ainda em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito às composições compreendendo um polipeptídeo da presente invenção.

As composições de polipeptídeo podem ser preparadas de acordo com os métodos conhecidos na técnica e podem estar na forma de uma composição líquida ou uma seca. Por exemplo, a composição de polipeptídeo pode estar na forma de um granulado ou um microgranulado. O polipeptídeo a ser incluído na composição pode ser estabilizado de acordo com métodos conhecidos na técnica.

Os exemplos são fornecidos abaixo dos usos preferidos dos polipeptídeos ou composições de polipeptídeo da invenção.

Ração para animal A presente invenção também é direcionada aos métodos para o uso dos polipeptídeos da invenção na ração para animal, assim como às composições de ração e aditivos para ração compreendendo os polipeptídeos da invenção. O termo animal inclui todos os animais, incluindo os seres humanos. Os exemplos de animais são não ruminantes, e ruminantes. Ao animais ruminantes incluem, por exemplo, os animais tais como ovelha, cabras, cavalos, e gado, por exemplo, gado de corte, vacas, e bezerros jovens. Em uma forma de realização particular, o animal é um animal não ruminante. Os animais não ruminantes incluem os animais monogástricos, por exemplo, porcos ou suínos (incluindo, mas não limitados a, leitões, porcos em desenvolvimento, e porcas); aves domésticas tais como perus, patos e galinha (incluindo mas não limitadas a galetos, galinha poedeira); bezerros jovens; e peixe (incluindo mas não limitado a salmão, truta, tilápia, peixe-gato e carpas; e crustáceos (incluindo mas não limitados a camarões e pitus). O termo ração ou composição de ração significa qualquer composto, preparação, mistura, ou composição adequada para, ou intencionada para o influxo por um animal.

No uso de acordo com a invenção a protease pode ser alimentada ao animal antes, depois, ou simultaneamente com a dieta. A última é preferida.

Em uma forma de realização particular, a protease, na forma em que é adicionada à ração, ou quando sendo incluída em um aditivo para ração, é bem definida. Bem definida significa que a preparação da protease é pelo menos 50 % de pureza como determinado pela Cromatografia de exclusão de tamanho (ver o Exemplo 12 da WO 01/58275). Em outras formas de realização particulares a preparação da protease é pelo menos 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94, ou pelo menos 95 % de pureza como determinado por este método.

Uma preparação da protease bem definida é vantajosa. Por exemplo, é muito mais fácil dosear corretamente à alimentação uma protease que é essencialmente livre de interferir ou contaminar outras proteases. O termo dose corretamente refere-se em particular ao objetivo de obter resultados consistentes e constantes, e a capacidade de otimizar a dosagem com base no efeito desejado.

Para o uso na ração para animal, entretanto, a protease não precisa ser aquela pura; ela por exemplo, pode incluir outras enzimas, em cujo caso ela poderia ser denominada uma preparação da protease. A preparação da protease pode ser (a) adicionada diretamente à alimentação (ou usada diretamente em um processo de tratamento de proteínas), ou (b) ela pode ser usada na produção de uma ou mais composições intermediárias tais como aditivos de alimentação ou pré misturas que é subseqüentemente adicionada à alimentação (ou usada em um processo de tratamento). O grau de pureza descrito acima refere-se à pureza da preparação da protease original, se usado de acordo com (a) ou (b) acima.

As preparações da protease com purezas desta ordem de magnitude são em particular obteníveis usando métodos recombinantes de produção, ao passo que elas não são tão facilmente obtidas e também submetidas a uma variação de lote a lote muito mais alta quando a protease é produzida por métodos de fermentação tradicionais.

Tal preparação da protease naturalmente pode ser misturada com outras enzimas.

Em uma forma de realização particular, a protease para o uso de acordo com a invenção é capaz de solubilizar as proteínas. Um ensaio adequado para determinar a proteína solubilizada é divulgado no Exemplo 5. A proteína pode ser uma proteína animal, tal como came e farinha de ossos, e/ou farinha de peixe; ou ela pode ser uma proteína vegetal. O termo proteínas vegetais como aqui usado refere-se a qualquer composto, composição, preparação ou mistura que inclui pelo menos uma proteína derivada de ou que origina de um vegetal, incluindo as proteínas modificadas e derivados de proteína. Em formas de realização particulares, o teor de proteína das proteínas vegetais é de pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, ou 60 % (p/p)· As proteínas vegetais podem ser derivadas de fontes de proteína vegetal, tais como legumes e cereais, por exemplo materiais de plantas das famílias Fabaceae (Leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae, e Poaceae, tais como farinha de soja, farinha de tremoço e farinha de semente de colza.

Em uma forma de realização particular, a fonte de proteína vegetal é o material de uma ou mais plantas da família Fabaceae, por exemplo, soja, tremoço, ervilha, ou feijão.

Em uma outra forma de realização particular, a fonte de proteína vegetal é o material de uma ou mais plantas da família Chenopodiaceae, por exemplo raiz de beterraba, beterraba, espinafre ou quinoa.

Outros exemplos de fontes de proteína vegetal são semente de colza, semente de girassol, semente de algodão, e repolho. A soja é uma fonte de proteína vegetal preferida.

Outros exemplos de fontes de proteína vegetal são os cereais tais como cevada, trigo, centeio, aveia, milho (milho), arroz, triticale, e sorgo. O tratamento de acordo com a invenção das proteínas com pelo menos uma protease da invenção resulta em uma solubilização aumentada de proteínas.

Os seguintes são exemplos de % de proteína solubilizada obtenível usando as proteases da invenção em um modelo monogástrico in vitro: Pelo menos 101 %, ou pelo menos 102 %, 103 %, 104 %, 105 %, 106 %, ou pelo menos 107 %, relativo a um espaço vazio. A porcentagem de proteína solubilizada é determinada usando o modelo monogás tricô in vitro do Exemplo 5. O termo solubilização de proteínas significa basicamente levar a(s) proteína(s) em solução. Tal solubilização podem ser devido a liberação mediada por protease da proteína a partir de outros componentes das composições naturais usualmente complexas tais como a alimentação.

Em uma outra forma de realização particular, a protease para o uso de acordo com a invenção é capaz de aumentar a quantidade de proteínas digestíveis. Os seguintes são exemplos de % de proteínas digeridas ou digestíveis obteníveis usando as proteases da invenção em um modelo monogástrico in vitro: Pelo menos 101 %, ou pelo menos 102 %, em relação a um branco. A porcentagem de proteína digerida ou digerível é determinado usando o modelo in vitro do Exemplo 5.

Ainda em uma outra forma de realização particular, a protease para o uso de acordo com a invenção é capaz de aumentar o Grau de Hidrólise (DH) de proteínas. Em uma forma de realização particular, o grau de hidrólise é de pelo menos 101 %, 102 %, 103 %, 104 %, ou pelo menos 105 %, em relação a um branco. O grau de hidrólise é determinado usando o modelo in vitro do Exemplo 5.

Em uma forma de realização particular de um processo de (pré-) tratamento da invenção, a(s) protease(s) em questão está(estão) afetando (ou atuando ou exercendo a sua influência de solubilizar) as proteínas ou fontes de proteína. Para obter isto, a proteína ou fonte de proteína é tipicamente colocada em suspensão em um solvente, por exemplo, um solvente aquoso tal como água, e os valores de pH e temperatura são ajustados prestando a devida atenção às características da enzima em questão. Por exemplo, o tratamento pode ocorrer em um valor de pH no qual a atividade da protease real é de pelo menos 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou pelo menos 90 %. Desse modo, por exemplo, o tratamento pode ocorrer a uma temperatura na qual a atividade da protease real é de pelo menos 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou pelo menos 90 %. As indicações de atividade percentual acima estão em relação às atividades máximas. A reação enzimática é continuada até que o resultado desejado seja obtido, a seguir do que pode ou não ser interrompida pela inativação da enzima, por exemplo, por uma etapa de tratamento térmico.

