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CN118726622A - 一种基于TtAgo的幽门螺杆菌等温扩增一管式检测用组合物、试剂盒和检测方法 - Google Patents

一种基于TtAgo的幽门螺杆菌等温扩增一管式检测用组合物、试剂盒和检测方法 Download PDF

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CN118726622A CN202410847991.0A CN202410847991A CN118726622A CN 118726622 A CN118726622 A CN 118726622A CN 202410847991 A CN202410847991 A CN 202410847991A CN 118726622 A CN118726622 A CN 118726622A
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urea
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朱翎嘉
朱之炜
张文璐
欧兰香
陈振
李雨桓
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SHANDONG LAIBO BIOTECHNOLOGY CO Ltd
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Abstract

本发明涉及一种基于TtAgo的幽门螺杆菌等温扩增一管式检测用组合物、试剂盒和检测方法。包括CagA引物组、VacA引物组、UreA引物组；CagA引导gDNA组、VacA引导gDNA组、UreA引导gDNA组；CagA荧光探针、VacA荧光探针、UreA荧光探针。本发明还提供了利用该试剂盒一管式检测幽门螺杆菌鉴定基因和毒力基因的方法。本发明首次采用LAMP和TtAgo组合一管式检测方法可以同时LAMP扩增‑Ago酶切幽门螺杆菌的毒力基因和鉴定基因，从而获得待测样本是否感染或感染CagA和/或VacA的检测结果，可实现单管多重靶基因定性检测，实现对幽门螺杆菌的核酸分型。

Description

一种基于TtAgo的幽门螺杆菌等温扩增一管式检测用组合物、 试剂盒和检测方法
技术领域
本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种基于TtAgo的幽门螺杆菌等温扩增一管式检测用组合物、试剂盒和检测方法。
背景技术
幽门螺杆菌(H.pylori)是一种微氧、多鞭毛、革兰氏阴性病原体，生活在胃上皮细胞中。在发展中国家，幽门螺杆菌感染的流行率已高达70～90％，在发达国家约为25％。自1982年由Marshall和Warren首次分离以来，研究人员逐渐发现，幽门螺杆菌感染可以影响胃功能，导致多种类型的胃疾病，如胃炎、萎缩、肠上皮化生和发育不良。大约10％的幽门螺杆菌感染会导致严重的胃病变。幽门螺杆菌被证明是胃癌(GC)发展的关键危险因素，这已被流行病学、临床前和临床研究揭示。世界卫生组织(WHO)已将幽门螺杆菌列为第Ⅰ类致癌因子。这种致癌菌株主要通过两种细胞毒素来发挥病原作用，即细胞毒素相关蛋白CagA和空泡细胞毒素VacA。根据它们是否表达这两种毒素，幽门螺杆菌可分为两种类型：I型和II型。I型是致病性较强的产毒菌株，它们表达CagA和VacA中的至少一种；而II型是毒性较弱的不产生这两种毒素的菌株。并非所有幽门螺杆菌感染者均会发病，具有细胞毒素相关蛋白(CagA)和空泡毒素(VacA)表达的菌株才是胃部炎症、溃疡及胃癌的相关菌株。对于幽门螺杆菌，包含某些特定毒力基因的菌株类型比其他株类型更倾向于进化为胃癌，在这些毒力基因中，空泡细胞毒素A(vacA)，特别是亚型s1和m1，以及细胞毒素相关基因A(cagA)与胃癌的发展密切相关。所有的幽门螺杆菌都携带有尿素酶基因(UreA)，尿素酶基因可用于幽门螺杆菌感染检测、菌株鉴定和流行病学调查，并可用于幽门螺旋杆菌的早期临床诊断。
目前，常见的幽门螺杆菌检测方法包括尿素呼气试验、血清抗体试验、粪便抗原试验、培养和荧光定量PCR技术。然而，这些方法各有局限：尿素呼气试验无法进行菌株分型，血清抗体试验不能区分感染状态，粪便抗原试验灵敏度不高且无法进行分型，幽门螺杆菌培养周期长且不能分型，而荧光定量PCR则需昂贵设备和专用试剂，难以推广至基层医疗单位及便携式检测场景。因此，迫切需要一种快速、准确、高特异性和高灵敏度的现场检测方法，以支持幽门螺杆菌的有效防控及患者管理。
