CN105886613B - 大豆品种ssr指纹图谱身份证的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种大豆品种SSR指纹图谱身份证的构建方法，其特征在于：首先对SSR标记进行初步筛选，然后以多样性指数高低为选择依据，确定大豆品种SSR指纹图谱身份证构建所需的核心标记，再然后记录核心SSR标记在大豆品种中的整体指纹图谱带型，并对这些带型进行数字编码，最后按照固定的顺序串联核心SSR标记的带型编码，即为大豆品种的SSR指纹图谱身份证代码。其有效解决传统方法存在的等位变异记录方式容易出现误差、较多数量的SSR标记组合不利于后续比对鉴定及推广应用等技术难题，具有简单明了地区分品种、数据易于存档记录和分析比较等优点，可以为快速准确地鉴定大豆新品种，评价种质资源和解决品种产权纠纷提供科学、有效的参考依据。

Description

大豆品种SSR指纹图谱身份证的构建方法

技术领域

本发明涉及一种大豆品种SSR指纹图谱身份证的构建方法，属于农作物品种分子鉴定技术领域。

背景技术

品种鉴定作为种子生产中的重要步骤，是保护新品种、防止假冒伪劣品种进入市场、维护农民利益的重要手段。近年来，随着优异亲本的重复利用以及新种质的匮乏，部分大豆品种出现血缘关系相近、表型特征相似的情况，然而传统的大豆品种鉴定方法以种子、幼苗和植株形态特征、农艺性状差异等为依据，虽然简单、经济，但所需周期较长，且表型特征易受环境影响，鉴别错误时有发生，无法满足当今品种鉴定的需要（中国油料作物学报，2013/35(3)//231~239）。随着分子生物学技术的发展，借助SSR分子标记指纹身份证技术直接检测品种间基因型的差异，已成为比传统的形态学鉴定方法更加准确、高效的品种鉴定技术。

目前，传统大豆品种SSR指纹图谱身份证的构建方法存在两个技术难题：第一，在统计SSR标记扩增片段时，大多依据扩增片段的大小，并对应分子量从大到小，依次记录为1，2，3，...，n，这种编码方式在SSR扩增条带较多、分布复杂时，容易出现读带误差、统计困难等问题，这将直接影响后续的数据统计分析结果（麦类作物学报，2006/26(4)//164~168）；第二，使用的SSR标记组合数量较多，不但增加了指纹图谱身份证的位数，而且在实际应用过程中大大增加工作量，不利于后续的比对鉴定和推广应用（中国农业科学，2011/44(10)//2081~2093）。为了给大豆种质资源、品种权的保护与管理提供更有力的技术支撑，这就需要对现有大豆品种指纹图谱身份证技术体系进行改进和提高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种大豆品种SSR指纹图谱身份证的构建方法，不但可以有效解决传统方法存在的等位变异记录方式容易出现误差、较多数量的标记组合不利于后续比对鉴定及推广应用等技术难题，而且具有简单明了地区分品种、数据易于存档记录和分析比较等优点，可以为大豆新品种的快速鉴定和准确评价提供科学、准确、有效的技术支撑。

为实现上述目的，本发明提供了一种大豆品种SSR指纹图谱身份证的构建方法，其特征在于构建的具体步骤如下：

1）大豆品种基因组DNA的提取：利用改进的CTAB法，将提取液中还原剂β-巯基乙醇的浓度从1%增加到2.5%，从而有效减少DNA提取过程中组织的褐化降解；在提取液中加入浓度为5%的聚乙烯吡咯烷酮PVP40，不但能够有效去除色素、脂肪等物质，而且能够提高DNA的完整性；在用苯酚：氯仿抽提时，使用pH 4.0的苯酚，苯酚在低pH的情况下能促进水相中的蛋白向有机相分配，从而最大限度的去除蛋白，提高DNA的纯度，即从0.1g大豆幼嫩叶片中提取基因组DNA，并稀释到10-15 ng/μl，置于-20℃冰箱保存备用；

2）SSR标记的初步筛选：选取均匀分布在大豆20个连锁群上的320个SSR标记，通过PCR扩增与非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，进行SSR标记的初步筛选，获得12个扩增稳定、条带清晰、多态性高的SSR标记，这12个SSR标记分别为Satt397、Satt235、Satt422、Sat_128、Satt160、Satt367、Sat155、Satt448、Sat_245、Satt494、Sat_288、Sat_351；

