CN118291656A - 肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌双重直接检测方法及试剂盒 - Google Patents
肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌双重直接检测方法及试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN118291656A CN118291656A CN202410470302.9A CN202410470302A CN118291656A CN 118291656 A CN118291656 A CN 118291656A CN 202410470302 A CN202410470302 A CN 202410470302A CN 118291656 A CN118291656 A CN 118291656A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- klebsiella pneumoniae
- carbapenem
- resistant
- detection
- amplification
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 title claims abstract description 163
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 77
- YZBQHRLRFGPBSL-RXMQYKEDSA-N carbapenem Chemical compound C1C=CN2C(=O)C[C@H]21 YZBQHRLRFGPBSL-RXMQYKEDSA-N 0.000 title claims abstract description 65
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 title claims description 15
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 62
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 62
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 62
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 36
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 claims abstract description 27
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 35
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 28
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 10
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims description 8
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 claims description 8
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N Betaine Natural products C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O N,N,N-trimethylglycinium Chemical compound C[N+](C)(C)CC(O)=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 7
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 claims description 7
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 7
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 5
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 3
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 claims description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 17
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 16
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 16
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 2
- 238000005580 one pot reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 3
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 3
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 3
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 208000009470 Ventilator-Associated Pneumonia Diseases 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000010206 sensitivity analysis Methods 0.000 description 2
- 101150070667 ureD gene Proteins 0.000 description 2