Em uma outra forma de realização particular de um processo de tratamento da invenção, a ação da protease é sustentada, significando por exemplo, que a protease é adicionada às proteínas ou proteína fontes, mas a sua influência solubilizante por assim dizer não é ligada até mais tarde quando desejado, uma vez que as condições de solubilização adequadas são estabelecidas, ou uma vez que quaisquer inibidores de enzima são inativados, ou tudo quanto outros meios tenham sido aplicados para postergar a ação da enzima.

Em uma forma de realização o tratamento é um pré tratamento de ração para animal ou proteínas para o uso na ração para animal. O termo melhorar o valor nutricional de uma ração para animal significa melhorar a disponibilidade e/ou digestibilidade das proteínas, levando deste modo a uma extração de proteína aumentada dos componentes da dieta, rendimentos de proteína mais altos, degradação de proteína aumentada e/ou utilização de proteína melhorada. O valor nutricional da alimentação é portanto aumentada, e o desempenho do animal tal como a taxa de crescimento e/ou o ganho de peso e/ou a taxa de conversão da alimentação (isto é, o peso da alimentação ingerida em relação ao ganho de peso) do animal é/são melhorados.

Em uma forma de realização particular a taxa de conversão de alimentação é aumentada em pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % ou pelo menos 10 %. Em uma outra forma de realização particular o ganho de peso é aumentado em pelo menos 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 % ou pelo menos 11 %. Estas figuras estão em relação a experimentos de controle sem nenhuma adição de protease . A taxa de conversão de alimentação (FCR) e o ganho de peso podem ser calculados como descrito em EEC (1986): Directive de la Commission du 9 avril 1986 fixant la metode de calcul de la valeur n rgetique des aliments composes destines la volaille. Journal Offíciel des Communauts Europennes, L130, 53 a 54. A protease pode ser adicionada à alimentação em qualquer forma, seja como uma protease relativamente pura, ou em mistura com outros componentes intencionados para a adição à ração para animal, isto é, na forma de aditivo de alimentação de animais, tais como as chamadas pré misturas para ração para animal.

Em um outro aspecto a presente invenção diz respeito às composições para o uso na ração para animal, tais como ração para animal, e aditivo de alimentação de animais, por exemplo, pré misturas. À parte da protease da invenção, o aditivo de alimentação animais da invenção contém pelo menos uma vitamina solúvel em gordura, e/ou pelo menos uma vitamina solúvel em água, e/ou pelo menos um mineral de traço. O aditivo de alimentação também pode conter pelo menos um macro mineral.

Além disso, ingredientes aditivos de alimentação, opcionais são agentes corantes, por exemplo, carotenóides tais como beta-caroteno, astaxantina, e luteína; compostos de aroma; estabilizadores; peptídeos antimicrobianos; ácidos graxos poliinsaturados; espécies que geram oxigênio reativo; e/ou pelo menos uma outra enzima selecionada dentre amilase tal como, por exemplo, amilase tal como alfa-amilase (EC 3.2.1.1), fitase (EC 3.1.3.8 ou 3.1.3.26); xilanase (EC 3.2.1.8); galactanase (EC 3.2.1.89); alfa-galactosidase (EC 3.2.1.22); protease (EC 3.4.-.-), fosfolipase Al (EC 3.1.1.32); fosfolipase A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipase (EC 3.1.1.5); fosfolipase C (3.1.4.3); fosfolipase D (EC 3.1.4.4); e/ou beta-glicanase (EC 3.2.1.4 ou EC 3.2.1.6).

Em uma forma de realização particular estas outras enzimas são bem definidas (como definido acima para as preparações da protease).

Os exemplos de peptídeos antimicrobianos (AMP's) são CAP18, Leucocina A, Tritrpticina, Protegrina-1, Tanatina, Defensina, Lactoferrina, Lactoferricina, e Ovispirina tal como Novispirina (Robert Lehrer, 2000), Plectasinas, e Estatinas, incluindo os compostos e polipeptídeos divulgados na WO 03/044049 e WO 03/048148, assim como variantes ou fragmentos dos acima que retenham a atividade antimicrobiana.

Os exemplos de polipeptídeos antifungicos (AFP's) são os peptídeos de Aspergillus giganteus, e Aspergillus niger, assim como variantes e fragmentos destes que retenham a atividade antifungica, como divulgado na WO 94/01459 e WO 02/090384.

Os exemplos de ácidos graxos poliinsaturados são ácidos graxos poliinsaturados Cl8, C20 e C22, tais como ácido araquidônico, ácido docosoexaenóico, ácido eicosapentaenóico e ácido gama-linoléico.

Os exemplos de espécies que geram oxigênio ativo são produtos químicos tais como perborato, persulfato, ou percarbonato; e enzimas tais como uma oxidase, uma oxigenase ou uma sintetase.

Usualmente gorduras e vitaminas solúveis em água, assim como minerais traços forma parte de uma chamada pré mistura intencionada para adição à alimentação, ao passo que os macro minerais são usualmente adicionados de modo separado à alimentação. Uma pré mistura enriquecida com uma protease da invenção, é um exemplo de um aditivo para ração para animal da invenção.

Em uma forma de realização particular, o aditivo para ração para animal da invenção é intencionado para ser incluído (ou prescrito como tendo sido incluído) em dietas de animais ou alimentação nos níveis de 0,01 a 10,0 %; mais particularmente 0,05 a 5,0 %; ou 0,2 a 1,0 % (% significando g de aditivo por 100 g de alimentação). Isto é assim em particular para as pré misturas. O que segue são listas não exclusivas de exemplos destes componentes: Os exemplos de vitaminas solúveis em gordura são vitamina A, vitamina D3, vitamina E, e vitamina K, por exemplo, vitamina K3.

Os exemplos de vitaminas solúveis em água são vitamina BI2, biotina e colina, vitamina B1, vit ina B2, vitamina B6, niacina, ácido fólico e pantotenato, por exemplo, Ca-D-pantotenato.

Os exemplos de minerais traços são manganês, zinco, ferro, cobre, iodo, selênio, e cobalto.

Os exemplos de macro minerais são cálcio, fósforo e sódio.

As exigências nutricionais destes componentes (exemplificados com aves domésticas e leitões/porcos) são listadas na Tabela A da WO 01/58275. Exigência nutricional significa que estes componentes devem ser fornecidos na dieta nas concentrações indicadas.

Na alternativa, o aditivo para ração para animal da invenção compreende pelo menos um dos componentes individuais especificados na Tabela A da WO 01/58275. Pelo menos um significa cada um de, uma ou mais de, um, ou dois, ou três, ou quatro e assim por diante até todos os treze, ou até todos os quinze componentes individuais. Mais especificamente, este pelo menos um componente individual é incluído no aditivo da invenção em uma quantidade tal como para fornecer uma concentração na alimentação dentro da faixa indicada na coluna quatro, ou coluna cinco, ou coluna seis da Tabela A. A presente invenção também diz respeito às composições de ração para animal. As composições ou dietas de ração para animal têm um teor relativamente alto de proteína. As dietas de aves domésticas e porcos podem ser caracterizadas como indicado na Tabela B da WO 01/58275, colunas 2-3. As dietas de peixes podem ser caracterizadas como indicado na coluna 4 desta Tabela B. Além disso tais dietas de peixe usualmente têm um teor de gordura bruta de 200 a 310 g/kg. WO 01/58275 corresponde a US 09/77334 que é aqui incorporada por referência.

Uma composição de ração para animal de acordo com a invenção tem um teor de proteína bruta de 50 a 800 g/kg, e além disso compreende pelo menos uma protease como aqui reivindicada.

Além disso, ou na alternativa (para o teor de proteína bruta indicada acima), a composição de ração para animal da invenção tem um teor de energia metabolizável de 10 a 30 MJ/kg; e/ou um teor de cálcio de 0,1 a 200 g/kg; e/ou um teor de fósforo disponível de 0,1 a 200 g/kg; e/ou um teor de metionina de 0,1 a 100 g/kg; e/ou um teor de metionina mais cisteína de 0,1 a 150 g/kg; e/ou um teor de lisina de 0,5 a 50 g/kg.