3）SSR带型的记录与数据统计分析：根据非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果，记录每个SSR标记在大豆品种上扩增出来的整体带型，并作为一个等位变异，然后将每个SSR标记在大豆品种上扩增出来的全部带型按从简到繁的次序排列，顺次记录为1，2，3，...，n，最后的结果是每一种SSR带型都被一个数字所赋值。利用POPGENE 1.31 统计软件计算每个SSR标记的等位变异数和多样性指数；所谓的“每个SSR标记在大豆品种上扩增出来的全部带型按从简到繁的次序排列”指的是扩增的条带数量少，带型简单；扩增的条带数量多，带型繁琐；

4）大豆品种SSR指纹图谱身份证构建所需核心标记的确定：以多样性指数的高低为选择依据，遂一加入步骤2）初筛获得的SSR标记，直至标记组合能够将大豆品种全部区分开。由于7个SSR标记就能够将大豆品种全部区分开，因此将Satt422、Sat_351、Satt160、Sat_128、Sat155、Satt397、Sat_245这7个SSR标记确定为大豆品种SSR指纹图谱身份证构建所需的核心标记；从初选的12个SSR标记中选择出来的，选择的标准是“以多样性指数的高低为选择依据，遂一加入步骤2）初筛获得的SSR标记，直至标记组合能够将大豆品种全部区分开；

5）大豆品种SSR指纹图谱身份证的构建：记录PCR扩增后步骤4）获得的核心SSR标记在大豆品种中的整体带型，并将带型按从简单到复杂次序排列，依次被编码为1、2、...、n，最后对于每一个品种，7个核心SSR标记都将赋予该品种7个带型编码，再按照固定的SSR标记顺序（依次为Satt422、Sat_351、Satt160、Sat_128、Sat155、Satt397、Sat_245）串联这7个带型编码，即可形成一组由7个数字排列成的数据，也就是大豆品种的SSR指纹图谱身份证代码。

本发明的积极效果是：

1、是一种应用性的遗传种质分析方法，其在指纹图谱的基础上将品种特征数字化，使每个品种都拥有一个属于自己的字符串形式的代码，比较于传统田间种植鉴定方法，具有周期短、易操作、稳定性好、重复性高、真实可靠、简单明了、易于存档记录和分析比较等优点，可以被有效应用于大豆品种的真伪鉴定、遗传关系分析和解决品种产权纠纷等方面；

2、根据每对SSR扩增的带型间的差别，直接对带型进行整体编号，使每个SSR标记在不同的大豆品种中扩增的不同带型都有一个对应的数字标识，不但简化了SSR带型的记录方式，而且提高了SSR标记扩增条带的可读性，有效避免了人工统计所引起的误差；

3、在确保数字代码唯一性的前提下，实现了尽量使用较少标记组合来构建大豆品种SSR指纹图谱身份证的目的，在实际的推广应用过程中能够显著降低工作量，并且便于后续的品种比对鉴定，不但能够为大豆新品种的快速鉴定和准确评价提供科学、准确、有效的技术支撑，而且对保护和利用种质资源、鉴定种子质量、保护品种权益均具有重要意义。

附图说明

图1 本发明一种实施例中初筛SSR标记在大豆品种中的等位变异特征。

具体实施方式

通过以下实施例进一步描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或者改变都将落入本发明的权利要求范围内。

实施例：吉林省新育成大豆品种SSR指纹图谱身份证的构建

（1）大豆品种基因组DNA的提取

选取吉林省2005-2012年审定的98个大豆品种，利用改进的CTAB法，从0.1g大豆幼嫩叶片中提取基因组DNA，并稀释到10-15 ng/μl，置于-20℃冰箱保存备用。

（2）PCR扩增与聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

PCR扩增反应体系总的体积为20μl，其中含有10-15ng基因组DNA，0.25μmol/l上下游引物，200μmol/l dNTPs，0.5 U Taq酶（TaKaRa），1×PCR缓冲液（10 mmol/l Tris–HCl,pH 8.3; 50 mmol/l KCl; 1.5 mmol/l MgCl2）。PCR扩增反应程序为94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；72℃延伸10min。PCR扩增反应结束后，在扩增产物中加入3 μl上样缓冲液（36% 甘油，30 mmol/l EDTA，0.05%溴酚蓝，0.035%二甲苯青），取2.5μl在12%非变性聚丙烯酰胺凝胶中恒压电泳分离，硝酸银染色显影检测。

（3）SSR标记的初步筛选

根据SoyBase网站提供的SSR标记引物序列，选取均匀分布在大豆20个连锁群上的320个SSR标记，先利用20个大豆品种进行SSR标记的初步筛选，获得12个扩增稳定、条带清晰、多态性高的标记（图1），这12个SSR标记为Satt397、Satt235、Satt422、Sat_128、Satt160、Satt367、Sat155、Satt448、Sat_245、Satt494、Sat_288、Sat_351。利用POPGENE1.31 统计软件计算每个SSR标记的等位变异数和多样性指数（表1）。