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 108010078777 Colistin Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 101100021923 Helicobacter pylori (strain ATCC 700392 / 26695) lspA gene Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 108010068385 carbapenemase Proteins 0.000 description 1
- 229960000484 ceftazidime Drugs 0.000 description 1
- NMVPEQXCMGEDNH-TZVUEUGBSA-N ceftazidime pentahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.S([C@@H]1[C@@H](C(N1C=1C([O-])=O)=O)NC(=O)\C(=N/OC(C)(C)C(O)=O)C=2N=C(N)SC=2)CC=1C[N+]1=CC=CC=C1 NMVPEQXCMGEDNH-TZVUEUGBSA-N 0.000 description 1
- 229960003346 colistin Drugs 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- JORAUNFTUVJTNG-BSTBCYLQSA-N n-[(2s)-4-amino-1-[[(2s,3r)-1-[[(2s)-4-amino-1-oxo-1-[[(3s,6s,9s,12s,15r,18s,21s)-6,9,18-tris(2-aminoethyl)-3-[(1r)-1-hydroxyethyl]-12,15-bis(2-methylpropyl)-2,5,8,11,14,17,20-heptaoxo-1,4,7,10,13,16,19-heptazacyclotricos-21-yl]amino]butan-2-yl]amino]-3-h Chemical compound CC(C)CCCCC(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)O)CN[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]1CCNC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCN)NC1=O.CCC(C)CCCCC(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)O)CN[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]1CCNC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCN)NC1=O JORAUNFTUVJTNG-BSTBCYLQSA-N 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- XDJYMJULXQKGMM-UHFFFAOYSA-N polymyxin E1 Natural products CCC(C)CCCCC(=O)NC(CCN)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)NC(CCN)C(=O)NC1CCNC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C(CCN)NC(=O)C(CCN)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CCN)NC1=O XDJYMJULXQKGMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KNIWPHSUTGNZST-UHFFFAOYSA-N polymyxin E2 Natural products CC(C)CCCCC(=O)NC(CCN)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)NC(CCN)C(=O)NC1CCNC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C(CCN)NC(=O)C(CCN)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CCN)NC1=O KNIWPHSUTGNZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 101150033897 sea gene Proteins 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- FPZLLRFZJZRHSY-HJYUBDRYSA-N tigecycline Chemical compound C([C@H]1C2)C3=C(N(C)C)C=C(NC(=O)CNC(C)(C)C)C(O)=C3C(=O)C1=C(O)[C@@]1(O)[C@@H]2[C@H](N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C1=O FPZLLRFZJZRHSY-HJYUBDRYSA-N 0.000 description 1
- 229960004089 tigecycline Drugs 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/22—Klebsiella