近年来，以CRISPR基因编辑系统(Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeats)为代表的新型检测方法因其在核酸识别方面的高灵敏度、特异性和可编程性而被广泛用于分子诊断。然而CRISPR检测技术也面临着诸多挑战，包括PAM(protospacer adjacent motif)对检测序列的限制，以及多重目标检测的困难。Ago蛋白(Argonaute)是一种广泛存在于生物体内的高度保守的蛋白，它可以通过“引导RNA”或“引导DNA”裂解互补链RNA或DNA，且无PAM序列的限制。这种蛋白有望克服CRISPR基因编辑核酸检测技术的缺点，并进一步提高测定的效率。
基于上述，为满足快速和便捷的诊断需求，需要建立一种特异性强、灵敏度高的非侵入性的幽门螺杆菌核酸分型的恒温LAMP扩增-Ago酶切兼容的一管式检测方案，来实现高致病性幽门螺旋杆菌菌株的高敏感度检测。目前，尚无以恒温LAMP扩增-Ago酶切兼容的一管式检测方案用于病原微生物检测报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于TtAgo的幽门螺杆菌等温扩增一管式检测用组合物、试剂盒和检测方法。该检测方法可以同时检测幽门螺杆菌(HP-I型、HP-II型)三种特异性指标，在检测幽门螺杆菌毒力基因的同时检测UreA鉴定基因，用于幽门螺杆菌感染的体外检测，辅助临床医生精准选择幽门螺杆菌治疗方案，提高治疗的根除率，降低胃癌的发生概率。并且特异性强、灵敏度高，且为非侵入性的检测方法，患者依从性好。
本发明的技术方案如下：
一种基于TtAgo的幽门螺杆菌等温扩增一管式检测用组合物，其包括CagA引物组、VacA引物组、UreA引物组；CagA引导gDNA组、VacA引导gDNA组、UreA引导gDNA组；CagA荧光探针、VacA荧光探针、UreA荧光探针；
所述CagA引物组包括外引物对CaA-F3和CaA-B3、内引物对CaA-FIP和CaA-BIP和环引物对CaA-LF和CaA-LB；所述外引物对CaA-F3和CaA-B3、内引物对CaA-FIP和CaA-BIP、环引物对CaA-LF和CaA-LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～6所示；
所述VacA引物组包括外引物对VacA-F3和VacA-B3、内引物对VacA-FIP和VacA-BIP和环引物对VacA-LF和VacA-LB；所述外引物对VacA-F3和VacA-B3、内引物对VacA-FIP和VacA-BIP、环引物对VacA-LF和VacA-LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.7～12所示；
所述UreA引物组包括外引物对UreA-F3和UreA-B3、内引物对UreA-FIP和UreA-BIP和环引物对UreA-LF和UreA-LB；所述外引物对UreA-F3和UreA-B3、内引物对UreA-FIP和UreA-BIP、环引物对UreA-LF和UreA-LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.13～18所示；
所述CagA引导gDNA组包括gDNA1 CagA和gDNA2 CagA，其核苷酸序列如SEQ IDNO.19～20所示；
所述VacA引导gDNA组包括gDNA1 VacA和gDNA2 VacA，其核苷酸序列如SEQ IDNO.22～23所示；
所述UreA引导gDNA组包括gDNA1 UreA和gDNA2 UreA，其核苷酸序列如SEQ IDNO.25～26所示；
所述CagA荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；
所述VacA荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；
所述UreA荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示。
其中，所述荧光探针两端连接有ROX、BHQ2、FAM、BHQ1和HEX等荧光基团。
一种一管式检测幽门螺杆菌鉴定基因和毒力基因的试剂盒，包括上述检测用组合物。
根据本发明优选的，所述试剂盒的CagA引物组、VacA引物组、UreA引物组中，引物对的浓度比和终浓度均相同；其中，浓度比为外引物对：内引物对：环引物对＝1：8：4；所述外引物对的终浓度为0.2μmol/L，所述内引物对的终浓度为1.6μmol/L，所述环引物对的终浓度为0.8μmol/L。
根据本发明优选的，所述试剂盒中，CagA引导gDNA组、VacA引导gDNA组、UreA引导gDNA组的终浓度为5～15μM；CagA荧光探针、VacA荧光探针、UreA荧光探针的终浓度为150～250nM。
进一步优选的，所述CagA引导gDNA组、VacA引导gDNA组、UreA引导gDNA组的终浓度为10μM；CagA荧光探针、VacA荧光探针、UreA荧光探针的终浓度为200nM。