Em formas de realização particulares, o teor de energia metabolizável, proteína bruta, cálcio, fósforo, metionina, metionina mais cisteína, e/ou lisina estão dentro de qualquer uma das faixas 2, 3, 4 ou 5 na Tabela B da WO 01/58275 (R. 2-5). A proteína bruta é calculada como nitrogênio (N) multiplicado por um fator de 6,25, isto é, Proteína bruta (g/kg) = N (g/kg) x 6,25. O teor de nitrogênio é determinado pelo método de Kjeldahl (A.O.A.C., 1984, Official Methods of Analysis 14a ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC). A energia metabolizável pode ser calculada com base na publicação NRC Nutrient requirements in swine, nona edição revisada 1988, subcommittee on swine nutrition, committee on animal nutrition, board of agriculture, national research council. National Academy Press, Washington, D.C., páginas 2 a 6, e na European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs, Spelderholt centre for poultry research and extension, 7361 DA Beekbergen, The Netherlands. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen. ISBN 90-71463-12-5. O teor da dieta de cálcio, fósforo disponível e aminoácidos em dietas de animais completas são calculados com base nas tabelas de alimentação tais como Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Yeevoederbureau, Runderweg 6,8219 pk Lelystad. ISBN 90- 72839-13-7.

Em uma forma de realização particular, a composição de ração para animal da invenção contém pelo menos uma proteína ou fonte de proteína como definida acima. Também pode conter proteína animal, tal como Farinha de carne e ossos, e/ou Farinha de peixe, tipicamente em uma quantidade de 0 a 25 %.

Ainda em outras formas de realização particulares, a composição de ração para animal da invenção contém de 0 a 80 % de milho; e/ou 0 a 80 % de sorgo; e/ou 0 a 70 % de trigo; e/ou 0 a 70 % de cevada; e/ou de 0 a 30 % de aveias; e/ou de 0 a 40 % de farinha de soja; e/ou de 0 a 25 % de farinha de peixe; de 0 a 25 % de farinha de came e ossos; e/ou de 0 a 20 % de soro de leite.

As dietas de animais por exemplo, podem ser fabricadas como alimentação de farelo ensopado (não pelotizada) ou alimentação pelotizada. Tipicamente, os gêneros alimentícios moídos são misturados e quantidades suficientes de vitaminas e minerais essenciais são adicionadas de acordo com as especificações para a espécie em questão. As enzimas podem ser adicionadas como formulações de enzima sólidas ou líquidas. Por exemplo, uma formulação de enzima sólida é tipicamente adicionada antes ou durante a etapa de mistura; e uma preparação de enzima líquida é tipicamente adicionada depois da etapa de pelotização. A enzima também pode ser incorporada em um aditivo de alimentação ou pré mistura. A concentração de enzima final na dieta está dentro da faixa de 0,01 a 200 mg de proteína de enzima por kg de dieta, por exemplo na faixa de 0,5 a 25 mg de proteína de enzima por kg de dieta de animal. A protease naturalmente deve ser aplicada em uma quantidade eficaz, isto é, em uma quantidade adequada para melhorar a solubilização e/ou melhorar o valor nutricional da alimentação. No momento é considerado que a enzima é administrada em uma ou mais das seguintes quantidades (faixas de dosagem): 0,01 a 200; 0,01 a 100; 0,5 a 100; 1 a 50; 5 a 100; 10 a 100; 0,05 a 50; ou 0,10 a 10 todas estas faixas sendo em mg de proteína de enzima protease por kg de alimentação (ppm).

Para determinar a mg de proteína de enzima por kg de alimentação, a protease é purificada a partir da composição de alimentação, e a atividade específica da protease purificada é determinada usando um ensaio relevante (ver sob atividade de protease, substratos, e ensaios). A atividade de protease da composição de alimentação como tal também é determinada usando o mesmo ensaio, e com base nestas duas determinações, a dosagem em mg de proteína de enzima por kg de alimentação é calculada.

Os mesmos princípios se aplicam para determinar mg de proteína de enzima em aditivos de alimentação. Naturalmente, se uma amostra estiver disponível da protease usada para preparar o aditivo de alimentação ou a alimentação, a atividade específica é determinada a partir desta amostra (nenhuma necessidade para purificar a protease da composição de alimentação ou do aditivo). A presente invenção é ainda descrita pelos seguintes exemplos que não devem ser interpretados como limitando o escopo da invenção. Composições Detergentes A protease da invenção pode ser adicionada e assim se tomar um componente de uma composição detergente. A composição detergente da invenção por exemplo pode ser formulada como uma composição detergente de lavar roupa à mão ou à máquina incluindo uma composição aditiva de lavar roupas adequada para o pré tratamento de tecidos tingidos e uma composição amaciante adicionada no enxágüe, ou ser formulada como uma composição detergente para o uso no geral nas operações de limpeza de superfícies duras domésticas, ou ser formulada para as operações de lavagem de louça à mão ou à máquina.

Em um aspecto específico, a invenção fornece um aditivo de detergente compreendendo a protease da invenção. O aditivo de detergente assim como a composição detergente pode compreender uma ou mais outras enzimas tais como uma outra protease, tais como proteases alcalinas de Bacillus, uma lipase, uma cutinase, uma amilase, uma carboidrase, uma celulase, uma pectinase, uma mananase, uma arabinase, uma galactanase, um xilanase, uma oxidase, por exemplo, uma lacase, e/ou uma peroxidase.

No geral as propriedades da(s) enzima(s) escolhida(s) deve(m) ser compatível(is) com o detergente selecionado, (isto é, pH ótimo, compatibilidade com outros ingredientes enzimáticos e não enzimáticos, etc.), e a(s) enzima(s) deve(m) estar presente(s) em quantidades eficazes. As lipases adequadas incluem aquelas de origem bacteriana ou fungica. Mutantes quimicamente modificados ou engendrados de proteína são incluídos. Os exemplos de lipases úteis incluem lipases de Humicola (sinônimo Thermomyces), por exemplo, de H. lanuginosa (T. lanuginosus) como descrito na EP 258068 e EP 305216 ou de H. insolens como descrito na WO 96/13580, uma lipase de Pseudomonas, por exemplo, de P. alcaligenes ou P. pseudoalcaligenes (EP 218272), P. cepacia (EP 331376), P. stutzeri (GB 1.372.034), P. flúores cens, Pseudomonas sp. cepa SD 705 (WO 95/06720 e WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), uma lipase de Bacillus, por exemplo, de B. subtilis (Dartois et al. (1993), Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253 a 360), B. stearothermophilus (JP 64/744992) ou B. pumilus (WO 91/16422). Outros exemplos são variantes de lipase tais como aqueles descritos na WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407225, EP 260105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079 e WO 97/07202. As enzimas de lipase comercialmente disponíveis preferidas incluem Lipolase® e Lipolase Ultra® (Novozymes A/S).

As amilases adequadas (alfa- e/ou beta-) incluem aquelas de origem bacteriana ou fungica. Mutantes quimicamente modificados ou engendrados de proteína são incluídos. Amilases incluem, por exemplo, alfa-amilases obtidas a partir de Bacillus, por exemplo, uma cepa especial de B. licheniformis, descrita em mais detalhes na GB 1.296.839. Os exemplos de amilases úteis são as variantes descritas na WO 94/02597, WO 94/18314, WO 95/26397, WO 96/23873, W097/43424, WO 00/60060, e WO 01/66712, especialmente as variantes com substituições em uma ou mais das seguintes posições: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408 e 444. As amilases comercialmente disponível são Natalase, Supramil, Stainzima, Duramil, Termamil, Fungamil® e BAN (Novozymes A/S), Rapidase e Purastar (da Genencor International Inc.).