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌双重直接检测方法及试剂盒，该方法为：通过高温裂解酶裂解肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌释放核酸，同时利用分子信标探针在同一体系下对UreD基因和KPC基因进行环介导核酸恒温扩增；再对不同荧光信号进行检测，就可以实现两种的检测。本发明采用耐高温裂解酶裂解肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌释放核酸，从而能在同一管内完成肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的直接一锅法LAMP扩增检测，无需基因组DNA的提取，具有操作简单、耗时短、准确度高等优势；这些优势使得本发明能够方便用于对肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的基层快速检测和鉴定诊断。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌双重直接检测方法及试剂盒。
背景技术
肺炎克雷伯氏菌是一类广泛存在于动物粘膜表面或环境(如水、土壤等)中的革兰氏阴性细菌。在中国，肺炎克雷伯菌占呼吸机相关性肺炎(VAP)和重症监护病房(ICU)获得性肺炎分离病原体的11.9％。其中，耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌耐药率非常高，仅粘菌素、替加环素、头孢他啶的耐药率等于10％，其他抗微生物药物的耐药率均高于50％。目前国内耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌株的耐药基因以产KPC型为主，因此开发一种单体系双重检测肺炎克雷伯菌和含KPC基因的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的方法具有重要的应用价值。
传统的分离鉴定、免疫学方法与实时荧光定量PCR等方法来检测肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌分别存在耗时长、灵敏度较低及检测成本昂贵等缺点。此外，常规PCR与常规恒温扩增方法一次只能扩增单一基因，不能尽快对临床中混合感染的耐药与非耐药性菌株进行区分，导致感染含耐药基因的菌株的患者没有得到及时、特异的治疗。基于此，多重PCR检测方法虽能够满足多重检测需求，但多重PCR引物设计存在较大的难度，且该方法耗时也较长。因此，需要一种简便、快速、灵敏、双重检测肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌临床检测手段。
环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种快速的核酸恒温扩增技术，其具有特异性强、灵敏度高等优点。分子信标(Molecular beacon,MB)基于荧光共振能量转移(Fluorescence resonanceenergytransfer,FRET)与碱基互补配对的原则设计的，MB长约17-30bp，两个末端分别标记荧光基团和淬灭基团，在特定靶DNA存在的情况下，MB的空间构象发生变化产生荧光。MB具有操作简单、敏感、特异、并能对样品进行实时扩增检测，被广泛用于核酸的定量分析、微生物检测、活动成像等领域。基于上述技术，其有望应用于构建肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的双重检测方法，但现在未见公开可靠的相似方案。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌双重直接检测方法及试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌双重直接检测方法，包括以下步骤：
S1、采集待测菌液样本；
S2、采用单管恒温扩增体系同时进行肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的双重直接检测：
将待测菌液样本加入恒温扩增体系中，进行恒温扩增，然后对扩增产物进行双通道荧光检测，根据两个通道的荧光强度判断待测菌液样本中是否含有肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌；
其中，恒温扩增体系中包含用于裂解细菌的裂解酶、用于扩增肺炎克雷伯菌特有的UreD基因的扩增引物组1、用于扩增耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌特有的KPC基因的扩增引物组2、用于检测UreD基因的分子信标探针1和用于检测KPC基因的分子信标探针2。
优选的是，裂解酶为的蛋白序列如SEQ ID NO.3所示。
优选的是，扩增引物组1包括如下引物：F3、B3、FIP、BIP、LF、LB，基因序列依次如SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.9所示。
优选的是，扩增引物组2包括如下引物：F3、B3、FIP、BIP、LB，基因序列依次如SEQID NO.10～SEQ ID NO.14所示。
优选的是，分子信标探针1的5’端和3’端分别修饰有FAM荧光基团和Dabcyl淬灭基团，分子信标探针2的5’端和3’端分别修饰有Cy5荧光基团和BHQ2淬灭基团。
优选的是，对扩增产物进行双通道荧光检测的方法具体为：
检测扩增产物在470nm的激发光下于525nm处的发射光的强度，记为I525；检测扩增产物在650nm的激发光下于670nm处的发射光的强度，记为I670；
若I525＞I0525且I670≤I0670，则表明待测菌液样本中含有肺炎克雷伯菌，且不含耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌；若I525＞I0525且I670≤I0670，则表明待测菌液样本中含有肺炎克雷伯菌，且所含的肺炎克雷伯菌中存在耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌；若I525≤I0525，则表明待测菌液样本中不含肺炎克雷伯菌。
优选的是，分子信标探针1的基因序列如SEQ ID NO.15所示。
优选的是，分子信标探针2的基因序列如SEQ ID NO.16所示。
优选的是，恒温扩增体系中均还包括以下组分：DNA聚合酶、Isothermo Buffer、Mg2+、dNTP、ddH2O和甜菜碱；
步骤S2中的恒温扩增温度为65℃。
本发明还提供一种肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌双重直接检测试剂盒，其包括如上的恒温扩增体系，该试剂盒采用如上所述的方法实现肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的双重直接检测。