根据本发明优选的，所述试剂盒还包括样本前处理试剂、10×Buffer I试剂、BstDNA聚合酶和TtAgo蛋白酶。
进一步优选的，所述样本前处理试剂组成为：10.0～20.0mM的三羟甲基氨基甲烷(Tris)、1.0～2.5mM的乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)、0.05％～0.5％(m/v)的十二烷基硫酸钠(SDS)、10.0～20.0mM的氯化钠(NaCl)、1.0％～2.0％(m/v)的聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40)，pH为8.0～8.5；
所述10×Buffer I试剂组成为：100～200mM的三羟甲基氨基甲烷(Tris)、100～200mM的氯化钾(KCl)、50～100mM的硫酸镁(MgSO4)、100～120mM硫酸铵((NH4)2SO4)、400～600mM甜菜碱，1.0％～2.0％(m/v)吐温-20(Tween 20)、80～120nM脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，pH为8.0～8.5；
所述试剂盒中，Bst DNA聚合酶的终浓度为50～400nM；TtAgo蛋白酶的终浓度为50～200nM。
最优选的，所述样本前处理试剂组成为：15mM的三羟甲基氨基甲烷(Tris)、2.5mM的乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)、0.5％(m/v)的十二烷基硫酸钠(SDS)、15mM的氯化钠(NaCl)、1.0％(m/v)的聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40)，pH为8.0～8.5；
所述10×Buffer I试剂组成为：200mM的三羟甲基氨基甲烷(Tris)、100mM的氯化钾(KCl)、80mM的硫酸镁(MgSO4)、100mM硫酸铵((NH4)2SO4)、600mM甜菜碱，1.0％(m/v)吐温-20(Tween 20)、100nM脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，pH为8.0～8.5；
所述试剂盒中，Bst DNA聚合酶的终浓度为50～400nM；TtAgo蛋白酶的终浓度为50～200nM。
一种利用上述试剂盒以非疾病诊断治疗目的、一管式检测幽门螺杆菌鉴定基因和毒力基因的方法，包括步骤如下：
(1)提取待测样品DNA；
(2)采用上述试剂盒配制一管式检测体系；
(3)将一管式检测体系在荧光定量PCR仪中，于65～70℃下反应30～40min，反应过程中每隔30～60s收集一次荧光信号；
(4)结果判读：待测样本的HEX检测通道若有信号且Ct值小于30，则判读为UreA(+)阳性，HEX检测通道若无明显信号或Ct值≥30，则判读为UreA(-)阴性；
待测样本的ROX/VIC通道若有信号且Ct值＜35，则判读为CagA(+)为阳性，VacA(+)阳性，ROX/VIC通道若无信号或Ct值≥35，则判读为CagA(-)为阴性，VacA(-)阴性。
当检测CagA(-)为阴性荧光信号，VacA(-)为阴性荧光信号，UreA(+)为阳性荧光信号则说明该样本幽门螺杆菌感染且为则为HP-II型毒力弱；
当检测CagA基因荧光信号和VacA基因荧光信号中的至少一个为阳性荧光信号，UreA(+)为阳性荧光信号说明该样本幽门螺杆菌感染且为则为HP-I型毒力强；
当检测CagA(-)为阴性荧光信号，VacA(-)为阴性荧光信号，UreA(-)为阴性荧光信号则说明该样本无幽门螺杆菌感染。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述待测样品为粪便样品或胃粘膜样品。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述一管式检测体系为：10×Buffer I 5μL，CagA引物组、VacA引物组和UreA引物组5μL，10μM的CagA引导gDNA组、VacA引导gDNA组和UreA引导gDNA组4μL、1μM的Bst DNA聚合酶2.5μL、1μM的TtAgo蛋白酶2.5μL，20μM的CagA荧光探针、VacA荧光探针和UreA荧光探针0.5μL，待测样本DNA 5～10μL和ddH2O补足至50μL。
本发明的技术特点：
如图1所示，本发明在获得待测样本DNA后，通过体系组分实现等温扩增和可编程核酸内切酶Ago的识别，在均相混合液中完成核酸DNA扩增与检测。LAMP扩增得到的产物称其为Target DNA，即目标DNA，设计的特异靶向毒力基因和鉴定基因的向导DNAs(gDNAs)及恒温LAMP扩增引物，Ago蛋白是在两条向导DNA(gDNAs)介导下特异性的识别切割targetDNA，切割出新的16nt gDNA从而激活Ago蛋白二次靶向切割探针(Reporter)的能力，对这个报告子断裂产生的信号进行测定，从而将核酸信号转化成荧光信号输出，进而分析检测结果并进行核酸分型。
