CN117305498A - 一种用于鉴别豌豆品种的分子标记组合、引物组合及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于鉴别豌豆品种的分子标记组合、引物组合及其应用,属于植物品种鉴别技术领域,本发明所述用于鉴别豌豆品种的分子标记组合,包括:PsSSR01、PsSSR02、PsSSR03、PsSSR04、PsSSR05、PsSSR06、PsSSR07、PsSSR08、PsSSR09、PsSSR10和PsSSR11;所述分子标记通过如SEQ ID NO.1~22所示引物对扩增得到。本发明公开了用于鉴别豌豆的分子标记组合,仅利用11对豌豆引物对即能扩增出上述的分子标记组合,进而能够将豌豆品种有效鉴别,鉴别准确率高达100%,可为豌豆品种DNA指纹鉴定提供技术支持。
Description
技术领域
本发明属于植物品种鉴别技术领域,尤其涉及一种用于鉴别豌豆品种的分子标记组合、引物组合及其应用。
背景技术
豌豆(Pisum sativum L.)有7对同源染色体,2n=14,在我国种植历史悠久,属被子植门,豆科(Leguminosae),蝶形花亚科,豌豆属(Pisum)。为自花授粉作物,春播为一年生,秋冬播越年生,攀援或矮生的日照草本植物。豌豆在我国东西南北各个地区均有分布,不喜干热但喜湿润气候,能耐住寒冷和贫瘠环境但不耐热,适合在多样性的土地条件和干旱地域下生长。豌豆富含蛋白质、淀粉及人体所需的多种微量元素,营养均衡,遗传多样性丰富在我国被广泛种植。截至2020年,中国国家作物种质库(NationalCrop GenebankofChina,NCGC)保存着7000多份具有丰富遗传多样性的豌豆种质资源,其中我国特有种质约5000份(71%),国外种质约2000份(29%)。由于不同地区之间品种交流频繁,从而导致了其种类和品种越发繁多,来源较为复杂,存在大量“同名异种”和“一品多名”种质。豌豆品种混乱、真假难辨,许多生产者不能区分出当地种植的品种,豌豆种子生产者能否生产出优质高产的豌豆品质无法得到保障,从而造成严重损失。多年来,品种鉴定是以形态学标记为依据的。这种方法虽然简单经济,但周期长,花费大,受季节限制,而且很多性状的表现受栽培措施及环境因子影响,从而制约了鉴定的准确性。DNA分子标记技术则具有高效、准确、不受环境条件影响、实验操作简单等优点,已广泛应用于植物品种真实性鉴定及纯度检测研究。SSR标记是近年来发展起来的建立在PCR基础上的第二代分子标记。由于SSR分子标记具有数量丰富、多态性高、遗传共显性、谱带扩增稳定、精度高、检测时间短、技术成熟等特点,已应用于作物遗传学研究。目前,豌豆中也有利用分子标记技术进行研究的,但是没有具体只针对豌豆品种开发的SSR分子标记以及利用SSR分子标记构建的技术体系。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明提出了一种用于鉴别豌豆品种的分子标记组合、引物组合及其应用,以解决上述现有技术存在的问题,本发明构建的指纹图谱能够准确鉴别不同品种的豌豆。
为实现上述目的,本发明提供了一种用于鉴别豌豆品种的分子标记组合,所述分子标记包括:PsSSR01、PsSSR02、PsSSR03、PsSSR04、PsSSR05、PsSSR06、PsSSR07、PsSSR08、PsSSR09、PsSSR10和PsSSR11;所述PsSSR01通过如SEQ ID NO.1~2所示引物对扩增得到,所述PsSSR02通过如SEQ ID NO.3~4所示引物对扩增得到,所述PsSSR03通过如SEQ IDNO.5~6所示引物对扩增得到,所述PsSSR04通过如SEQ ID NO.7~8所示引物对扩增得到,所述PsSSR05通过如SEQ ID NO.9~10所示引物对扩增得到,所述PsSSR06通过如SEQ ID NO.11~12所示引物对扩增得到,所述PsSSR07通过如SEQ ID NO.13~14所示引物对扩增得到,所述PsSSR08通过如SEQ ID NO.15~16所示引物对扩增得到,所述PsSSR09通过如SEQ IDNO.17~18所示引物对扩增得到,所述PsSSR10通过如SEQ ID NO.19~20所示引物对扩增得到,所述PsSSR11通过如SEQ ID NO.21~22所示引物对扩增得到。
本发明还提供了一种用于鉴别豌豆品种的引物组合,包括11对引物对,所述引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1~22所示。
本发明还提供了一种用于鉴别豌豆品种的试剂盒,包含所述的引物组合。
