CN114134218B - 一种基于CRISPR-Cas12a的荧光检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas12a的荧光检测方法及应用，所述方法将PCR扩增与CRISPR‑Cas12a荧光检测相结合以检测盖尔森基兴诺卡菌，通过PCR扩增目的DNA片段，利用Cas12a蛋白的反式切割活性，实现CRISPR‑Cas12a的特异性荧光检测。该检测平台可用于鉴定盖尔森基兴诺卡菌，具有检测快速、灵敏度和特异性高的特点。

Description

一种基于CRISPR-Cas12a的荧光检测方法

技术领域

本发明公开了一种基于CRISPR-Cas12a与PCR相结合检测病原体核酸的方法，属于分子生物学和微生物学领域。

背景技术

诺卡氏菌是一种机会致病菌，可导致几乎所有器官的严重感染，包括创伤性感染、肺部疾病和脑脓肿。近年来，在免疫功能低下的患者中，诺卡氏菌的感染显著增加，包括艾滋病晚期、糖尿病患者和器官移植患者等。盖尔森基兴诺卡菌(Nocardiacyriacigeorgica)越来越成为一种常见的诺卡氏菌感染病原体。由于诺卡氏菌种间序列高度相似，传统的分离培养和生化试验难以将诺卡氏菌鉴定到种水平，而诺卡氏菌不同的种具有不同的抗菌药物耐药模式，因此，迫切需要一种快速、特异的检测方法鉴定盖尔森基兴诺卡菌，指导临床早期合理用药。

成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeats，CRISPR)和CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated protein,Cas蛋白)组成的CRISPR-Cas系统是细菌或古细菌体内的一种获得性免疫系统。CRISPR-Cas系统不仅可用于基因编辑，也可用于病原体的核酸检测。Cas12a蛋白具有反式切割活性，Cas12a蛋白在crRNA的引导下特异性地与靶向双链DNA(dsDNA)结合并激活其反式切割活性，不加区别的切割非特异性单链DNA(ssDNA)，通过在ssDNA两端修饰荧光基团和猝灭基团，当ssDNA探针裂解后会发出荧光信号，因此CRISPR-Cas12a系统可作为核酸检测的工具。DETECTR(DNA Endonuclease-Targeted CRISPR Trans Reporter)是基于CRISPR-Cas12a建立的一种核酸检测方法，特异性地鉴别人乳头瘤病毒(HPV)16型和18型。CRISPR-Cas12a荧光检测方法通过设计不同的crRNA序列，指导Cas12a蛋白结合不同的靶向dsDNA序列，可用于不同病原体的检测。

基于现有技术存在的问题，本发明的目的就是建立一种将聚合酶链扩增反应(PCR)与CRISPR-Cas12a检测相结合的核酸检测方法，并将其用于诺卡氏菌的检测。

发明内容

基于上述目的，本发明首先提供了一种基于非诊断目的应用CRISPR-Cas12a技术检测核酸的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)以盖尔森基兴诺卡菌的基因组中protein_id为VFA97995.1的蛋白质的编码基因为靶基因进行聚合酶链扩增反应(PCR)；

(2)使用步骤(1)获取的聚合酶链扩增产物，Cas12a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基团双标记的单链DNA探针，以及crRNA分子在CRISPR-Cas12a技术检测体系里反应，其中，crRNA分子的序列如SEQ ID NO.3所示；

(3)对步骤(2)的反应体系进行荧光强度的检测。

本发明提供的方法将PCR扩增和CRISPR-Cas12a荧光检测相结合，被命名为“CRISPR-PCR”，所述引物和探针是基于盖尔森基兴诺卡菌的蛋白质protein_id:VFA97995.1编码基因设计的，盖尔森基兴诺卡菌全基因组Accession:LR21597.3，蛋白质protein_id:VFA97995.1的编码基因位于1870620-1871693bp之间，由本申请人命名为Ncc1基因。本发明提供的方法可用于检测盖尔森基兴诺卡菌。所述方法首先根据PCR引物，扩增目的DNA片段；然后根据保守序列设计特异性crRNA，引导Cas12a蛋白与靶向dsDNA结合，以实现盖尔森基兴诺卡菌的检测。

在一个优选的实施方案中，所述聚合酶链扩增反应使用的上游引物的序列如SEQID NO.1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示。所述聚合酶链扩增区间为Ncc1基因的79bp-266bp，PCR扩增的目的片段的长度为187bp。