（4）大豆品种SSR指纹图谱身份证构建所需核心标记的确定

为了达到用最少SSR标记区分最多品种的目的，以初筛获得的12个SSR标记的多样性指数高低为选择依据，首先从多样性指数最高的标记Satt422开始筛选品种，但无任何品种能够被区分开；再加入多样性指数第二高的标记Sat_351，结果发现能够区分开10个品种；再加入多样性指数第三高的标记Satt160，结果有49个品种能够被区分开；再加入多样性指数第四高的标记Sat_128，结果发现能够区分开72个品种；再加入多样性指数第五高的标记Sat155，结果发现能够区分开84个品种；再加入多样性指数第六高的标记Satt397，结果发现能够区分开94个品种；最后加入多样性指数第七高的标记Sat_245，结果发现全部98个品种都能够被区分开（表2）。因此，将Satt422、Sat_351、Satt160、Sat_128、Sat155、Satt397、Sat_245这7个SSR标记确定为大豆品种SSR指纹图谱身份证构建所需的核心标记。

（5）大豆品种SSR指纹图谱身份证的构建

记录7个核心SSR标记在98个大豆品种中PCR扩增后获得的整体带型，并对这些带型进行数字编码。以Satt422标记为例，其具有3个等位变异（表1），即PCR扩增后其在大豆品种中具有3种带型，这3种带型按从简单到复杂次序排列，依次被编码为1、2、3。以同样方式，对其他核心SSR标记扩增后的整体带型进行数字编码。

对于每一个大豆品种，7个核心SSR标记将赋予该品种7个带型编码，再按照固定的SSR标记顺序（依次为Satt422、Sat_351、Satt160、Sat_128、Sat155、Satt397、Sat_245）串联这7个带型编码，即可形成一组由7个数字排列成的数据，也就是各品种指纹图谱身份证代码（表3）。以表3中的吉育202为例，其指纹图谱身份证代码为3213311，其表示第1个SSR核心标记（Satt422）的扩增带型为3号带型，第2个SSR核心标记（Sat_351）的扩增带型为2号带型，第3个SSR核心标记（Satt160）的扩增带型为1号带型，第4个SSR核心标记（Sat_128）的扩增带型为3号带型，第5个SSR核心标记（Sat155）的扩增带型为3号带型，第6个SSR核心标记（Satt397）的扩增带型为1号带型，第7个SSR核心标记（Sat_245）的扩增带型为1号带型。

所述的12个SSR标记（含7个核心SSR标记）的引物序列如下：

表3 98个大豆品种的SSR指纹图谱身份证代码

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Claims (3)

1.大豆品种SSR指纹图谱身份证的构建方法，其特征在于，构建的具体步骤如下：

1)大豆品种基因组DNA的提取：利用改进的CTAB法，从0.1g大豆幼嫩叶片中提取基因DNA，并稀释到10-15 ng/μL，置于-20℃冰箱保存备用；

2) SSR标记的初步筛选：选取均匀分布在大豆20个连锁群上的320个SSR标记，通过PCR扩增与非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，进行SSR标记的初步筛选，获得12 个扩增稳定、条带清晰、多态性高的SSR标记，即为Satt397、Satt235、Sat422、Sat_128、Satt160、Satt367、Sat155、Satt448、Sat_245、Satt494、Sat_288、Sat_351；

3)SSR带型的记录与数据统计分析：根据非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果，记录步骤2)获得的每个SSR标记在大豆品种上扩增出来的整体带型，并统计分析每个SSR标记的多样性指数；

4)大豆品种SSR指纹图谱身份证构建所需核心标记的确定：以多样性指数的高低为选择依据，遂一加入步骤2)获得的初筛SSR标记，直至标记组合能够将大豆品种全部区分开；依据SSR标记多样性指数的高低，首先从多样性指数最高的标记开始筛选大豆品种，再加入多样性指数第二、第三、......高的标记，获得将大豆品种全部区分开的7个SSR标记，即Satt422、Sat_351、Satt160、Sat_128、Sat155、Satt397、Sat_245，将这7个SSR标记确定为大豆品种SSR指纹图谱身份证构建所需的核心标记；

5)大豆品种SSR指纹图谱身份证的构建：记录步骤4)获得的核心SSR标记在大豆品种中PCR扩增后获得的整体带型，并对这些带型进行数字编码，再按照固定的SSR标记顺序串联带型编码，即形成大豆品种的指纹图谱身份证代码；