As celulases adequadas incluem aquelas de origem bacteriana ou fungica. Os mutantes quimicamente modificados ou engendrados de proteína são incluídos. As celulases adequadas incluem celulases dos gêneros Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, por exemplo, as celulases fungicas produzidas a partir de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila e Fusarium oxysporum divulgadas na US 4.435.307, US 5.648.263, US 5.691.178, US 5.776.757 e WO 89/09259. As celulases especialmente adequadas são as celulases alcalinas ou neutras tendo benefícios de cuidado de cor. Os exemplos de tais celulases são as celulases descritas na EP 0 495257, EP 531372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Outros exemplos são variantes de celulase tais como aquelas descritas na WO 94/07998, EP 0 531 315, US 5.457.046, US 5.686.593, US 5.763.254, WO 95/24471, WO 98/12307 e WO 99/01544. As celulases comercialmente disponíveis incluem Celluzyme® e Carezyme® (Novozymes A/S), Clazinase e Puradax HA (Genencor International Inc.), e KAC-500 (B)® (Kao Corporation).

As peroxidases/oxidases adequadas incluem aquelas de origem vegetal, bacteriana ou fungica. Os mutantes quimicamente modificados ou engendrados de proteína são incluídos. Os exemplos de peroxidases úteis incluem peroxidases de Coprins, por exemplo de C. cinereus, e variantes destas como aquelas descritas na WO 93/24618, WO 95/10602, e WO 98/15257. As peroxidases comercialmente disponíveis incluem Guardzyme® (Novozymes). A(s) enzima(s) detergente(s) pode(m) ser incluída(s) em uma composição detergente pela adição de aditivos separados contendo uma ou mais enzimas, ou pela adição de um aditivo combinado compreendendo todas estas enzimas. Um aditivo detergente da invenção, isto é, um aditivo separado ou um aditivo combinado, pode ser formulado por exemplo, como um granulado, um líquido, uma lama, etc. As formulações de aditivo detergente preferidas são granulados, em particular granulados não formador de poeira, líquidos, em particular líquidos estabilizados, ou lamas.

Os granulados não formadores de poeira podem ser produzidos, por exemplo, como divulgado na US 4.106.991 e 4.661.452 e podem ser opcionalmente revestidos pelos métodos conhecidos na técnica. Os exemplos de materiais de revestimento ceroso são produtos de poli (óxido de etileno) (polietileno glicol, PEG) com pesos moleculares médios de 1000 a 20000; nonilfenóis etoxilados tendo de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; álcoois graxos etoxilados em que o álcool contém de 12 a 20 átomos de carbono e em que existem de 15 a 80 unidades de óxido de etileno; álcoois graxos; ácidos graxos; e mono- e di- e triglicerídeos de ácidos graxos. Os exemplos de materiais de revestimento formadores de película adequados para a aplicação pelas técnicas de leito fluídicos são dados na GB 1483591. As preparações de enzima líquida, por exemplo, podem ser estabilizadas pela adição de um poliol tal como propileno glicol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido lático ou ácido bórico de acordo com métodos estabelecidos. As enzimas protegidas podem ser preparadas de acordo com o método divulgado na EP 238216. A composição de detergente da invenção pode estar em qualquer forma conveniente, por exemplo, uma barra, um tablete, um pó, um grânulo, uma pasta ou um líquido. Um detergente líquido pode ser aquoso, tipicamente contendo até 70 % de água e de 0 a 30 % de solvente orgânico, ou não aquoso. A composição detergente compreende um ou mais tensoativos, que podem ser não iônicos incluindo semi-polares e/ou aniônicos e/ou catiônicos e/ou zuiteriônicos. Os tensoativos estão tipicamente presentes em um nível de 0,1 % a 60 % em peso.

Quando incluído dessa maneira o detergente usualmente conterá de cerca de 1 % a cerca de 40 % de um tensoativo aniônico tal como alquilbenzenossulfonato linear, alfa-olefmsulfonato, sulfato de alquila (sulfato de álcool graxo), etoxissulfato álcool, alcanossulfonato secundário, éster metílico de alfa-sulfo ácido graxo, ácido alquil- ou alquenilsuccínico ou sabão.

Quando incluído dessa maneira o detergente usualmente conterá de cerca de 0,2 % a cerca de 40 % de um tensoativo não iônico tal como etoxilato álcool, etoxilato de nonilfenol, alquilpoliglicosídeo, óxido de alquildimetilamina, monoetanolamida de ácido graxo etoxilado, monoetanolamida de ácido graxo, poliidróxi alquil amida de ácido graxo, ou derivados de N-acil N-alquil de glicosamina (“glicamidas”). O detergente pode conter de 0 a 65 % de um formador de detergente ou agente complexante tal como zeólito, difosfato, trifosfato, fosfonato, carbonato, citrato, ácido nitrilotriacético, ácido etilenodiamino- tetraacético, ácido dietilenotriaminopentaacético, ácido alquil ou alquenil-succínico, silicatos solúveis ou silicatos em camada (por exemplo, SKS-6 da Hoechst). O detergente pode compreender um ou mais polímeros. Os exemplos são carboximetilcelulose, poli (vinilpirrolidona), poli (etileno glicol), poli (álcool vinílico), poli (vinilpiridina-N-óxido), poli (vinilimidazol), policarboxilatos tais como poliacrilatos, copolímeros de ácido maléico/acrílico e copolímeros de metacrilato de laurila/ácido acrílico. O detergente pode conter um sistema de branqueamento que pode compreender uma fonte de H2O2 tal como perborato ou percarbonato que pode ser combinada com um branqueador que forme um ativador de perácido tal como tetraacetiletilenodiamina ou nonanoiloxibenzeno-sulfonato. Altemativamente, o sistema de branqueador pode compreender peroxiácidos por exemplo, do tipo amida, imida, ou sulfona. A(s) enzima(s) da composição de detergente da invenção pode(m) ser estabilizada(s) usando agentes de estabilização convencionais, por exemplo, um poliol tal como propileno glicol ou glicerol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido lático, ácido bórico, ou um derivado de ácido bórico, por exemplo, um éster de borato aromático, ou um derivado de ácido fenil borônico tal como o ácido 4-formilfenil borônico, e a composição pode ser formulada como descrito por exemplo, na WO 92/19709 e WO 92/19708. O detergente também pode conter outros ingredientes de detergente convencionais tais como por exemplo, condicionadores de tecido incluindo argilas, fomentadores de espuma, supressores de espuma, agentes anti-corrosão, agentes de suspensão de sujeira, agentes anti-redeposição de sujeira, corantes, bactericidas, abrilhantadores óticos, hidrótropos, inibidores de desbotamento, ou perfumes. É considerado no presente que nas composições detergentes qualquer enzima, em particular a enzima da invenção, pode ser adicionada em uma quantidade correspondendo a 0,01 a 100 mg de proteína de enzima por litro de líquido de lavagem, preferivelmente de 0,05 a 5 mg de proteína de enzima por litro de líquido de lavagem, em particular de 0,1 a 1 mg de proteína de enzima por litro de líquido de lavagem. A enzima da invenção pode ser adicionalmente incorporada nas formulações detergentes divulgadas na WO 97/07202.

Depósito de Material Biológico O seguinte material biológico, isolado de uma amostra de solo coletada na Dinamarca em 2001, foi depositada sob os termos do Tratado de Budapest com a DeutscheSammiung von Mikroorganismen und Zelikulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, e dado o seguinte número de acesso: Depósito Número de Acesso Data de Depósito Nocardiopsis alba DSM 15647 30 de maio de 2003 A cepa foi depositada sob condições que garantem que o acesso à cultura estará disponível durante a pendência dos pedidos de patente a uma pessoa determinada pelo Comissário de Patentes e Marcas a ser designado para isso sob 37 C. F. R. §1.14 e 35 U.S.C. §122. O depósito representa uma cultura substancialmente pura da cepa depositada. O depósito está disponível como necessário pelas leis de patente estrangeira em países em que as contrapartes destes pedidos, ou a sua progênie são depositadas. Entretanto, deve ser entendido que a disponibilidade de um depósito não constitui uma licença para a prática da invenção em detrimento dos direitos de patente garantidos pela ação governamental. A invenção aqui descrita e reivindicada não dever ser limitada em escopo pelas formas de realização específicas aqui divulgadas, visto que estas formas de realização são intencionadas como ilustrações de diversos aspectos da invenção. Quaisquer formas de realização equivalentes são intencionadas a estarem dentro do escopo desta invenção. De fato, várias modificações da invenção além daquelas apresentadas e aqui descritas tomar-se-ão evidentes àqueles habilitados na técnica a partir da descrição precedente. Tais modificações também são intencionadas a cair dentro do escopo da reivindicações anexas. No caso de conflito, a presente divulgação incluindo as definições controlarão.