本发明还提供了一种豌豆指纹图谱的构建方法,包括以下步骤:采集不同生长习性的豌豆并编号,利用权利要求2所述的引物组合对所述不同品种的豌豆的DNA进行PCR扩增,对所述扩增得到的扩增产物进行电泳检测,根据电泳检测的结果构建所述豌豆指纹图谱。
优选的,所述豌豆品种包括资源库号为19WD045的DWD05-01、资源库号为19WD109的成豌11号、资源库号为19WD208的C13、资源库号为19WD001的方绿豌豆、资源库号为19WD034的杂粮甜豌豆、资源库号为19WD083的WD-0030、资源库号为19WD040的定豌7号、资源库号为19WD077的WD-0007、资源库号为19WD081的WD-0013、资源库号为19WD006的麻豌豆、资源库号为19WD010的澳洲红玉豆、资源库号为19WD223的S6071、资源库号为19WD005的黑眼豌豆、资源库号为19WD228的SW1102、资源库号为19WD196的C01、资源库号为19WD224的1702、资源库号为19WD007的彩豌豆、资源库号为19WD234的S5008、资源库号为19WD235的RC09、资源库号为19WD012的食荚型水果甜豌豆、资源库号为19WD020的鲜嫩二号豌豆、资源库号为19WD021的美国甜脆豌豆、资源库号为19WD031的豌豆、资源库号为19WD090的德利荷兰豆、资源库号为19WD073的WD-0019、资源库号为19WD085的优选法国008香豆、资源库号为19WD050的DWD05-03、资源库号为19WD104的猪耳朵扁豆、资源库号为19WD084的WD-0009、资源库号为19WD051的DWD05-010、资源库号为19WD226的WD04-09、资源库号为19WD004的黑豌豆。
优选的,所述PCR扩增的反应体系为:50ng/μLDNA模板1μL,10pmo1/L上游引物0.5μL,10pmo1/L下游引物0.5μL,Taq Master Mix 10μL,ddH2O 8μL。
优选的,所述PCR扩增的反应程序为:95℃预变性5min;95℃变性30s,57℃退火30s,72℃延伸45s,共35个循环;72℃延伸5min,16℃保存。
本发明还提供了所述的分子标记组合、所述的引物组合或所述的试剂盒在获取豌豆指纹图谱中的应用。
本发明还提供了所述的分子标记组合、所述的引物组合、所述的试剂盒或所述的构建方法在鉴别豌豆品种中的应用。
与现有技术相比,本发明具有如下优点和技术效果:
本发明公开了用于鉴别豌豆的分子标记组合,仅利用11对豌豆引物对即能扩增出该分子标记组合,进而能够将豌豆品种有效鉴别,鉴别准确率高达100%。因此,本发明公开的分子标记组合和引物组合在进一步鉴别大量豌豆品种方面具有很大潜力,与现有常规形态鉴定相比,具有效果更佳,且节约时间、成本等优点,本发明可为豌豆品种DNA指纹鉴定提供技术支持。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为兼用检测记录DNA指纹图谱的方式,其中,M为Marker,01~32为32份豌豆材料的电泳带型图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式,并非用于限制本发明。另外,对于本发明中的数值范围,应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料,但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时,以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下,可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化,这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等,均为开放性的用语,即意指包含但不限于。
实施例1豌豆指纹图谱的构建方法
1、实验材料
以32份豌豆品种作为样本材料,根据开发的SSR分子标记构建豌豆品种的指纹数据,以达到品种鉴定的目的。
32种豌豆品种信息如表1所示。以下实施例中豌豆品种名称及资源库号均来自于国家杂粮工程技术研究中心种质资源库。
表1 32种豌豆品种信息
序号 | 名称 | 资源库号 |
1 | DWD05-01 | 19WD045 |
2 | 成豌11号 | 19WD109 |
3 | C13 | 19WD208 |
4 | 方绿豌豆 | 19WD001 |
5 | 杂粮甜豌豆 | 19WD034 |
6 | WD-0030 | 19WD083 |
7 | 定豌7号 | 19WD040 |
8 | WD-0007 | 19WD077 |
9 | WD-0013 | 19WD081 |