本发明的有益效果是：
本发明公开了一种肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌双重直接检测方法及试剂盒，本发明采用耐高温裂解酶裂解肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌释放核酸，从而实现菌液的直接一锅法LAMP扩增检测；采用具有耗时短、准确度高等优势；这些优势使得本发明开发的基于LAMP核酸恒温扩增技术方便用于对肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的基层快速检测和鉴定诊断；
本发明通过利用分子信标探针结合LAMP恒温扩增的技术，能实现对肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的快速、高灵敏度、高特异性的双重直接检测；
本发明针对肺炎克雷伯菌特有的脲酶基因UreD或大部分耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌特有的耐药基因KPC分别设计特异的分子信标探针，实现了在单管中双重检测两株不同的肺炎克雷伯菌；此外，在LAMP扩增体系中引入分子信标探针相较于直接添加荧光染料，在一定程度上解决了非特异性扩增造成的假阳性信号的问题，同时也具有耗时更短的优势；
本发明的方案可适用于引入含其他耐碳青霉烯酶基因的肺炎克雷伯菌，从而实现单管多重检测不同肺炎克雷伯菌株，并完成多种耐药基因的快速分型检测。
附图说明
图1为本发明的实施例2中利用UreD基因引物组及分子信标探针MB1的检测体系特异性分析结果；
图2为本发明的实施例3中利用KPC基因引物组及分子信标探针MB2的检测体系特异性分析结果；
图3为本发明的实施例4中含不同分子信标的LAMP扩增体系添加耐高温裂解酶与否的实时荧光检测结果；
图4为本发明的实施例5中利用UreD基因引物组及分子信标探针MB1的检测体系灵敏度分析结果；
图5为本发明的实施例6中利用KPC基因引物组及分子信标探针MB2的检测体系灵敏度分析结果；
图6为本发明的实施例7中利用两组引物(UreD及KPC)及两组分子信标(MB1及MB2)在单管中进行双重检测肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的实验结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
下列实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。下列实施例中所用的材料试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下列实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或者制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提供一种肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌双重直接检测方法，本发明在恒温条件下，通过高温裂解酶裂解肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌释放核酸，同时利用分子信标探针在同一体系下对UreD基因和KPC基因进行环介导核酸恒温扩增(LAMP)；再对不同荧光信号进行检测，就可以特异性区分样品中肺炎克雷伯菌和含有KPC基因的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌。该方法具体包括以下步骤：
S1、采集待测菌液样本：
根据患者病理特征分别采用无菌棉拭子采集痰标本、环甲膜穿刺气管吸引(TTA)、防污染双套管毛刷采样(PSB)、支气管肺泡灌洗(BAL)和经皮肺穿刺吸引(LA)等方法进行采集。
S2、采用单管恒温扩增体系同时进行肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的双重直接检测：
将待测菌液样本加入恒温扩增体系中，进行恒温扩增，然后对扩增产物进行双通道荧光检测，根据两个通道的荧光强度判断待测菌液样本中是否含有肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌；
其中，恒温扩增体系中包含用于裂解细菌的裂解酶、用于扩增肺炎克雷伯菌特有的UreD基因的扩增引物组1、用于扩增耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌特有的KPC基因的扩增引物组2、用于检测UreD基因的分子信标探针1和用于检测KPC基因的分子信标探针2。
在优选的实施例中，恒温扩增体系中均还包括以下组分：DNA聚合酶、IsothermoBuffer、Mg2+、dNTP、ddH2O和甜菜碱。
在优选的实施例中，步骤S2中的恒温扩增温度为65℃，扩增反应时间为60min。
在优选的实施例中，裂解酶为的蛋白序列如SEQ ID NO.3所示。
在优选的实施例中，扩增引物组1包括如下引物：F3、B3、FIP、BIP、LF、LB，基因序列依次如SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.9所示。
在优选的实施例中，扩增引物组2包括如下引物：F3、B3、FIP、BIP、LB，基因序列依次如SEQ ID NO.10～SEQ ID NO.14所示。
在优选的实施例中，分子信标探针1的5’端和3’端分别修饰有FAM荧光基团和Dabcyl淬灭基团，分子信标探针2的5’端和3’端分别修饰有Cy5荧光基团和BHQ2淬灭基团。
在优选的实施例中，对扩增产物进行双通道荧光检测的方法具体为：
检测扩增产物在470nm的激发光下于525nm处的发射光的强度，记为I525；检测扩增产物在650nm的激发光下于670nm处的发射光的强度，记为I670；
若I525＞I0525且I670≤I0670，则表明待测菌液样本中含有肺炎克雷伯菌，且不含耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌；若I525＞I0525且I670≤I0670，则表明待测菌液样本中含有肺炎克雷伯菌，且所含的肺炎克雷伯菌中存在耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌；若I525≤I0525，则表明待测菌液样本中不含肺炎克雷伯菌。