As vários referências são aqui citadas, as divulgações das quais são incorporadas por referência em suas totalidades.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: Clonagem e expressão da protease derivada de Nocardiopsis alba DSM 15647 Reagentes e meios LB ágar Descrito em Ausubel, F. M. et al. (eds. ) “Current protocols in Molecular Biology”. John Wiley and Sons, 1995 LB-PG ágar LB ágar suplementado com 0,5 % de Glicose e 0,05 M de fosfato de potássio, pH 7,0 PS-1 10 % de sacarose, 4 % de flor de farinha de soja, 1 % de Na3P04-12H20, 0,5 % de CaC03, e 0,01 % de ácido plurônico TE lOmMde Tris-HCl, pH 7,4 1 mM de EDTA, pH 8,0 TEL 50mg/mldeLisozimaemtampãodeTE

Tiocianato 5M de tiocianato de guanídio 100 mM de EDTA 0,6 % p/v de N-laurilsarcosina, sal de sódio 60 g de tiocianato, 20 ml de EDTA 0,5 M, pH 8,0, 20 ml de H20 dissolve a 65°C.

Resfriar até a temperatura ambiente (RT) e adicionar 0,6 g de N-laurilsarcosina. Adicionar H20 a 100 ml e filtrar através de um filtro 0,2 μ de filtro estéril. NH4Ac 7,5 M de CH3COONH4 TER 1 μg/ml de Rnase A em tampão de TE CIA Clorofórmio/álcool isoamílico 24:1 Procedimento experimental A SEQ ID NO: 1 é a seqüência de DNA que codifica uma proforma da protease a partir de Nocardiopsis alba DSM 15647. Os nucleotídeos 502 a 1065 correspondem ao peptídeo maduro que codifica a parte. A SEQ ID NO: 2 é a seqüência de aminoácido deduzida da SEQ ID NO: 1. Os aminoácidos -167 a -1 são o propeptídeo, e os aminoácidos 1 a 188 o peptídeo maduro.

Clonagem da SEQ ID NO: 1 O tipo selvagem foi desenvolvido durante 3 dias antes da colheita no meio seguinte a 30°C: Tripticase 20 g Extrato de levedura 5 g Ferrocloreto 6 mg Sulfato de magnésio 15 mg Água destilada ad 1000 ml pH ajustado para 9 pela adição de carbonato de sódio O DNA genômico de Nocardiopsis alba DSM 15647 foi isolado de acordo com o procedimento seguinte: Colher a cultura de 1,5 ml e recolocar em suspensão em 100 μΐ de TEL. Incubar a 37°C durante 30 min.

Adicionar 500 μΐ de tampão de tiocianato e deixar na temperatura ambiente durante 10 min.

Adicionar 250 μΐ de NH4Ac e deixar em gelo durante 10 min.

Adicionar 500 μΐ de CIA e misturar.

Transferir para uma microcentrífuga e girar durante 10 min. na velocidade máxima.

Transferir o sobrenadante a um novo tubo -Eppendorf e adicionar 0,54 em volume de isopropanol fido. Misturar completamente.

Girar e lavar a pelota de DNA com 70 % de EtOH.

Recolocar em suspensão o DNA genômico em 100 μΐ de TER. O DNA genômico foi usado como modelo para a amplificação de PCR usando os iniciadores das SEQ ID NOs. 3 e 4 abaixo. O fragmento de PCR foi isolado em um gel de agarose a 0,7 %.

Iniciadores: 1421: 5'-GTT CAT CGA TCG CAT CGG CTG CGA CCG GCC CGC ICO COO AGT C-3’ (SEQ ID NO: 3) 1604: 5’- GCG GAT CCT ATC AGG TGC GCA GGG TOA GAC C-3’ (SEQ ID NO: 4} O fragmento de PCR digerido e purificado foi ligado ao plasmídeo digerido pDG268NeoMCS-PramyQ/Prcrylil/crylilAstab/Sav de Cia I e BamH I (Patente US N° 5.955.310). A mistura de ligação foi usada para a transformação em E.coli TOP10F’ (Invitrogen BV, The Netherlands) e várias colônias foram selecionadas para a miniprep (QIAprep spin, QIAGEN GmbH, Alemanha). Os plasmídeos purificados foram checados quanto a inserção antes da transformação em uma cepa of Bacillus subtilis derivada de B. subtilis DN 1885 com os genes apr, npr e pel rompidos (Diderichsen et al (1990), J. Bacteriol., 172, 4315 a 4321). O rompimento foi realizado essencialmente como descrito em “Bacillus subtilis and other Gram-Positive Bactéria”, American Society for Microbiology, página 618, eds. A. L. Sonenshein, J. A. Hoch e Richard Losick (1993). As células transformadas foram plaqueadas em 1 % de placas de ágar LB-PG de leite desnatado LB-PG, suplementadas com 6 pg/ml cloranfenicol. As células plaqueadas foram incubadas durante a noite a 37°C e as colônias contendo protease foram identificadas por uma zona de clareamento circundante. As colônias positivas de protease foram selecionadas e a seqüência de codificação da enzima expressada a partir da construção de expressão foi confirmada pela analise da sequência de DNA. Fermentação As células hospedeiras transformadas de Bacillus subíilis como descrito acima foi fermentadas em uma tabela de agitação rotativa (250 r.p.m.) em frascos Erlenmeyer de 500 ml com defletores contendo 100 ml de meio PS-1 suplementado com 6 pg/ml de cloranfenicol, a 37°C durante 16 horas e a 26°C durante 4 dias extras. EXEMPLO 2: Purificação e caracterização da protease de Nocardiopsis alba DSM 15647.

Ensaios de protease 1) ensaio de pNA: substrato de pNA: Suc-AAPF-pNA (Bachem L-1400).

Temperatura: Temperatura ambiente (25 °C) Tampões de ensaio: 100 mM de ácido succínico, 100 mM de HEPES, 100 mM de CHES, 100 mM de CABS, 1 mM de CaCl2, 150 mM de KC1, 0,01 % de Triton X-100 ajustado aos valores de pH 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0, 11,0, e 12,0 com HC1 ou NaOH. 20 μΐ de protease (diluídos em 0,01 % de Triton X-100) são misturados com 100 μΐ de tampão de ensaio. O ensaio é iniciado adicionando-se 100 μΐ de substrato de pNA (50 mg dissolvidos em 1,0 ml de DMSO e ainda diluídos 45 x com 0,01 % de TritonX-100). O aumento em OD405 é monitorado como uma medida da atividade de protease. 2) Ensaio de Protazima AK: Substrato: tablete de Protazima AK (caseína reticulada e tingida; da Megazyme) Temperatura: controlada (temperatura de ensaio).

Tampões de ensaio: 100 mM de ácido succínico, 100 mM de HEPES, 100 mM de CHES, 100 mM CABS, 1 mM de CaCl2, 150 mM de KC1, 0,01 % de Triton X-100 ajustado aos valores de pH 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 e 11,0 com HC1 ou NaOH.