本发明的有益效果：
1、本发明首次采用LAMP和TtAgo组合一管式检测方法可以同时LAMP扩增-Ago酶切幽门螺杆菌的毒力基因和鉴定基因，从而获得待测样本是否感染或感染CagA和/或VacA的检测结果，可实现单管多重靶基因定性检测，实现对幽门螺杆菌的核酸分型。
2、本发明运用LAMP等温扩增技术对幽门螺杆菌DNA进行扩增及在引导gDNA条件下可编程TtAgo识别切割特定的荧光探针，该技术无需繁琐的循环变温过程，将温度控制于65℃，恒温孵育30min，即可完成；该扩增方法可以在医疗资源匮乏的地区实现，不依赖于大型仪器设备等，且耗时短，灵敏度高，对操作人员技术要求低，可在各种场所应用。
3、本发明的gDNA可引导TtAgo蛋白结合到靶序列上识别并切割靶序列，同时，切割在反应体系的单链DNA报告分子；当单链DNA报告分子为FAM荧光素-猝灭剂双标记探针时，可配合荧光检测仪器直接读取检测结果；当单链DNA报告分子为FAM荧光素-生物素双标记探针时，可配合免疫层析条读取检测结果；据此，本发明可作为临床大规模检测人群的方法，且相对传统诊断检测方式，本发明检测方式既大大地缩短了检测时间，也不需要反复训练的操作人员。
4、本发明将LAMP扩增与TtAgo技术相结合，建立的新的检测平台具有创新性，可进一步推广应用于各类病原体和基因的检测；该检测平台快速、灵敏、特异性强、成本低、操作简单，可满足临床对于幽门螺杆菌及毒力基因快速检测的需求，具有极大的市场潜力；将基础研究转向临床研究，具有转化的创新性。
5、本发明将LAMP扩增与TtAgo技术相结合具有高容错性，TtAgo具有较高的特异性和剪切能力，其对样本质量和反应条件的容忍度较高，LAMP-TtAgo技术在幽门螺杆菌感染者的粪便样本和胃粘膜样本快提样本DNA中依然能够提供可靠的检测结果。可以增强LAMP反应的特异性，减少假阳性结果的产生。
6、本发明建立的检测方法检测限度低，最低检测限度为200copies/mL，该检测平台快速其恒温孵育30min内即可完成，该检测灵敏度及反应速度明显优于现有技术。
7、本发明建立的在两条5’磷酸化的16nt单链DNA(gDNAs)条件下引导TtAgo蛋白识别到LAMP扩增出的靶序列并切割出新的16nt gDNA，从而激活Ago蛋白二次靶向切割探针(Reporter)的能力，与多数TtAgo+LAMP检测方法中使用3条引导gDNAs是显著区别，减少引导gDNA可显著降低LAMP非特异性扩增。
附图说明
图1为本发明中基于TtAgo的幽门螺杆菌等温扩增一管式检测用组合物检测幽门螺杆菌鉴定基因和毒力基因的原理示意图。
图2为最低检出限试验中CagA的LAMP-TtAgo扩增曲线图。
图3为最低检出限试验中VacA的LAMP-TtAgo扩增曲线图。
图4为最低检出限试验中UreA的LAMP-TtAgo扩增曲线图。
图5是基于可编程核酸酶TtAgo和LAMP等温组合一管式试验幽门螺杆菌粪便样本和胃粘膜样本结果与临床样本数据C13或C14呼气试验一致性对比试验结果图。
具体实施方式
下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述实施例仅是本发明的较佳实施方式，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
下述实施例中，所使用的实验方法，未做具体说明的，均为常规方法。实施例所用试剂均为市售产品。
Bst DNA聚合酶和TtAgo蛋白酶在山东省大健康精准医疗产业技术研究院有售。
实施例1、引物组的设计、筛选与合成
利用DNAMAN8.0软件对GenBanK序列号AP017632.1、AF373584.1、GQ403154.1、AF373556.1、AF373567.1、AF3735.0.1进行多序列比对，得到ureA的高度保守区。
利用DNAMAN8.0软件对GenBanK序列号AP017632.1、AB015413.1、AB090088.1、GQ161098.1、GU173878.1、LC339462.1进行多序列比对，得到cagA的高度保守区。
利用DNAMAN8.0软件对GenBanK序列号AP017632.1、FN598874.1、GQ331975.1、AY049007.1、U05676.1、LC187359.1进行多序列比对，得到vacA的高度保守区域。
在LAMP Primer Design Tool version 1.3.0网站设计选取毒力基因cagA、vacA，以及幽门螺杆菌鉴定ureA基因高度保守区域设计LAMP引物，选取6条引物，进行扩增。最终确定出可鉴定幽门螺杆菌cagA引物组、vacA引物组、ureA引物组，由苏州金唯智生物科技有限公司人工合成，获得毒力基因cagA、vacA以及鉴定ureA基因的CagA引物组、VacA引物组和UreA引物组，具体序列如下表1中的SEQ ID NO.1～SEQ 18所示。