在优选的实施例中，分子信标探针1的基因序列如SEQ ID NO.15所示(具体序列为FAM-CTGGATCTGGTGAAAGCGGAGATCCAG-Dabcyl)。
在优选的实施例中，分子信标探针2的基因序列如SEQ ID NO.16所示(具体序列为Cy5-CCCAACAATTTGTTGCTGAAGGAGTTGGG-BHQ2)。
本发明还提供一种肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌双重直接检测试剂盒，其包括如上的恒温扩增体系，该试剂盒采用如上所述的方法实现肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的双重直接检测。
以上为本发明的总体构思，以下在其基础上提供详细的实施例，以对本发明做进一步说明。
试剂来源说明：
LAMP核酸恒温扩增反应所需的Bst 3.0DNA聚合酶、10X扩增缓冲液和100mM MgSO4购自哈尔滨新海基因检测有限公司；10mM dNTP购自生工生物工程(上海)股份有限公司；扩增引物与分子信标探针由苏州金唯智生物公司合成；肺炎克雷伯菌(1706)和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌(1705)购置于美国模式培养物集存库(ATCC)；铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌来源于中科院苏州医学工程技术研究所医学检验室；甜菜碱购置于北京索莱宝科技有限公司。
实施例1利用实时荧光检测系统及分子信标探针检测经LAMP扩增后的UreD基因和KPC基因
1-1、LAMP恒温扩增引物的制备
根据UreD基因和KPC基因的序列信息(SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2)，设计相应的用于UreD基因(依次为F3、B3、FIP、BIP、LF及LB)和KPC基因(依次为F3、B3、FIP、BIP及LB)的扩增引物组，引物的序列依次如SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.14所示；引物由苏州金唯智生物科技股份有限公司合成，
1-2、分子信标探针的制备
根据UreD基因扩增引物组中环引物LF设计针对该基因的分子信标探针1(MB1)，其中MB1最后的21个碱基与LF相同形成的分子信标的环状区域及一条茎部序列，LFP的前六个碱基序列与自身的后六个碱基序列形成反向互补，形成了分子信标的另一个茎部序列。荧光基团和淬灭基团分别用FAM和Dabcyl修饰，并各自连接到分子信标的5’及3’，MB1的序列信息如SEQ ID NO.15所示；
根据KPC基因扩增引物组中环引物LB设计针对该基因的分子信标探针2(MB2)，其中MB2最后的24个碱基与LB相同形成的分子信标的环状区域及一条茎部序列，MB2的前五个碱基序列与自身的后五个碱基序列形成反向互补，形成了分子信标的另一个茎部序列。荧光基团和淬灭基团分别用Cy5和BHQ2修饰，并各自连接到分子信标的5’及3’，MB2的序列信息如SEQ ID NO.16所示；分子信标探针由苏州金唯智生物科技股份有限公司合成。
1-3、利用分子信标探针单独LAMP扩增检测UreD基因
采用25μL反应体系，具体成分及用量如下(参照表1)。其中UreD Primer mix为FIP、BIP(均为16μM)、F3、B3(均为2μM)和LF、LB(均为4μM)。向扩增反应体系中依次加入1μLPrimer mix、2.5μL 10×Isothermo Buffer(Mg2+free)、2μL Mg2+(100mM)、2μL甜菜碱(5M)、1μL分子信标探针1(10μM)、3.5μL dNTP(10mM)、3.5μL ddH2O、1μL sample、1μL裂解酶(75ug/mL；蛋白序列如SEQ ID NO.3所示)和1μL Bst 3.0DNA/RNA Polymerase(8U/μL)。各组分混合均匀后于65℃下反应60min。
表1
| 成分 | 用量 |
| UreD Primer mix | 1μL |
| Bst 3.0DNA/RNA Polymerase(8U/μL) | 1μL |
| 10×Isothermo Buffer(Mg2+free) | 2.5μL |
| Mg2+(100mM) | 2μL |
| dNTP(10mM) | 3.5μL |
| 甜菜碱(5M) | 2μL |
| 裂解酶(75ug/mL) | 1μL |
| 分子信标探针1(MB1；10μM) | 1μL |
| Sample | 1μL |
| ddH2O | 10μL |
1-4、利用分子信标探针单独LAMP扩增检测KPC基因
采用25μL反应体系，具体成分及用量如下(参照表2)。其中KPC Primer mix为FIP、BIP(均为16μM)、F3、B3(均为2μM)和LB(4μM)。向扩增反应体系中依次加入1.5μL Primermix、2.5μL 10×Isothermo Buffer(Mg2+free)、2μL Mg2+(100mM)、2μL甜菜碱(5M)、1μL分子信标探针2(10μM)、3.5μL dNTP(10mM)、3.5μL ddH2O、1μL sample、1μL裂解酶(75ug/mL；蛋白序列如SEQ ID NO.3所示)和1μL Bst 3.0DNA/RNA Polymerase(8U/μL)。各组分混合均匀后于65℃下反应60min。
表2
1-5利用分子信标及LAMP扩增双重检测UreD基因及KPC基因：
采用25μL反应体系，参照实施例1中1-3与1-4，将相同浓度与体积的UreD Primermix、KPC Primer mix及两种分子信标探针混合加入双重检测体系，其余试剂的浓度及添加量不变，最后ddH2O补足至25μL。
1-6扩增产物检测：
扩增产物检测方法采用实时荧光检测法，其中FAM荧光检测通道激发波长为470nm，发射波长为525nm；Cy5荧光检测通道激发波长为650nm，发射波长为670nm。
实施例2利用UreD基因引物组及MB1检测两株肺炎克雷伯菌的特异性