所述改进的CTAB法中β-巯基乙醇的浓度为2.5%，聚乙烯吡咯烷酮PVP40的浓度为5%，氯仿抽提时苯酚的pH为4.0；

所述PCR扩增时使用的对应引物如下表所示：

SSR标记 大豆连锁群位置 上游引物序列 下游引物序列 Satt422 C2 ATTAGGGGAGGGGAGGTAAAAAGT TGAAGGCCCGATATCCAAATAAA Sat_351 D1b GCGCCACCCAAGGGCATCTTTCG GCGGGCCGCAACTATGAAAAGAC Satt160 F TCCCACACAGTTTTCATATAATATA CATCAAAAGTTTATAACGTGTAGAT Sat_128 B1 GGGGTTTTGTTAATCATTGTCCTTAGAT GGGAGAAAATTTTTAATGCCAGTAGTTA Sat155 A1 AGATCCAACACCTGGCCTAAT GCTGCACAATTCATTCCATTT Satt397 D2 TCTCGGGATCCTTGTTAGAT GCGAAGAAGAAGAGAACATGTGAA Sat_245 L GCGAGCCTACTTTTACTAGAACGTCAACAAG GCGAAAAATTCAACTCCCCTTTAATAGATTC Satt235 G GCGGGCTTTGCCAAGAAGTTT GCGGTGAGGCTGGCTATAAG Satt367 I GCGGATATGCCACTTCTCTCGTGAC GCGGAATAGTTGCCAAACAATAATC Satt448 L GCGCTAAGGGCAATTTTATTCAA GCGCAGCCTGTTCAGTTTTTCTTTTGTC Satt494 M GGCCGGTTCTCATTACAGGTCTCT GGATTTCCATCTTGAATTTTATTA Sat_288 M GCGACAGACTGCAAGAATTGATGTAAATCT GCGGGAAGGTAGGTTAAAGAAAATTCAAATGA

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2.根据权利要求1所述的大豆品种SSR指纹图谱身份证的构建方法，其特征在于，所述SSR带型进行记录与数据统计分析时，记录每个SSR标记在大豆品种上扩增出来的整体带型，并作为一个等位变异，然后将每个SSR标记在大豆品种上扩增出来的全部带型按从简到繁的次序排列，顺次记录为1、2、...、 n，最后的结果是每一种SSR带型都被一个数字所赋值。

3.一种大豆品种SSR指纹图谱身份证的构建方法，其特征在于，利用改进的CTAB法，从0.1g大豆幼嫩叶片中提取基因DNA，并稀释到10-15 ng/μL，置于-20℃冰箱保存备用；记录PCR扩增后7个核心SSR标记在大豆品种中的整体带型，并将带型按从简单到复杂次序排列，依次被编码为1、2、...、n，最后对于每一个品种，7个核心SSR标记都将赋予该品种7个带型编码，再按照固定的SSR标记顺序，依次为Satt422、Sat_351、Satt160、 Sat_128、Sat155、Satt397、Sat_245，串联这7个带型编码，形成一组由7个数字排列成的数据，即大豆品种的SSR指纹图谱身份证代码；

所述改进的CTAB法中β-巯基乙醇的浓度为2.5%，聚乙烯吡咯烷酮PVP40的浓度为5%，氯仿抽提时苯酚的pH为4.0；

所述PCR扩增时使用的对应引物如下表所示：

SSR标记 大豆连锁群位置 上游引物序列 下游引物序列 Satt422 C2 ATTAGGGGAGGGGAGGTAAAAAGT TGAAGGCCCGATATCCAAATAAA Sat_351 D1b GCGCCACCCAAGGGCATCTTTCG GCGGGCCGCAACTATGAAAAGAC Satt160 F TCCCACACAGTTTTCATATAATATA CATCAAAAGTTTATAACGTGTAGAT Sat_128 B1 GGGGTTTTGTTAATCATTGTCCTTAGAT GGGAGAAAATTTTTAATGCCAGTAGTTA Sat155 A1 AGATCCAACACCTGGCCTAAT GCTGCACAATTCATTCCATTT Satt397 D2 TCTCGGGATCCTTGTTAGAT GCGAAGAAGAAGAGAACATGTGAA Sat_245 L GCGAGCCTACTTTTACTAGAACGTCAACAAG GCGAAAAATTCAACTCCCCTTTAATAGATTC Satt235 G GCGGGCTTTGCCAAGAAGTTT GCGGTGAGGCTGGCTATAAG Satt367 I GCGGATATGCCACTTCTCTCGTGAC GCGGAATAGTTGCCAAACAATAATC Satt448 L GCGCTAAGGGCAATTTTATTCAA GCGCAGCCTGTTCAGTTTTTCTTTTGTC Satt494 M GGCCGGTTCTCATTACAGGTCTCT GGATTTCCATCTTGAATTTTATTA Sat_288 M GCGACAGACTGCAAGAATTGATGTAAATCT GCGGGAAGGTAGGTTAAAGAAAATTCAAATGA

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