Um tablete de Protazima AK é colocada em suspensão em 2,0 ml de Triton X-100 a 0,01 % por agitação suave. 500 μΐ desta suspensão e 500 μΐ de tampão de ensaio são misturados em um tubo Eppendorf e colocados em gelo. 20 μΐ de amostra de protease (diluídos em 0,01 % de Triton X-100) são adicionados. O ensaio é iniciado transferindo-se o tubo Eppendorf a um misturador térmico Eppendorf, que é ajustado à temperatura de ensaio. O tubo é incubado durante 15 minutos no misturador térmico Eppendorf em sua taxa de agitação mais alta (1400 rpm). A incubação é interrompida transferindo-se o tubo de volta ao banho de gelo. Depois o tubo é centrifugado em uma centrífuga gelada durante poucos minutos e 200 μΐ de sobrenadante são transferidos a uma placa microtituladora. O OD650 é lido como uma medida de atividade da protease. Uma ligação de tampão é incluída no ensaio (ao invés da enzima). A fermentação da protease descrita no Exemplo 1 foi centrifugada (20000 x g, 20 min) e os sobrenadantes foram cuidadosamente decantadas a partir dos precipitados. Os sobrenadantes combinados foram filtrados através de uma placa Seitz EKS de modo a remover o restante das células de Nocardiopsis. O filtrado de EKS foi transferido a 50 mM de H3BO3, 5 mM de ácido succínico, 1 mM de CaCl2, pH 7 em uma coluna G25 sephadex que resultou em uma solução turva. A turvação foi removida por uma outra filtração através de uma placa Seitz EKS. O filtrado claro foi aplicado a uma coluna de sílica de bacitracina equilibrada no mesmo tampão. Depois de lavar a coluna extensivamente com 0 tampão de equilíbrio, a protease foi eluída por etapa com 100 mM de H3BO3, 10 mM de ácido succínico, 2 mM de CaCl2, 1 M de NaCl, 25 % de isopropanol, pH 7. O eluído de bacitracina foi transferido a 50 mM de H3BO3, 5 mM de ácido succínico, 1 mM de CaCl2, pH 7 em uma coluna G25 sephadex e concentrado por ultrafiltração a um volume mínimo em uma célula de concentração de Amicon equipada com uma membrana de corte de 5000 Da„ A enzima concentrada foi aplicada a uma coluna de exclusão de tamanho Superdex 75 equilibrada em 100 mM de H3B03, 10 mM de ácido succínico, 2 mM de CaCl2, 200 mM de NaCl, pH 7 e a coluna foi eluída com o mesmo tampão. As frações from a coluna foram analisadas quanto a atividade de protease (usando o ensaio de Protazima AK a 37°C e pH 9) e as frações ativas foram ainda analisada por SDS-PAGE. As frações, onde apenas uma faixa foi vistas no gel de SDS-PAGE tingido com coomassie, foram reunidas como a preparação purificada e foram usadas para outra caracterização.

Atividade de pH. estabilidade de pH. e atividade de temperatura O ensaio de pNA foi usado para obter o perfil de atividade de pH assim como o perfil de estabilidade de pH. Para o perfil de estabilidade de pH a protease foi diluída 10 x nos tampões de ensaio e incubada durante 2 horas a 37°C. Depois da incubação as amostras de protease foram transferidas ao mesmo pH - pH 9, antes do ensaio para a atividade residual, pela diluição no tampão de ensaio de pH 9. O ensaio de Protazima AK foi usado para obter o perfil de atividade de temperatura no pH 9. Os resultados são mostrados nas Tabelas 1 a 3 abaixo.

Tabela 1: Perfil de atividade de pH______________________________________________ Tabela 2: Perfil de estabilidade de pH

Tabela 3: Perfil de atividade de temperatura A protease foi encontrada ser inibida pelo Fluoreto de Fenil Metil Sulfonila. Seu peso molecular relativo como determinado por SDS-PAGE foi de Mr = 19 kDa.

Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC) A DSC foi usada para determinar a estabilidade da temperatura no pH 7,0 da protease derivada de Nocardiopsis alba e de Nocardiopsis sp. NRRL 18262. As proteases purificadas foram dialisadas durante a noite a 4°C contra 10 mM de fosfato de sódio, 50 mM de cloreto de sódio, pH 7,0 e conduzidas em um instrumento de VP-DSC (Micro Cal) com uma taxa de varredura constante de l,5°C/min de 20 a 100°C. A manipulação dos dados foi realizada usando o software de Origem MicroCal.

As temperaturas de desnaturação ou de fusão resultantes, Tm,'s foram: Para a protease da invenção derivada de Nocardiopsis alba: 78,3 °C; para a protease derivada de Nocardiopsis sp. NRRL 18262: 76,5°C. EXEMPLO 3: Atividade específica da protease de Nocardiopsis alba DSM 15647 A preparação de protease purificada descrita no Exemplo 2 foi usada para a determinação da atividade específica. A pureza da preparação foi acima de 95 % quando analisada por SDSPAGE (determinado como descrito no Exemplo 2A na WO 01/58275). A amostra de protease foi dividida em duas. Uma parte foi analisada quanto ao teor de proteína (mg/ml) pela análise de aminoácido, a outra parte foi analisada quanto a atividade de protease. Análise de Aminoácido (AAAVfmg/ml!

As ligações de peptídeo da amostra de protease foram submetidas à hidrólise ácida, seguido por separação e quantificação dos aminoácidos liberados em um Analisador de Aminoácido Biochrom 20 Plus, comercialmente disponível da Bie & Bemtsen A/S, Sandbaekvej 5-7, DK-2610 Roedovre, Dinamarca, de acordo com as instruções do fabricante. Para a hidrólise ácida, a amostra de proteína foi seca em uma centrífuga a vácuo, resolvida em 18,5 % (vol/vol) de EtCl + 0,1 % (vol/vol) de fenol e incubada durante 16 horas a 110°C. Depois da incubação, a amostra foi novamente seca na centrífuga a vácuo, resolvida em tampão de carga (0,2 M de citrato de Na, pH 2,2) e carregada no Analisador de Aminoácido Biochrom 20 Plus.

Para a quantificação, a amostra de hidrólise foi carregada em uma coluna da resina de troca de cátion UltroPac ns 8, forma sódica, que é comercialmente disponível da Bie & Bemtsen A/S, catálogo na 80-2104-15. Os tampões de pH variantes (pH 1 a pH 8) e força iônica foram bombeados através da coluna de acordo com as instruções do fabricante referidas acima, para separar os vários aminoácidos. A temperatura da coluna foi exatamente controlada, também de acordo com as instruções do fabricante (de 53°C a 92°C e de volta a 53°C) de modo a garantir a separação necessária. A.eluente de coluna foi misturado com reagente de ninhidrina (Bie & Berntsen, catálogo ns 80-2038-07) e a mistura passada através da bobina de reação de temperatura alta do Analisador de Aminoácido. Na bobina de reação, a ninhidrina reagiu com os aminoácidos para formar compostos coloridos, a quantidade dos quais foi diretamente proporcional à quantidade de aminoácido presente.

Ensaio de atividade de protease (AU/ml) A hemoglobina desnaturada (0,65 % (p/p) em 6,7 mM de tampão de KH2P04/Na0H, pH 7,50) foi degradada a 25°C durante 10 minutos pela protease, e a hemoglobina não digerida foi precipitada com o ácido tricloroacético (TCA) e removida por filtração. Os produtos de degradação de hemoglobina solúveis em TCA no filtrado foram determinados com reagente de fenol de Folin & Ciocalteu, que forneceu uma cor azul com vários aminoácidos. A unidade de atividade (AU) foi medida e definida por referência a um padrão de ALCALASE®. Uma descrição detalhada do ensaio, assim como uma amostra do padrão de ALCALASE®, estão disponíveis no pedido da Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Dinamarca (ensaio n-EB-SM-0349.02/01). A atividade específica foi calculada como: Atividade específica (AU/g) = (Atividade (AU/mi) / AAA (mg/ml)) x 1000 (mg/g). A atividade específica da protease derivada de Nocardiopsis alba DSM 15647 foi de 53,5 AU/g, quando comparada à atividade específica da protease derivada de Nocardiopsis sp. NRRL 18262 de 38,3 AU/g. EXEMPLO 4: Protease Lia A Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei DSM 43235 foi desenvolvida no meio de Trypticase do tipo selvagem, e no DNA genômico isolado, como descrito no Exemplo 1. A região de codificação para a proprotease madura Lia (nucleotídeos 88 a 1143 da SEQID NO: 1) foi amplificada com os iniciadores 1424 e 1485 seguintes no DNA genômico: Iniciador 1485 (SEQ ID NO: 7): 5 ’-gcttttagttcatcgatcgcatcggctgcgaccgtaccggccgagccag-3 ’ Iniciador 1424 (SEQ ID NO: 8): 5 ’-ggagcggattgaacatgcgattactaaccggtcaccagggacagcc-3 ’ Os polinucleotídeos de Lia foram fundidos, por PCR, em estrutura a um fragmento de DNA heterólogo que codifica um peptídeo de sinal Sav (SEQ IDNO: 9).