表1、引物组序列
序列编号 引物名称 引物序列(5’-3’)
SEQ ID NO.1 CaA-F3 ATGACTAACGAAACTATTGACC
SEQ ID NO.2 CaA-B3 TTGGTAGGATTTTTGATCGC
SEQ ID NO.3 CaA-FIP CAACTTTAAGAAAAGCCACTTGAAGACAACCACAAACCGAAGC
SEQ ID NO.4 CaA-BIP CCTGATCAAAAACCAATCGTTGATGTATTCTTCCCTTAATTGCGAG
SEQ ID NO.5 CaA-LF TGTTGATAAATTGCTGCGG
SEQ ID NO.6 CaA-LB GGCAAGCTTTTGATGGAAT
SEQ ID NO.7 VacA-F3 GTATTGCCACCATTCTCAGT
SEQ ID NO.8 VacA-B3 TCTACAGGTACCAATGGCA
SEQ ID NO.9 VacA-FIP AAAGCATGGTGAACAACCCTGATAGCCGTTTTACTGATGCC
SEQ ID NO.10 VacA-BIP TAGCCATACCGCATGCTTTTAACCGCATGGATACTTGTG
SEQ ID NO.11 VacA-LF CTTATCGGTAAGGCATGGAGAA
SEQ ID NO.12 VacA-LB TGTCATCAGTATTTCGCACCA
SEQ ID NO.13 UreA-F3 CTGTCAAAGTCTAAGCATCT
SEQ ID NO.14 UreA-B3 ACTCGTAACCGTGCATAC
SEQ ID NO.15 UreA-FIP GCCGTTAGCGTGAAAGTTAAAAAAAGAAATGGAAGTGTGAGC
SEQ ID NO.16 UreA-BIP GCCTTCGTTGATAGTGATGTCTCCTATTGAGGCCAATGGTA
SEQ ID NO.17 UreA-LF ACAGACCGGTTCAAATCG
SEQ ID NO.18 UreA-LB AAGAACAACTCACCAGGAAC
实施例2、gDNA组及探针的设计
TtAgo检测方法的核心在于gDNA，故gDNA的选择与最终检测方法的有效性直接相关。根据来自于Thermus thermophilus的Argonaute蛋白，在5’磷酸化的16nt单链DNA的引导下切割互补序列，设计检测幽门螺杆菌鉴定基因和毒力基因的gDNA和探针，具体序列如下表2中的SEQ ID NO.19～27所示。
表2、gDNA和探针序列
实施例3
一种一管式检测幽门螺杆菌鉴定基因和毒力基因的试剂盒，包括实施例1所述的CagA引物组、VacA引物组和UreA引物组，实施例2所述的CagA引导gDNA组、VacA引导gDNA组和UreA引导gDNA组，实施例2所述的CagA荧光探针、VacA荧光探针和UreA荧光探针，样本前处理试剂，10×Buffer I试剂、Bst DNA聚合酶和TtAgo蛋白酶。
所述试剂盒的CagA引物组、VacA引物组、UreA引物组中，引物对的浓度比和终浓度均相同；其中，浓度比为外引物对：内引物对：环引物对＝1：8：4；所述外引物对的终浓度为0.2μmol/L，所述内引物对的终浓度为1.6μmol/L，所述环引物对的终浓度为0.8μmol/L。
所述试剂盒中，所述CagA引导gDNA组、VacA引导gDNA组、UreA引导gDNA组的终浓度为10μM；CagA荧光探针、VacA荧光探针、UreA荧光探针的终浓度为200nM。
所述样本前处理试剂组成为：15mM的三羟甲基氨基甲烷(Tris)、2.5mM的乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)、0.5％(m/v)的十二烷基硫酸钠(SDS)、15mM的氯化钠(NaCl)、1.0％(m/v)的聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40)，pH为8.0～8.5；
所述10×Buffer I试剂组成为：200mM的三羟甲基氨基甲烷(Tris)、100mM的氯化钾(KCl)、80mM的硫酸镁(MgSO4)、100mM硫酸铵((NH4)2SO4)、600mM甜菜碱，1.0％(m/v)吐温-20(Tween 20)、100nM脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，pH为8.0～8.5；
所述试剂盒中，Bst DNA聚合酶的终浓度为200nM；TtAgo蛋白酶的终浓度为100nM。
实施例4、最低检出限试验
分别检测实施例1提供的幽门螺杆菌CagA引物组、VacA引物组、UreA引物组以及实施例2提供幽门螺杆菌鉴定基因和毒力基因的gDNA和探针的最低检出限。
试验方法如下：
将携带CagA、VacA和UreA基因的幽门螺杆菌DNA标准品(ATCC43504)按照梯度稀释为以下5个浓度，分别为2×106copies/mL、2×105copies/mL、2×104copies/mL、2×103copies/mL、2×102copies/mL，按照实施例3提供的反应体系分别检测CagA、VacA和UreA基因的扩增及识别切割效果。
(1)所述检测体系为：10×Buffer I 5μL，CagA引物组5μL，10μM引导CagA gDNA组4μL、1μM的Bst DNA聚合酶2.5μL、1μM的TtAgo蛋白酶2.5μL，20μM的CagA荧光探针0.5μL，不同浓度梯度稀释幽门螺杆菌DNA标准品10μL，ddH2O补足至50μL；
在ABI 7300荧光定量PCR仪中进行恒温LAMP扩增-Ago酶切，65℃反应，30min，60s收集一次荧光信号，CagA基因的TtAgo-LAMP检测体系结果如图2所示。
(2)所述检测体系为：10×Buffer I 5μL，VacA引物组5μL，10μM引导VacAgDNA组4μL、1μM的Bst DNA聚合酶2.5μL、1μM的TtAgo蛋白酶2.5μL，20μM VacA荧光探针0.5μL，不同浓度梯度稀释幽门螺杆菌DNA标准品10μL，ddH2O补足至50μL；
在ABI 7300荧光定量PCR仪中进行恒温LAMP扩增-Ago酶切，65℃反应，30min，60s收集一次荧光信号，VacA基因的TtAgo-LAMP检测体系结果如图3所示。
(3)所述检测体系为：10×Buffer I 5μL，UreA引物组5μL，10μM引导UreA gDNA组4μL、1μM的Bst DNA聚合酶2.5μL、1μM的TtAgo蛋白酶2.5μL，20μM的UreA荧光探针0.5μL，不同浓度梯度稀释幽门螺杆菌DNA标准品10μL，ddH2O补足至50μL；
在ABI 7300荧光定量PCR仪中进行恒温LAMP扩增-Ago酶切，65℃反应，30min，60s收集一次荧光信号，UreA基因的TtAgo-LAMP检测体系结果如图4所示。
由图2、图3、图4可知，CagA引物组、VacA引物组、UreA引物组及相应gDNA和探针在TtAgo-LAMP检测体系均能检测出浓度为2×102copies/mL的幽门螺杆菌DNA标准品，说明TtAgo-LAMP检测体系扩增及切割效果较好。
实施例5、临床样本检测
收集济南市中心医院30例尿素酶呼气试验阳性的幽门螺杆菌感染者的粪便样本和胃粘膜样本、30例尿素酶呼气试验阴性人员的粪便样本和胃粘膜样本。
1、利用本发明实施例3所述试剂盒一管式检测粪便样本中幽门螺杆菌的方法，包括步骤如下：
(1)取新鲜粪便样本或解冻后的-80℃保存粪便样本0.4g到一新的2mL离心管中，加入0.5mL核酸提取试剂，漩涡震荡1min使样品均匀分布，室温静置30s，10000rpm离心2min，将上清转移至新的离心管，得到粪便样本DNA，备用；
(2)采用实施例3试剂盒配制一管式检测体系；
所述一管式检测体系为：10×Buffer I 5μL，CagA引物组、VacA引物组和UreA引物组5μL，10μM的CagA引导gDNA组、VacA引导gDNA组和UreA引导gDNA组4μL、1μM的Bst DNA聚合酶2.5μL、1μM的TtAgo蛋白酶2.5μL，20μM的CagA荧光探针、VacA荧光探针和UreA荧光探针0.5μL，粪便样本DNA 10μL，ddH2O补足至50μL；
(3)将一管式检测体系在荧光定量PCR仪中，于65℃下反应30min，反应过程中每隔60s收集一次荧光信号。
2、利用本发明实施例3所述试剂盒一管式检测胃粘膜中幽门螺杆菌的方法，包括步骤如下：
(1)取粘膜组织至1.5mL离心管中，加入100μL核酸提取试剂，100℃恒温处理5±1分钟，漩涡震荡1min使样品均匀分布，室温静置30s，10000rpm离心2min，将上清转移至新的离心管中，得到胃粘膜DNA，备用；
(2)采用实施例3试剂盒配制一管式检测体系；
所述一管式检测体系为：10×Buffer I 5μL，CagA引物组、VacA引物组和UreA引物组5μL，10μM的CagA引导gDNA组、VacA引导gDNA组和UreA引导gDNA组4μL、1μM的Bst DNA聚合酶2.5μL、1μM的TtAgo蛋白酶2.5μL，20μM的CagA荧光探针、VacA荧光探针和UreA荧光探针0.5μL，胃粘膜DNA 5μL，ddH2O补足至50μL；
(3)将一管式检测体系在荧光定量PCR仪中，于65℃下反应30min，反应过程中每隔60s收集一次荧光信号。
然后根据以上两种检测方法所得的荧光信号数据进行结果判读，判读的标准如下：