10 | 麻豌豆 | 19WD006 |
11 | 澳洲红玉豆 | 19WD010 |
12 | S6071 | 19WD223 |
13 | 黑眼豌豆 | 19WD005 |
14 | SW1102 | 19WD228 |
15 | C01 | 19WD196 |
16 | 1702 | 19WD224 |
17 | 彩豌豆 | 19WD007 |
18 | S5008 | 19WD234 |
19 | RC09 | 19WD235 |
20 | 食荚型水果甜豌豆 | 19WD012 |
21 | 鲜嫩二号豌豆 | 19WD020 |
22 | 美国甜脆豌豆 | 19WD021 |
23 | 豌豆 | 19WD031 |
24 | 德利荷兰豆 | 19WD090 |
25 | WD-0019 | 19WD073 |
26 | 优选法国008香豆 | 19WD085 |
27 | DWD05-03 | 19WD050 |
28 | 猪耳朵扁豆 | 19WD104 |
29 | WD-0009 | 19WD084 |
30 | DWD05-010 | 19WD051 |
31 | WD04-09 | 19WD226 |
32 | 黑豌豆 | 19WD004 |
2、不同品种豌豆标准DNA指纹图谱库的构建
2.1豌豆各品种总DNA提取
将豌豆种植于土壤中,室温培养,幼苗长到6~15cm时取豌豆幼叶在液氮冷冻后于-80℃保存备用。取各品种小豆幼嫩的叶片0.2g于1.5mL离心管中,加入液氮研磨成粉末。采用CTAB法提取DNA,操作实验步骤为加入经过65℃水浴加热的含有2%的巯基乙醇CTAB提取液600μL;将EP管中CTAB提取液和样品全部转入65℃水浴锅中水浴1h,期间每10min间隔性混匀一次;取出后12000r/min在4℃下离心10min,将上清转移至新EP管中,加入600μL体积比为25:24:1的酚:氯仿:异戊醇混合溶液,充分混匀后,置于冰盒上静置反应10min,在4℃条件下12000r/min,离心15min;取出后将上清液转移到新的离心管中加等体积混合比例为24:1的氯仿与异戊醇混合溶液,使用冷冻离心机在4℃条件下,12000r/min离心15min;取出后将上清液转移到新的EP管中加如上清0.6倍体积预冷异丙醇,充分混匀后。放置-20℃冰箱冷藏15min;取出后使用冷冻离心机在4℃条件下,12000r/min离心15min,取出后弃上清液,保留沉淀,并充分吸干残留液体。加入预冷过的75%乙醇洗涤沉淀,再使用冷冻离心机12000r/min离心5min,重复上一步骤,弃上清液,室温晾干,加入40μL ddH2O溶解。用琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测总DNA的质量,然后将总DNA稀释成100ng/μL,储存于-20℃备用。
2.2引物的筛选
a.SSR标记合成:由生物公司合成SSR分子标记的扩增引物,引物合成的纯度要求为HAP纯化,并分装成1OD/管,把上、下游引物的浓度均稀释成10pmol/L。
b.SSR分子标记引物组合的筛选方法
筛选出在不同豌豆品种间具有多态性、带型清晰且能够稳定重复的SSR初筛引物。通过筛选获得以下引物,其标记、引物名称、位置如表2所示。
表2引物标记名称
c.SSR标记扩增引物组合的筛选
以豌豆品种为材料,利用合成的SSR分子标记的扩增引物(如表2)分别对表1所示各豌豆品种的DNA进行PCR扩增,PCR反应试验中采用的PCR反应体系为20μL体系:DNA模板1μL,10pmol/L上游引物0.5μL,10pmo1/L下游引物0.5μL,Taq Master Mix 10μL,ddH2O 8μL,总计20μL。
PCR反应程序为:95℃预变性5min;95℃变性30s,57℃退火30s,72℃延伸45s,共35个循环;72℃延伸5min,16℃保存。
d.凝胶电泳及Gel-red显色
扩增产物采用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,电泳在LF-CZ05A高通量垂直电泳槽中进行。
显色:利用Gel-red固定20min,放入凝胶成像(Bio-red)中照相记录,根据标准DNA分子量和引物的迁移率记录电泳结果,每对引物迁移率最大的条带记为1,迁移率次之的记为2,依次类推,无条带记为0,建立SSR基因型信息数据,按照引物顺序进行编码,得到的指纹代码即为该品种的特征指纹图谱,指纹图谱如图1所示。
3、豌豆DNA特征指纹图谱的构建
表3 25份豌豆材料分子标记指纹代码
由表3可得出以下结论:任意两个品种的DNA分子标记指纹图谱都不相同,可判断出32份供试豌豆品种是不同的品种,且所对应的DNA分子指纹代码是该品种所特有的指纹。
