CN109541205B - 一种益生菌中乳酸菌的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种益生菌中乳酸菌的检测方法，属于微生物制品的检测技术领域。该方法包括：（1）将待测样品加入到添加有BSAV的PBS缓冲液中，均质，制成样品匀液，待测样品与PBS缓冲液的用量比为1g:9mL；在样品匀液中加入乳糖溶液，经水浴、离心分离除去上清液后得到菌悬液；（2）向步骤（1）所得的菌悬液中加入乳酸菌免疫磁珠，经混合、振荡后于磁力架上静置分层，弃上层，对下层样品进行洗脱，在洗脱后的乳酸菌免疫磁珠中加入PBS缓冲液，振荡重悬磁珠，得到样品待测液；（3）将样品待测液培养、观察、检测。本发明缩短了对样品中乳酸菌的检测时间，提高了乳酸菌的检出率及检测结果的准确性，且检测灵敏度高。

Description

一种益生菌中乳酸菌的检测方法

技术领域

本发明属于微生物制品的检测技术领域，具体涉及一种益生菌中乳酸菌的检测方法。

背景技术

益生菌作为一类能够对宿主生理功能产生有益作用的活性微生物，具有调节肠道菌群、降低胆固醇、增强免疫力、缓解口腔疾病及情绪异常等作用，被广泛应用于食品领域、医药领域以及畜牧领域。近年来，对益生菌中乳酸菌及其制品的研发、生产和销售情况可以了解到乳酸菌菌在人体健康中起到的重要功效越来越受到研究人员和消费者的关注，乳酸菌主要包括双歧杆菌、嗜热链球菌和乳杆菌，对环境温度较为敏感，乳酸菌制品在保藏及运输过程中，可能会造成乳酸菌菌体失活，最终导致终产品中乳酸菌存活率下降的情况，故而，对终产品中乳酸菌的检测具有重要意义。

目前益生菌中乳酸菌的检测方法，主要依赖于传统的微生物学检测方法。传统的国标检测法至少3天才能出结果，培养时间较长、费时费力；此外，在实际检测过程中，检测环境不利于菌体生长及检测时间长等因素，使得乳酸菌的生物活性存在下降甚至死亡的情况，导致终产品中益生菌的检出率较实际样品中低。因此，需要一种快速检测乳酸菌的方法和手段。

发明内容

为解决背景技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种快速检测益生菌中乳酸菌的方法，以提高待测样品中益生菌的检出率。

基于上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种益生菌中乳酸菌的检测方法，包括以下步骤：

1)将待测样品加入到添加牛血清白蛋白（第五组份）（BSAV）的PBS缓冲液无菌均质袋中，均质，制成样品匀液，待测样品与PBS缓冲液的用量比为1g:9mL；将样品匀液混匀后再加入乳糖溶液，经水浴后得到样品菌液，对其离心分离除去上清液后得到菌悬液；

2)向骤1）所得的菌悬液中加入乳酸菌免疫磁珠，经混合、振荡后于磁力架上静置分层，弃上层，对下层样品用洗脱液洗脱，在洗脱后的乳酸菌免疫磁珠中加入PBS缓冲液，振荡重悬磁珠，得到样品待测液；所述乳酸菌免疫磁珠采用链霉亲和素修饰磁珠偶联生物素标记的乳酸菌抗体制得；

3)将样品待测液培养、观察、检测。

进一步地，所述乳酸菌为双歧杆菌、嗜热链球菌和乳杆菌的混合物；所述乳酸菌抗体为双歧杆菌抗体、嗜热链球菌抗体和乳杆菌抗体按照重量比4:3:3混匀后的混合物。

进一步地，步骤1）中，PBS缓冲液中BSAV的质量浓度为0.5%～5%；乳糖溶液与待测样品的体积比为（0.2～2）︰1，乳糖溶液的浓度为1%～20%。

进一步地，步骤1）中，所述水浴温度为35℃～50℃，水浴时间为3min；离心温度为4℃，离心转速为6000rmp，离心时间为1min～6min。

进一步地，步骤2）中，乳酸菌免疫磁珠的浓度为5mg/mL,乳酸菌免疫磁珠与样品菌液的体积比为1︰50，所述洗脱液为浓度为0.02mol/L的PBS缓冲液。

进一步地，步骤2）中，菌悬液与免疫磁珠混合后振荡的时间为0.5min～3min；所述静置时间为2min；所述洗脱次数为2～3次。

进一步地，所述乳酸菌免疫磁珠的制备方法，包括以下步骤：

a)用0.01mol/L磷酸盐-吐温20缓冲液（PBST缓冲液）稀释乳酸菌抗体至1mg/mL，用无水DMSO配制10mg/mL生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液（BNHS溶液），在BNHS溶液中加入稀释的乳酸菌抗体进行混合，BNHS溶液与乳酸菌抗体的体积比为4︰1，室温下孵育，即得生物素标记的乳酸菌抗体；

b)在生物素标记的乳酸菌抗体中加入1mg已活化溶解的链霉素亲和素修饰磁珠进行混合，得到抗体与磁珠的混合物，室温放置；

c)在步骤b)所得的混合物中加入9.6μL 1mol/L NH₄Cl溶液，室温孵育；上1ml的分子筛柱，以PBS缓冲液洗脱，收集1ml/管，加入PBS缓冲液与0.01%叠氮钠的混合液，置-20℃避光保存。

进一步地，步骤a)中PBST缓冲液的pH值为7.4。

与现有技术相比，本发明具有如下的优点：

（1）本发明在样品前处理过程中加入一定量的乳糖溶液，保护乳酸菌中的有效成分不被破坏，并使菌体更加均匀分散，降低乳酸菌在检测过程中的死亡率，提高了样品中乳酸菌的检出率。

（2）水浴使得乳酸菌群中的目标菌体在适宜的温度下快速生长，采用低温离心，避免高温干扰目标菌的生物活性，同时，通过离心将目标菌体富集，提高了目标菌的检出率。

（3）本发明利用乳酸菌免疫磁珠能同时特异性地捕获双歧杆菌、嗜热链球菌和乳杆菌，将目标菌从样品中快速分离，整合了免疫反应的高度特异性和磁分离的快速、简单的优点，以降低对检测准确性的干扰，有效避免或减少假阳性现象的发生，并实现同步检测三种目标菌，提高了目标菌的检出率，同时缩短了检测时间，由传统的3天时间缩减值24小时内即可出结果。

（4）在PBS缓冲液中添加BSAV，阻止蛋白、脂肪等大分子干扰，使样品中的目标菌更加稳定地生长，并在后续洗脱过程以PBS缓冲液为洗脱液减少目标菌的洗脱率，有利于目标菌的检出率。

（5）以无水DMSO配制BNHS溶液，为目标菌抗体提供适宜的生物素化程度，防止目标菌抗体生物素化不足或者过多，干扰后续检测结果的准确性；在PBST缓冲液中加入Tween-20，利用该缓冲液将抗体溶液透析，以除去未结合的生物素，防止反应混合液中有叠氮钠或游离氨基存在，而抑制目标菌抗体的生物素标记反应，提高检测结果的准确性。

综上所述，本发明在样品处理过程中通过添加乳糖溶液并经水浴和离心处理，有利于目标菌的快速生长和富集，提高了样品中目标菌的检出率及检测结果的准确性；利用乳酸菌免疫磁珠，特异性地吸附目标菌，使目标菌进行富集，有效缩短了整个检测时间。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明作进一步的说明。

乳酸菌免疫磁珠的制备

a)用pH值为7.4，浓度为0.01mol/L的PBST缓冲液稀释乳酸菌抗体至1mg/mL，所述乳酸菌抗体为双歧杆菌抗体、嗜热链球菌抗体和乳杆菌抗体按照重量比为4:3:3混匀后的混合物，,用无水DMSO配制10mg/mL生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液，在生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液中加入稀释的乳酸菌抗体进行混合，生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液与乳酸菌抗体的体积比为4︰1，室温下孵育，即得生物素标记的乳酸菌抗体；

b)在生物素标记的乳酸菌抗体中加入1mg已活化溶解的链霉素亲和素修饰磁珠进行混合，得到抗体与磁珠的混合物，室温放置；

c)在步骤b)所得的混合物中加入9.6μL 1mol/L NH4Cl溶液，室温孵育；上1ml的分子筛柱，以PBS缓冲液洗脱，收集1ml/管，加入PBS缓冲液与0.01%叠氮钠的混合液，置-20℃避光保存。

实施例1 BSAV浓度的选择

分别取6份225mL含有不同浓度的BASV的PBS缓冲液（PBS浓度为0.02mol/L）于均质袋中，每个均质袋内加入25g均含有双歧杆菌、乳杆菌和嗜热链球菌的阳性样品，均质30s，均质混匀后，得到样品匀液，由于此时样品匀液中目标菌浓度较高，直接按照GB4789.35中规定的检测方法，无法计数，故需要对样品匀液进行稀释，按照10倍梯度稀释，将样品匀液稀释至10^-5，得到被稀释的样品匀液；添加BSAV的浓度分别为0%（未添加BSAV）、0.5%、1%、2%、3%和5%。

另外，再取225mL 0.85%生理盐水作为对比液，加入25g含有双歧杆菌、乳杆菌和嗜热链球菌的阳性样品，均质30s，均质混匀后，按照10倍梯度稀释，稀释至10^-5，制成被稀释的样品匀液，作为对比例。

按照GB4789.35中规定的检测方法，分别对上述样品匀液进行增菌、划线分离和涂板计数等操作，得出试验结果，结果如表1所示。

从表1结果可知，经含有1%BSAV的PBS缓冲液培养后可检测到的菌落数最高，而继续增加其浓度，菌落数并未进一步提高，因此BSAV的浓度优选为1%。

实施例2 乳糖溶液浓度的选择

取7份均含有双歧杆菌、乳杆菌和嗜热链球菌的阳性样品25g，加入225mL含有1%BASV的PBS缓冲液于均质袋中，均质30s，均质混匀后，按照10倍梯度稀释，稀释至10^-5，得到被稀释的样品匀液，在稀释后的样品匀液中添加乳糖溶液20mL，乳糖溶液的浓度分别为0%（国标）、1%、2%、5%、8%、10%和20%。

按照GB4789.35中规定的检测方法，分别对上述样品液进行增菌、划线分离和涂板计数等操作，得出试验结果，结果如表2所示。

从表2结果可知，经添加5%的乳糖溶液后可检测到的菌落数最高，而继续增加其浓度，菌落数有所下降，因此添加乳糖溶液的浓度优选为5%。

实施例3 乳糖溶液添加量的选择

取6份均含有双歧杆菌、乳杆菌和嗜热链球菌的阳性样品25g，加入225mL含有1%BASV的PBS缓冲液于均质袋中，均质30s，均质混匀后，按照10倍梯度稀释，将样品稀释至10^-5，得到被稀释的样品匀液，在稀释后的样品匀液中添加浓度为5%的乳糖溶液，其中乳糖溶液的添加量分别为0mL（国标）、5mL、10mL、20mL、40mL和50mL。

按照GB4789.35中规定的检测方法，分别对上述样品液进行增菌、划线分离和涂板计数等操作，得出试验结果，结果如表3所示。

从表3结果可知，乳糖溶液的添加量为20mL时，可检测到的菌落数最高，而继续增加其添加量，菌落数有所下降，因此，当乳糖溶液的浓度为5%时，乳糖溶液的添加量优选为20mL。

实施例4 水浴温度的选择

取4份均含有双歧杆菌、乳杆菌和嗜热链球菌的阳性样品25g，加入225mL含有1%BASV的PBS缓冲液于均质袋中，均质30s，均质混匀后，按照10倍梯度稀释，将样品稀释至10^-5，得到被稀释的样品匀液，在稀释后的样品匀液中添加浓度为5%的乳糖溶液20mL，混匀后，分别在35℃、40℃、45℃和50℃的温度下水浴3min。

按照GB4789.35中规定的检测方法，分别对上述样品液进行划线分离和涂板计数等操作，得出试验结果，结果如表4所示。

从表4结果可知，水浴温度为45℃时，可检测到的菌落数最高，温度低则不利于菌体繁殖，而温度过高则会影响菌体活性，故水浴温度优选为45℃。

实施例5 离心时间的选择

取含有双歧杆菌、乳杆菌和嗜热链球菌的阳性样品25g，加入225mL含有1%BASV的PBS缓冲液于均质袋中，均质30s，均质混匀后，按照10倍梯度稀释，将样品稀释至10^-5，得到被稀释的样品匀液，在稀释后的样品匀液中添加浓度为5%的乳糖溶液20mL，混匀后，在45℃下水浴3min，得到样品菌液。分别取4份5mL的样品菌液，在离心温度为4℃，转速为6000rpm的条件下，离心时间分别为1min、3min、5min和6min。

离心分离后除去上清液后得到菌悬液；在菌悬液中加入100µL 5mg/mL的乳酸菌免疫磁珠，经混合、振荡1min后于磁力架上静置2min后，弃上层，对下层样品用1mL 0.02mol/L的PBS洗脱液洗脱，重复振荡、磁分离和洗脱过程3次后，在洗脱后的乳酸菌免疫磁珠中加入100µL 0.02mol/L PBS缓冲液，振荡重悬磁珠，得到样品待测液100µL。

按照GB4789.35中规定的检测方法，分别对上述样品待测液进行涂板计数操作，得出试验结果，结果如表5所示。

从表5结果可知，离心时间为3min时，可检测到的菌落数最高，继续增加离心时间，所检测到的菌落数几乎不变，故菌液的离心时间优选为3min。

实施例6 免疫磁珠振荡时间的选择

取含有双歧杆菌、乳杆菌和嗜热链球菌的阳性样品25g，加入225mL含有1%BASV的PBS缓冲液于均质袋中，均质30s，均质混匀后，按照10倍梯度稀释，将样品稀释至10^-5，得到被稀释的样品匀液，在稀释后的样品匀液中添加浓度为5%的乳糖溶液20mL，混匀后，在45℃下水浴3min，得到样品菌液。分别取5份5mL的样品菌液，在离心温度为4℃，转速为6000rpm的条件下，离心时间为3min，离心分离除去上清液后，得到菌悬液，在菌悬液中加入5mg/mL的乳酸菌免疫磁珠100µL，混合均匀，并对混合后的菌液进行不同时间的振荡，振荡结束后，将菌液置于磁力架上静置2min后，除去上清液，在剩余物中加入1mL 0.02mol/L的PBS洗脱液进行洗脱，重复振荡、磁分离和洗脱过程3次后，在洗脱后的免疫磁珠中加入100µL0.02mol/L的PBS缓冲液，振荡重悬磁珠，得到样品待测液100µL。所述振荡时间分别为：0.5min、1min、1.5min、2min和3min。

按照GB4789.35中规定的检测方法，分别对上述样品待测液进行涂板计数操作，得出试验结果，结果如表6所示。

从表6结果可知，振荡时间为1min时，检测到的菌落数最多，时间过长或过短，菌落数变化较小，振荡时间优选为1min。

实施例7 免疫磁珠分离乳酸菌灵敏度试验

取含有双歧杆菌、乳杆菌和嗜热链球菌的阳性样品25g，加入225mL含有1%BASV的PBS缓冲液于均质袋中，均质30s，均质混匀后，按照10倍梯度稀释，将样品稀释至10^-7、10^-8、10^-9和10^-10四个不同的浓度梯度的样品匀液，每个不同浓度梯度的样品匀液均取100µL涂于MRS平板，36℃培养24h观察菌落并计数。

在另外四个不同浓度梯度的样品匀液中添加浓度为5%的乳糖溶液20mL，混匀后，在45℃下水浴3min，得到样品菌液。分别取5份5mL的样品菌液，在离心温度为4℃，转速为6000rpm的条件下，离心时间为3min，离心分离除去上清液后，得到菌悬液，在菌悬液中加入5mg/mL的乳酸菌免疫磁珠100µL，混合均匀，并对混合后的菌液振荡1min，振荡结束后，将菌液置于磁力架上静置2min后，除去上清液，在剩余物中加入1mL 0.02mol/L的PBS洗脱液进行洗脱，重复振荡、磁分离和洗脱过程3次后，在洗脱后的免疫磁珠中加入100µL 0.02mol/L的PBS缓冲液，振荡重悬磁珠，得到样品待测液100µL,将样品待测液涂于MRS平板，36℃培养24h观察菌落并计数，结果如表7所示。

从表7结果可知，经免疫磁珠富集后，乳酸菌菌落的检出量明显高于直接平板计数，在样品液稀释至10^-10时，直接平板计数已经无法检测出目标菌，而经免疫磁珠富集后，依然能检测出目标菌，可见，本发明提供的检测方法的灵敏度高于传统的直接平板计数法。

Claims (3)

1.一种益生菌中乳酸菌的检测方法，其特征在于，所述乳酸菌为双歧杆菌、嗜热链球菌和乳杆菌的混合物，所述检测方法包括以下步骤：

1)将待测样品加入到添加有质量浓度为1%的牛血清白蛋白第五组分的PBS缓冲液中，均质，制成样品匀液，待测样品与PBS缓冲液的用量比为1g:9mL；将样品匀液混匀后再加入浓度为5%的乳糖溶液，乳糖溶液与待测样品的体积比为0.8︰1，经45℃水浴3min后得到样品菌液，在离心温度为4℃，离心转速为6000rpm条件下，离心3min分离除去上清液后得到菌悬液；

2)向步骤1）所得的菌悬液中加入浓度为5mg/mL的乳酸菌免疫磁珠，乳酸菌免疫磁珠与样品菌液的体积比为1︰50，经混合、振荡1min后于磁力架上静置2min分层，弃上层，对下层样品用浓度为0.02mol/L的PBS缓冲液进行洗脱，重复振荡、磁分离和洗脱过程2～3次，在洗脱后的乳酸菌免疫磁珠中加入PBS缓冲液，振荡重悬磁珠，得到样品待测液；所述乳酸菌免疫磁珠采用链霉亲和素修饰磁珠偶联生物素标记的乳酸菌抗体制得；所述乳酸菌抗体为双歧杆菌抗体、嗜热链球菌抗体和乳杆菌抗体按照重量比为4:3:3混匀后的混合物；

3)将样品待测液培养、观察、检测。

2.根据权利要求1所述的益生菌中乳酸菌的检测方法，其特征在于，所述乳酸菌免疫磁珠的制备方法，包括以下步骤：

a)用0.01mol/L磷酸盐-吐温20缓冲液稀释乳酸菌抗体至1mg/mL，用无水DMSO配制10mg/mL生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液，在生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液中加入稀释的乳酸菌抗体进行混合，生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液与乳酸菌抗体的体积比为4︰1，室温下孵育，即得生物素标记的乳酸菌抗体；

b)在生物素标记的乳酸菌抗体中加入1mg已活化溶解的链霉素亲和素修饰磁珠进行混合，得到抗体与磁珠的混合物，室温放置；

c)在步骤b)所得的混合物中加入9.6μL 1mol/L NH₄Cl溶液，室温孵育；上1ml的分子筛柱，以PBS缓冲液洗脱，收集1ml/管，加入PBS缓冲液与0.01%叠氮钠的混合液，置-20℃避光保存。

3.根据权利要求2所述的益生菌中乳酸菌的检测方法，其特征在于，所述步骤a)中磷酸盐-吐温20缓冲液的pH值为7.4。