以1μL菌液为扩增模板，按实施例1中1-3的方法进行核酸恒温扩增。其中用含UreD基因的扩增引物及MB1的检测体系分别对肺炎克雷伯菌(1706)、含KPC基因的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌(1705)、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌及大肠杆菌菌液进行扩增，按1-6的方法进行扩增产物检测，其反应检测结果如图1所示；其中，横坐标为时间，纵坐标为荧光强度；图上曲线分别是肺炎克雷伯菌(1706)、含KPC基因的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌(1705)、铜绿假单胞菌(PaK)、金黄色葡萄球菌(SA)、大肠杆菌(Eco)及ddH2O(NTC)的扩增曲线。此外，所有实验组的荧光强度数据是以NTC组为对照计算得到的实时荧光相对变化值。
结果表明，本发明所采用的含UreD基因的扩增引物组及MB1的检测体系对不同肺炎克雷伯菌株的检测特异性非常好。
实施例3利用KPC基因引物组及分子信标2检测含KPC基因的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌菌液的特异性
以1μL菌液为扩增模板，按实施例1中1-4的方法进行核酸恒温扩增。其中用含KPC基因的扩增引物及MB2的检测体系对肺炎克雷伯菌、含KPC基因的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌及大肠杆菌菌液进行扩增，按1-6的方法进行扩增产物检测，其反应检测结果如图2所示；其中，横坐标为时间，纵坐标为荧光强度；图上曲线分别是肺炎克雷伯菌(1706)、含KPC基因的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌(1705)、铜绿假单胞菌(PaK)、金黄色葡萄球菌(SA)、大肠杆菌(Eco)及ddH2O(NTC)的扩增曲线。此外，所有实验组的荧光强度数据是以NTC组为对照计算得到的实时荧光相对变化值。
结果表明，本发明所采用的含KPC基因的扩增引物及MB2的检测体系对含KPC基因的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的检测特异性非常好。
实施例4含不同分子信标的LAMP扩增体系添加耐高温裂解酶与否的实时荧光检测
以1μL菌液为扩增模板，按实施例1中1-3与1-4的方法进行核酸恒温扩增。其中用UreD基因的扩增引物与MB1对肺炎克雷伯菌(1706)菌液进行扩增，用KPC基因的扩增引物与MB2对耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌(1705)菌液进行扩增，按1-6的方法进行扩增产物检测；针对不同扩增组设置添加耐高温裂解酶与否的区别，其反应检测结果如图3所示；其中，横坐标为时间，纵坐标为荧光强度；图上曲线分别是UreD基因引物加肺炎克雷伯菌及无高温裂解酶组(UreD+1706；FAM+无裂解酶)、UreD基因引物加肺炎克雷伯菌及含高温裂解酶组(UreD+1706；FAM+含裂解酶)、KPC基因引物加含KPC基因的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌及无高温裂解酶组(KPC+1705；Cy5+无裂解酶组)、KPC基因引物加含KPC基因的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌及含高温裂解酶组(KPC+1705；Cy5+含裂解酶组)及ddH2O(NTC)的扩增曲线。此外，所有实验组的荧光强度数据是以NTC组(按照两种荧光信号强度值分别计算)为对照计算得到的实时荧光相对变化值。
结果表明，本发明所采用的方法中裂解酶能够裂解两株肺炎克雷伯菌，并成功释放出核酸，能达到单管一步法检测菌液的目的。
实施例5利用UreD基因引物组及MB1检测两株肺炎克雷伯菌的灵敏度
以1μL菌液为扩增模板，按实施例1中1-3的方法进行核酸恒温扩增。其中用含UreD基因的扩增引物及MB1的双重检测体系分别对肺炎克雷伯菌与含KPC基因的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌进行扩增，按1-6的方法进行扩增产物检测；针对菌液浓度的不同，其反应检测结果如图4所示；其中，横坐标为时间，纵坐标为荧光强度；图上曲线分别是菌液浓度为104(1706 104CFU/mL)、103(1706 103CFU/mL)、102(1706 102CFU/mL)CFU/mL的肺炎克雷伯菌及104(1705 104CFU/mL)、103(1705 103CFU/mL)、102(1705102CFU/mL)CFU/mL含KPC基因的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的扩增曲线；NTC(ddH2O)为阴性对照组。此外，所有实验组的荧光强度数据是以NTC组为对照计算得到的实时荧光相对变化值。
结果表明，本发明所采用的方法中UreD基因引物组及MB1在50分钟内能够准确检测到103CFU/mL的两株肺炎克雷伯菌。
实施例6利用KPC基因引物组及MB1检测含KPC基因的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的灵敏度
以1μL菌液为扩增模板，按实施例1中1-4的方法进行核酸恒温扩增。其中用含KPC基因的扩增引物及MB2的双重检测体系对含KPC基因的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌进行扩增；针对菌液浓度的不同，其反应检测结果如图5所示；其中，横坐标为时间，纵坐标为荧光强度；图上曲线分别是菌液浓度为104(1706 104CFU/mL)、103(1706 103CFU/mL)、102(1706102CFU/mL)CFU/mL的肺炎克雷伯菌及104(1705 104CFU/mL)、103(1705 103CFU/mL)、102(1705 102CFU/mL)CFU/mL含KPC基因的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的扩增曲线；NTC(ddH2O)为阴性对照组。此外，所有实验组的荧光强度数据是以NTC组为对照计算得到的实时荧光相对变化值。
结果表明，本发明所采用的方法中KPC基因引物组及MB2在50分钟内能够准确检测到103CFU/mL的含KPC基因的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌。
