CN111149703B - 一种简便高效高质量的番木瓜组培苗生根方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于组织培养育苗技术领域，具体涉及一种基于组织培养技术快繁培育番木瓜优良种苗的生根方法。本发明所述番木瓜组培苗生根方法，利用植株侧芽为外植体，分别经初代培养和增殖培养后获得大量分化芽，通过将分化芽切口基端浸泡于含吲哚丁酸、氯化镧和根皮苷的生根诱导液中进行生根诱导的方式，可有效促进植株的根系分化，经诱导后的分化芽再经过生根基质的培育即可。本发明所述生根方法组培苗生根率可达100％，生根数量提高3‑10倍，根系平均长度提高1‑2倍，育苗周期缩短10‑20d，且须根多，根毛发达，根系不会出现膨化和愈伤化现象，假植成活率高达98％以上，适宜于番木瓜种苗的培育。

Description

一种简便高效高质量的番木瓜组培苗生根方法

技术领域

本发明属于组织培养育苗技术领域，具体涉及一种基于组织培养技术快繁培育番木瓜优良种苗的生根方法。

背景技术

番木瓜又称木瓜、乳瓜、万寿果，属于常绿软木质大型多年生草本植物，是热带、亚热带地区广泛栽培的热带名果之一，被世界卫生组织列为最有营养价值的十大水果之首。目前，番木瓜商业种植主要是用种子进行实生苗繁殖，但番木瓜种子苗株性复杂和农艺性状分离严重，不利于现代标准化栽培生产。

植物组织培养又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。植物组织培养技术广泛应用于植物快速繁殖、基因工程改良和优良种质资源保存等方面。通过组培技术可以高效获得大量优质的番木瓜种苗，有助于优良农艺性状和遗传性状稳定的番木瓜品种推广利用。然而，目前番木瓜组培苗生根难、根系质量不佳、操作繁琐、效率低、移栽成活率低等问题严重限制了我国番木瓜组培苗的生产和推广。

《番木瓜生物技术》中公开的番木瓜组培苗催根的方法为：采用1/2MS+KT0.2mg/L+IBA1.0mg/L+蔗糖2％+AC2g/L+5g/L琼脂的培养基进行生根培养，可得到带根的完整植株。但实际生产中生根效果不太理想，会有基部膨大畸形海绵状根产生，移栽成活率不理想。王芳等在《番木瓜组培苗生根培养基及移栽基质的筛选》中报道的番木瓜生根方法是将继代苗接种于1/2MS+IBA0.4mg/L+卡拉胶/琼脂的传统生根培养基上得到完整植株。这种生根方法生根率有大幅度提高，但还是存在部分根畸形膨大，有细密根毛的正常根偏少的情况，影响移栽成活率。王龙甫硕士论文《番木瓜组培快繁技术体系的研究》提出了“一步生根法”、“两步生根法”、“扦插生根法”，其中，“一步生根”和“两步生根”均是基于传统组织培养基配方MS+卡拉胶/琼脂+激素来生根，所生出的根均出现膨大畸形海绵状的不正常根系；“扦插生根法”采用将无根小苗经过浸泡诱根剂、杀菌剂配比好的混合液中再扦插入基质中，此种方法虽然省时省力，但扦插法死亡率极高，报道的最佳方案死亡率也高达50％以上，不能满足以后规模化生产的需要。张秀春发表《番木瓜“台农杂交2号”组织培养技术》提出的生根方法通过两次转接得到正常生根植株，并在第二次转接的培养基质中添加蛭石，这也是近几年来在传统培养基基础上的改良，得到的植株膨大畸形根减少，正常根植株增加，但还是存在频繁转接植株不仅会造成损伤，增加污染率还增加成本，非常不利于以后规模化生产的问题。

可见，在现代规模化番木瓜种苗生产中，应在保证组培苗根系质量的基础上，提高组培苗促根效率和移栽成活率，缩短育苗时间，降低生产成本，对推进我国番木瓜组培苗节约化、大规模工厂化生产具有重要意义。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于提供基于组织培养技术快繁培育番木瓜优良种苗的生根方法，以解决现有技术中番木瓜组培快繁过程中组培苗生根难、技术操作繁琐、育苗周期长、效率低的问题。

