CN115011715A

CN115011715A - 一种基于ssr分子标记构建小豆的指纹图谱

Info

Publication number: CN115011715A
Application number: CN202210416571.8A
Authority: CN
Inventors: 杜吉到; 张琦; 任心雨; 张文静; 韩金鹏; 唐钰鑫; 褚多; 马悦; 张欣林; 李思琪; 杨一鸣; 吴贵生; 耿思琦
Original assignee: Heilongjiang Bayi Agricultural University
Current assignee: Heilongjiang Bayi Agricultural University
Priority date: 2022-04-20
Filing date: 2022-04-20
Publication date: 2022-09-06
Anticipated expiration: 2042-04-20
Also published as: CN115011715B

Abstract

本发明公开了一种基于SSR分子标记构建小豆的指纹图谱，涉及植物品种鉴别技术领域。所述分子标记包括VaSSR01‑VaSSR13，分别通过如SEQ ID NO：1‑26所示的引物对扩增得到。本发明还公开了如SEQ ID NO：1‑SEQ ID NO：26所示的引物组合、包括该引物组合的试剂盒以及小豆的指纹图谱的构建方法，通过构建的DNA指纹图谱构建成小豆的指纹图谱，该指纹图谱可以100％准确鉴定不同品种的小豆，检测效果好且节约时间、成本等优点，本发明可为小豆品种DNA指纹鉴定提供技术支持。

Description

一种基于SSR分子标记构建小豆的指纹图谱

技术领域

本发明涉及植物品种鉴别领域，特别是涉及一种基于SSR分子标记构建小豆的指纹图谱。

背景技术

小豆(Vigna angularis)起源于中国，隶属于豇豆属(Vigna)栽培种的一种。我国种植小豆至少已有2000多年的历史。小豆属于杂粮，小豆除富含蛋白质、维生素、矿质元素等营养物质外，适当的食用小豆有利尿消肿的作用，是广受欢迎的医食两用作物。我国的小豆种质资源丰富，截至2008年，国家种质库保存量近5000份，由于不同地区之间品种交流频繁，从而导致了其种类和品种繁多，来源较为复杂，存在大量“同名异种”和“一品多名”种质。小豆品种混乱、真假难辨，许多生产者不能区分出当地种植的品种，小豆种子生产者能否生产出优质高产的小豆品质无法得到保障，从而造成严重损失。多年来，品种鉴定是以形态学标记为依据的。这种方法虽然简单经济，但周期长，花费大，受季节限制，而且很多性状的表现受栽培措施及环境因子影响，从而制约了鉴定的准确性。DNA分子标记技术则具有高效、准确、不受环境条件影响、实验操作简单等优点，已广泛应用于植物品种真实性鉴定及纯度检测研究。SSR标记是近年来发展起来的建立在PCR基础上的第二代分子标记。由于SSR分子标记具有数量丰富、多态性高、遗传共显性、谱带扩增稳定、精度高、检测时间短、技术成熟等特点，已应用于作物遗传学研究。目前，小豆中也有利用分子标记技术进行研究的，但是没有具体只针对小豆品种开发的SSR分子标记以及利用SSR分子标记构建的技术体系。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于SSR分子标记构建小豆的指纹图谱，以解决上述现有技术存在的问题，本发明构建的指纹图谱能够准确鉴别不同品种的小豆。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种用于鉴别小豆的分子标记组合，所述分子标记包括VaSSR01、VaSSR02、VaSSR03、VaSSR04、VaSSR05、VaSSR06、VaSSR07、VaSSR08、VaSSR09、VaSSR10、VaSSR11、VaSSR12和VaSSR13；所述VaSSR01通过如SEQ ID NO：1-2所示引物对扩增得到，所述VaSSR02通过如SEQ ID NO：3-4所示引物对扩增得到，所述VaSSR03通过如SEQ ID NO：5-6所示引物对扩增得到，所述VaSSR04通过如SEQ ID NO：7-8所示引物对扩增得到，所述VaSSR05通过如SEQ ID NO：9-10所示引物对扩增得到，所述VaSSR06通过如SEQ ID NO：11-12所示引物对扩增得到，所述VaSSR07通过如SEQ ID NO：13-14所示引物对扩增得到，所述VaSSR08通过如SEQ ID NO：15-16所示引物对扩增得到，所述VaSSR09通过如SEQ ID NO：17-18所示引物对扩增得到，所述VaSSR10通过如SEQ ID NO：19-20所示引物对扩增得到，所述VaSSR11通过如SEQ ID NO：21-22所示引物对扩增得到，所述VaSSR12通过如SEQ ID NO：23-24所示引物对扩增得到，所述VaSSR13通过如SEQ ID NO：25-26所示引物对扩增得到。

本发明还提供一种用于鉴别小豆的引物组合，包括13对特异性引物对，所述引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：26所示。

本发明还提供一种用于鉴别小豆的试剂盒，包含上述的引物组合。

本发明还提供一种小豆指纹图谱的构建方法，包括：采集不同生长习性的小豆并进行编号，利用上述的引物组合对不同品种小豆的DNA进行PCR扩增，再对扩增产物进行电泳检测，根据电泳检测结果构建所述小豆指纹图谱。

进一步地，小豆品种包括资源库号为XD017的北23、资源库号为XD021的北26、资源库号为XD035的山东枣庄农家种、资源库号为XD036的宝清红、资源库号为XD045的LZX031、资源库号为XD050的LZX051、资源库号为XD053的红小豆、资源库号为XD054的LZX063、资源库号为XD075的红珍珠、资源库号为XD084的HD2、资源库号为XD099的FBX01、资源库号为XD113的FJMS01、资源库号为XD116的FLD01、资源库号为XD120的天津红、资源库号为XD128的A485、资源库号为XD130的杂豆、资源库号为XD132的红小豆1-1、资源库号为XD143的保876-16、资源库号为XD166的红小豆、资源库号为XD178的H05、资源库号为XD180的H06、资源库号为XD182的H07、资源库号为XD184的冀红9218、资源库号为XD188的H09-1、资源库号为XD199的H14-1。

进一步地，所述PCR扩增的反应体系为：DNA模板0.8μL，l0pmo1/L上游引物0.2μL，10pmo1/L下游引物0.2μL，10×PCRbuffer 2μL，25mmol/LMg²⁺1.2μL，10mmol/L dNTP 0.5μL，5U/μLTaq酶0.2μL，ddH₂O 14.4μL；所述PCRbuffer不含Mg²⁺。

进一步地，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。

本发明还提供上述的分子标记组合、引物组合或试剂盒在获取小豆指纹图谱中的应用。

本发明还提供上述的分子标记组合、引物组合、试剂盒或构建方法在鉴别小豆品种中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明公开了用于鉴别小豆的分子标记组合，仅利用13对小豆引物对即能扩增出上述的分子标记组合，进而能够将小豆品种有效鉴别，鉴别准确率高达100％。因此，本发明公开的分子标记组合和引物组合在进一步鉴别大量小豆品种方面具有很大潜力，与现有常规形态鉴定相比，具有效果更佳，且节约时间、成本等优点，本发明可为小豆品种DNA指纹鉴定提供技术支持。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为兼用检测记录DNA指纹图谱的方式，其中M为Marker，01-25为25份小豆材料的电泳带型图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1小豆指纹图谱的构建方法

1、实验材料

以25份小豆品种作为样本材料，根据开发的SSR分子标记构建小豆品种的指纹数据，以达到品种鉴定的目的。

25种小豆品种信息如表1所示。以下实施例中小豆品种名称及资源库号均来自于国家杂粮工程技术研究中心种质资源库。

表1 25种小豆品种信息

2、不同品种小豆标准DNA指纹图谱库的构建

2.1小豆各品种总DNA提取

将小豆种植于土壤中，室温培养，长出10-15d天后取小豆幼叶在液氮冷冻后于-80℃保存备用。取各品种小豆幼嫩的叶片0.2g于1.5m离心管中，加入液氮研磨成粉末。采用试剂盒法提取DNA，操作实验步骤按照试剂盒说明书进行。用琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测总DNA的质量，然后将总DNA稀释成100ng/μL，储存于-20℃备用。

2.2引物的筛选

a.SSR标记合成：由生物公司合成SSR分子标记的扩增引物，引物合成的纯度要求为PAGE纯化，并分装成10D/管，把上、下游引物的浓度均稀释成10pmol/L。

b.SSR分子标记引物组合的筛选方法

步骤一，筛选引物：筛选出在不同小豆品种间具有多态性、带型清晰且能够稳定重复的SSR初筛引物。

通过筛选获得以下引物，其标记、引物名称、位置如表2所示。

表2引物标记名称

c.SSR标记扩增引物组合的筛选

以小豆品种为材料，利用合成的SSR分子标记的扩增引物(如表3)分别对各小豆品种的DNA进行PCR扩增，PCR反应试验中采用的PCR反应体系为20μL体系：DNA模板0.8μL，F-primer(10pmol/L)0.2μL，R-primer(10pmol/L)0.2μL，10×PCRbuffer(不含Mg²⁺)2μL，Mg²⁺(25mmo1/L)1.2μL，dNTP(10mmol/L)0.5μL，Taq酶(5U/μL)0.2μL，ddH₂O 14.4μL，总计20.0μL。

PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。

d.凝胶电泳及Gel-red显色

扩增产物采用10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳在Sequi-Gen GT核酸电泳系统(Bio-Rad，USA)中进行。

显色：利用Gelred固定30min，放入凝胶成像(Bio-red)中照相记录，根据标准DNA分子量和引物的迁移率记录电泳结果，每对引物迁移率最大的条带记为1，迁移率次之的记为2，依次类推，无条带记为0，建立SSR基因型信息数据，按照引物顺序进行编码，得到的指纹代码即为该品种的特征指纹图谱；记录方式如图1所示。

3.3小豆DNA特征指纹图谱的构建

表3 25份小豆材料分子标记指纹代码

序号	名称	资源库号	指纹代码
				1	北26	XD021	1111211212121
2	北23	XD017	1121111211111
				3	LZX031	XD045	1111221112111
4	LZX051	XD050	2111121122221
				5	红小豆(张地营子村)	XD053	2111122111121
6	山东枣庄农家种	XD035	1121111111112
				7	宝清红	XD036	2122121222211
8	红小豆1-1	XD132	2121112122111
				9	LZX063	XD054	2111222111221
10	红珍珠	XD075	2111221121211
				11	HD2	XD084	2112221121121
12	FBX01	XD099	1211111121212
				13	FJMS01	XD113	1211121121211
14	FLD01	XD116	1111222111122
				15	天津红	XD120	1211212211212
16	A485	XD128	1211222111211
				17	杂豆	XD130	1112212131111
18	红小豆	XD166	1212121111111
				19	H05	XD178	1111222112211
20	H06	XD180	1111111112112
				21	H07	XD182	2211222112211
22	冀红9218	XD184	1212222112211
				23	H09-1	XD188	1112222122211
24	H14-1	XD199	1212211212222
				25	保876-16	XD143	1121222111112

由表3可得出结论，任意两个品种的DNA分子标记指纹图谱都不相同，可判断出25份供试小豆品种是不同的品种，且所对应的DNA分子指纹代码是该品种所特有的指纹。

结果表明，13对引物组合可用于鉴定小豆品种的遗传特征，保护这些品种权免受侵犯。

本发明利用上述技术体系和筛选出的13对小豆SSR多态性引物，构建了25个小豆DNA指纹图谱，可把25个小豆品种区分开，将为小豆的鉴定和品种权保护提供技术支撑。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 黑龙江八一农垦大学

<120> 一种基于SSR分子标记构建小豆的指纹图谱

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggacactggt tatgaattgt gact 24

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ataggttagt ctctcggtcc aca 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaccctcatg ctatcacatg cta 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtggaccat tgtgttaatg agc 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcgaagaaaa gcataactgg gtt 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gatgtaacta tggaagcagg cct 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcgcctgatt ttgttgactg ata 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtcgttggat ctttgtcgga aaa 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggcgagacaa aaattcctgg aaa 23

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggaggtttgt tcttgaagct ttca 24

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aggaaaacag tgggttaagg gta 23

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ctcacatgca tcaacttcca ctg 23

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gtcgatatgt ttcagaaggg tgc 23

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

acctctaaca gcttcccttc ttg 23

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atctgctcca atctccgtac ttc 23

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

agcatcagcc tcaattcatg gta 23

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gctttcccat aacaatggca tgt 23

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cgttgtatgt gcatgtgaac agt 23

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

aaatgggcat tatgtgtgtg tgg 23

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gcacctcgtt tgttctctct ttc 23

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gaagcacaag caccatttta cct 23

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ccattagttt ggtccatatc ttccg 25

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cttgtcggtc acttatttac gcc 23

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ttcagtccca tgacgatgtc ttt 23

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

aaatagcaga gcaaggaggg aaa 23

Claims

1.一种用于鉴别小豆的分子标记组合，其特征在于，所述分子标记包括VaSSR01、VaSSR02、VaSSR03、VaSSR04、VaSSR05、VaSSR06、VaSSR07、VaSSR08、VaSSR09、VaSSR10、VaSSR11、VaSSR12和VaSSR13；所述VaSSR01通过如SEQ ID NO：1-2所示引物对扩增得到，所述VaSSR02通过如SEQ ID NO：3-4所示引物对扩增得到，所述VaSSR03通过如SEQ ID NO：5-6所示引物对扩增得到，所述VaSSR04通过如SEQ ID NO：7-8所示引物对扩增得到，所述VaSSR05通过如SEQ ID NO：9-10所示引物对扩增得到，所述VaSSR06通过如SEQ ID NO：11-12所示引物对扩增得到，所述VaSSR07通过如SEQ ID NO：13-14所示引物对扩增得到，所述VaSSR08通过如SEQ ID NO：15-16所示引物对扩增得到，所述VaSSR09通过如SEQ ID NO：17-18所示引物对扩增得到，所述VaSSR10通过如SEQ ID NO：19-20所示引物对扩增得到，所述VaSSR11通过如SEQ ID NO：21-22所示引物对扩增得到，所述VaSSR12通过如SEQ ID NO：23-24所示引物对扩增得到，所述VaSSR13通过如SEQ ID NO：25-26所示引物对扩增得到。

2.一种用于鉴别小豆的引物组合，其特征在于，包括13对特异性引物对，所述引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：26所示。

3.一种用于鉴别小豆的试剂盒，其特征在于，包含权利要求2所示的引物组合。

4.一种小豆指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括：采集不同生长习性的小豆并进行编号，利用权利要求2所述的引物组合对不同品种小豆的DNA进行PCR扩增，再对扩增产物进行电泳检测，根据电泳检测结果构建所述小豆指纹图谱。

5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，小豆品种包括资源库号为XD017的北23、资源库号为XD021的北26、资源库号为XD035的山东枣庄农家种、资源库号为XD036的宝清红、资源库号为XD045的LZX031、资源库号为XD050的LZX051、资源库号为XD053的红小豆、资源库号为XD054的LZX063、资源库号为XD075的红珍珠、资源库号为XD084的HD2、资源库号为XD099的FBX01、资源库号为XD113的FJMS01、资源库号为XD116的FLD01、资源库号为XD120的天津红、资源库号为XD128的A485、资源库号为XD130的杂豆、资源库号为XD132的红小豆1-1、资源库号为XD143的保876-16、资源库号为XD166的红小豆、资源库号为XD178的H05、资源库号为XD180的H06、资源库号为XD182的H07、资源库号为XD184的冀红9218、资源库号为XD188的H09-1、资源库号为XD199的H14-1。

6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：DNA模板0.8μL，l0pmo1/L上游引物0.2μL，10pmo1/L下游引物0.2μL，10×PCR buffer 2μL，25mmol/LMg²⁺1.2μL，10mmol/L dNTP 0.5μL，5U/μL Taq酶0.2μL，ddH₂O 14.4μL；所述PCR buffer不含Mg²⁺。

7.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。

8.根据权利要求1所述的分子标记组合、权利要求2所述的引物组合或权利要求3所述的试剂盒在获取小豆指纹图谱中的应用。

9.根据权利要求1所述的分子标记组合、权利要求2所述的引物组合、权利要求3所述的试剂盒或权利要求4-7任一项所述的构建方法在鉴别小豆品种中的应用。