实施例7利用分子信标及LAMP扩增双重检测肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌
以1μL菌液为扩增模板，按实施例1中1-5的方法进行核酸恒温扩增。其中用含UreD与KPC基因的两组扩增引物及两种分子信标探针的双重检测体系分别对肺炎克雷伯菌与含KPC基因的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌进行扩增；针对分子信标探针的不同，其反应检测结果如图6所示；其中，横坐标为时间，纵坐标为荧光强度。图上曲线分别是检测肺炎克雷伯菌的FAM荧光信号组(1706；FAM)、检测含KPC基因的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的FAM荧光信号组(1705；FAM)、检测肺炎克雷伯菌的Cy5荧光信号组(1706；Cy5)、检测含KPC基因的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的Cy5荧光信号组(1705；Cy5)及ddH2O(NTC)的扩增曲线；NTC(ddH2O)为阴性对照组。此外，所有实验组的荧光强度数据是以NTC组(按照两种荧光信号强度值分别计算)为对照计算得到的实时荧光相对变化值。
结果表明，对于，耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌1706，FAM(525nm)和Cy5的荧光强度(670nm)均提高，对于肺炎克雷伯菌1705，FAM(525nm)的荧光强度提高、Cy5的荧光强度(670nm)未提高。所以本发明所采用的方法中的双重检测体系能够准确在单管反应体系中准确区分肺炎克雷伯菌与含KPC基因的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌。
核酸序列表如下：
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
Claims (10)
1.一种肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌双重直接检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、采集待测菌液样本；
S2、采用单管恒温扩增体系同时进行肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的双重直接检测：
将待测菌液样本加入恒温扩增体系中，进行恒温扩增，然后对扩增产物进行双通道荧光检测，根据两个通道的荧光强度判断待测菌液样本中是否含有肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌；
其中，恒温扩增体系中包含用于裂解细菌的裂解酶、用于扩增肺炎克雷伯菌特有的UreD基因的扩增引物组1、用于扩增耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌特有的KPC基因的扩增引物组2、用于检测UreD基因的分子信标探针1和用于检测KPC基因的分子信标探针2。
2.根据权利要求1所述的肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌双重直接检测方法，其特征在于，裂解酶为的蛋白序列如SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求1所述的肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌双重直接检测方法，其特征在于，扩增引物组1包括如下引物：F3、B3、FIP、BIP、LF、LB，基因序列依次如SEQID NO.4～SEQ ID NO.9所示。
4.根据权利要求1所述的肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌双重直接检测方法，其特征在于，扩增引物组2包括如下引物：F3、B3、FIP、BIP、LB，基因序列依次如SEQ IDNO.10～SEQ ID NO.14所示。
5.根据权利要求1所述的肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌双重直接检测方法，其特征在于，分子信标探针1的5’端和3’端分别修饰有FAM荧光基团和Dabcyl淬灭基团，分子信标探针2的5’端和3’端分别修饰有Cy5荧光基团和BHQ2淬灭基团。
6.根据权利要求5所述的肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌双重直接检测方法，其特征在于，对扩增产物进行双通道荧光检测的方法具体为：
检测扩增产物在470nm的激发光下于525nm处的发射光的强度，记为I525；检测扩增产物在650nm的激发光下于670nm处的发射光的强度，记为I670；
若I525＞I0525且I670≤I0670，则表明待测菌液样本中含有肺炎克雷伯菌，且不含耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌；若I525＞I0525且I670≤I0670，则表明待测菌液样本中含有肺炎克雷伯菌，且所含的肺炎克雷伯菌中存在耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌；若I525≤I0525，则表明待测菌液样本中不含肺炎克雷伯菌。
7.根据权利要求6所述的肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌双重直接检测方法，其特征在于，分子信标探针1的基因序列如SEQ ID NO.15所示。
8.根据权利要求6所述的肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌双重直接检测方法，其特征在于，分子信标探针2的基因序列如SEQ ID NO.16所示。
9.根据权利要求1所述的肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌双重直接检测方法，其特征在于，恒温扩增体系中均还包括以下组分：DNA聚合酶、Isothermo Buffer、Mg2+、dNTP、ddH2O和甜菜碱；
步骤S2中的恒温扩增温度为65℃。