为解决上述技术问题，本发明所述的一种简便高效高质量的番木瓜组培苗生根方法，包括如下步骤：

(1)选择适宜的番木瓜侧芽为外植体，并经过消毒杀菌处理后，备用；

(2)将处理后的外植体进行初代培养及增殖培养，获得大量番木瓜分化芽；

(3)将所得番木瓜分化芽浸泡于生根诱导液中进行不定根诱导，并移植至生根基质中进行生根培育；

所述生根诱导液为包含质量浓度0.2-5g/L吲哚丁酸、0.1-1mg/L氯化镧以及10-80mg/L根皮苷的混合溶液。

具体的，所述步骤(3)中，所述不定根诱导步骤为选取较为老熟的具有5-8片叶的组培苗分化芽的茎基部浸泡于生根诱导液中进行不定根诱导。

具体的，所述步骤(3)中，所述生根基质包括固体基质和营养液的混合液，所述固体基质的质量和所述营养液的体积比例为1-3：1g/mL。

具体的，所述固体基质包括质量比为1-2：1-2：1-2的草炭、珍珠岩和沸石。

具体的，所述营养液成分包括：1/2MS+40-60mg/L氯化胆碱+25-35g/L蔗糖，pH5.5-6.0。

具体的，所述步骤(3)中，所述生根培育步骤为将移植的所述分化芽的叶片倒插于所述生根基质中，从而使所述分化芽茎段基部切口悬空进行培育；

所述生根培育步骤的条件为28-30℃条件下，每日光照培养12-14h，光照强度为12000-15000lx。

具体的，所述步骤(1)中，所述外植体为挑选大田成龄优良单株截干后萌发的侧芽，去掉叶片和叶柄后截取顶端2-3cm作为外植体。

具体的，所述步骤(1)中，所述杀菌消毒步骤包括：先用300mg/L利福平浸泡杀菌1h，再用75％酒精消毒30s，再用0.1％氯化汞溶液消毒7-8min，无菌水冲洗3次。

具体的，所述步骤(2)中，所述初代培养步骤包括将具有2-3个芽位的顶端幼嫩部分接种至预培养基质中进行培养的步骤；

所述预培养基质的成分包括：MS+0.1-0.2mg/L 6-BA+0.2-0.3mg/LKT+0.4-0.5mg/L IAA+25-35g/L蔗糖+5-10g/L琼脂，pH5.5-6.0；

所述初代培养步骤条件为25-30℃条件下，每日光照培养10-14h，控制光照强度为4000-6000lx，培养25-30d。

具体的，所述步骤(2)中，所述增殖培养步骤包括截取初代培养中萌芽的外植体茎段，置于增殖培养基质中进行增殖培养的步骤；

所述增殖培养基质的成分包括：MS+0.1-0.3mg/L 6-BA+0.2-0.3mg/L KT+0.1-0.2mg/L NAA+0.1-0.2mg/L IBA+25-35g/L蔗糖+5-10g/L琼脂，pH5.5-6.0；

所述增殖培养步骤生物条件为每日光照培养10-14h，光照强度为7000-9000lx，继代周期为25-30d，8-10个继代周期培养后可产生大量丛生不定芽。

本发明还公开了一种番木瓜组培苗方法，具体包括按照所述方法进行生根培育的步骤，以及将生根后的组培苗移植并进行常规培育的步骤。

本发明所述简便高效高质量的番木瓜组培苗生根方法，通过组织培养快繁技术培育优良农艺性状番木瓜种苗，通过利用植株侧芽为外植体，分别经初代培养和增殖培养后获得大量分化芽，通过将分化芽切口基端浸泡于含吲哚丁酸、氯化镧和根皮苷的生根诱导液中进行生根诱导的方式，可有效促进植株的根系分化，经诱导后的分化芽再经过生根基质的培育，即可经移植及培育生长成为正常小植株。本发明所述生根方法与传统生根技术相比，可将组培苗生根率从70-95％提高至100％，生根数量提高3-10倍，根系平均长度提高1-2倍，育苗周期缩短10-20d，且须根多，根毛发达，根系不会出现膨化和愈伤化现象，假植成活率高达98％以上，可有效解决现有番木瓜组培快繁过程中组培苗生根难、技术操作繁琐、育苗周期长、效率低的问题，适宜于番木瓜种苗的培育。

本发明所述简便高效高质量的番木瓜组培苗生根方法，优选所述生根基质为改良的以草炭、珍珠岩、沸石为固体基质，并混合添加氯化胆碱的MS培养基形成，经光照培育的分化芽在培养7-8d后即可从分化芽茎段切口基端愈合处长出7-50条具有根毛的正常根，常规培养21d后大部分根系长可达2-7cm，可有效提高外植体生根率、根系数量、长度和质量，避免根系出现膨化和愈伤化情况，并缩短生根时间和育苗周期，从而大大提高育苗效率。

具体实施方式

实施例1

本实施例所述番木瓜组培苗生根方法，具体包括如下步骤：

(1)选取“穗黄”番木瓜品种，根据结果性状、抗病性、抗逆性和株系表现，选择综合农艺性状优良的番木瓜成年结果树，于晴朗或阴天天气选取大田成龄优良单株，在植株茎干80-100cm处截断后，经过20-30d培养，由潜伏芽萌发、生长后获得健壮侧芽，去除叶片和叶柄后，截取顶端2-3cm作为外植体；将选取的外植体先用300mg/L利福平进行杀菌处理，再用75％酒精消毒30s，再以0.1％氯化汞溶液进行消毒7min，并以无菌水冲洗至少3次，备用；

(2)经消毒的外植体，将具有2-3个芽位的顶端幼嫩部分接种于预培养基质中进行初代培养，于28-30℃条件下，每日光照培养12h，光照强度为5000lx，培养25-28d，并观察外植体培养的污染情况和出芽情况；

所述预培养基质的成分包括：MS+6-BA 0.2mg/L+KT 0.3mg/L+IAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8；

将初代培养后的外植体，截取外植体萌发的幼芽接种于增殖培养基质中进行分化芽增殖培养，于28℃条件下，每日光照培养12h，控制光照强度为8000lx，连续培养时间25-30d为一个继代周期，8-10个继代周期培养后可产生大量丛生不定芽；

所述增殖培养基质的成分包括：MS+6-BA 0.2mg/L+KT 0.3mg/L+NAA0.1mg/L+IBA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8；

(3)增殖培养后，选取具有5-8片叶、较老熟的单个不定芽，将其茎端切口处浸泡于生根诱导液(含吲哚丁酸1g/L+氯化镧0.1mg/L+根皮苷10mg/L)中2min进行不定根诱导，以促进根系分化；

经过诱导液诱导后，将组培苗茎段基部插入经过高温消毒灭菌处理后的生根基质中，于28-30℃，每日光照培养12h，光照强度为12000-15000lx，进行生根培育，以促进根系分化和生长，避免茎端根原基因缺氧胁迫和生长素长时间诱导而出现发根难、根系膨化和愈伤化；所述生根培养基组成包括100g固体基质和50mL营养液；其中，所述固体基质包括质量比为1：1：1的草炭、珍珠岩和沸石；所述营养液成分如下：1/2MS+氯化胆碱50mg/L+蔗糖30g/L，pH5.8。

按照上述方法进行生根培养7-8d后，可见根尖从组培苗茎段切口愈合处长出，培养21d后大部分根系长2-7cm，根系数量7-35条，此时即可移植到基质培养基，生长成为正常小植株。

实施例2

本实施例所述生根方法同实施例1，其区别仅在于，所述生根诱导液成分包括：2g/L吲哚丁酸+0.25mg/L氯化镧+20mg/L根皮苷。

实施例3

本实施例所述生根方法同实施例1，其区别仅在于，所述生根诱导液成分包括：3g/L吲哚丁酸+0.5mg/L氯化镧+40mg/L根皮苷。

实施例4

本实施例所述生根方法同实施例1，其区别仅在于，选用“一尺瓜”番木瓜品种，且所述生根诱导液成分包括：3g/L吲哚丁酸+0.5mg/L氯化镧+40mg/L根皮苷。

实施例5

本实施例所述生根方法同实施例1，其区别仅在于，选用“日升”番木瓜品种，且所述生根诱导液成分包括：3g/L吲哚丁酸+0.5mg/L氯化镧+40mg/L根皮苷。

对比例1

本对比例所述生根方法同实施例1，其区别仅在于，所述生根基质组成为：1/2MS+IBA 2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8，移植方法是将组培苗茎段悬空叶片倒插于生根培养基中进行生根。

对比例2

本对比例所述生根方法同实施例4，其区别仅在于，所述生根基质组成为：1/2MS+IBA 2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8，移植方法是将组培苗茎段悬空叶片插入于生根培养基中进行生根。

对比例3

本对比例所述生根方法同实施例5，其区别仅在于，所述生根基质组成为：1/2MS+IBA 2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8，移植方法是将分化芽茎段悬空叶片倒插于生根培养基中进行生根。

对比例4

本对比例所述生根方法同对比例1，其区别仅在于，是将组培苗茎段基部插入于所述生根培养基中进行生根。

对比例5

本对比例所述生根方法同对比例2，其区别仅在于，是将组培苗茎段基部插入于所述生根培养基中进行生根。

对比例6

本对比例所述生根方法同对比例3，其区别仅在于，是将组培苗茎段基部插入于所述生根培养基中进行生根。

对比例7

本对比例所述生根方法同实施例1，其区别仅在于，以无菌水代替生根诱导液对组培苗茎段切口进行浸泡处理。

对比例8

本对比例所述生根方法同实施例1，其区别仅在于，以无菌水代替生根诱导液对组培苗茎段切口进行浸泡处理，并且，所述生根基质组成为：1/2MS+IBA 2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8。

对比例9

本对比例所述生根方法同实施例1，其区别仅在于，所述生根诱导液不含有氯化镧。

对比例10

本对比例所述生根方法同实施例1，其区别仅在于，所述生根诱导液不含有根皮苷。

对比例11

本对比例所述生根方法同实施例1，其区别仅在于，所述生根基质不含有氯化胆碱。

对比例12

本对比例所述生根方法同实施例1，其区别仅在于，所述生根基质成分为：1/2MS+氯化胆碱50mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8。

实验例

分别对上述实施例1-5及对比例1-9中方法的生根情况进行检测及记录，结果记录于下表1。

表1不同处理方式番木瓜组培苗的生根情况

从上表数据可见，本发明所述生根方法与现有技术已知生根技术(对比例1-6)相比，可将组培苗生根率从70％左右提高至100％，生根数量提高3-10倍，根系平均长度提高1-2倍，育苗周期缩短10-20d，且须根多，根毛发达，根系不会出现膨化和愈伤化现象，假植成活率高达98％以上，可有效解决现有番木瓜组培快繁过程中组培苗生根难、技术操作繁琐、育苗周期长、效率低的问题。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (5)

1.一种简便高效高质量的番木瓜组培苗生根方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）选择适宜的番木瓜侧芽为外植体，并经过消毒杀菌处理后，备用；

（2）将处理后的外植体进行初代培养及增殖培养，获得大量番木瓜分化芽；

（3）将所得番木瓜分化芽浸泡于生根诱导液中进行不定根诱导，并移植至生根基质中进行生根培育；

所述生根诱导液组成为质量浓度0.2-5g/L吲哚丁酸、0.1-1mg/L氯化镧以及10-80mg/L根皮苷的混合溶液；

所述不定根诱导步骤为选取较为老熟的具有5-8片叶的组培苗分化芽的茎基部浸泡于生根诱导液中进行不定根诱导；

所述生根基质组成为固体基质和营养液的混合液，所述固体基质的质量和所述营养液的体积比例为1-3：1g/mL；所述固体基质组成为质量比为1-2：1-2：1-2的草炭、珍珠岩和沸石；所述营养液成分组成为：1/2MS+40-60mg/L氯化胆碱+25-35g/L蔗糖，pH5.5-6.0；

所述生根培育步骤为将组培苗茎段基部插入经过高温消毒灭菌处理后的生根基质中；

所述生根培育步骤的条件为28-30℃条件下，每日光照培养12-14h，光照强度为12000-15000lx。

2.根据权利要求1所述简便高效高质量的番木瓜组培苗生根方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述外植体为挑选大田成龄优良单株截干后萌发的侧芽，去掉叶片和叶柄后截取顶端2-3cm作为外植体。

3.根据权利要求1所述简便高效高质量的番木瓜组培苗生根方法，其特征在于，所述步骤（2）中，所述初代培养步骤包括将具有2-3个芽位的顶端幼嫩部分接种至预培养基质中进行培养的步骤；

所述预培养基质的成分为：MS+0.1-0.2mg/L 6-BA+0.2-0.3mg/L KT+0.4-0.5mg/L IAA+25-35g/L蔗糖+5-10g/L琼脂，pH5.5-6.0；

所述初代培养步骤条件为25-30℃条件下，每日光照培养10-14h，控制光照强度为4000-6000lx，培养25-30d。

4.根据权利要求1所述简便高效高质量的番木瓜组培苗生根方法，其特征在于，所述步骤（2）中，所述增殖培养步骤包括截取初代培养中萌芽的外植体茎段，置于增殖培养基质中进行增殖培养的步骤；

所述增殖培养基质的成分为：MS+0.1-0.3mg/L 6-BA+0.2-0.3mg/L KT+0.1-0.2mg/LNAA+0.1-0.2mg/L IBA+25-35g/L蔗糖+5-10g/L琼脂，pH5.5-6.0；

所述增殖培养步骤生物条件为每日光照培养10-14h，光照强度为7000-9000lx，继代周期为25-30d，8-10个继代周期培养后可产生大量丛生不定芽。

5.一种番木瓜组培苗方法，其特征在于，包括按照权利要求1-4任一项所述方法进行生根培育的步骤，以及将生根后的组培苗移植并进行常规培育的步骤。