在一个更为优选的实施方案中，步骤(2)所述单链DNA探针的序列如SEQ ID NO.4所示，所述单链DNA探针在5’端被标记荧光基团6-FAM，在3’端被标记荧光淬灭基团BHQ1。

在另一个优选的实施方案中，步骤(1)所述聚合酶链扩增反应的退火温度为60-65℃。

更为优选地，步骤(1)所述聚合酶链扩增反应的退火温度为65℃。

在又一个优选的实施方案中，步骤(3)所述荧光强度的检测为实时荧光定量检测方法。

其次，本发明提供了一种用于上述方法的核酸分子组合，所述核酸分子组合包括：序列如SEQ ID NO.1所示的聚合酶链扩增反应上游引物，序列如SEQ ID NO.2所示的聚合酶链扩增反应下游引物，序列如SEQ ID NO.3所示的crRNA分子。

最后，本发明提供了一种含有上述核酸分子组合的核酸检测试剂盒，所述试剂盒还包括：Cas12a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基团双标记的单链DNA探针。

在一个优选的实施方案中，所述单链DNA探针在5’端被标记荧光基团6-FAM，在3’端被标记荧光淬灭基团BHQ1。

在一个更为优选的实施方案中，所述DNA探针的序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明提供的基于CRISPR-PCR荧光检测盖尔森基兴诺卡菌的方法具有极高的灵敏度，其检测下限为10^-3ng。在针对60株盖尔森基兴诺卡菌进行CRISPR-PCR荧光检测时均有为阳性；25株诺卡氏菌其他菌种以及19株其他菌属细菌在进行CRISPR-PCR荧光检测时均为阴性，本发明方法在应用于临床标本的检测时，可检测出临床标本中浓度为10⁶-10⁴CFU/mL的盖尔森基兴诺卡菌，检测限为10⁴CFU/mL；而血平板分离培养可检测出浓度为10⁶-10⁵CFU/mL的盖尔森基兴诺卡菌。因此，盖尔森基兴诺卡菌CRIPSR-PCR荧光检测方法相比于分离培养具有更好的灵敏度，且检测时间极大缩短，两小时内可以完成检测。本发明提供的方法简便、快速、高效，易于在现场和基层广泛开展，具有优异的应用前景。

附图说明

图1.CRISPR-PCR荧光检测系统工作流程和原理示意图。CRIPSR-PCR荧光检测流程包括三个步骤，分别为基因组提取、PCR扩增目的片段和CRISPR荧光检测。整个检测过程可以在两个小时内完成。CRISPR-PCR荧光检测的原理：首先PCR扩增目的DNA片段；然后Cas12a蛋白与crRNA结合形成CRISPR-Cas12a/crRNA复合物，Cas12a蛋白在crRNA的引导下与靶向双链DNA结合，激活其反式切割活性，不加区别的裂解单链DNA探针，探针裂解后发出荧光，可用实时荧光定量PCR仪捕获荧光信号。

图2.盖尔森基兴诺卡菌CRISPR-PCR荧光检测的引物及crRNA位置及序列。

图3.PCR扩增的最佳退火温度筛选。用温度梯度PCR筛选退火温度，温度范围为60℃-65℃，退火温度为65℃时目的条带明亮且几乎无非特异性扩增。

图4.盖尔森基兴诺卡菌CRISPR-PCR荧光检测的灵敏度。连续十倍稀释盖尔森基兴诺卡菌DNA模板，浓度依次为10ng、1ng、10^-1ng、10^-2ng、10^-3ng、10^-4ng，NC为无DNA模板的阴性对照。

图5.盖尔森基兴诺卡菌CRISPR-PCR荧光检测的特异性。1-60代表60株盖尔森基兴诺卡菌(包括7株标准菌株和53株临床菌株)。纵坐标代表在实时荧光定量PCR仪中，37℃条件下反应20分钟的荧光值的变化量；NC为阴性对照。

图6.25株诺氏菌属非盖尔森基兴诺卡菌；阳性对照为盖尔森基兴诺卡菌标准菌株DSM 44484；NC为阴性对照。

图7.19株非诺卡氏菌属细菌，阳性对照为盖尔森基兴诺卡菌标准菌株DSM 44484；NC为阴性对照。

图8.CRISPR-PCR荧光检测的临床应用。盖尔森基兴诺卡菌在临床标本中的终浓度依次为10⁶CFU/mL-10²CFU/mL；NC为阴性对照。纵坐标代表37℃反应20分钟后的荧光值变化。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。