10.一种肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌双重直接检测试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1-9中任意一项中的恒温扩增体系，该试剂盒采用如权利要求1-9中任意一项所述的方法实现肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的双重直接检测。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410470302.9A CN118291656A (zh) | 2024-04-18 | 2024-04-18 | 肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌双重直接检测方法及试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410470302.9A CN118291656A (zh) | 2024-04-18 | 2024-04-18 | 肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌双重直接检测方法及试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118291656A true CN118291656A (zh) | 2024-07-05 |
Family
ID=91682820
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410470302.9A Pending CN118291656A (zh) | 2024-04-18 | 2024-04-18 | 肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌双重直接检测方法及试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN118291656A (zh) |
-
2024
- 2024-04-18 CN CN202410470302.9A patent/CN118291656A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110541022B (zh) | 基于CRISPR-Cas12a系统的结核分枝杆菌复合群检测试剂盒 | |
| CN113249499B (zh) | 一种伤寒沙门氏菌的检测试剂盒、其制备方法及其应用 | |
| Mu et al. | The fluorescent probe-based recombinase-aided amplification for rapid detection of Escherichia coli O157: H7 | |
| CN105219772B (zh) | 一组核苷酸序列及在沙门菌和志贺菌检测中的应用 | |
| CN113718045A (zh) | 用于检测4种鲍特菌和特异性检测百日咳鲍特菌的dna片段、引物、探针和试剂盒及应用 | |
| CN110628926A (zh) | 一种检测碳青霉烯类抗生素kpc耐药基因的环介导等温扩增引物组及检测方法 | |
| CN118207347B (zh) | 基于CRISPR-Cas12a系统的流感嗜血杆菌的快速检测方法 | |
| CN110656192B (zh) | 一种检测脑膜炎奈瑟氏菌的环介导等温扩增引物组及检测方法 | |
| CN111518935A (zh) | 一种用于检测阪琦肠杆菌的试剂盒、引物对、探针及方法 | |
| CN113817854B (zh) | 一种单标记ssDNA探针可视化检测沙门氏菌基因的方法 | |
| CN118291656A (zh) | 肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌双重直接检测方法及试剂盒 | |
| CN116904628A (zh) | 一种用于检测大熊猫三种致病菌的引物组合、试剂盒及其检测方法 | |
| US20240352539A1 (en) | Pathogen specific nucleic acid fragment and application thereof | |
| CN116479150A (zh) | 单管一步法RPA-Cas12a/Cas13a快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 | |
| CN116254352A (zh) | 一种基于crispr的检测替加环素耐药高毒力肺炎克雷伯氏菌的方法及试剂盒 | |
| CN114480690A (zh) | 金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸快速检测方法及试剂盒 | |
| CN112301104B (zh) | 一种快速检测沙眼衣原体的rda方法及试剂盒 | |
| CN118147334A (zh) | 肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌快速直接检测方法及试剂盒 | |
| CN118308504B (zh) | 一种肺炎衣原体、肺炎支原体及其耐药相关位点的引物探针组合及应用 | |
| CN112301137B (zh) | 一种快速检测解脲支原体的rda方法及试剂盒 | |
| CN114634972B (zh) | 利用Cas酶进行核酸检测的方法 | |
| CN113755616B (zh) | 耐药性金黄色葡萄球菌MecA和ErmA基因的多重荧光RPA检测方法及试剂盒 | |
| CN118064617A (zh) | 一种检测分枝杆菌种群的Taqman探针及其方法和应用 | |
| CN115747360A (zh) | 双交叉引物扩增联合CRISPR-Cas 12a检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的系统 | |
| CN116042609A (zh) | 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测试剂和方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |