CN103254311B - 一种制备抗体-美登素类生物碱药物偶联物的方法 - Google Patents
一种制备抗体-美登素类生物碱药物偶联物的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103254311B CN103254311B CN201310168886.6A CN201310168886A CN103254311B CN 103254311 B CN103254311 B CN 103254311B CN 201310168886 A CN201310168886 A CN 201310168886A CN 103254311 B CN103254311 B CN 103254311B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antibody
- chromatography
- desalination
- reaction
- buffer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 25
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 claims abstract description 61
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 46
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims abstract description 34
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 claims abstract description 27
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 claims abstract description 20
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 claims abstract description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 20
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 53
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 51
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims description 40
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 40
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 34
- WSTYNZDAOAEEKG-GWJSGULQSA-N tingenone Chemical class CC1=C(O)C(=O)C=C2[C@@](CC[C@]3([C@@H]4C[C@H](C(C[C@@]4(CC[C@@]33C)C)=O)C)C)(C)C3=CC=C21 WSTYNZDAOAEEKG-GWJSGULQSA-N 0.000 claims description 32
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 30
- IADUWZMNTKHTIN-MLSWMBHTSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-[[3-[3-[[(2S)-1-[[(1S,2R,3S,5S,6S,16E,18E,20R,21S)-11-chloro-21-hydroxy-12,20-dimethoxy-2,5,9,16-tetramethyl-8,23-dioxo-4,24-dioxa-9,22-diazatetracyclo[19.3.1.110,14.03,5]hexacosa-10,12,14(26),16,18-pentaen-6-yl]oxy]-1-oxopropan-2-yl]-methylamino]-3-oxopropyl]sulfanyl-2,5-dioxopyrrolidin-1-yl]methyl]cyclohexane-1-carboxylate Chemical compound CO[C@@H]1\C=C\C=C(C)\Cc2cc(OC)c(Cl)c(c2)N(C)C(=O)C[C@H](OC(=O)[C@H](C)N(C)C(=O)CCSC2CC(=O)N(CC3CCC(CC3)C(=O)ON3C(=O)CCC3=O)C2=O)[C@]2(C)O[C@H]2[C@H](C)[C@@H]2C[C@@]1(O)NC(=O)O2 IADUWZMNTKHTIN-MLSWMBHTSA-N 0.000 claims description 29
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims description 23
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 claims description 17
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 16
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 claims description 15
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 14
- 229940022353 herceptin Drugs 0.000 claims description 12
- WSTYNZDAOAEEKG-UHFFFAOYSA-N Mayol Natural products CC1=C(O)C(=O)C=C2C(CCC3(C4CC(C(CC4(CCC33C)C)=O)C)C)(C)C3=CC=C21 WSTYNZDAOAEEKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- WSTYNZDAOAEEKG-QSPBTJQRSA-N Maytenin Natural products CC1=C(O)C(=O)C=C2[C@@](CC[C@@]3([C@@H]4C[C@H](C(C[C@@]4(CC[C@]33C)C)=O)C)C)(C)C3=CC=C21 WSTYNZDAOAEEKG-QSPBTJQRSA-N 0.000 claims description 11
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 10
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000013019 capto adhere Substances 0.000 claims description 9
- PCLIMKBDDGJMGD-UHFFFAOYSA-N N-bromosuccinimide Chemical compound BrN1C(=O)CCC1=O PCLIMKBDDGJMGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 8
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims description 8
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 5
- 229960005395 cetuximab Drugs 0.000 claims description 5
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 claims description 5
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 claims description 5
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 claims description 4
