CN117918260B - 一种云南松组培苗的繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
发明涉及植物组织培养技术领域，尤其公开一种云南松组培苗的繁殖方法，包括以下步骤，种子催芽和消毒、无菌萌发、丛生芽诱导、伸长生长、生根培养和移栽炼苗，丛生芽诱导为将获得的无菌实生苗的顶芽接种于丛生芽诱导培养基上，进行丛生芽诱导；所述丛生芽诱导培养基的配方为：1/2MS+1.0mg/L 6‑BA+0.15 mg/L IBA+1.5 mg/L KT+4.4 g/L琼脂+30 g/L蔗糖，pH 5.6，本发明技术方案下，不经过愈伤组织，直接通过顶芽形成丛生芽，缩短了培育时间，节省了成本。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种云南松组培苗的繁殖方法。背景技术
云南松（Pinus yunnanensis）属松科松属植物，为云贵高原的主要乡土树种，也是西南地区特有的森林植被类型，仅云南省内，云南松林就占到全省林地面积的19.56%。云南松具有适应性强、耐干旱瘠薄、木材用途广泛等特点，是西南地区荒山造林的先锋树种和重要经济林木。由于基因遗传、人为干扰、病虫害等因素的影响，云南松林分质量低劣，遗传资源大量流失或消失，天然更新的云南松常见扭干现象，使林分质量呈下降趋势，对云南松林分的生产力与碳收支产生一定影响。因此，通过有效的手段对云南松优良种质进行繁殖、保存和改良显得尤为重要，而无性繁殖是解决这一问题的重要途径之一。
现有云南松种子园由于产量有限，无法持续供应足够的云南松优良种子，因此，而利用植物组织培养技术可以解决此类问题，实现云南松优良种质的快速扩繁。云南松作为木本裸子植物，其植物组织培养十分困难，如何建立稳定的组培育苗技术体系，确保云南松良种在造林中的普及应用就显得尤为重要。云南松的组培研究虽有相关报道，但其相关工作仍需不断推进。
目前，云南松组织培养的研究虽有零星报道，但由于易褐化、再分化困难、生根困难等问题，云南松的组培快繁工作推进较为缓慢。因此，若能以云南松优良种质为材料，利用植物组织培养技术实现云南松组培快繁，对于云南松的遗传改良、新品种培育具有重要意义，同时也可为西南地区的低产低效林改造、人工林营造过程中优质种苗的培育提供技术支撑。
发明内容
基于背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种不受环境影响、增殖稳定的云南松组培苗繁殖方法。
具体的，本发明提供以下技术方案：
一种云南松组培苗的繁殖方法，包括以下步骤：
（1）种子催芽和消毒：选取云南松的成熟健康种子，首先利用初始温度为50～55°C温水持续浸泡，直到自然冷却，在浸泡24h后更换冷水1次，催芽累计持续48h，消毒后获得无菌种子备用；
（2）无菌萌发：无菌条件下，将步骤（1）获得的无菌种子接种于无菌培养瓶中萌发生长，获得无菌实生苗；
（3）丛生芽诱导：无菌条件下，将步骤（2）获得的无菌实生苗的顶芽接种于丛生芽诱导培养基上，进行丛生芽诱导；所述丛生芽诱导培养基的配方为：1/2MS+1.0mg/L 6-BA+0.15 mg/L IBA+1.5 mg/L KT+4.4 g/L琼脂+30 g/L 蔗糖，pH 5.6；
（4）伸长生长：将诱导出的丛生芽转接至伸长生长培养基上进行生长；所述伸长生长培养基为1/4 MS+0.2%活性炭+30 g/L 蔗糖，pH 5.6，在该培养基上培养45～60天后，将丛生芽取出切成单芽，转移到相同培养基上培养30～45天，至芽的高度为2.0～3.0cm左右；
（5）生根培养：选择高度为2.0～3.0cm的单芽，然后置于含有生长素的无菌溶液中浸泡20～30 min，结束后置于无菌纸上吸干水分，最后接种于生根培养基上；所述含有生长素的无菌溶液中含0.15 mg/LIBA+0.15 mg/L NAA的生长素；所述生根培养基配方为：1/4MS+0.2%活性炭+20 g/L 蔗糖，pH 5.6；
（6）移栽炼苗：将生根苗在室内自然光下，闭瓶炼苗10 d，取出生根苗并用清水洗净基部培养基，移栽至田园土中。
进一步的，步骤（3）中，丛生芽诱导后将诱导出的丛生芽进行继代扩繁，所述继代扩繁使用的培养基为在丛生芽诱导培养基中添加0.1%活性炭制备而成。
优选的，所述无菌萌发、丛生芽诱导、伸长生长和生根培养，培养条件均为：温度21±2°C，光照时间为14～16 h/d，光照强度为2000～2500 Lx。
优选的，步骤（1）中，所述消毒方法为：使用0.1%的HgCl2浸泡消毒1.5～2 h后，再用无菌水浸泡20～30 min，挑出种子置于无菌滤纸上吸干水分，获得无菌种子。
优选的，步骤（6）中，所述移栽炼苗过程中的环境条件为：温度为20～30°C，空气湿度保持在80%以上。
本发明的技术进步和有益效果是：
（1）本发明以带种皮的云南松种子为起始的外植体材料，在消毒过程中可以延长消毒时间，消毒后几乎不会影响种子活力。
（2）消毒后的种子直接接种在组培瓶内的无菌纸上，不用去种皮，操作省时省力，且萌发速度快；避免了种子在培养基上受水势影响，出现发现慢或发芽困难的问题。
（3）本发明不经过愈伤组织，直接通过顶芽形成丛生芽，缩短了培育时间，节省了成本。
（4）本发明中利用植物组织培养的方法进行材料扩繁，不受季节限制，条件可控，可连续生产。
（5）本发明实现了云南松的组培苗高效扩繁，能够为云南松优良种质的规模化培育提供技术保障。
附图说明
图1是云南松带种皮种子无菌萌发生长30 d情况图；
图2是云南松丛生芽诱导生长90 d情况图；
图3是云南松继代扩繁后丛生芽生长90 d情况图；
图4是云南松第一次伸长生长培养45 d生长情况图；
图5是云南松第二次伸长生长培养20 d生长情况图；
图6是有活性炭的生根配方中云南松的生根图（55 d）；
图7是移栽前的云南松生根苗；
图8是移栽炼苗的云南松生长情况（30 d）；
图9是不同基础培养基对云南松丛生芽诱导的影响对比图（60 d）；
图10是不同培养基对云南松丛生芽伸长生长的影响对比图（45 d）；
图11是不同培养基对云南松生根培养的影响对比图（60 d）。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
一种云南松的组培苗繁殖方法，包括如下步骤：
（1）种子催芽和消毒：
储存于4°C冰箱的云南大理弥渡种子园云南松种子，经初始温度为50～55°C温水持续浸泡，直到自然冷却，在浸泡24h后更换冷水1次，在换冷水时去除漂浮粒，在累计浸泡48 h后，将种子转移到超净工作台内用0.1%的HgCl2浸泡1.5～2 h消毒，随后用无菌水荡洗3～4次后置于无菌水下浸泡20～30 min，再荡洗3～4 次，挑出种子置于无菌滤纸上吸干水分，种子催芽和消毒即完成，获得无菌种子；
（2）无菌萌发：
在超净工作台内将消毒完成获得的无菌种子接种于无菌培养瓶中萌发生长；其中，培养瓶内含有两层无菌卫生纸（发芽床）和10～12 mL无菌水，其中组培瓶的规格为高11cm，口径6.3cm；培养5d时种子开始萌发，17 d时外种壳掉落，针叶展开，萌发率为94%，无菌苗的生长情况详见图1。
其中萌发生长条件均为：温度21±2°C，光照时间为14～16 h/d，光照强度为2000～2500 Lx。
丛生芽诱导：
无菌条件下，将步骤（2）获得的无菌实生苗的顶芽接种于丛生芽诱导培养基上，进行丛生芽诱导；诱导培养至35d时，顶芽开始增殖出丛生芽，最后丛生芽的平均芽数量为8.7个(图2)。将诱导出的丛生芽进行继代扩繁，可以实现丛生芽的不断增殖（图3）。
其中，丛生芽诱导培养基的配方为：1/2 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.15 mg/L IBA+1.5mg/L KT+4.4 g/L 琼脂+30 g/L 蔗糖，pH 5.6；继代扩繁培养基则是在丛生芽诱导培养基中添加0.1%活性炭；培养条件均为：温度21±2°C，光照时间为14～16 h/d，光照强度为2000～2500 Lx。
（4）伸长生长：
将诱导的丛生芽转接至伸长生长培养基上进行生长，丛生芽伸长生长效果见图4；经进一步切取单芽进行伸长生长，生长效果见图5，单芽平均高度为2.8 cm；其中，丛生芽伸长生长培养基1/4 MS+0.2%活性炭+30g/L 蔗糖，pH 5.6。培养条件均为：温度21±2℃，光照时间为14～16 h/d，光照强度为2000～2500 Lx。
（5）生根培养：
选择高度为2～3cm的云南松丛生单芽，如存在褐化组织，则剪去其褐化的组织，然后置于含有生长素的无菌溶液中浸泡20 min，接种于生根培养基中；生根培养35 d时，开始生根，生根率为46%，生根苗生长情况见图6。
其中，含有生长素的无菌溶液中的生长素浓度为0.15 mg/L IBA+0.15 mg/L NAA，生根培养基配方为1/4 MS+0.2%活性炭+20 g/L 蔗糖，pH 5.6；培养条件为：温度21±2°C，光照时间为14～16 h/d，光照强度为2000～2500 Lx。
（6）移栽炼苗：
将生根苗在室内自然光下，闭瓶炼苗10 d后，取出生根苗并用清水洗净基部培养基（图7），移栽至田园土中（图8），其中，移栽炼苗过程中的环境条件为：温度为20～30°C，空气湿度保持在80%以上。
本发明通过以下实验对本发明的技术方案做进一步说明：
1、不同基础培养基对云南松丛生芽诱导的影响
将无菌萌发生长的实生苗顶芽接种于不同的丛生芽基础培养基中，结果结合表1，丛生芽诱导及生长情况见图9，从图中可知，采用1/2MS作为基本培养基，可以实现云南松顶芽的生长及增殖，具体表现为茎的基部膨大，顶芽变化明显，顶部有较多丛生芽产生，新长出的针叶翠绿色，而其他培养基培养下则出现死亡或无法形成丛生芽的情况发生。
表1 不同基础培养基对云南松丛生芽诱导的影响
| 培养基 | 效果 |
| MS | 茎的基部褐化，顶芽生长缓慢，部分针叶变黄，甚至出现顶芽死亡的现象。 |
| 1/2MS | 茎的基部膨大，顶芽变化明显，顶部有较多丛生芽产生，新长出的针叶翠绿色。 |
| DCR | 茎的基部呈棕黄色，顶芽长势一般，在顶部未能形成丛生芽。 |
| WPM | 茎部黄绿，长势较好，针叶翠绿且较长，高生长明显，未能形成丛生芽。 |
2、不同培养基对云南松丛生芽伸长生长的影响
增殖后获得的丛生芽，其侧芽较小，如果直接进行生根，易出现愈伤化后不长根或死亡的情况，因此需要进行伸长生长。伸长生长采用两步法，第一步，先将诱导的丛生芽以丛芽的方式进行伸长培养，即可促进侧芽生长，也可避免或减少死亡，待生长至一定大小（高0.8-1.1cm），再进行单芽伸长；第二步，将第一步培养结束的丛生芽切成单芽进行伸长培养，使单芽伸长生长，为生根作准备。
将增殖生长90 d的云南松丛生芽转接到下表培养基中进行伸长生长培养45 d，生长情况如图10。下表2中所有配方中均添加4.4g/L琼脂，30 g/L蔗糖。从图10中可知，处理1的丛生芽伸长生长效果最好，且长势好，侧芽均有明显伸长生长。虽然处理2的侧芽也有伸长生长，但长势一般；处理3和处理4的侧芽伸长变化不明显。下表中“AC”指代活性炭。
表2不同培养基对云南松丛生芽伸长生长的影响
| 处理 | 配方 | 芽的高度（cm） | 生长表现 |
| 1 | 1/4MS+0.2%AC | 0.8-1.1 | 针叶绿色，侧芽和主芽伸长生长好。 |
| 2 | 1/2MS+0.2%AC | 0.6-1.1 | 新生针叶绿色，侧芽和主芽伸长生长较明显，但老叶失绿。 |
| 3 | 1/2DCR+0.2%AC | 0.5-0.8 | 新生针叶绿色，老叶失绿，主芽针叶伸长较明显，但侧芽伸长生长不明显。 |
| 4 | 1/2DCR | 0.6-0.9 | 新生针叶绿色，老叶失绿，主芽新生针叶较多，但侧芽伸长生长不明显。 |
3、不同培养基对云南松生根培养的影响
将完成伸长生长的云南松单芽转接到下表培养基中进行生根培养60 d，生根情况如图11。下表3中所有配方中均添加4.4g/L琼脂。从表3中可知，处理1的生根率最高；从生长效果来看，处理1的生根苗生长效果最好，处理2下生根率较低，且根毛少，根系活力差，移栽后死亡，处理3和处理4的生根苗基部均有愈伤组织形成，且针叶黄枯严重，由愈伤组织形成的根，在移栽时易从连接处折断，同时移栽后难成活或者成活率下降。
表3不同培养基对云南松生根培养的影响
| 处理 | 配方 | 生根率% | 平均生根条数 |
| 1 | 1/4MS+0.2%AC+20g/L蔗糖 | 50 a | 2 |
| 2 | 1/4MS+0.5mg/LNAA+0.2 mg/LIBA+10g/L蔗糖 | 13 c | 1 |
| 3 | WPM+1.4 mg/LNAA+20g/L蔗糖 | 33 b | 3 |
| 4 | WPM+1.8 mg/LNAA+20g/L蔗糖 | 17 c | 2 |
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种云南松组培苗的繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）种子催芽和消毒：选取云南松的成熟健康种子，首先利用初始温度为50～55°C温水持续浸泡，直到自然冷却，在浸泡24h后更换冷水1次，催芽累计持续48h，然后消毒获得无菌种子备用；
（2）无菌萌发：无菌条件下，将步骤（1）获得的无菌种子接种于无菌培养瓶中萌发生长，获得无菌实生苗；
（3）丛生芽诱导：无菌条件下，将步骤（2）获得的无菌实生苗的顶芽接种于丛生芽诱导培养基上，进行丛生芽诱导；所述丛生芽诱导培养基的配方为：1/2MS+1.0mg/L 6-BA+0.15mg/L IBA+1.5 mg/L KT+4.4 g/L琼脂+30 g/L 蔗糖，pH 5.6；
（4）伸长生长：将诱导出的丛生芽转接至伸长生长培养基上进行生长；所述伸长生长培养基为1/4 MS+0.2%活性炭+30g/L 蔗糖，pH 5.6，在该培养基上培养45～60天后，将丛生芽取出切成单芽，转移到相同培养基上继续培养30～45天，至芽的高度为2.0～3.0cm；
（5）生根培养：选择高度为2.0～3.0 cm的单芽，然后置于含有生长素的无菌溶液中浸泡20～30 min，结束后置于无菌纸上吸干水分，最后接种于生根培养基上；所述含有生长素的无菌溶液中含0.15 mg/L IBA+0.15 mg/L NAA；所述生根培养基配方为：1/4 MS+0.2%活性炭+20 g/L 蔗糖，pH 5.6；
（6）移栽炼苗：将生根苗在室内自然光下，闭瓶炼苗8～10 d，取出生根苗并用清水洗净基部培养基，移栽至田园土中。
2.根据权利要求1所述的繁殖方法，其特征在于，步骤（3）中，丛生芽诱导后将诱导出的丛生芽进行继代扩繁，所述继代扩繁使用的培养基为在丛生芽诱导培养基中添加0.1%活性炭制备而成。
3.根据权利要求2所述的繁殖方法，其特征在于，所述无菌萌发、丛生芽诱导、丛生芽进行继代扩繁、伸长生长和生根培养，培养条件均为：温度21±2℃，光照时间为14～16 h/d，光照强度为2000～2500 Lx。
4.根据权利要求1所述的繁殖方法，其特征在于，步骤（1）中，消毒方法为：使用0.1%的HgCl2浸泡消毒1.5～2 h后，再用无菌水浸泡20～30 min，挑出种子置于无菌滤纸上吸干水分，获得无菌种子。
5.根据权利要求1所述的繁殖方法，其特征在于，步骤（6）中，所述移栽炼苗过程中的环境条件为：温度为20～30°C，空气湿度保持在80%以上。
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