CN110771512B - 一种溪荪愈伤组织的高效诱导方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种溪荪愈伤组织的高效诱导方法，该方法以溪荪胚轴部分为诱导愈伤组织的外植体。先对成熟的溪荪种子进行消毒，然后接入培养基使其萌发出胚根，接着切取生长为0.5～1cm的胚轴和胚根部分放入诱导培养基，愈伤组织将在胚轴部位诱导出现。其最佳培养基为MS+1.0mg/L 6‑BA+1.5mg/L2,4‑D+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，30天时诱导率高达95.34％，该方法为优化组织培养体系及建立遗传转化体系奠定了坚实的基础。
Description
技术领域
本发明涉及涉及植物组织培养技术领域，具体涉及到一种溪荪愈伤组织的高效诱导方法。
背景技术
溪荪(Iris sanguinea)是鸢尾科，鸢尾属多年生草本花卉，又称东方鸢尾。植株高度大约在50～100cm，根状茎强健，线形叶，花蓝色，较小，有着特殊的花形，一般为2～3朵；花期在6～7月，7～9月为果期。其花色艳丽而丰富、株型俊美、抗寒能力强、观赏价值高，作为园林绿化和插花花卉，具有极高的市场潜力，在园林上用途比较广泛，主要应用在林下观赏植被、绿地片植、草地点缀、模纹花坛等方面；溪荪可作为盆栽花卉应用于室内小环境家居装饰，同时也可用作插花材料。目前溪荪在我国没有得到很好的开发利用，而且其野生环境随着开发遭到破坏，野生资源越来越少。
组织培养因可高效繁殖植株并且可以改进植株质量，而被广为使用(Shimizu,K.et al.)。E.V.Boltenkov和E.V.Zarembo以溪荪种子为外植体，研究了外植体在脱分化和再分化过程中与激素含量变化的关系，未统计诱导率，且根未形成(E.V.Boltenkov andE.V.Zarembo，2005)。年玉欣等人以溪荪的根、已休眠的带芽根状茎和已萌发的芽为外植体进行不定芽诱导，得出结论为适宜的外植体为带芽根状茎，诱导率为88.57％。目前溪荪相关研究较少，多为生理性研究，在组织培养及大量繁殖等方面研究十分欠缺。
目前虽然已有相关研究开展了溪荪愈伤组织的诱导，但是诱导率并不高，针对这一问题，我们总结前人的经验，对实验材料、条件、培养基等进行了优化，提供了一种溪荪诱导愈伤组织的方法，提高了诱导率，为溪荪愈伤组织途径的再生体系的建立提供了帮助。
发明内容
为解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种溪荪愈伤组织的高效诱导方法,该方法可诱导培育出大量生长健壮的愈伤组织,在适当的条件下可再分化形成不定芽，进而形成植株,从而实现溪荪种苗的快速繁殖及为花色遗传研究前期工作打下基础。
本发明提供的溪荪愈伤组织的高效诱导方法，技术方案如下：
种子的选择及消毒：选取已成熟且种荚开裂的溪荪种子，将其进行消毒处理；
胚轴的诱导及生长：将消毒后的溪荪种子接入固体培养基MS+0.5mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂中；
愈伤组织的诱导及产生：切取生长总长度为0.5～1cm的胚轴和胚根的部分放入诱导培养基放入固体培养基MS+1.0mg/L 6-BA+1.5mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+7g/L琼脂中。培养15天继代1次，连续继代两次，胚轴上将会产生黄色的愈伤组织，最终选取获得的颜色为黄色的愈伤组织；
上述所有培养基的pH值均调节至5.8～6.0，培养室的培养温度为25±1℃、光照时间为14h/d、光照强度为25μmol/(m2.s)；
进一步地，步骤(1)中所述消毒处理是指将溪荪种子用80℃热水浸种1d后，以75％酒精灭菌30s，再用4％NaClO溶液消毒20min；
进一步地，步骤(3)步骤中所述切取生长总长度为0.5～1cm的胚轴和胚根部分放入诱导培养基是指切取种子上刚生长出来的长度0.5～1cm的健壮胚轴及胚根放入诱导培养基；
进一步地，步骤(3)步骤中所述选取获得的颜色为黄色的愈伤组织是指颜色为黄色、颗粒明显且松散的从胚轴部位上产生的愈伤组织；
本发明采用组织培养技术，在愈伤组织诱导过程中产生的有益效果：诱导过程中无褐化现象，产生愈伤组织的没有细菌感染，诱导率高达95.34％，为实现溪荪种苗的快速繁殖提供一条新的途径。
图1是溪荪诱导愈伤培养示意图
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
本实施例提供的溪荪愈伤组织的高效诱导培养方法包括如下步骤：
种子的选择及消毒：挑选已成熟且种荚开裂的溪荪种子放入锥形瓶中，加入适量的水和洗洁剂，不停的摇晃10min去除杂质，之后在流水下冲洗1h，无泡沫后用温度为80℃的自来水浸泡1d，然后在无菌操作台中将种子重新放在已灭菌的锥形瓶中，75％的酒精消毒30s，无菌水冲洗3次，4％的NaClO消毒20min，冲洗5次，浸泡10min；
胚轴的诱导及生长：将消毒后的溪荪种子用镊子接入固体培养基MS+0.5mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂中，培养基的pH值为5.8～6.0，接种密度为20粒/皿，培养室的培养温度为25±1℃、光照时间为14h/d、光照强度为25μmol/(m2.s)，培养约11d时种子胚根萌发，陆续切取长度为0.5～1cm的带胚轴的部分，30d后结束萌发；
愈伤组织的诱导及产生：将已切取的生长为0.5～1cm的带胚轴的部分用镊子放入诱导培养基放入固体培养基MS+1.0mg/L 6-BA+1.5mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+7g/L琼脂中，培养基的pH值为5.8～6.0，接种密度为15个/皿，培养室的培养温度为25±1℃、光照时间为14h/d、光照强度为25μmol/(m2.s)，培养15天继代1次，连续继代2次，最终选取获得的颜色为黄色且生长健壮的愈伤组织，其褐化率为0％，污染率为0％，诱导率高达95.34％。
诱导培养基选择实验
根据已公布资料初选适于溪荪诱导愈伤组织的激素浓度，选择MS培养基中添加不同浓度6-BA、NAA和2,4-D，同时添加琼脂7g/L，蔗糖30g/L，调节PH至5.8～6.0。接种时每个处理接种30个胚轴，3个重复，培养30d进行数据统计，具体见表1。
表1不同激素组合比较实验
可以看出当6-BA浓度为1mg/L时，与其他两种激素配合所培养出的愈伤组织状态较好，6-BA与2,4-D对愈伤组织的诱导影响更大，NAA影响最小；
结果表明，在培养基MS+1.0mg/L 6-BA+1.5mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，诱导率最高，达到了95.34％。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，任何熟悉本领域的技术人员均可利用上述阐述的技术方案对本发明加以修改或将其修改为等同的技术方案。
Claims (4)
1.一种溪荪愈伤组织的高效诱导培养方法,其特征在于：
（1）种子的选择及消毒：选择颗粒成熟饱满且种荚开裂的溪荪种子，将其进行消毒处理；
（2）胚轴的诱导及生长：将消毒后的溪荪种子接入固体培养基MS + 0.5 mg/L 6-BA +30 g/ L蔗糖 + 3.5 g/L琼脂中；
（3）愈伤组织的诱导及产生：切取生长为0.5~1cm的胚根和胚轴部分放入诱导培养基MS+ 1.0 mg/ L 6-BA + 1.5 mg/ L 2,4-D + 30 g/ L蔗糖 + 7 g/L琼脂中，培养15天继代1次，连续继代2次，最终选取获得的颜色为黄色的愈伤组织；
上述所有培养基的pH值均调节至5.8~ 6.0，培养室的培养温度为25 ± 1 ℃、光照时间为14h/d、光照强度为25µmol/ ( m2·s )。
2.根据权利要求1所述的溪荪愈伤组织的高效诱导培养方法，其特征在于步骤（1）中所述消毒处理是指将溪荪种子用80 ℃热水浸种1 d后，以75 %酒精灭菌30 s，再用4 % NaClO溶液消毒20 min。
3.根据权利要求1所述的溪荪愈伤组织的高效诱导培养方法，其特征在于步骤（3）中胚根和胚轴部分放入诱导培养基是指切取种子上刚生长出来的长为0.5~1cm的健壮胚根和胚轴放入诱导培养基。
4.根据权利要求1所述的溪荪愈伤组织的高效诱导培养方法，其特征在于步骤（3）中所述选取获得的颜色为黄色的愈伤组织是指颜色为黄色、颗粒明显且松散的愈伤组织且是从胚轴上生长出来的愈伤组织。
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