待测样本的HEX检测通道若有信号且Ct值小于30，则判读为UreA(+)阳性，HEX检测通道若无明显信号或Ct值≥30，则判读为UreA(-)阴性；
待测样本的ROX/VIC通道若有信号且Ct值＜35，则判读为CagA(+)为阳性，VacA(+)阳性，ROX/VIC通道若无信号或Ct值≥35，则判读为CagA(-)为阴性，VacA(-)阴性。
当检测CagA(-)为阴性荧光信号，VacA(-)为阴性荧光信号，UreA(+)为阳性荧光信号则说明该样本幽门螺杆菌感染且为则为HP-II型毒力弱；
当检测CagA基因荧光信号和VacA基因荧光信号中的至少一个为阳性荧光信号，UreA(+)为阳性荧光信号说明该样本幽门螺杆菌感染且为则为HP-I型毒力强；
当检测CagA(-)为阴性荧光信号，VacA(-)为阴性荧光信号，UreA(-)为阴性荧光信号则说明该样本无幽门螺杆菌感染。
以上两种样本的检测结果如图5所示。
由图5可知，30例尿素酶呼气试验阳性的幽门螺杆菌感染者的粪便样本和胃粘膜样本，均检测出UreA基因阳性信号，4例感染CagA的样本，2例感染CagA和VacA的样本。30例尿素酶呼气试验阴性人员的粪便样本和胃粘膜样本均未检测出UreA基因信号，CagA和VacA基因信号。统计阴阳性符合率均特异性检出100％，其中特异性检出30例阳性的幽门螺杆菌感染者，30例阴性人员，HP-I型感染者检出有6例，HP-II型感染者24例。
综上所述，本发明提供的基于TtAgo的幽门螺杆菌等温扩增一管式检测用组合物、试剂盒和检测方法，可用于能够实现对待测样本是否感染以及感染CagA和/或VacA进行检测，有很好的临床应用价值，来帮助预防高致病性幽门螺杆菌的传播、对已患病人群的实时监测和诊断。

Claims (10)

1.一种基于TtAgo的幽门螺杆菌等温扩增一管式检测用组合物，其特征在于，包括CagA引物组、VacA引物组、UreA引物组；CagA引导gDNA组、VacA引导gDNA组、UreA引导gDNA组；CagA荧光探针、VacA荧光探针、UreA荧光探针；
所述CagA引物组包括外引物对CaA-F3和CaA-B3、内引物对CaA-FIP和CaA-BIP和环引物对CaA-LF和CaA-LB；所述外引物对CaA-F3和CaA-B3、内引物对CaA-FIP和CaA-BIP、环引物对CaA-LF和CaA-LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～6所示；
所述VacA引物组包括外引物对VacA-F3和VacA-B3、内引物对VacA-FIP和VacA-BIP和环引物对VacA-LF和VacA-LB；所述外引物对VacA-F3和VacA-B3、内引物对VacA-FIP和VacA-BIP、环引物对VacA-LF和VacA-LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.7～12所示；
所述UreA引物组包括外引物对UreA-F3和UreA-B3、内引物对UreA-FIP和UreA-BIP和环引物对UreA-LF和UreA-LB；所述外引物对UreA-F3和UreA-B3、内引物对UreA-FIP和UreA-BIP、环引物对UreA-LF和UreA-LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.13～18所示；
所述CagA引导gDNA组包括gDNA1 CagA和gDNA2 CagA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.19～20所示；
所述VacA引导gDNA组包括gDNA1 VacA和gDNA2 VacA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.22～23所示；
所述UreA引导gDNA组包括gDNA1 UreA和gDNA2 UreA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.25～26所示；
所述CagA荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；
所述VacA荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；
所述UreA荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示。
2.一种一管式检测幽门螺杆菌鉴定基因和毒力基因的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的基于TtAgo的幽门螺杆菌等温扩增一管式检测用组合物。