Uma cepa de Bacillus subtilis designada Sav-Lla foi construída incorporando-se o gene (incluindo o sinal peptídeo que codifica a parte) por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira de Bacillus subtilis MB 1053 (W003/95658). O gene foi expressado sob o controle de um sistema promotor triplo (como descrito na W099/43835), consistindo das promotoras do gene da alfa-amilase de Bacillus licheniformis (amyL), gene da alfa-amilase de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), e a promotora de crylIIA de Bacillus thuringiensiscry incluindo a seqüência estabilizante. O gente que codifica a cloranfenicol acetil-transferase foi usado como marcador (descrito por exemplo, em Diderichsen, B.; Pulsen, G. B.; Joergensen, S. T.; A useful cloning vector for Bacillus subtilis. Plasmid 30: 312(1993)).

Os transformantes resistentes ao cloranfenicol foram checados quanto a atividade de protease e um transformante selecionado para a verificação da seqüência como descrito no Exemplo 1, seguindo o qual ele foi fermentado como também descrito no Exemplo 1, mas a 26°C durante 6 dias. O caldo da cultura foi centrifugado (20000 x g, 20 min) e os sobrenadantes foram cuidadosamente decantados dos precipitados. Os sobrenadantes combinados foram filtrados através de uma placa Seitz EKS de modo a remover o restante das células hospedeiras de Bacillus. O filtrado EKS foi transferido a 50 mM de H3BO3, 5 mMde ácido succinico, 1 mM de CaCl2, pH 7 em uma coluna G25 sephadex. Sulfato de amônio sólido foi adicionado à solução da enzima a partir da coluna G25 sephadex para fornecer uma concentração de (NH4)2S04 final de 1,6 M na solução da enzima. A solução da enzima foi misturada suavemente com um agitador magnético durante a adição de (NH4)2S04 e a agitação foi continuada durante 30 minutos depois da adição para levar o sistema ao equilíbrio. Depois a solução da enzima foi aplicada a uma coluna equilibrada de Butyl Toyopearl em 100 mM de H3BO3, 10 mM de ácido succinico, 2 mM de Cal2, 1,6 M de (NH4)2S04, pH 7. Depois de lavar a coluna extensivamente com o tampão de equilíbrio, a protease foi eluída com um gradiente de (NH4)2S04 linear (1,6 a 0 M) no mesmo tampão. As frações contendo a protease foram reunidas e transferidas a 20 mM de HEPES, pH 8 em uma coluna G25 sephadex e aplicadas a uma coluna equilibrada de Q sefarose FF no mesmo tampão. Depois de lavar a coluna extensivamente com o tampão de equilíbrio, a protease foi eluída com um gradiente de NaCl linear (0 a 0,5 M) no mesmo tampão. As frações da coluna foram analisadas quanto à atividade de protease (usando o ensaio de Suc-AAPF-pNA no pH 9) e as frações ativas foram ainda analisadas por SDS-PAGE. As frações com apenas uma faixa (como avaliado por um gel de SDS-PAGE tingido com coomassie) foram reunidas para fornecer a preparação purificada que foi usada para outra caracterização. A protease Lia é uma enzima como a protease alfa-lítica (família de peptidase S1E, notação antiga S2A) que é encontrada ser inibida pelo Fluoreto de Fenil Metil Sulfonila (PMSF), e pelo Inibidor de Síreptomyces Subtilisin (SSI). O peso molecular relativo como determinado por SDS-PAGE é Mr = 22 kDa. A atividade específica da protease Lia foi determinada como descrito no Exemplo 3 a 49,8 AU/g. EXEMPLO 5: Resultados in vitro monogástricos O desenvolvimento da protease purificada descrita no Exemplo 2 foi testado em um modelo in vitro que estimula a digestão em animais monogástricos. Em particular, a protease foi testada quanto a sua capacidade para melhorar a solubilização e digestão de proteínas de milho/-SBM (milho/-farinha de soja). O sistema in vitro consistiu de 10 frascos em que substrato milho/-SBM foi inicialmente incubado com digestão gástrica de estimulação de HCl/pepsina e subseqüentemente com digestão intestinal de estimulação de pancreatina. Cinco dos frascos foram dosados com a protease no início da fase gástrica ao passo que os cinco frascos remanescentes serviram como espaços vazios. Na extremidade das amostras de fase de incubação intestinal de digestão in vitro foram removidas e analisadas para a proteína solubilizada e digerida.

Esboço de procedimento de digestão in vitro _______ Condições Substrato: 4 g de SBM, 6 g de milho (pré misturado) pH: 3,0 de etapa estomacal/6,8 a 7,0 de etapa intestinal HC1: 0,105 M durante 1,5 hora (i.e, 30 min de pré mistura de substrato de HC1) pepsina: 3000 U/g de dieta durante 1 hora pancreatina: 8 mg/g de dieta durante 4 horas temperatura: 40°C. replicações: n Soluções 0,39 M de NaOH 0,105 M de HC1 0,105 M de HC1 contendo 6000 U de pepsina por 5 ml 1 M de NaHCOs contendo 16 mg de pancreatina por ml 125 mM de tampão de NaAc, pH 6,0 A quantidade de proteína da enzima protease (EP) é calculada na base dos valores de A280 e das seqüências de aminoácido (composições de aminoácido) usando os princípios esboçado em S. C. Gill & P. H. von Hippel, Analytical Biochemistry 182, 319 a 326, (1989). O procedimento experimental foi de acordo com o esboço acima. O pH foi medido no tempo de 1, 2,5, e 5,5 horas. As incubações foram terminadas depois de 6 horas e as amostras de 30 ml foram removidas e colocadas em gelo antes da centrifiigação (10000 x g, 10 min, 4°C). os sobrenadantes foram removidos e armazenados a -20°C.

Toas as amostras foram analisada quanto ao teor de proteína solubilizada e digerida usando a filtração em gel, e quanto ao grau de hidrólise (DH) com o método OPA.

Determinação de DH pelo método OPA O Grau de Hidrólise de proteína em amostras diferentes foi determinado usando uma placa microtituladora semi-automatizada com base no método colorimétrico (Nielsen, P.M.; Petersen, D.; Dambmann, C. Improved method for determining food protein degree of hydrolisis. J. Food Sei. 2001, 66, 642 a 646). O reagente OPA foi preparado como segue: 7,620 g de tetraborato de di-Na decaidratado e 200 mg de dodecil sulfato de sódio (SDS) foram dissolvidos em 150 ml de água deionizada. Os reagentes foram completamente dissolvidos antes de continuar. 160 mg de o-ftal-dialdeído 97 % (OPA) foi dissolvido em 4 ml de etanol. A solução OPA foi transferida quantitativamente para a solução mencionada acima pelo enxágue com água deionizada. 176 mg de ditiotreitol a 99 % (DTT) foram adicionados à solução que foi completada a 200 ml com água deionizada. Um padrão de serina (0,9516 meqv/i) foi preparado pela solubilização de 50 mg de serina (Merck, Alemanha) em 500 ml de água deionizada. A solução de amostra foi preparada pela diluição de cada amostra a uma absorbância (280 nm) de cerca de 0,5. No geral, os sobrenadantes foram diluídos (100 x) usando uma central de diluição Tecan automatizada (Mannedorf, Suíça). Todos as outras leituras de espectrofotômetro foram realizadas a 340 mn usando água deionizada como o controle. 25 μΐ de amostra, padrão e cego foram dispensados em uma placa microtituladora. A placa de micro-título foi inserida em uma leitora iEMS MF (Labsystems, Finlândia) e 200 μΐ de reagente OPA foram automaticamente dispensados. As placas foram agitadas (2 min; 700 rpm) antes de medir a absorbância. Finalmente, o DH foi calculado. A determinação de cinco vezes de todas as amostras foi realizada.

Estimativa de proteína solubilizada e digerida O teor de proteína solubilizada em sobrenadantes a partir de amostras digeridas in vitro foi estimado pela quantificação da proteína bruta (CP) usando HPLC de filtração em gel. Os sobrenadantes foram descongelados, filtrados através de filtros de policarbonato de 0,45 μπι e diluídos (1:50, v/v) com H20. As amostras diluídas foram submetidas à cromatografia pela HPLC usando uma coluna de filtração em gel Superdex Peptide PE (7,5 x 300 mm) (Global). O eluente usado para a eluição isocrática foi de 50 mM de tampão de fosfato de sódio (pH 7,0) contendo 150 mM de NaCl. O volume total de eluente por rodada foi de 26 ml e a taxa de fluxo foi de 0,4 ml/min. Os perfis de eluição foram registrados a 214 nm e a área total sob os perfis foi determinada pela integração. Para estimar o teor de proteína das áreas integradas, uma curva de calibração (R = 0,9993) foi feita de uma série de diluição de uma amostra de milho/-SBM de referência digerida in vitro com teor de proteína total conhecido. A determinação da proteína nesta amostra de referência foi realizada usando o método de Kjeldahl (determinação da % de nitrogênio; A.O.A.C. (1984) Official Methods of Analysis 14a ed., Washington DC). O teor de proteína digerida foi estimado integrando-se a área do cromatograma correspondente aos peptídeos e aminoácidos tendo uma massa molecular de 1500 Daltons ou abaixo (Savoie, L.; Gauthier, S. F.

Dialysis Cell For The In-vitro Measurement Protein Digestibility J. Food Sei. 1986, 51, 494 a 498; Babinszky, L.; Van, D. M. J. M.; Boer, H.; Den, H. L. A. A In-vitro Method for Prediction of The Digestible Crude Protein Content in Pig Feeds. J. Sei. Food Agr. 1990, 50, 173 a 178; Boisen, S.; Eggum, B. O. Criticai Evaluation of In-vitro Methods for Estimating Digestibility in Simple-Stomach Animais. Nutrition Research Reviews 1991, 4, 141 a 162). Para determinar a linha divisória de 1500 Daltons, a coluna de filtração em gel foi calibrada usando citocromo C (Boehringer, Alemanha), aprotinina, gastrina 1, e substância P (Sigma Aldrich, USA), como padrões de massa molecular.

Os resultados mostrados nas Tabelas 4 e 5 abaixo indicam que a protease significantemente aumentou o nível de proteína digerível, assim como o grau de hidrólise, ambos em relação ao branco.

Tabela 4: Grau de Hidrólise (OH)______________________________ Letras diferentes dentro da mesma coluna indicam diferenças significantes (ANOVA 1-caminho, teste de Tukey-Kramer, P < 0,05). DP = Desvio Padrão. % de CV = Coeficiente de Variação = (DP/valor médio) x 100 % Tabela 5: Proteína bruta solubilizada e digerida Letras diferentes dentro da mesma coluna indicam diferenças significantes (ANOVA 1-caminho, teste de Tukey-Kramer, P < 0,05). DP = Desvio Padrão. % de CV = Coeficiente de Variação = (DP/valor médio) x 100 % Exemplo 6: Ração para animal e Aditivos de Ração para animal Um aditivo para ração para animal compreendendo a protease preparada como descrito no Exemplo 2, o aditivo de alimentação sendo na forma de uma pré mistura de vitaminas e minerais, é composta como mostrada na Tabela 6 abaixo. As vitaminas e os carotenóides são comercialmente disponíveis da DSM Nutritional Products T odas as quantidades são em g/kg.

Tabela 6: Composição da Pré Mistura Vitamina A__________ROVIMIX 500__________________________4,00_______________ Vitamina D3_________ROVIMIX D3 500_______________________R00________________ Vitamina B2_________ROVIMIX E 50 Ads_____________________.8,00______________ ____________________ROVIMIX B2 80-SD_____________________R0_________________ ____________________CAROPHILL Amarelo____________________KR0________________ ____________________Cloreto de colina 50 %, min._________300,0______________ Minerais____________Oxido de Mn__________________________60,0_______________ ____________________Oxido de Zn__________________________12,0_______________ ____________________Sulfato de Fe monoidratado___________20,0_______________ ____________________Oxido de Cu__________________________R0_________________ ____________________Sulfato de Co________________________R2_________________ Enzima______________Protease do Exemplo 2________________10,0 ______________ Farelo de trigo 571,8 A pré mistura da Tabela 6 é incluída em uma dieta em galinhas poedeiras com uma composição como mostrada na Tabela 7 abaixo. A quantidade de cada ingrediente é indicada em % (ρ/ρ). A concentração na dieta da protease L2a é de 100 mg de proteína de enzima de protease por kg da dieta.

Tabela 7: Dieta em galinhas noedeiras Milho____________________ 55,00__________________________ Trigo____________________10,00___________________________ Aveia____________________7,50____________________________ Soja_____________________20,00___________________________ Calcário_________________7,50____________________________ Pré mistura da Tabela 6 1,00

Claims

1. Uso de pelo menos um polipeptídeo isolado tendo atividade de protease, caracterizado pelo fato de ser: (i) em ração para animal; (ii) na preparação de uma composição para o uso na ração para animal; (iii) para melhorar o valor nutricional de uma ração para animal; (iv) para aumentar a proteína digerível e/ou solúvel em dietas de animais; (v) para aumentar o grau de hídrólise de proteínas em dietas de animais; e/ou (vi) para o tratamento das proteínas, em que o dito polipeptídeo isolado tem uma atividade específica em hemoglobina no pH 7,5 e a 25°C de pelo menos 39 unidades de atividade/g, e é selecionado do grupo que consiste de: (a) uma sequência de aminoácido tendo um grau de identidade para os aminoácidos 1 a 188 de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 95%; e/ou (b) uma sequência de aminoácido tendo um grau de identidade para os aminoácidos 1 a 192 da SEQ ID NO: 6 de pelo menos 95%.

2. Método para a produção de um polipeptídeo como definido na reivindicação I, o método caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante compreendendo (i) uma construção de ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo como definido na reivindicação 1 operavelmente lígada a uma ou mais sequências de controle que conduzem a produção do polipeptídeo; ou (ii) um vetor compreendendo a construção de ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo como definido na reivindicação I operavelmente ligada a uma ou mais sequências de controle que conduzem a produção do polipeptídeo para produzir um sobrenadante compreendendo o polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

3. Aditivo para ração para animal, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um polipeptídeo como definido na reivindicação l;e (a) pelo menos uma vitamina solúvel em gordura, e/ou (b) pelo menos uma vitamina solúvel em água, e/ou (e) pelo menos um mineral de traço.

4. Composição de ração para animal, caracterizada pelo fato de que tem um teor de proteína bruto de 50 a 800 g/kg e compreende pelo menos um polipeptídeo como definido na reivindicação 1, ou pelo menos um aditivo para ração como definido na reivindicação 3.

5. Composição de ração para animal de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a concentração final de polipeptídeo na dieta está dentro da faixa de 0,01-200 mg proteína de enzima por kg de dieta.

6. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um polipeptídeo como definido na reivindicação 1, junto com pelo menos uma outra enzima selecionada dentre amilase, fitase, xilanase, galactanase, alfa-galactosidase, protease, fosfolipase, e/ou beta-glucanase,

7. Uso de pelo menos um polipeptídeo isolado tendo atividade de protease, caracterizado pelo fato de ser em detergentes, em que o dito polipeptídeo isolado tem uma atividade específica em hemoglobina no pH 7,5 e a 25°C de pelo menos 39 unidades de atividade/g, e é selecionado do grupo que consiste de: (a) uma sequência de amínoácido tendo um grau de identidade para os mainoácidos 1 a 188 de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 95%; e/ou (b) uma sequência de amínoácido tendo um grau de identidade para os aminoácidos 1 a 192 da SEQ ID NO: 6 de pelo menos 95%,