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 claims description 4
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 4
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 4
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 claims description 4
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 claims description 3
- IHVODYOQUSEYJJ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 6-[[4-[(2,5-dioxopyrrol-1-yl)methyl]cyclohexanecarbonyl]amino]hexanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCCCNC(=O)C(CC1)CCC1CN1C(=O)C=CC1=O IHVODYOQUSEYJJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- HVUMOYIDDBPOLL-UHFFFAOYSA-N 2-(3,4-Dihydroxyoxolan-2-yl)-2-hydroxyethyl octadecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)C1OCC(O)C1O HVUMOYIDDBPOLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 claims description 2
- 229920001219 Polysorbate 40 Polymers 0.000 claims description 2
- 229920001214 Polysorbate 60 Polymers 0.000 claims description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 2
- IYFATESGLOUGBX-YVNJGZBMSA-N Sorbitan monopalmitate Chemical group CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O IYFATESGLOUGBX-YVNJGZBMSA-N 0.000 claims description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 claims description 2
- 239000013622 capto Q Substances 0.000 claims description 2
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 claims description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims description 2
- NZNMSOFKMUBTKW-UHFFFAOYSA-M cyclohexanecarboxylate Chemical compound [O-]C(=O)C1CCCCC1 NZNMSOFKMUBTKW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 claims description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims description 2
- 239000000249 polyoxyethylene sorbitan monopalmitate Substances 0.000 claims description 2
- 235000010483 polyoxyethylene sorbitan monopalmitate Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000001818 polyoxyethylene sorbitan monostearate Substances 0.000 claims description 2
- 235000010989 polyoxyethylene sorbitan monostearate Nutrition 0.000 claims description 2
- 229940101027 polysorbate 40 Drugs 0.000 claims description 2
- 229940113124 polysorbate 60 Drugs 0.000 claims description 2
- 239000008362 succinate buffer Substances 0.000 claims description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 claims 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 abstract description 18
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 abstract description 14
- 230000008878 coupling Effects 0.000 abstract description 12
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 abstract description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 4
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 abstract description 3
- WKPWGQKGSOKKOO-RSFHAFMBSA-N maytansine Chemical class CO[C@@H]([C@@]1(O)C[C@](OC(=O)N1)([C@H]([C@@H]1O[C@@]1(C)[C@@H](OC(=O)[C@H](C)N(C)C(C)=O)CC(=O)N1C)C)[H])\C=C\C=C(C)\CC2=CC(OC)=C(Cl)C1=C2 WKPWGQKGSOKKOO-RSFHAFMBSA-N 0.000 abstract description 3
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 73
- 239000000611 antibody drug conjugate Substances 0.000 description 13
- 229940049595 antibody-drug conjugate Drugs 0.000 description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- OPQNCARIZFLNLF-UHFFFAOYSA-N ansamitocin P-3 Natural products CN1C(=O)CC(OC(=O)C(C)C)C2(C)OC2C(C)C(OC(=O)N2)CC2(O)C(OC)C=CC=C(C)CC2=CC(OC)=C(Cl)C1=C2 OPQNCARIZFLNLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OPQNCARIZFLNLF-JBHFWYGFSA-N ansamitocin P3 Chemical compound CO[C@@H]([C@@]1(O)C[C@H](OC(=O)N1)[C@@H](C)[C@@H]1O[C@@]1(C)[C@@H](OC(=O)C(C)C)CC(=O)N1C)\C=C\C=C(C)\CC2=CC(OC)=C(Cl)C1=C2 OPQNCARIZFLNLF-JBHFWYGFSA-N 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 4
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 4
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 4
- 241000239218 Limulus Species 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 3
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000001630 Pyrus pyrifolia var culta Nutrition 0.000 description 2
- 240000002609 Pyrus pyrifolia var. culta Species 0.000 description 2
- PVNFMCBFDPTNQI-UIBOPQHZSA-N [(1S,2R,5S,6S,16E,18E,20R,21S)-11-chloro-21-hydroxy-12,20-dimethoxy-2,5,9,16-tetramethyl-8,23-dioxo-4,24-dioxa-9,22-diazatetracyclo[19.3.1.110,14.03,5]hexacosa-10,12,14(26),16,18-pentaen-6-yl] acetate [(1S,2R,5S,6S,16E,18E,20R,21S)-11-chloro-21-hydroxy-12,20-dimethoxy-2,5,9,16-tetramethyl-8,23-dioxo-4,24-dioxa-9,22-diazatetracyclo[19.3.1.110,14.03,5]hexacosa-10,12,14(26),16,18-pentaen-6-yl] 3-methylbutanoate [(1S,2R,5S,6S,16E,18E,20R,21S)-11-chloro-21-hydroxy-12,20-dimethoxy-2,5,9,16-tetramethyl-8,23-dioxo-4,24-dioxa-9,22-diazatetracyclo[19.3.1.110,14.03,5]hexacosa-10,12,14(26),16,18-pentaen-6-yl] 2-methylpropanoate [(1S,2R,5S,6S,16E,18E,20R,21S)-11-chloro-21-hydroxy-12,20-dimethoxy-2,5,9,16-tetramethyl-8,23-dioxo-4,24-dioxa-9,22-diazatetracyclo[19.3.1.110,14.03,5]hexacosa-10,12,14(26),16,18-pentaen-6-yl] propanoate Chemical compound CO[C@@H]1\C=C\C=C(C)\Cc2cc(OC)c(Cl)c(c2)N(C)C(=O)C[C@H](OC(C)=O)[C@]2(C)OC2[C@H](C)[C@@H]2C[C@@]1(O)NC(=O)O2.CCC(=O)O[C@H]1CC(=O)N(C)c2cc(C\C(C)=C\C=C\[C@@H](OC)[C@@]3(O)C[C@H](OC(=O)N3)[C@@H](C)C3O[C@@]13C)cc(OC)c2Cl.CO[C@@H]1\C=C\C=C(C)\Cc2cc(OC)c(Cl)c(c2)N(C)C(=O)C[C@H](OC(=O)C(C)C)[C@]2(C)OC2[C@H](C)[C@@H]2C[C@@]1(O)NC(=O)O2.CO[C@@H]1\C=C\C=C(C)\Cc2cc(OC)c(Cl)c(c2)N(C)C(=O)C[C@H](OC(=O)CC(C)C)[C@]2(C)OC2[C@H](C)[C@@H]2C[C@@]1(O)NC(=O)O2 PVNFMCBFDPTNQI-UIBOPQHZSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000481 chemical toxicant Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002346 endotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 description 2
- UOWVMDUEMSNCAV-WYENRQIDSA-N rachelmycin Chemical compound C1([C@]23C[C@@H]2CN1C(=O)C=1NC=2C(OC)=C(O)C4=C(C=2C=1)CCN4C(=O)C1=CC=2C=4CCN(C=4C(O)=C(C=2N1)OC)C(N)=O)=CC(=O)C1=C3C(C)=CN1 UOWVMDUEMSNCAV-WYENRQIDSA-N 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- QWPXBEHQFHACTK-KZVYIGENSA-N (10e,12e)-86-chloro-12,14,4-trihydroxy-85,14-dimethoxy-33,2,7,10-tetramethyl-15,16-dihydro-14h-7-aza-1(6,4)-oxazina-3(2,3)-oxirana-8(1,3)-benzenacyclotetradecaphane-10,12-dien-6-one Chemical compound CN1C(=O)CC(O)C2(C)OC2C(C)C(OC(=O)N2)CC2(O)C(OC)\C=C\C=C(C)\CC2=CC(OC)=C(Cl)C1=C2 QWPXBEHQFHACTK-KZVYIGENSA-N 0.000 description 1
- STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 7-Cyan-hept-2t-en-4,6-diinsaeure Natural products C1=2C(O)=C3C(=O)C=4C(OC)=CC=CC=4C(=O)C3=C(O)C=2CC(O)(C(C)=O)CC1OC1CC(N)C(O)C(C)O1 STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000257465 Echinoidea Species 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 229930126263 Maytansine Natural products 0.000 description 1
- QWPXBEHQFHACTK-UHFFFAOYSA-N Maytansinol Natural products CN1C(=O)CC(O)C2(C)OC2C(C)C(OC(=O)N2)CC2(O)C(OC)C=CC=C(C)CC2=CC(OC)=C(Cl)C1=C2 QWPXBEHQFHACTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001441512 Maytenus serrata Species 0.000 description 1
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 1
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 1
- 229940121849 Mitotic inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 229940123237 Taxane Drugs 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 1
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 1
- 231100000196 chemotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002604 chemotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229960000975 daunorubicin Drugs 0.000 description 1
- STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N daunorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(C)=O)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- AMRJKAQTDDKMCE-UHFFFAOYSA-N dolastatin Chemical compound CC(C)C(N(C)C)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)N(C)C(C(C)C)C(OC)CC(=O)N1CCCC1C(OC)C(C)C(=O)NC(C=1SC=CN=1)CC1=CC=CC=C1 AMRJKAQTDDKMCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930188854 dolastatin Natural products 0.000 description 1
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 231100000284 endotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000005918 in vitro anti-tumor Effects 0.000 description 1
- 230000005917 in vivo anti-tumor Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 1
- 239000003123 plant toxin Substances 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- XPFJYKARVSSRHE-UHFFFAOYSA-K trisodium;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O XPFJYKARVSSRHE-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明涉及一种制备抗体-美登素类生物碱药物偶联物的方法。该方法包括：抗体置换至反应缓冲液中，双功能连接剂-美登素生物碱用有机溶剂溶解制得美登素生物碱药物的母液；按比例将置换的抗体与美登素生物碱母液混合，进行偶联反应，反应温度20～30℃，反应时间1～4小时；反应液进行阴离子交换层析，收集的流穿液进行SephadexTMG25脱盐层析柱纯化，收集第一个出峰样品，即为所制备的抗体-美登素生物碱类药物偶联物。本发明方法制得的抗体-美登素类生物碱药物偶联物具有合适的偶联率、高的纯度和低的内毒素含量。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗体-美登素生物碱类药物偶联物的制备方法，属于生物技术领域。
背景技术
随着靶向治疗药物的开发，癌症的治疗取得了显著的进步。近几年来，研究人员利用癌细胞表面选择性表达的细胞受体和抗原，开发了许多抗体药物，这些抗体可以与肿瘤细胞进行特异性结合。在此基础上，将细胞毒素分子，比如细菌和植物毒素、放射性核素和某些化学治疗药物与抗体进行化学连接，得到抗体-药物偶联物，这类抗体-药物偶联物在与肿瘤细胞结合后释放药物或激活药物的细胞毒活性，将肿瘤细胞杀灭。抗体-药物偶联物的特异性可以降低对正常细胞的毒性，因此提高了药物在患者体内的耐受性。
美登素（Maytansine）首先是由Kupchan等人从东非灌木齿叶美登木（Maytenusserrata）中分离出来。美登素生物碱是一类高度细胞毒性的药物，据研究，它的毒性要比传统的癌症化疗药物如甲氨蝶呤、柔红霉素等的细胞毒性要强100至1000倍，参见US3896111。之后，发现一些微生物也可以产生美登素生物碱，如美登木醇（maytansinol）和美登木醇的C-3酯，参见US4151042。
美登素是有丝分裂抑制剂，已报道，用美登素处理的L1210细胞，导致67%的积累在有丝分裂期，而未被处理的对照细胞显示范围在3.2%至5.8%之间。用海胆卵和蛤卵的研究显示，美登素通过抑制微管蛋白的聚合而干扰微管的形成，从而抑制有丝分裂。参见Remillard，189Science1002-1005（1975）。
由于美登素生物碱的高度细胞毒性，预示它们在治疗癌症中有作用，不过，美登素生物碱的临床试验并不令人满意，主要是由于它们的副作用。对中枢神经系统和胃肠症状的副作用导致患者拒绝进一步治疗，并且美登素生物碱似乎和周围神经病相关，该周围神经病可能是累积的（Issel at207）。
通过制备抗体-美登素生物碱偶联物可以定向将药物传送至靶细胞位点，从而降低对正常组织和细胞的毒性，降低美登素生物碱的副作用。
CN101087611A报道了用不可切割接头连接抗体与美登素生物碱制备的偶联物和用可切割接头连接抗体与美登素生物碱制备的偶联物相比，两者具有相同的体外和体内抗肿瘤活性，但是前者在血浆清除率和毒性方面显示了显著的降低。
US5208020和US5416064等公开了制备抗体-美登素生物碱偶联物的方法，首先用双功能连接剂与单克隆抗体偶联，利用SephadexTM G25色谱柱纯化连接上连接剂的单克隆抗体，再将连接有连接剂的单克隆抗体与过量的含巯基的化学毒素偶联，再次利用SephadexTM G25色谱柱纯化。
CN101087611A也公开了与US5208020、US5416064相同的方式制备抗体-美登素生物碱偶联物的方法，即先将双功能连接剂与单克隆抗体偶联，纯化获得第一混合物，再与化学毒素偶联，进行纯化获得偶联物。利用这种方式获得的抗体-药物偶联物纯度低并且不稳定。例如，CN101087611A实施例中公开的曲妥珠-SMCC-DM1偶联物的纯度只有95%左右，并且蛋白聚体物的含量占到了4.2%以上，这种高聚物的存在在治疗过程中存在引起较高免疫源性的风险。
CN102596922A公开了一种新的双功能连接剂，即在传统的双功能连接剂上并入亲水性的PEG间隔物将其修饰为亲水性连接体。利用这种连接剂偶联得到的抗体-药物偶联物可以允许每个抗体分子偶联最多15个药物分子，从而提高了连接效率。同时，也公开了一种新的抗体-药物偶联的方法，即先将双功能连接剂和化学药物连接，在将其和单克隆抗体连接。利用这种偶联方法减少了偶联中的纯化步骤，提高了产物收率，同时也大大降低了抗体-药物偶联物的异质性。但是，利用该专利文件公开的方案合成亲水性的双功能连接剂是一件比较繁琐的化学反应过程，可能会限制此种双功能连接剂的应用。且CN102596922A公开的偶联方法合成曲妥珠-SMCC-DM1，利用TSK-GEL尺寸排阻层析（流动相含有15%的异丙醇，可以更好的将偶联物单体与聚体分开）分析发现仍然含有高达4%的偶联物聚体。并且，为了获得合适偶联率，即偶联物中药物与抗体的摩尔比，一般需要在反应时加入6-10倍过量的药物，例如，在曲妥珠-SMCC-DM1制备中，需要投入7-9倍过量的药物，一般在7.5-8.5倍之间，使成本增加。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种高偶联效率制备抗体-美登素生物碱偶联物的偶联方法，该方法制备获得的偶联物具有合适的偶联率、高的纯度和低的内毒素含量。
本发明的详细技术方案如下：
一种抗体-美登素类生物碱药物偶联物的制备方法，包括以下步骤：
（1）抗体置换缓冲液
利用超滤浓缩或者脱盐层析的方式置换抗体原液至反应缓冲液中，反应缓冲液中含有0.02%～0.1%v/v的表面活性剂，浓缩至抗体浓度在20～30mg/ml；得置换后的抗体；
所述的抗体原液单克隆抗体的原液；
（2）制备美登素生物碱类药物母液
取连接有双功能连接剂的美登素生物碱类药物，即双功能连接剂-美登素生物碱，用有机溶剂溶解，制备含有10mg/ml美登素生物碱药物的母液。
（3）偶联反应
按双功能链接剂-美登素生物碱与抗体的摩尔比为5～6:1的比例，将第（1）步中得到的置换后的抗体与第（2）步中得到的美登素生物碱母液混合，进行偶联反应，反应温度20～30℃，反应时间1～4小时；
（4）阴离子交换层析
将上述反应液上样至阴离子交换层析柱进行纯化；首先用平衡缓冲液平衡阴离子层析柱，然后上样，层析柱载量为30-50mg/ml，上样流速为75-100cm/h，收集流穿液，上样完毕后，再用平衡缓冲液冲洗阴离子层析柱，直至收集完毕；
（5）脱盐层析
将上述阴离子交换层析收集的流穿液进行SephadexTM G25脱盐层析柱纯化；脱盐缓冲液平衡脱盐层析柱，脱盐缓冲液含有0.02～0.1%（v/v）的表面活性剂，将阴离子交换层析的收集液上样至脱盐层析柱，流速为2～5cm/h，收集第一个出峰样品，即为所制备的抗体-美登素生物碱类药物偶联物。
根据本发明优选的，步骤（1）所述的抗体原液选自曲妥珠单抗、西妥昔单抗或帕尼单抗。
根据本发明优选的，步骤（1）所述的置换抗体原液的反应缓冲液选自磷酸钠盐缓冲液、磷酸钾盐缓冲液、Tris-Hcl缓冲液或者磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，缓冲液pH6.0～9.0。
根据本发明优选的，步骤（1）所述的超滤浓缩或者脱盐层析的方式可以采用现有技术，例如可以通过Pellicon系统进行超滤浓缩，或采用SephadexTM G25凝胶层析柱进行脱盐层析。
根据本发明优选的，步骤（1）所述的表面活性剂主要是指非离子型表面活性剂，优选脂肪酸山梨坦类和聚山梨酯类，其中脂肪酸山梨坦类优选司盘40、司盘60；聚山梨酯类优选吐温20、吐温40、吐温60和吐温80，表面活性剂的用量为0.02%～0.1%（v/v）。
根据本发明优选的，步骤（2）所述的有机溶剂选自二甲基乙酰胺（DMA）、二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亚砜（DMSO）或乙醇（EtOH）。
根据本发明优选的，步骤（3）所述的双功能连接剂选自N-琥珀酸酰亚胺基4-（马来酰亚胺甲基）环己烷羧酸酯（SMCC）、N-琥珀酸酰亚胺基4-（马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧基-（6-酰氨基己酸酯）（LC-SMCC），均可购自苏州昊帆生物技术公司。
根据本发明优选的，步骤（3）所述的美登素生物碱类药物是由安丝菌素P-3合成的。合成美登素生物碱药物的方法参照文献J Med.Chem.2006,49,4392-4408的方法进行。安丝菌素P-3可市购。例如购自妍域生物培养基公司。
根据本发明优选的，步骤（3）所述的连接有双功能连接剂的美登素生物碱类药物可以参照CN102596922A的[0438]段提供的方法合成。
根据本发明优选的，步骤（4）所述的阴离子交换层析的层析介质选自Q Sepharose、DEAE Sepharose、Capto Q、Capto DEAE、Capto Adhere，优选使用Capto Adhere。
根据本发明优选的，步骤（4）所述的阴离子交换层析所用的平衡缓冲液可以与步骤（1）所用的反应缓冲液相同，也可以选择不同的缓冲液；阴离子交换层析所用的平衡缓冲液可以选自磷酸钠盐缓冲液、磷酸钾盐缓冲液、Tris-Hcl缓冲液或者磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，缓冲液中仍需要添加0.02%～0.1%（v/v）的表面活性剂。所述表面活性剂与步骤（1）的表面活性剂相同。
根据本发明优选的，步骤（5）所述的脱盐层析使用的脱盐缓冲液选择柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、琥珀酸缓冲液或磷酸盐缓冲液，缓冲液中含有0.02%～0.1%（v/v）的表面活性剂。所述表面活性剂与步骤（1）的表面活性剂相同。
在本发明中，步骤（4）所述的阴离子交换层析采用穿出模式，即所需要得到的抗体-药物偶联物单体流穿，抗体-药物偶联物聚体被吸附在阴离子层析柱上；为了提高阴离子交换层析纯化的效果，本发明选择了较低的线性流速，一般为75～100cm/h，层析载量30～50mg/ml。
在本发明中，步骤（5）所述的脱盐层析为SephadexTM G25色谱柱纯化，为有效的将未反应的美登素生物碱类药物、有机溶剂等和抗体-美登素生物碱药物偶联物分开，选择了较低的线性流速，一般为2～5cm/h。
本发明方法中所述的“抗体”可以为任何免疫球蛋白，任何免疫球蛋白片段如Fab、F（ab’）2、dsFv、sFv、双抗体和三链抗体，或者免疫球蛋白嵌合体，它们可以与细胞表面上的抗原结合。抗体可为多克隆抗体或单克隆抗体，最优选择为单克隆抗体。单克隆抗体是指均质的抗体分子，其对特定的抗原为特异性的。一般通过B淋巴细胞单克隆产生。本方法中优选抗体为人源化单克隆抗体，比如包括huN901、huMy9-6、huB4、huC242、曲妥珠单抗、帕尼单抗和利妥昔单抗等。
本发明方法中使用的细胞毒性剂为美登素生物碱,选自DM1（化学名称为N2’-脱乙酰-N2’-3-巯基-1氧代丙基）-美登素），DM4（化学名称为N2’-脱乙酰-N2’-4-甲基-4巯基-1氧代戊基）-美登素）。细胞毒性剂也可选其他合适的化学毒性药物,即可导致细胞死亡、引诱细胞死亡或者减少细胞生存力的任何化合物，合适的细胞毒性剂选自紫杉烷类、CC-1065和CC-1065类似物或多拉司他汀及类似物等。优选的所述美登素生物碱为DM1或DM4。
本发明方法，优选的抗体-美登素类生物碱药物偶联物为：曲妥珠-SMCC-DM1、帕尼-SMCC-DM1、西妥昔-SMCC-DM1。
根据本发明，优选的技术方案一，曲妥珠-SMCC-DM1偶联物的制备方法，步骤如下：
（1）利用SephadexTM G25色谱柱纯化脱盐层析方式置换曲妥珠单抗原液至反应缓冲液，反应缓冲液组成为0.1M磷酸钠盐，pH7.5,含0.05%v/v的吐温20；浓缩抗体浓度至20mg/ml，制得置换的曲妥珠抗体；
（2）称取SMCC-DM1，用二甲基乙酰胺（DMA）充分溶解制备10mg/ml的SMCC-DM1母液；
（3）按SMCC-DM1与抗体的摩尔比为5～5.5:1，在步骤（1）所制备的曲妥珠单抗中加入步骤（2）配制的SMCC-DM1母液，开始偶联反应，反应温度为25℃，反应时间为1.5h；
（4）将上述反应液上样Capto Adhere阴离子交换层析柱。层析柱先用步骤（1）中相应的反应缓冲液进行平衡，然后将步骤（3）反应完毕后的反应液上样，流速为75cm/h，载量为35mg/ml，收集流穿样品，上样完毕后，用相应的反应缓冲液冲洗，至收集完毕；
（5）将上述经阴离子交换层析的收集液分别进行SephadexTM G25脱盐层析。脱盐层析柱先用脱盐缓冲液平衡，流速为3cm/h。所用的脱盐缓冲液为20mM琥珀酸，0.05%吐温20，pH5.5。上样完毕后，用同样的缓冲液冲洗，根据UV280紫外吸收值收集出峰样品，即为制备的曲妥珠-SMCC-DM1偶联物。
本发明优选技术方案二，帕尼-SMCC-DM1偶联物的制备方法，如实施例3所述。
本发明优选技术方案三，西妥昔-SMCC-DM1偶联物的制备方法，如实施例4所述。
在单克隆抗体纯化过程中，一般采用阴离子交换层析的流穿模式去除单抗聚体，因为单抗聚体一般要比单体带有更多电荷而容易被吸附在阴离子交换介质上。偶联反应中产生的偶联物聚体也可通过阴离子交换层析去除。另外，阴离子交换层析还具有去除内毒素的作用，降低了临床用药时的隐患。
本发明技术方案的特点：在抗体置换缓冲液步骤即采用加入表面活性剂的缓冲液，这样在后续的偶联反应体系中，可以增加增加药物的亲水性，提高偶联反应的效率，从而降低偶联反应的投料比。同时，在后续纯化步骤中加入表面活性剂的缓冲液也可以有效的降低抗体-药物偶联物因为药物疏水性而产生偶联物聚体的几率。在抗体纯化步骤中，增加了一步阴离子交换层析步骤，和没有增加阴离子交换层析的偶联工艺相比，可以提高终产品的纯度，降低了产品中内毒素含量，而对偶联率和总收率几乎无影响。
本发明的优良效果在于：
1、在制备抗体-美登素生物碱偶联物的反应缓冲液以及之后的纯化缓冲液中添加了表面活性剂，从而使制备抗体-美登素生物碱偶联物具有较高的效率，以曲妥珠-SMCC-DM1为例，在同等比例下进行偶联反应，添加表面活性剂的偶联反应的投料比与未添加表面活性的投料比相比，投料比可由1:7.5降低至1:6，大大提高了偶联反应的效率，降低了成本。
2、通过增加一步阴离子交换层析使制备的抗体-美登素生物碱偶联物具有较高的纯度和较低的内毒素含量。以曲妥珠-SMCC-DM1为例，SEC-HPLC纯度达到98%以上，形成的抗体-药物偶联物聚体小于2%；产品内毒素含量由现有技术的0.8EU/mg降低为0.2EU/mg，抗体-药物偶联物中游离药物的水平小于2%（相对于总药物）。
具体实施方式
偶联率的测定方法：测定偶联率是指测定每个单抗分子上连接有美登素生物碱类药物的数量，即美登素生物碱类药物摩尔数与单抗摩尔数的比值。可采用紫外分光光度法和质谱分析法两种方法测定。紫外分光光度法：通过测定抗体-美登素生物碱类偶联物在252nM和280nM处的紫外吸收值，并通过朗伯比尔定律进行计算得出偶联率；质谱分析法：对抗体-美登素生物碱偶联物进行ESI-MS分析，可以获得连接不用个数药物的峰型图，根据各个峰的面积进行计算得出偶联率。通过两种方法获得的偶联率具有很好的一致性。
偶联物浓度测定：采用紫外分光光度法，测定出在252nM和280nM处的紫外吸收值，通过朗伯比尔定律即可计算出抗体和药物的浓度；本发明中所述的偶联物浓度是单抗浓度与连接到单抗上的美登素生物碱药物的总和。
SEC-HPLC分析：利用GLK3000高效分子筛柱对抗体-美登素生物碱药物进行分析，流动相选用20mM PB，15%异丙醇，pH7.0。按照面积归一法计算偶联物聚体和偶联物单体所占的比例。
内毒素含量检测：参照《中国药典2010版三部》附录XII E细菌内毒素检查法进行。
以下通过实施例进一步说明本发明，但是，应当理解，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应将其理解为用于以任何形式限制本发明。在本文中，除非另外说明，所用试剂均为市售产品。
实施例中的连接有双功能连接剂的美登素生物碱类药物（即双功能连接剂-美登素生物碱）为SMCC-DM1。SMCC购自苏州昊帆生物技术公司，DM1是通过安丝菌素P-3参照文献JMed.Chem.2006,49,4392-4408的方法进行合成的，其中安丝菌素P-3购自妍域生物培养基公司。SMCC-DM1参照CN102596922A的[0438]段提供的方法合成。
实施例中的产品采用“抗体-双功能连接剂-美登素生物碱”的表达方式。
实施例1、制备曲妥珠-SMCC-DM1偶联物，验证加入表面活性剂后对偶联效率的影响。
曲妥珠-SMCC-DM1偶联物的制备方法，步骤如下：
（1）抗体置换缓冲液
利用脱盐层析（SephadexTM G25）方式置换曲妥珠单抗原液至反应缓冲液A1（0.1M磷酸钠盐，pH7.5）中，并浓缩抗体浓度至20mg/ml，制备曲妥珠抗体A1；
利用脱盐层析（SephadexTM G25）方式置换曲妥珠单抗原液至反应缓冲液A2（0.1M磷酸钠盐，pH7.5,0.05%v/v吐温20）中，并浓缩抗体浓度至20mg/ml，制备曲妥珠抗体A2；
（2）制备SMCC-DM1母液
称取SMCC-DM1，用二甲基乙酰胺（DMA）充分溶解制备10mg/ml的SMCC-DM1母液；
（3）偶联反应
在步骤（1）所制备的曲妥珠单抗中加入步骤（2）配制的SMCC-DM1母液，开始偶联反应，反应温度为25℃，反应时间为1.5h；反应分为三组进行：
a：使用反应缓冲液A1和曲妥珠抗体A1，反应中加入7.5倍过量摩尔比的SMCC-DM1母液；
b：使用反应缓冲液A2和曲妥珠抗体A2，反应中加入7.5倍过量摩尔比的SMCC-DM1母液；
c：使用反应缓冲液A2和曲妥珠抗体A2，反应中加入5.5倍过量摩尔比的SMCC-DM1母液；
（4）阴离子交换层析
分别将上述a、b、c三组反应液上样Capto Adhere阴离子交换层析柱。层析柱先用步骤（1）中相应的反应缓冲液进行平衡，然后将步骤（3）反应完毕后的反应液上样，流速为75cm/h，载量为35mg/ml，收集流穿样品，上样完毕后，用相应的反应缓冲液冲洗，至收集完毕；
（5）脱盐层析
将上述三组经阴离子交换层析的收集液分别进行SephadexTM G25脱盐层析。脱盐层析柱先用脱盐缓冲液平衡，流速为3cm/h。a组样品所用的脱盐缓冲液为20mM琥珀酸，pH5.5，b组和c组样品所用的缓冲液为20mM琥珀酸，0.05%v/v吐温20，pH5.5。上样完毕后，各组分别用相应的缓冲液冲洗，根据UV280紫外吸收值收集出峰样品，即为制备的曲妥珠-SMCC-DM1偶联物。
将获得的曲妥珠-SMCC-DM1偶联物利用紫外分光光度法（分别测定偶联物在252nm和280nm的吸光度）计算产品的浓度和偶联率，同时也使用质谱分析法计算产品的偶联率，并进行对比，数据见表1。
表1添加表面活性剂对偶联效率的影响
| 样品 | 产品浓度（mg/ml） | 收率 | 偶联率（紫外法） | 偶联率（质谱法） |
| 曲妥珠-SMCC-DM1a | 6.50 | 89.5% | 3.21 | 3.19 |
| 曲妥珠-SMCC-DM1b | 6.23 | 90.05% | 4.30 | 4.37 |
| 曲妥珠-SMCC-DM1c | 6.36 | 87.6% | 3.62 | 3.66 |
从表1可以看出，当缓冲液体系中添加一定量的表面活性剂（如0.05%的吐温20）可以有效的提高偶联效率。相同摩尔投料比可以获得较高的偶联率，同时降低摩尔投料比为5.5时即可获得3.5左右偶联率的抗体-药物偶联物。
实施例2、在偶联工艺中加入阴离子交换层析可以降低偶联物聚体的含量和内毒素含量。
曲妥珠-SMCC-DM1偶联物的制备，步骤如下：
（1）抗体置换缓冲液：首先利用脱盐层析（SephadexTMG25）方式置换曲妥珠抗体原液至反应缓冲液（0.1M磷酸钠盐，pH7.5,0.05%v/v吐温20）中，浓缩抗体浓度至20mg/ml；
（2）制备SMCC-DM1母液：称取与步骤（1）中曲妥珠单抗摩尔比5.5倍的SMCC-DM1，用二甲基乙酰胺（DMA）充分溶解制备10mg/ml的SMCC-DM1母液；
（3）偶联反应：
在步骤（1）所制备的曲妥珠单抗中加入步骤（2）配制的SMCC-DM1母液，开始偶联反应，反应温度为25℃，反应时间为1.5h；
将反应液分为d、e两组，d组只进行脱盐层析,e组先进行阴离子交换层析,再进行脱盐层析；
（4）阴离子交换层析
将上述e组反应液上样Capto Adhere阴离子交换层析柱。层析柱先用步骤（1）中的反应缓冲液进行平衡，然后上样相应的反应液，流速为75cm/h，载量为35mg/ml，收集流穿样品，上样完毕后，用反应缓冲液冲洗，至收集完毕；
（5）脱盐层析
将上述e组阴离子交换层析的收集液和d组的反应液分别进行SephadexTM G25脱盐层析。脱盐层析柱先用脱盐缓冲液平衡，流速为3cm/h，所用的缓冲液为20mM琥珀酸，0.05%v/v吐温20，pH5.5。平衡完毕后上样，用缓冲液继续冲洗，根据UV280吸收值收集出峰样品，即为制备的曲妥珠-SMCC-DM1偶联物。
将获得的曲妥珠-SMCC-DM1偶联物利用紫外分光光度法（分别测定偶联物在252nm和280nm的吸光度）计算产品的浓度和偶联率，同时利用SEC-HPLC检测产品的纯度，利用鲎试剂法检测产品中内毒素含量。
表2阴离子交换层析对偶联物的影响
| 样品 | 产品浓度（mg/ml） | 收率 | SEC-HPLC聚体% | SEC-HPLC单体% | 内毒素 |
| 曲妥珠-SMCC-DM1d | 9.32 | 93.5% | 4.16 | 95.76 | 0.8EU/mg |
| 曲妥珠-SMCC-DM1e | 6.16 | 88.9% | 1.23 | 98.70 | 0.2EU/mg |
从表2可以看出，在对偶联反应液进行纯化的过程中，增加一步阴离子交换层析，可以有效的降低偶联物聚体的含量，提高偶联物的纯度，同时也可以进一步减少产品中内毒素的含量。相对于不增加阴离子交换层析的偶联工艺来说，总收率值降低与5%左右。
实施例3、制备帕尼-SMCC-DM1偶联物，步骤如下：
（1）抗体置换缓冲液
首先利用超滤浓缩（pellicon系统）方式置换帕尼单抗原液至反应缓冲液中（20mM磷酸钾盐缓冲液，0.02%v/v吐温20，pH6.0）中，并浓缩抗体浓度至30mg/ml。
（2）制备SMCC-DM1母液
称取与步骤（1）中帕尼单抗摩尔比5.0倍的SMCC-DM1，用二甲基乙酰胺（DMA）充分溶解制备10mg/ml的SMCC-DM1母液。
（3）偶联反应
在步骤（1）所制备的帕尼单抗中加入步骤（2）配制的SMCC-DM1母液，开始偶联反应，反应温度为25℃，反应时间为2.0h；
（4）阴离子交换层析
将上述反应液上样Capto Adhere阴离子交换层析柱。层析柱先用步骤（1）中的反应缓冲液进行平衡，然后上样反应液，流速为75cm/h，载量为45mg/ml，收集流穿样品，上样完毕后，用反应缓冲液冲洗，至收集完毕；
（5）脱盐层析
将上述阴离子交换层析的收集液进行SephadexTM G25脱盐层析。脱盐层析柱先用脱盐缓冲液平衡，流速为3.5cm/h。脱盐所用的缓冲液为20mM磷酸钠盐，0.02%v/v吐温20，pH7.2。上样完毕后，用脱盐缓冲液冲洗，根据UV280紫外吸收值收集出峰样品，即为制备的帕尼-SMCC-DM1偶联物。
将获得的帕尼-SMCC-DM1偶联物利用紫外分光光度法（分别测定偶联物在252nm和280nm的吸光度）计算产品的浓度和偶联率，同时利用SEC-HPLC检测产品的纯度，利用鲎试剂法检测产品中内毒素含量。
表3帕尼-SMCC-DM1偶联物产品的性质
实施例4、制备西妥昔-SMCC-DM1偶联物
（1）抗体置换缓冲液
首先利用超滤浓缩（pellicon系统）或者脱盐层析（SephadexTM G25）方式置换西妥昔单抗原液至反应缓冲液中（20mM磷酸氢二钠-10mM柠檬酸，0.1%v/v吐温80，pH8.0）中，并浓缩抗体浓度至20mg/ml；
（2）制备SMCC-DM1母液
称取与步骤（1）中西妥昔单抗摩尔比6.0倍的SMCC-DM1，用二甲基乙酰胺（DMA）充分溶解制备10mg/ml的SMCC-DM1母液；
（3）偶联反应
在步骤（1）所制备的西妥昔单抗中加入步骤（2）配制的SMCC-DM1母液，开始偶联反应，反应温度为22.5℃，反应时间为4.0h；
（4）阴离子交换层析
将上述反应液上样Capto Adhere阴离子交换层析柱。层析柱先用反应缓冲液进行平衡，然后上样反应液，流速为75cm/h，载量为40mg/ml，收集流穿样品，上样完毕后，用反应缓冲液冲洗，至收集完毕；
（5）脱盐层析
将上述阴离子交换层析的收集液进行SephadexTM G25脱盐层析。脱盐层析柱先用脱盐缓冲液平衡，流速为3cm/h。脱盐所用的缓冲液为20mM柠檬酸-柠檬酸钠，含0.1%v/v吐温80，pH5.0。上样完毕后，用脱盐缓冲液冲洗，根据UV280紫外吸收值收集出峰样品，即为制备的西妥昔-SMCC-DM1偶联物。
将获得的西妥昔-SMCC-DM1偶联物利用紫外分光光度法（分别测定偶联物在252nm和280nm的吸光度）计算产品的浓度和偶联率，同时利用SEC-HPLC检测产品的纯度，利用鲎试剂法检测产品中内毒素含量。
表4西妥昔-SMCC-DM1偶联物产品的性质
Claims (8)
1.一种抗体-美登素类生物碱药物偶联物的制备方法，包括以下步骤：
（1）抗体置换缓冲液
利用超滤浓缩或者脱盐层析的方式置换抗体原液至反应缓冲液中，反应缓冲液中含有0.02%～0.1% v/v的表面活性剂，浓缩至抗体浓度在20～30mg/mL；得置换后的抗体；
所述的抗体原液为单克隆抗体的原液；所述的表面活性剂为司盘40、司盘60、吐温20、吐温40、吐温60或吐温80；
（2）制备美登素生物碱类药物母液
取连接有双功能连接剂的美登素生物碱类药物，即双功能连接剂-美登素生物碱，用有机溶剂溶解，制备含有10mg/mL美登素生物碱药物的母液；
所述美登素生物碱为DM1或DM4；
（3）偶联反应
按双功能连接剂-美登素生物碱与抗体的摩尔比为5～6:1的比例，将第（1）步中得到的置换后的抗体与第（2）步中得到的美登素生物碱母液混合，进行偶联反应，反应温度20～30℃，反应时间1～4小时；
（4）阴离子交换层析
将上述反应液上样至阴离子交换层析柱进行纯化；首先用平衡缓冲液平衡阴离子层析柱，然后上样，层析柱载量为30-50mg/mL，上样流速为75-100cm/h，收集流穿液，上样完毕后，再用平衡缓冲液冲洗阴离子层析柱，直至收集完毕；
所述的阴离子交换层析的层析介质选自Q Sepharose、DEAE Sepharose、Capto Q、Capto DEAE或Capto Adhere；所述的阴离子交换层析所用的平衡缓冲液与步骤（1）所用的反应缓冲液相同；
（5）脱盐层析
将上述阴离子交换层析收集的流穿液进行SephadexTM G25脱盐层析柱纯化；脱盐缓冲液平衡脱盐层析柱，脱盐缓冲液含有0.02～0.1% v/v 的表面活性剂，所述的表面活性剂与步骤（1）所用的表面活性剂相同；将阴离子交换层析的收集液上样至脱盐层析柱，流速为2～5cm/h，收集第一个出峰样品，即为所制备的抗体-美登素生物碱类药物偶联物。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（1）所述的抗体原液选自曲妥珠单抗、西妥昔单抗或帕尼单抗。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（1）所述的置换抗体原液的反应缓冲液选自磷酸钠盐缓冲液、磷酸钾盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或者磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，缓冲液pH6.0～9.0。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（1）所述的超滤浓缩是通过Pellicon系统进行超滤浓缩，所述脱盐层析是采用SephadexTM G25凝胶层析柱进行脱盐层析。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（2）所述的有机溶剂选自二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或乙醇。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（3）所述的双功能连接剂选自N-琥珀酸酰亚胺基 4-（马来酰亚胺甲基）环己烷羧酸酯（SMCC）、N-琥珀酸酰亚胺基 4-（马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧基-（6-酰氨基己酸酯）（LC-SMCC）。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（5）所述的脱盐层析使用的脱盐缓冲液选择柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、琥珀酸缓冲液或磷酸盐缓冲液，缓冲液中含有0.02%～0.1%v/v的表面活性剂。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤如下：
（1）利用SephadexTM G25色谱柱纯化脱盐层析方式置换曲妥珠单抗原液至反应缓冲液，反应缓冲液组成为0.1 M 磷酸钠盐，pH7.5,含0.05% v/v的吐温20；浓缩抗体浓度至20mg/mL，制得置换的曲妥珠抗体；
（2）称取SMCC-DM1，用二甲基乙酰胺充分溶解制备10mg/mL的SMCC-DM1母液；
（3）按SMCC-DM1与抗体的摩尔比为5～5.5:1，在步骤（1）所制备的曲妥珠单抗中加入步骤（2）配制的SMCC-DM1母液，开始偶联反应，反应温度为25℃，反应时间为1.5h；
（4）将上述反应液上样Capto Adhere阴离子交换层析柱；层析柱先用步骤（1）中相应的反应缓冲液进行平衡，然后将步骤（3）反应完毕后的反应液上样，流速为75cm/h，载量为35mg/mL，收集流穿样品，上样完毕后，用相应的反应缓冲液冲洗，至收集完毕；
（5）将上述经阴离子交换层析的收集液进行SephadexTM G25脱盐层析；脱盐层析柱先用脱盐缓冲液平衡，流速为3cm/h；所用的脱盐缓冲液为20 mM 琥珀酸，0.05% v/v的吐温20，pH5.5；上样完毕后，用同样的缓冲液冲洗，根据UV280紫外吸收值收集出峰样品，即为制备的曲妥珠-SMCC-DM1偶联物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310168886.6A CN103254311B (zh) | 2013-05-09 | 2013-05-09 | 一种制备抗体-美登素类生物碱药物偶联物的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310168886.6A CN103254311B (zh) | 2013-05-09 | 2013-05-09 | 一种制备抗体-美登素类生物碱药物偶联物的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103254311A CN103254311A (zh) | 2013-08-21 |
| CN103254311B true CN103254311B (zh) | 2015-05-13 |
Family
ID=48958561
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310168886.6A Expired - Fee Related CN103254311B (zh) | 2013-05-09 | 2013-05-09 | 一种制备抗体-美登素类生物碱药物偶联物的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103254311B (zh) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2014233385C1 (en) | 2013-03-15 | 2019-09-19 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Biologically active molecules, conjugates thereof, and therapeutic uses |