本发明所公开的CRISPR-PCR的工作流程及检测原理：

如图1所示，CRISPR-PCR检测方法包括以下三个步骤：1.样本基因组提取，15分钟；2.PCR扩增，70分钟；3.基于CRIPSR的荧光检测，20分钟。整个CRISPR-PCR荧光检测流程可在2小时内完成。

基因组DNA提取后，用PCR扩增目的基因片段，以提高检测灵敏度；在CRISPR检测阶段，Cas12a蛋白先与crRNA在37℃条件下结合形成CRISPR-Cas12a/crRNA复合物，在crRNA的引导下Cas12a与目的片段中的靶向序列特异性结合，激活Cas12a蛋白的反式切割活性，不加区别地切割非特异性ssDNA探针，修饰有荧光基团和猝灭基团的序列如SEQ ID NO.4所示的ssDNA(5’-6-FAM-TTTTTTTT-BHQ1-3’)裂解后发出荧光，用实时荧光定量PCR仪检测荧光信号。

本发明中所使用的试剂及仪器：

DNA提取试剂盒

Genomic DNA Purification Kit购于美国Promega公司。PCR反应体系混合物2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)和DL 2000DNA Marker购于宝生物工程(北京)有限公司。CRISPR反应缓冲液10×NEBuffer 2.1和Cas12a蛋白

LbaCas12a(Cpf1)购于美国New England Biolabs公司。

实时荧光定量PCR仪QuantStudioTM6Flex、PCR仪Veriti 96和分光光度计NanoDrop-1000为美国赛默飞公司产品。电泳仪为北京君意东方电泳设备有限公司产品。凝胶成像系统Bio-Rad Gel Dox XR为美国Bio-Rad公司产品。恒温金属浴为北京金银杏生命科学有限公司产品。

本发明实验中所使用的菌株：

本发明实验中所用的菌株为中国疾病预防控制中心传染病预防控制所生物安全实验室收集与保藏，详见表1。

表1.本发明实验中所用的菌株

实施例1.CRISPR-Cas12a的荧光检测平台的构建

1.序列设计

根据盖尔森基兴诺卡菌标准菌株DSM 44484基因组设计PCR引物和crRNA序列，所扩增的目的基因由本申请人命名为Ncc1，该基因所编码的蛋白质protein_id:VFA97995.1盖尔森基兴诺卡菌全基因组Accession:LR21597.3，Ncc1基因位于1870620-1871693bp之间，聚合酶链扩增区间为Ncc1基因的79bp-266bp，扩增的目的片段的长度为187bp。PCR引物的特异性通过NCBI中Primer-BLAST进行验证。PCR引物和crRNA设计的序列及位置如表2和图2所示。

表2.盖尔森基兴诺卡菌引物及crRNA序列

注：NN代表简并碱基。

2.PCR扩增

PCR扩增的总反应体系20μL，包含10μL的Premix Ex Taq(Probe qPCR)，7μL的无酶水，上下游引物各1μL和1μL的DNA模板。使用PCR仪Veriti 96进行扩增，程序设置为95℃预变性5min，35个循环的95℃变性30s、65℃退火30s、72℃延伸30s，72℃终末延伸7min。PCR扩增产物使用浓度为2％的琼脂糖凝胶电泳进行验证。

3.CRISPR荧光检测反应体系

首先配置CRISPR-Cas12a/crRNA复合物包含100nM的crRNA和75nM的Cas12a蛋白，在37℃金属浴中孵育10分钟。CRISPR荧光检测总反应体系包含50μL的2×NEBuffer 2.1，18μL的CRISPR-Cas12a/crRNA复合物，2.5μL浓度为10μM的ssDNA探针，27.5μL的无酶水，2μL的PCR扩增产物。

4.CRISPR检测结果

使用实时荧光定量PCR仪进行CRISPR荧光检测。CRISPR反应体系在实时荧光定量PCR仪中37℃条件下反应20分钟，读取荧光信号。若为阳性，则有荧光信号的变化；若为阴性，则无荧光信号的变化。

5.盖尔森基兴诺卡菌CRISPR-PCR扩增反应条件优化

筛选PCR扩增产物的最佳退火温度。采用梯度PCR扩增筛选最佳退火温度，温度范围在60℃-65℃之间。PCR扩增后，将PCR扩增产物用2％的琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图3所示，在65℃反应条件下，目的条带明亮且几乎无非特异性扩增。

实施例2.盖尔森基兴诺卡菌CRISPR-PCR荧光检测体系的灵敏度

用CRISPR-PCR检测10倍连续稀释的盖尔森基兴诺卡菌标准菌株DSM 44484的基因组DNA，浓度范围10ng到10^-4ng。结果如图4所示，盖尔森基兴诺卡菌CRISPR-PCR荧光检测的检测限为10^-3ng。

实施例3.盖尔森基兴诺卡菌CRISPR-PCR荧光检测体系的特异性

以60株盖尔森基兴诺卡菌(包括7株标准菌株和53株临床分离株)，25株诺卡氏菌其他菌种和19株其他菌属的DNA为模板，评价盖尔森基兴诺卡菌的CRISPR-PCR荧光检测方法的特异性。有荧光值的变化，则为阳性；无荧光值的变化，则为阴性。

结果如图5-图7所示，60株盖尔森基兴诺卡菌进行CRISPR-PCR荧光检测均有荧光值的变化,为阳性(参见图5)；25株诺卡氏菌其他菌种以及19株其他菌属细菌在进行CRISPR-PCR荧光检测时均没有荧光信号的改变，为阴性(参见图6-图7)。结果表明CRISPR-PCR荧光检测系统具有良好的特异性。

实施例4.盖尔森基兴诺卡菌CRISPR-PCR荧光检测体系应用于临床标本的检测

为了评价CRISPR-PCR荧光检测方法检测临床标本的灵敏度，我们将收集的阴性痰标本等分成5份，每份各900μL，加入100μL十倍连续稀释的盖尔森诺卡菌的菌悬液，菌液终浓度为10⁶CFU/mL到10²CFU/mL。同时以血平板分离培养做对照试验。

结果如图8所示，CRISPR-PCR可检测出临床标本中浓度为10⁶-10⁴CFU/mL的盖尔森基兴诺卡菌，检测限为10⁴CFU/mL；而血平板分离培养可检测出浓度为10⁶-10⁵CFU/mL的盖尔森基兴诺卡菌。因此，盖尔森基兴诺卡菌CRIPSR-PCR荧光检测方法相比于分离培养具有更好的灵敏度，且检测时间极大缩短，两小时内可以完成检测。

序列表

<110> 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所

<120> 一种基于CRISPR-Cas12a的荧光检测方法及应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Nocardia cyriacigeorgica

<400> 1

ccgcccaann ccgagatcgt 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Nocardia cyriacigeorgica

<400> 2

cgtggttctc ccattcgaac c 21

<210> 3

<211> 41

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

uaauuucuac uaaguguaga uuggaccaug cuggugaaca a 41

<210> 4

<211> 8

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tttttttt 8

Claims (10)

1.一种基于非诊断目的应用CRISPR-Cas12a技术检测核酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)以盖尔森基兴诺卡菌的基因组中protein_id为VFA97995.1的蛋白质的编码基因为靶基因进行聚合酶链扩增反应；

(2)使用步骤(1)获取的聚合酶链扩增产物，Cas12a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基团双标记的单链DNA探针，以及crRNA分子在CRISPR-Cas12a技术检测体系里反应，其中，crRNA分子的序列如SEQ ID NO.3所示；

(3)对步骤(2)的反应体系进行荧光强度的检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚合酶链扩增反应使用的上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述单链DNA探针的序列如SEQ IDNO.4所示，所述单链DNA探针在5’端被标记荧光基团6-FAM，在3’端被标记荧光淬灭基团BHQ1。

4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述聚合酶链扩增反应的退火温度为60-65℃。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述聚合酶链扩增反应的退火温度为65℃。

6.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述荧光强度的检测为实时荧光定量检测方法。

7.一种用于权利要求1所述方法的核酸分子组合，其特征在于，所述核酸分子组合包括：序列如SEQ ID NO.1所示的聚合酶链扩增反应上游引物，序列如SEQ ID NO.2所示的聚合酶链扩增反应下游引物，序列如SEQ ID NO.3所示的crRNA分子。

8.一种含有权利要求7所述核酸分子组合的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：Cas12a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基团双标记的单链DNA探针。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述单链DNA探针在5’端被标记荧光基团6-FAM，在3’端被标记荧光淬灭基团BHQ1。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA探针的序列如SEQ ID NO.4所示。

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