结果表明,11对引物组合可用于鉴定豌豆品种的遗传特征,保护这些品种权免受侵犯。
本发明利用上述技术体系和筛选出的11对豌豆SSR多态性引物,构建了32个豌豆DNA指纹图谱,把32个豌豆品种区分开,将为豌豆的鉴定和品种权保护提供技术支撑。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种用于鉴别豌豆品种的分子标记组合,其特征在于:所述分子标记包括:PsSSR01、PsSSR02、PsSSR03、PsSSR04、PsSSR05、PsSSR06、PsSSR07、PsSSR08、PsSSR09、PsSSR10和PsSSR11;所述PsSSR01通过如SEQ ID NO.1~2所示引物对扩增得到,所述PsSSR02通过如SEQ ID NO.3~4所示引物对扩增得到,所述PsSSR03通过如SEQ ID NO.5~6所示引物对扩增得到,所述PsSSR04通过如SEQ ID NO.7~8所示引物对扩增得到,所述PsSSR05通过如SEQID NO.9~10所示引物对扩增得到,所述PsSSR06通过如SEQ ID NO.11~12所示引物对扩增得到,所述PsSSR07通过如SEQ ID NO.13~14所示引物对扩增得到,所述PsSSR08通过如SEQID NO.15~16所示引物对扩增得到,所述PsSSR09通过如SEQ ID NO.17~18所示引物对扩增得到,所述PsSSR10通过如SEQ ID NO.19~20所示引物对扩增得到,所述PsSSR11通过如SEQ ID NO.21~22所示引物对扩增得到。
2.一种用于鉴别豌豆品种的引物组合,其特征在于:包括11对引物对,所述引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1~22所示。
3.一种用于鉴别豌豆品种的试剂盒,其特征在于:包含权利要求2所述的引物组合。
4.一种豌豆指纹图谱的构建方法,其特征在于:包括以下步骤:采集不同生长习性的豌豆并编号,利用权利要求2所述的引物组合对所述不同品种的豌豆的DNA进行PCR扩增,对所述扩增得到的扩增产物进行电泳检测,根据电泳检测的结果构建所述豌豆指纹图谱。
5.根据权利要求4所述的构建方法,其特征在于:所述豌豆品种包括资源库号为19WD045的DWD05-01、资源库号为19WD109的成豌11号、资源库号为19WD208的C13、资源库号为19WD001的方绿豌豆、资源库号为19WD034的杂粮甜豌豆、资源库号为19WD083的WD-0030、资源库号为19WD040的定豌7号、资源库号为19WD077的WD-0007、资源库号为19WD081的WD-0013、资源库号为19WD006的麻豌豆、资源库号为19WD010的澳洲红玉豆、资源库号为19WD223的S6071、资源库号为19WD005的黑眼豌豆、资源库号为19WD228的SW1102、资源库号为19WD196的C01、资源库号为19WD224的1702、资源库号为19WD007的彩豌豆、资源库号为19WD234的S5008、资源库号为19WD235的RC09、资源库号为19WD012的食荚型水果甜豌豆、资源库号为19WD020的鲜嫩二号豌豆、资源库号为19WD021的美国甜脆豌豆、资源库号为19WD031的豌豆、资源库号为19WD090的德利荷兰豆、资源库号为19WD073的WD-0019、资源库号为19WD085的优选法国008香豆、资源库号为19WD050的DWD05-03、资源库号为19WD104的猪耳朵扁豆、资源库号为19WD084的WD-0009、资源库号为19WD051的DWD05-010、资源库号为19WD226的WD04-09、资源库号为19WD004的黑豌豆。
6.根据权利要求4所述的构建方法,其特征在于:所述PCR扩增的反应体系为:50ng/μLDNA模板1μL,10pmo1/L上游引物0.5μL,10pmo1/L下游引物0.5μL,Taq Master Mix 10μL,ddH2O 8μL。
7.根据权利要求4所述的构建方法,其特征在于:所述PCR扩增的反应程序为:95℃预变性5min;95℃变性30s,57℃退火30s,72℃延伸45s,共35个循环;72℃延伸5min,16℃保存。
8.如权利要求1所述的分子标记组合、权利要求2所述的引物组合或权利要求3所述的试剂盒在获取豌豆指纹图谱中的应用。
9.如权利要求1所述的分子标记组合、权利要求2所述的引物组合、权利要求3所述的试剂盒或权利要求4~7任一项所述的构建方法在鉴别豌豆品种中的应用。
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