3.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的CagA引物组、VacA引物组、UreA引物组中，引物对的浓度比和终浓度均相同；其中，浓度比为外引物对：内引物对：环引物对＝1：8：4；所述外引物对的终浓度为0.2μmol/L，所述内引物对的终浓度为1.6μmol/L，所述环引物对的终浓度为0.8μmol/L。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中，CagA引导gDNA组、VacA引导gDNA组、UreA引导gDNA组的终浓度为5～15μM；CagA荧光探针、VacA荧光探针、UreA荧光探针的终浓度为150～250nM；
进一步优选的，所述CagA引导gDNA组、VacA引导gDNA组、UreA引导gDNA组的终浓度为10μM；CagA荧光探针、VacA荧光探针、UreA荧光探针的终浓度为200nM。
5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样本前处理试剂、10×Buffer I试剂、Bst DNA聚合酶和TtAgo蛋白酶。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述样本前处理试剂组成为：10.0～20.0mM的三羟甲基氨基甲烷、1.0～2.5mM的乙二胺四乙酸二钠、0.05％～0.5％(m/v)的十二烷基硫酸钠、10.0～20.0mM的氯化钠、1.0％～2.0％(m/v)的聚乙烯吡咯烷酮，pH为8.0～8.5；
所述10×Buffer I试剂组成为：100～200mM的三羟甲基氨基甲烷、100～200mM的氯化钾、50～100mM的硫酸镁、100～120mM硫酸铵、400～600mM甜菜碱，1.0％～2.0％(m/v)吐温-20、80～120nM脱氧核糖核苷三磷酸，pH为8.0～8.5；
所述试剂盒中，Bst DNA聚合酶的终浓度为50～400nM；TtAgo蛋白酶的终浓度为50～200nM。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述样本前处理试剂组成为：15mM的三羟甲基氨基甲烷、2.5mM的乙二胺四乙酸二钠、0.5％(m/v)的十二烷基硫酸钠、15mM的氯化钠、1.0％(m/v)的聚乙烯吡咯烷酮，pH为8.0～8.5；
所述10×Buffer I试剂组成为：200mM的三羟甲基氨基甲烷、100mM的氯化钾、80mM的硫酸镁、100mM硫酸铵、600mM甜菜碱，1.0％(m/v)吐温-20、100nM脱氧核糖核苷三磷酸，pH为8.0～8.5；
所述试剂盒中，Bst DNA聚合酶的终浓度为50～400nM；TtAgo蛋白酶的终浓度为50～200nM。
8.一种利用权利要求2～7任一项所述试剂盒以非疾病诊断治疗目的、一管式检测幽门螺杆菌鉴定基因和毒力基因的方法，其特征在于，包括步骤如下：
(1)提取待测样品DNA；
(2)采用上述试剂盒配制一管式检测体系；
(3)将一管式检测体系在荧光定量PCR仪中，于65～70℃下反应30～40min，反应过程中每隔30～60s收集一次荧光信号；
(4)结果判读：待测样本的HEX检测通道若有信号且Ct值小于30，则判读为UreA(+)阳性，HEX检测通道若无明显信号或Ct值≥30，则判读为UreA(-)阴性；
待测样本的ROX/VIC通道若有信号且Ct值＜35，则判读为CagA(+)为阳性，VacA(+)阳性，ROX/VIC通道若无信号或Ct值≥35，则判读为CagA(-)为阴性，VacA(-)阴性。
当检测CagA(-)为阴性荧光信号，VacA(-)为阴性荧光信号，UreA(+)为阳性荧光信号则说明该样本幽门螺杆菌感染且为则为HP-II型毒力弱；
当检测CagA基因荧光信号和VacA基因荧光信号中的至少一个为阳性荧光信号，UreA(+)为阳性荧光信号说明该样本幽门螺杆菌感染且为则为HP-I型毒力强；
当检测CagA(-)为阴性荧光信号，VacA(-)为阴性荧光信号，UreA(-)为阴性荧光信号则说明该样本无幽门螺杆菌感染。
9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述待测样品为粪便样品或胃粘膜样品。
10.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述一管式检测体系为：10×Buffer I 5μL，CagA引物组、VacA引物组和UreA引物组5μL，10μM的CagA引导gDNA组、VacA引导gDNA组和UreA引导gDNA组4μL、1μM的Bst DNA聚合酶2.5μL、1μM的TtAgo蛋白酶2.5μL，20μM的CagA荧光探针、VacA荧光探针和UreA荧光探针0.5μL，待测样本DNA5～10μL和ddH2O补足至50μL。
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