CN116640705B - 改善宠物毛发的嗜酸乳杆菌King45及其菌剂和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一种改善宠物毛发的嗜酸乳杆菌King45及其菌剂和应用。嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）King45于2022年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.25558。该菌株可在宠物肠道内长久定植，通过代谢不断生成蛋氨酸，使得宠物不需要额外补充其它营养物质在正常进食的情况下能够做到长时间保持毛色艳亮，减少了宠物掉毛现象，增强了宠物毛发韧性。通过服用嗜酸乳杆菌King45菌剂维护宠物毛发健康，有助于减轻宠物饲养者的经济负担，同时不会出现高蛋白饮食引起的宠物排便困难、便臭等负面作用。
Description
技术领域
本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一种改善宠物毛发的嗜酸乳杆菌King45及其菌剂和应用。
背景技术
动物毛发的主要成分是角蛋白，角蛋白含量的高低是影响毛发浓密、韧性及艳亮的关键因素。角蛋白是所有蛋白质中为数不多的含硫元素成分的蛋白质，组成了毛发的绝大成分，而构成角蛋白的蛋氨酸又是机体必须的氨基酸，它无法在体内合成，所以如果不通过饮食摄取，就会造成制造氨基酸的原料不足，让毛发稀疏、脱落、生长变慢。因此，摄取蛋氨酸对毛发的持久鲜亮具有重要生物意义。
目前市面上可以维持宠物毛色发亮的方法主要包括外用洗液和饮食补充。外用洗液以护发素为主，但其治标不治本，可能还会存在不良商家将工业色素添加至护发素中，影响宠物健康。饮食补充主要包括摄入高蛋白食品或额外补充营养强化剂。通过摄入大量高蛋白高营养食品可以补充宠物体内的生物基硫元素，促进角蛋白合成，从而促使毛色光亮，但高蛋白高营养食品不利于宠物消化吸收，长期喂养高蛋白食物容易出现消化不良、便秘、粪便恶臭等负面作用。通过额外补充卵磷脂、海藻粉等营养强化剂等膳食营养补充剂也可以增进宠物的毛色发亮，但一旦停止服用，宠物的毛发又会回归到干燥、暗淡的状态，同时这些营养添加剂价格昂贵，成本较高。
发明内容
针对市面上改善宠物毛发的产品负面作用大、效果不持久、成本高的问题，本发明提供一种改善宠物毛发的嗜酸乳杆菌King45及其菌剂和应用。
第一方面，本发明提供一种改善宠物毛发的嗜酸乳杆菌King45，嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）King45于2022年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.25558。
第二方面，本发明提供一种嗜酸乳杆菌King45菌剂，包括上述嗜酸乳杆菌King45的菌体。
进一步的，其制备方法具体包括以下步骤：
（1）制备MRS液体培养基和MRS平板培养基；
（2）取保藏的嗜酸乳杆菌King45在MRS平板培养基上活化，将活化后菌接种于MRS液体培养基中，然后培养获得菌液；
（3）将菌液离心后，收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后，重悬于复原脱脂乳中，获得悬浊液；调整悬浊液的浓度为1.0×1010~2.0×1010cfu/mL，获得菌悬液，将菌悬液冷冻干燥后，获得菌粉；
（4）将菌粉与低聚异麦芽糖混合，制成菌剂。
进一步的，步骤（1）中，MRS液体培养基的制备方法为：蛋白胨10g、牛肉粉5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g、蒸馏水1000mL；将上述原料混合后，调pH为6.8，搅拌菌液后，在121℃、0.1MPa下灭菌20min。
进一步的，步骤（1）中，MRS平板培养基的制备方法为：蛋白胨10g、牛肉粉5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g、琼脂15g、蒸馏水1000mL；将上述原料混合后，自然pH，搅拌菌液后，在121℃、0.1MPa下灭菌20min，将灭菌后的培养基倒入平皿中，放凉后待用。
进一步的，步骤（2）中，活化后菌接种于MRS液体培养基的接种量为1%~2%。
进一步的，步骤（2）中，培养温度为35~38℃，培养时间为24~36h。
进一步的，步骤（3）中，复原脱脂乳的质量浓度为15%。
第三方面，本发明提供一种上述嗜酸乳杆菌King45在制备改善宠物毛发的产品中的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的改善宠物毛发的嗜酸乳杆菌King45可在宠物肠道内长久定植，通过代谢不断生成蛋氨酸，使得宠物不需要额外补充其它营养物质在正常进食的情况下能够做到长时间保持毛色艳亮，减少了宠物掉毛现象，增强了宠物毛发韧性。通过服用嗜酸乳杆菌King45菌剂维护宠物毛发健康，有助于减轻宠物饲养者的经济负担，同时不会出现高蛋白饮食引起的宠物排便困难、便臭等负面作用。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1 菌种的分离鉴定
1、菌株筛选及纯化
（1）菌株来源：健康犬粪便，2021年6月采集于山东省青州市。
（2）制备样品：
①取灭菌后的生理盐水（0.85%）至于无菌三角瓶中，然后将步骤（1）的健康犬粪便1g加入其中，振荡，待用；
②对步骤①的溶液稀释制成不同浓度梯度的样品，分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，标号分别为1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#，待用。
（3）制备MRS平板培养基：
蛋白胨10g、牛肉粉 5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g、琼脂15g、蒸馏水1000mL；将上述原料混合后，自然pH，搅拌菌液后，在121℃、0.1MPa下灭菌20min，将灭菌后的培养基倒入平皿中，放凉后待用。
（4）培养菌株：将1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#号溶液分别使用涂布器涂布在MRS平板培养基中，于37℃、厌氧条件下培养48h；
（5）按照以下菌落特征挑选菌落：
菌落直径1~2mm，菌落圆润、边缘整齐、微白色中间有凸起。
（6）分离纯化
根据步骤（5）的菌落特征挑取5个单菌落，采用划线法接种至MRS平板培养基上，于37℃、厌氧条件下培养48h，挑取单菌落，置于甘油管中-70℃保藏。
2、鉴定
将分离纯化后得到的单菌落送去鉴定，鉴定单位：中国工业微生物菌种保藏管理中心；检测方法：FMIC-QO01-001-2015微生物学检测 细菌多相鉴定检测方法；鉴定结果为：该菌株为Lactobacillus acidophilus。
鉴定过程中得到的菌株的基因序列为：
TGAACCAACAGATTCACTTCGGTGATGACGTTGGGAACGCGAGCGGCGGATGGGTGAGTAACACGTGGGGAACCTGCCCCATAGTCTGGGATACCACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGGATAAGAAAGCAGATCGCATGATCAGCTTATAAAAGGCGGCGTAAGCTGTCGCTATGGGATGGCCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAGGGTAACGGCCTACCAAGGCAATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTGGTGAAGAAGGATAGAGGTAGTAACTGGCCTTTATTTGACGGTAATCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGAAGAATAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAACTGCATCGGAAACTGTTTTTCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGGAGGTTTCCGCCTCTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTAGTGCAATCCGTAGAGATACGGAGTTCCCTTCGGGGACACTAAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGTACAACGAGGAGCAAGCCTGCGAAGGCAAGCGAATCTCTTAAAGCTGTTCTCAGTTCGGACTGCAGTCTGCAACTCGACTGCACGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTCTGCAATGCCCAAAGCCGGTGGCCTAAC
将鉴定后的菌株命名为嗜酸乳杆菌King45，将该菌株送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏信息如下；
分类命名：嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus，保藏日期：2022年8月19日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号：CGMCC No.25558。
实施例2 制备嗜酸乳杆菌King45菌剂
（1）制备MRS液体培养基：蛋白胨10g、牛肉粉5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g、蒸馏水1000mL；将上述原料混合后，调pH为6.8，搅拌菌液后，在121℃、0.1MPa下灭菌20min，即可；
（2）取保藏的干酪乳杆菌King45在MRS平板培养基上活化，将活化后菌按照1%的接种量接种于MRS液体培养基中，然后在37℃条件下培养24h，获得菌液；
（3）将菌液离心后，收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后，重悬于15%（w/w）的复原脱脂乳中，获得悬浊液；调整悬浊液的浓度为2.0×1010cfu/mL，获得菌悬液，将菌悬液冷冻干燥后，获得菌粉；
（4）将菌粉与低聚异麦芽糖混合制成菌剂，低聚异麦芽糖购自保龄宝生物股份有限公司。
在本实施例中，制备的嗜酸乳杆菌King45菌剂中菌体数量为150亿/g。
实施例3 制备嗜酸乳杆菌King45菌剂
（1）制备MRS液体培养基：蛋白胨10g、牛肉粉5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g、蒸馏水1000mL；将上述原料混合后，调pH为6.8，搅拌菌液后，在121℃、0.1MPa下灭菌20min，即可；
（2）取保藏的干酪乳杆菌King45在MRS平板培养基上活化，将活化后菌按照2%的接种量接种于MRS液体培养基中，然后在35℃条件下培养36h，获得菌液；
（3）将菌液离心后，收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后，重悬于15%（w/w）的复原脱脂乳中，获得悬浊液；调整悬浊液的浓度为1.0×1010cfu/mL，获得菌悬液，将菌悬液冷冻干燥后，获得菌粉；
（4）将菌粉与低聚异麦芽糖混合制成菌剂，低聚异麦芽糖购自保龄宝生物股份有限公司。
在本实施例中，制备的嗜酸乳杆菌King45菌剂中菌体数量为100亿/g。
实施例4 嗜酸乳杆菌King45通过模拟胃肠消化液实验
1、胃液制备与操作
称取若干份实施例2制得的嗜酸乳杆菌King45菌剂（活菌数为150亿/g）作为样品，每份样品重量为1g，转移至预热的装有9mL模拟胃液试管中，分别于37℃、80r/min下处理1h、2h、3h、4h，每个处理3个重复。
模拟胃液按照如下方法配制：用9.5%盐酸加蒸馏水稀释至pH值为1.5，每100mL加入1.0g胃蛋白酶，混匀后用0.22μm无菌滤膜过滤，现配现用。
对处理后的样品溶液进行梯度稀释，使用倾注法做活菌计数，再计算存活率，存活率=（处理后菌数/原始菌数）×100%。
2、肠液制备与操作
称取若干份实施例2制得的嗜酸乳杆菌King45菌剂（活菌数为150亿/g）作为样品，每份样品重量为1g，转移至装有9mL模拟肠液试管中，分别于37℃、80r/min下处理1h、2h、3h、4h，每个处理3个重复。
模拟肠液按照如下方法配制：将6.8g的KH2PO4溶于500mL蒸馏水中，加入3g胆盐和10g胰蛋白酶，用浓度为4g/L的NaOH溶液调节溶液pH值至6.8，用蒸馏水定容至1L后，混匀后用0.22μm无菌滤膜过滤，现配现用。
对处理后的样品溶液进行梯度稀释，使用倾注法做活菌计数，再计算存活率，存活率=（处理后菌数/原始菌数）×100%。
表1 体外模拟胃肠环境下King45存活率
菌株King45在体外模拟胃肠环境下的存活率数据如表1所示，可以看出嗜酸乳杆菌King45在体外模拟胃肠环境下的存活率非常高，在模拟宠物高酸胃液和肠液中4h，存活率依然在88%以上，可以为后续菌种定植肠道、发挥功能作用垫定基础。
实施例5 嗜酸乳杆菌King45对Caco-2的粘附率对照实验
将Caco-2细胞置于含10%热灭活新生牛血清和双抗（青霉素浓度100U/mL、链霉素1.0μg/mL）的DMEM培养液（购自Gibco公司）中，于37℃、5%CO2、相对湿度95%的二氧化碳培养箱中孵育，每天换1次培养液，3~4天传代1次，18天后将细胞接种于24孔培养板中，接种密度约为5×105CFU/mL，待细胞长至单层后进行粘附试验。
将活化好的King45按体积分数1%的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃培养12h。离心收集菌体（4000g、4℃、10min），并用无菌PBS缓冲液洗涤3次，将菌体重悬于无菌PBS缓冲液中，得到浓度为2×108CFU/mL的King45菌悬液，PBS缓冲液按照如下方法配制：
KH2PO40.27g、Na2HPO41.42g、NaCl 8g、KCl 0.2g，加去离子水约800mL充分搅拌溶解，加浓盐酸调pH至7.4，加去离子水定容至1L，于121℃灭菌20min，制得pH=7.4的PBS缓冲液备用。
将已长成单层的Caco-2细胞用无菌PBS缓冲液漂洗2次，每孔加入0.5mL的King45菌悬液和0.5mL新鲜的DMEM培养液，于37℃、5%CO2、相对湿度95%的二氧化碳培养箱中孵育1h，然后用无菌PBS缓冲液漂洗细胞5次，以除去未粘附的细菌，并对对处理后的样品溶液进行梯度稀释，使用倾注法做活菌计数，计算出粘附率，粘附率=（初始菌数-漂洗下的菌数）/初始菌数×100%。每个处理做3个平行。
漂洗完后，用甲醛固定，革兰染色，镜检，倒置显微镜下计算20个随机视野下100个细胞上黏附的细菌数，计算每个细胞黏附的平均细菌数。以不加菌液细胞培养为对照。
表2 King45在Caco-2细胞上的粘附率及粘附个数
菌株King45对Caco-2细胞的黏附率和细胞粘附个数如表2所示，可以看出嗜酸乳杆菌King45在细胞定植方面有较强的能力。
实施例6 嗜酸乳杆菌King45代谢生成蛋氨酸实验
配置相同的250mL MRS液体培养基2瓶，同时在121℃条件下灭菌30min，取其中的一瓶进行气相色谱检测，另一瓶在超净台中接种1g嗜酸乳杆菌King45菌剂（实施例3，菌体数量100亿/g），37℃条件下培养24h，取发酵液进行气相色谱检测，第三瓶在超净台中接种1g 嗜酸乳杆菌CICC 6075菌粉（嗜酸乳杆菌CICC 6075购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，制备方法同实施例3，菌体数量100亿/g），37℃条件下培养24h，取发酵液进行气相色谱检测；将购买的蛋氨酸标准品（阿拉丁，≥95%）用甲醇溶解后，进行相同条件下气相色谱检测。以上步骤重复5次。
检测条件：色谱柱SE-50毛细管柱；检测器：FID检测器；载气：氮气0.3MPa；燃气：氢气，20ml/min；温度：柱温220℃；进样口温度：250℃；检测器：270℃；升温条件：梯度升温，初始温度220℃，保持5分钟，以5℃/min升至240℃，保持20分钟。
表3 King45代谢生产蛋氨酸含量
表3中可以看出，实验组中的King45蛋氨酸产量明显高于其他两组，说明King45有较高的蛋氨酸产量。
实施例7 嗜酸乳杆菌King45对宠物犬毛色亮度色泽评估实验
在山东潍坊某宠物医院进行实验验证。经宠物饲养者同意之后选取20只金毛进行验证。将金毛按照体型大小均匀分成两组，实验组10只，对照组10只。实验组每天喂养实施例2制备的嗜酸乳杆菌King45菌剂（活菌数为150亿/g），早晚各一次，喂养时间1个月；对照组不喂养菌剂，其余饲养方式及生活方式均正常一致。1个月后由宠物医师进行评估比对，比对项目为宠物犬毛发的光泽和触感，均以10分制计算。
表4 宠物犬毛色亮度色泽评估结果
如表4所示，无论是在毛发光泽还是毛发触感方面，实验组宠物犬得分均高于对照组宠物犬，该实验验证了服用嗜酸乳杆菌King45菌剂可以有效改善宠物犬毛发色泽与触感。
实施例8 嗜酸乳杆菌King45对宠物犬脱毛程度的影响评估实验
对于实施例7中实验组和对照组的宠物犬，分别用相同的宠物梳子从宠物犬脖颈开始沿脊椎方向梳理30公分，同一位置连续梳理3次，收集每次梳理毛发，并用电子天平称量收集到的毛发质量，其数据如下：
表5 宠物犬脱毛程度评估结果
由上表结果计算可知，实验组平均毛重0.0534g，对照组平均毛重0.1g，实验组掉毛重量仅为对照组掉毛重量的53.4%，效果明显，因此服用嗜酸乳杆菌King45菌剂有助于减少宠物犬掉毛。
实施例9 嗜酸乳杆菌King45对宠物犬毛发韧性检测实验
对于实施例7中实验组和对照组的宠物犬，分别从宠物犬尾尖部各抽取毛发1根，采用头发拉力测试仪进行拉力测试，实验结果如下：
表6 宠物犬毛发韧性评估结果
根据表6中的结果计算可知，实验组平均拉力值为1.0705N，对照组平均拉力值为0.9219N。由此可以得出结论：服用嗜酸乳杆菌King45有助于增强宠物犬毛发韧性。
尽管通过优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1. 一种改善宠物毛发的嗜酸乳杆菌King45，其特征在于，嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）King45于2022年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.25558。
2.一种嗜酸乳杆菌King45菌剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的嗜酸乳杆菌King45的菌体。
3.如权利要求2所述的嗜酸乳杆菌King45菌剂，其特征在于，其制备方法具体包括以下步骤：
（1）制备MRS液体培养基和MRS平板培养基；
（2）取保藏的嗜酸乳杆菌King45在MRS平板培养基上活化，将活化后菌接种于MRS液体培养基中，然后培养获得菌液；
（3）将菌液离心后，收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后，重悬于复原脱脂乳中，获得悬浊液；调整悬浊液的浓度为1.0×1010~2.0×1010cfu/mL，获得菌悬液，将菌悬液冷冻干燥后，获得菌粉；
（4）将菌粉与低聚异麦芽糖混合，制成菌剂。
4. 如权利要求3所述的嗜酸乳杆菌King45菌剂，其特征在于，步骤（1）中，MRS液体培养基的制备方法为：将原料蛋白胨10g、牛肉粉5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温801mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g、蒸馏水1000mL混合后，调pH为6.8，搅拌菌液后，在121℃、0.1MPa下灭菌20min。
5. 如权利要求3所述的嗜酸乳杆菌King45菌剂，其特征在于，步骤（1）中，MRS平板培养基的制备方法为：将原料蛋白胨10g、牛肉粉5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温801mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g、琼脂15g、蒸馏水1000mL混合后，自然pH，搅拌菌液后，在121℃、0.1MPa下灭菌20min，将灭菌后的培养基倒入平皿中，放凉后待用。
6.如权利要求3所述的嗜酸乳杆菌King45菌剂，其特征在于，步骤（2）中，活化后菌接种于MRS液体培养基的接种量为1%~2%。
7.如权利要求3所述的嗜酸乳杆菌King45菌剂，其特征在于，步骤（2）中，培养温度为35~38℃，培养时间为24~36h。
8.如权利要求3所述的嗜酸乳杆菌King45菌剂，其特征在于，步骤（3）中，复原脱脂乳的质量浓度为15%。
9.一种如权利要求1所述嗜酸乳杆菌King45在制备改善宠物毛发的产品中的应用。
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| CN116640705A (zh) | 2023-08-25 |
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