| JP6462673B2 (ja) * | 2013-07-05 | 2019-01-30 | フォーメーション バイオロジックス インコーポレイテッド | Ｅｇｆｒ抗体コンジュゲート |
| CA2921412C (en) | 2013-08-26 | 2024-05-28 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Pharmaceutical compositions comprising macrolide diastereomers, methods of their synthesis and therapeutic uses |
| CN103483357B (zh) * | 2013-10-12 | 2015-11-18 | 齐鲁制药有限公司 | 一种抗体-美登素偶联物的中间体新晶型及其制备方法 |
| CN106606784B (zh) * | 2015-10-19 | 2020-01-21 | 泰州迈博太科药业有限公司 | 一种靶向表达egfr肿瘤细胞的前抗体偶联药物及其应用 |
| AU2017211120C1 (en) | 2016-01-25 | 2021-10-07 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Maytansinoid derivatives, conjugates thereof, and methods of use |
| CN105963711A (zh) * | 2016-06-20 | 2016-09-28 | 杭州皓阳生物技术有限公司 | 一种抗人cd20单克隆抗体-dm1偶联物及其制备方法 |
| CN111317754B (zh) * | 2018-12-13 | 2022-02-18 | 泰州医药城国科化物生物医药科技有限公司 | 一种北豆根总碱的制备方法及应用 |
| CN112691190A (zh) * | 2019-10-23 | 2021-04-23 | 东曜药业有限公司 | 抗体-高活性细胞毒小分子药物偶联药物及制备和应用 |
| JP2024509700A (ja) * | 2021-02-09 | 2024-03-05 | ジーンクアンタム ヘルスケア （スーチョウ） シーオー．， エルティーディー． | コンジュゲーション装置及びコンジュゲートの生成方法 |
| CN118290514A (zh) * | 2024-06-05 | 2024-07-05 | 东曜药业有限公司 | 基于阴离子膜的抗体偶联药物的纯化方法及抗体偶联药物 |
| CN118290513A (zh) * | 2024-06-05 | 2024-07-05 | 东曜药业有限公司 | 一种去除抗体偶联药物中游离小分子的阴离子柱层析方法及抗体偶联药物 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5208020A (en) * | 1989-10-25 | 1993-05-04 | Immunogen Inc. | Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use |
| CN101087611A (zh) * | 2003-10-10 | 2007-12-12 | 伊缪诺金公司 | 用经不可切割接头连接的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物靶向特定细胞群的方法、所述偶联物和制备所述偶联物的方法 |
| CN102596922A (zh) * | 2009-10-06 | 2012-07-18 | 免疫基因公司 | 有效的缀合物和亲水性连接体 |
-
2013
- 2013-05-09 CN CN201310168886.6A patent/CN103254311B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5208020A (en) * | 1989-10-25 | 1993-05-04 | Immunogen Inc. | Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use |
| CN101087611A (zh) * | 2003-10-10 | 2007-12-12 | 伊缪诺金公司 | 用经不可切割接头连接的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物靶向特定细胞群的方法、所述偶联物和制备所述偶联物的方法 |
| CN102596922A (zh) * | 2009-10-06 | 2012-07-18 | 免疫基因公司 | 有效的缀合物和亲水性连接体 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103254311A (zh) | 2013-08-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103254311B (zh) | 一种制备抗体-美登素类生物碱药物偶联物的方法 | |
| US9637526B2 (en) | Chlorotoxin polypeptides and conjugates and uses thereof | |
| US20180021451A1 (en) | Antibody-active agent conjugates and methods of use | |
| WO2017012591A1 (en) | Complex comprising metallic nanoparticle, linkers and antibodies | |
| CN117241833A (zh) | 抗体偶联药物的制备方法及应用 | |
| TW201905000A (zh) | 含有抗globo h抗體之抗體－藥物共軛物及其用途 | |
| TWI807320B (zh) | 含有α-烯醇酶抗體之藥物共軛物及其用途 | |
| CN107261137A (zh) | 两种抗her2抗体‑毛壳素偶联物及其制备方法和抗肿瘤应用 | |
| CN114522244B (zh) | 视黄酸修饰的lytac分子及其制备方法和应用 | |
| CN105963711A (zh) | 一种抗人cd20单克隆抗体-dm1偶联物及其制备方法 | |
| CN107583058B (zh) | 一种t-2毒素-抗体缀合物及其用途 | |
| CN117881431A (zh) | 一种由可断裂连接子偶联的抗体偶联药物 | |
| Li et al. | Preparation of antigastric cancer monoclonal antibody MGb2-mitomycin C conjugate with improved antitumor activity | |
| CN118846111A (zh) | 一种抗trop2抗体-药物偶联物及其制备方法和用途 | |
| CN101352572B (zh) | 一种叶酸羧基复合物的制备方法 | |
| EP4223741A1 (en) | Preparation method for bis-substituted bridging antibody-drug conjugate | |
| CN116370651A (zh) | 一种抗psma抗体-药物缀合物及其制备方法和应用 | |
| EP3565601A2 (en) | Cell internalizing compounds | |
| CN117700553A (zh) | 靶向c-MET的纳米抗体、药物偶联物及其用途 | |
| CN116059392A (zh) | 配体偶联物及其应用 | |
| CN1305847A (zh) | 以环糊精为偶联剂的单抗药物偶联物 | |
| AU2015201510A1 (en) | Chlorotoxin polypeptides and conjugates and uses thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20150513 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |