Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

CN116497029B - 小鼠进行基因敲除的方法及构建的lmna基因敲除小鼠模型 - Google Patents

小鼠进行基因敲除的方法及构建的lmna基因敲除小鼠模型 Download PDF

Info

Publication number
CN116497029B
CN116497029B CN202310506530.2A CN202310506530A CN116497029B CN 116497029 B CN116497029 B CN 116497029B CN 202310506530 A CN202310506530 A CN 202310506530A CN 116497029 B CN116497029 B CN 116497029B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
injection
grna
mouse
lmna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202310506530.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN116497029A (zh
Inventor
范柠粼
武会娟
王玮
丁晓婷
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Laboratory Animal Research Center Co ltd
Original Assignee
Beijing Laboratory Animal Research Center Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Laboratory Animal Research Center Co ltd filed Critical Beijing Laboratory Animal Research Center Co ltd
Priority to CN202310506530.2A priority Critical patent/CN116497029B/zh
Publication of CN116497029A publication Critical patent/CN116497029A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN116497029B publication Critical patent/CN116497029B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knock-out vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/89—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microinjection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本申请提供一种用于靶向小鼠LMNA基因的gRNA、对小鼠进行基因敲除的方法以及LMNA基因敲除的小鼠模型的构建方法。其中，所述方法包括利用基因编辑技术，破坏小鼠的LMNA基因的第二外显子区域。本申请设计了特异性靶向小鼠LMNA基因的两条gRNA，利用Cas9蛋白将LMNA基因的第二外显子敲除，造成移码突变，从而达到对小鼠进行基因敲除的目的。本申请对小鼠基因改造的方法简单易行，周期短，利用该方法构建的小鼠模型可以充分研究LMNA基因在衰老等疾病的致病机理，并为进一步开发针对此类疾病的治疗方式提供服务。

Description

小鼠进行基因敲除的方法及构建的LMNA基因敲除小鼠模型
技术领域
本申请属于基因工程技术领域，具体地，涉及一种对小鼠进行基因敲除的方法及利用该方法构建的LMNA基因敲除小鼠模型。
背景技术
核纤层蛋白也被称为第五类中间纤维，是细胞核中提供结构功能和调控转录的纤维蛋白。核纤层蛋白与膜相关蛋白相互交织，形成了核膜内侧下方的核纤层。核纤层蛋白涉及有丝分裂中核膜的解体与重建以及核孔的定位。核纤层蛋白分为两类：A型核纤层蛋白和B型核纤层蛋白，它们展示了一个N末端非结构化头部结构域、一个参与组装成细丝的中央螺旋杆结构域和一个球状C末端尾部，其中包含核定位信号和参与蛋白质-蛋白质的免疫球蛋白样(IgG样)折叠相互作用。其中A型核纤层蛋白是由A型核纤层蛋白(LMNA)基因编码，LMNA基因的突变可引起多种罕见的病症，它们可能会影响横纹肌、脂肪组织、神经或者其他系统等，并伴有各种加速衰老综合症。
LMNA基因的点突变导致椎板破裂并损害核完整性；LMNA基因的异常剪接引起早衰症和其他早衰综合症，它的特征是严重的生长迟缓、发育迟缓、脱发、骨质疏松症、严重的动脉粥样硬化伴心血管功能下降、皮肤色素沉着异常、脂肪营养不良和关节挛缩；LMNA基因突变可导致Dunnigan型脂肪营养不良综合征，其特征是四肢缺乏脂肪组织及其在颈部和面部的积聚，并伴有代谢异常。脂肪代谢障碍的症状可能与成人早衰样综合征部分重叠，这是LMNA在脂肪储存以及脂肪细胞发育中的重要作用基础，多种疾病的发生可导致衰老综合症的产生。
发明内容
本申请的目的在于提供一种对小鼠进行基因敲除的方法及构建的LMNA基因敲除小鼠模型。
具体来说，本申请涉及如下方面：
1.一种用于靶向小鼠LMNA基因的gRNA，其中所述gRNA包含与小鼠LMNA基因的第二外显子区域互补的核苷酸序列。
2.根据项1所述的gRNA，其中小鼠LMNA基因的第二外显子区域的靶序列如SEQ IDNO:5所示。
3.根据项1所述的gRNA，其中所述gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。
4.一种对小鼠进行基因敲除的方法，其中所述方法包括：
利用基因编辑技术，破坏小鼠的LMNA基因的第二外显子区域。
5.根据项4所述的构建方法，其中所述基因编辑技术为基于锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas基因编辑技术，优选地，所述基因编辑技术为CRISPR/Cas9基因编辑技术。
6.根据项4所述的方法，其中用于靶向所述第二外显子区域的gRNA选自SEQ IDNO:1所示的第一gRNA和SEQ ID NO:2所示的第二gRNA中的一种或两种。
7.根据项4所述的方法，其中所述方法包括以下步骤：
制备包含Cas9 mRNA和用于靶向所述第二外显子区域的gRNA的基因编辑注射液；
将所述基因编辑注射液注射到小鼠的受精卵内；
将注射后的受精卵分裂得到的二细胞移植到假孕小鼠中以得到F0代小鼠。
8.根据项7所述的方法，其中所述方法还包括：
基于F0代小鼠筛选LMNA基因敲除的纯合子代，以得到LMNA基因敲除的纯合小鼠。
9.根据项7所述的方法，其中所述制备包含Cas9 mRNA和用于靶向所述第二外显子区域的gRNA的基因编辑注射液包括以下步骤：
构建包含用于靶向所述第二外显子区域的gRNA的载体，并将载体通过体外转录，以得到gRNA注射液；
将包含Cas9 mRNA的载体通过体外转录，以得到Cas9 mRNA注射液；
将所述gRNA注射液和所述Cas9 mRNA注射液混合，以得到基因编辑注射液。
10.根据项7所述的方法，其中所述注射为显微注射。
11.根据项7所述的方法，其中所述基因编辑注射液中Cas9 mRNA、所述第一gRNA和所述第二gRNA的摩尔比为(2～3):(1～5)：(1～5)。
12.根据项7所述的方法，其中所述基因编辑注射液还包括荧光素，优选地，荧光素在所述基因编辑注射液中的浓度为0.5-2mg/mL。
13.一种LMNA基因敲除的小鼠模型的构建方法，其中所述方法包括：
利用基因编辑技术，破坏小鼠的LMNA基因的第二外显子区域。
14.根据项13所述的构建方法，其中小鼠LMNA基因的第二外显子区域的靶序列如SEQ ID NO:5所示。
15.根据项13所述的构建方法，其中所述基因编辑技术为基于锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas基因编辑技术，优选地，所述基因编辑技术为CRISPR/Cas9基因编辑技术。
16.根据项13所述的方法，其中用于靶向所述第二外显子区域的gRNA选自SEQ IDNO:1所示的第一gRNA和SEQ ID NO:2所示的第二gRNA中的一种或两种。
17.根据项13所述的方法，其中所述方法包括以下步骤：
制备包含Cas9 mRNA和用于靶向所述第二外显子区域的gRNA的基因编辑注射液；
将所述基因编辑注射液注射到小鼠的受精卵内；
将注射后的受精卵分裂得到的二细胞移植到假孕小鼠中，以得到F0代小鼠。
18.根据项17所述的方法，其中所述方法还包括：
基于F0代小鼠筛选LMNA基因敲除的纯合子代，以得到LMNA基因敲除的小鼠模型。
19.根据项17所述的方法，其中所述制备包含Cas9 mRNA和用于靶向所述第二外显子区域的gRNA的基因编辑注射液方法包括以下步骤：
构建包含用于靶向所述第二外显子区域的gRNA的载体，并将载体通过体外转录，以得到gRNA注射液；
将包含Cas9 mRNA的载体通过体外转录，以得到Cas9 mRNA注射液；
将所述gRNA注射液和所述Cas9 mRNA注射液混合，以得到基因编辑注射液。
20.根据项17所述的方法，其中所述注射为显微注射。
21.根据项17所述的方法，其中所述基因编辑注射液中Cas9 mRNA、所述第一gRNA和所述第二gRNA的摩尔比为(2～3):(1～5)：(1～5)。
22.根据项17所述的方法，其中所述基因编辑注射液还包括荧光素。
23.根据项22所述的方法，其中荧光素在所述基因编辑注射液中的浓度为0.5-2mg/mL。
24.一种LMNA基因敲除的小鼠模型，其中所述小鼠模型通过项13-23中任一项所述的方法构建。
本申请设计了特异性靶向小鼠LMNA基因的两条gRNA，利用Cas9蛋白将LMNA基因的第二外显子敲除，造成移码突变，从而达到对小鼠进行基因敲除的目的。本申请对小鼠基因改造的方法简单易行，周期短，利用该方法构建的小鼠模型可以充分研究LMNA基因在衰老等疾病的致病机理，并为进一步开发针对此类疾病的治疗方式提供服务。
附图说明
图1为LMNA基因靶点单核苷酸多态性检测结果，其中M为D2000 Marker，条带分别为100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，1500bp，2000bp。
图2为重组载体体外转录胶图，其中M为D2000 Marker，条带分别为100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，1500bp，2000bp。
图3为F0代小鼠LMNA基因型鉴定结果。
图4为F2代小鼠LMNA基因型鉴定结果。
图5为小鼠外观检查结果。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本申请，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本申请，并非用于限制本申请。
除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。以下结合具体实施例对本申请作进一步的说明，但不用来限制本申请的范围。
定义
在本文中使用的术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用。它们是指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)或其类似物的聚合形式。多核苷酸的实例包括但不限于基因或基因片段的编码区或非编码区、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、小分子RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列分离的DNA、任何序列分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸中的一个或多个核苷酸可以经进一步修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸也可以在聚合之后修饰，例如通过与标记剂偶联。
在本文中使用的术语“CRISPR/Cas9”是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9基因编辑技术，则是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。以CRISPR/Cas9为基础的基因编辑技术在一系列基因治疗的应用领域都展现出极大的应用前景，例如血液病、肿瘤和其他遗传疾病。该技术成果已应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠以及细菌的基因组精确修饰。
在本文中使用的术语“gRNA”、“向导RNA”和“CRISPR向导序列”可通篇互换使用并且是指包含决定CRISPR/Cas系统Cas结合蛋白的特异性的序列的核酸。gRNA与宿主细胞基因组中的靶核酸序列杂交(部分或完全互补)。与靶核酸杂交的gRNA或其部分的长度可介于15-25个核苷酸、18-22个核苷酸或19-21个核苷酸之间。在一些实施方式中，与靶核酸杂交的gRNA序列的长度可为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在一些实施方式中，与靶核酸杂交的gRNA序列的长度介于10-30或15-25个核苷酸之间。
在本文中使用的术语“sgRNA”通常是指人工CRISPR/Cas9系统中，单分子向导RNA或单链向导RNA，是指引导Cas蛋白特异性结合靶标DNA序列的RNA，是CRISPR基因敲除/敲入系统中重要的组成部分。本申请的sgRNA包含靶向目标序列的指导序列。在优选实施方案中，本申请的sgRNA进一步包含tracr序列和tracr伴侣序列。
本申请中的“指导序列”(guide sequence)是指指定靶向位点的约17-20bp的序列，且可与“引导序列”或“间隔子”互换使用。在形成CRISPR复合物的背景下，“靶序列”是指导序列经设计以与其具有互补性的序列，其中靶序列和指导序列间的杂交促进CRISPR复合物的形成，所述杂交要求“靶序列”和“指导序列”或称“引导序列”有足够的互补性，能引起杂交并促进CRISPR复合物形成即可，完全互补不是必须的。
“互补”是指“指导序列”或称“引导序列”与靶核苷酸序列(就本申请而言为小鼠受精卵的LMNA基因的第二外显子区域靶核苷酸序列)可以通过沃森和克里克发现的核苷酸配对原则杂交。本领域技术人员可以理解，只要具有足够的互补性，“指导序列”便可与靶核苷酸序列杂交，而不需要它们之间具有100％的完全互补。在一些实施方案中，当使用适当的比对算法最佳比对时，指导序列及其相应靶序列间的互补程度可为约或大于约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。最佳比对可用于比对序列的任何适当的算法确定，包括Smith-Waterman算法、Needleman-Wimsch算法、基于Burrows-Wheeler Transform的算法等。
通常，在内源CRISPR系统的背景下，CRISPR复合物的形成(包括指导序列与靶序列杂交并与一种或多种Cas蛋白复合)导致靶序列中或靶序列附近(例如，距离靶序列1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或更多碱基对的范围内)的一条链或两条链的切割。不希望受理论所限，tracr序列可包含野生型tracr序列的全部或其一部分，例如野生型tracr序列约或大于约20、23、26、29、32、35、38、41、44、47、50、53、56、59、62、65、70、75、80、85或更多个核苷酸)或由上述组成的tracr序列还可形成CRISPR复合物的一部分，例如通过沿tracr序列的至少一部分与指导序列可操作连接的tracr伴侣序列的全部或一部分杂交。
在一些实施方式中，tracr序列与tracr伴侣序列具有足够的互补性以杂交并参与CRISPR复合物的形成。与“靶序列”和“指导序列”或称“引导序列”杂交的情况类似，完全互补并不是必须的，只要足以发挥其功能即可。在一些实施方案中，在最佳对齐的情况下，tracr序列沿tracr伴侣序列的长度具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的互补性。
在本文中使用的术语“基因敲除”或“敲除”是指，对细胞中的基因进行编辑(例如，对该基因进行插入、替换、和/或删除等改造)，使得该基因丧失其原有功能(例如，不能表达功能性的蛋白)。可使用各种已知的分子生物学技术(例如，使用基于锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术和CRISPR/Cas(如CRISPR/Cas9)基因编辑技术)来编辑细胞基因组中的基因。基因敲除并不局限于将整个基因完整缺失或去除，而只要使基因丧失其原有功能即可。例如，可通过在基因中插入外源DNA片段，使得该基因无法表达功能性蛋白，或可通过在基因中插入或缺失一个或数个碱基，使得该基因发生移码突变，来实现对该基因的敲除。例如，在本申请的基因敲除可以使用CRISPR/Cas9基因编辑技术。
在本文中使用的术语“载体”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
在本文中使用的术语“显微注射”是指将物质注射到生物体的器官、组织、细胞或细胞内的细胞器。上述物质可包含化学物质、多核苷酸或多肽。
本申请提供用于靶向小鼠LMNA基因的gRNA，所述gRNA包含与小鼠LMNA基因的第二外显子区域互补的核苷酸序列。
在一个具体的实施方式中，小鼠LMNA基因的第二外显子区域的靶序列如SEQ IDNO:5所示。
其中，SEQ ID NO:5为：
CAACACCAAGAAGGAGGGGGACTTGTTGGCTGCGCAGGCCCGGCTCAAGGACCTCGAGGCTCTTCTCAACTCCAAGGAAGCTGCCCTGAGCACTGCTCTCAGTGAGAAGCGCACATTGGAGGGCGAGCTCCATGACCTGCGGGGGCAGGTAGCCAAG
在一个具体的实施方式中，所述gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。
其中，SEQ ID NO:1为：
AACCCAGCCTCAGAAACTGG
SEQ ID NO:2为：
GAGCTGTCTAGGGAGACAGG。
本申请提供一种对小鼠进行基因敲除的方法，其中所述方法包括：利用基因编辑技术，破坏小鼠的LMNA基因的第二外显子区域。
本领域技术人员可以理解，在获知高效基因编辑区域(在本申请为小鼠的LMNA基因的第二外显子区域)后，本领域技术人员可以用任何基因编辑方法，例如基于锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术和CRISPR/Cas(如CRISPR/Cas9)基因编辑技术，以及今后发现的其它基因编辑方法，对所获知的高效基因编辑区域进行编辑，优化基因编辑条件，实现高效编辑的目的。因此，本申请涵盖通过任何可利用的基因编辑方法对本申请所鉴定的小鼠的LMNA基因的第二外显子区域靶序列的技术方案。
在一个具体的实施方式中，本申请通过CRISPR/Cas9技术，破坏小鼠的LMNA基因的第二外显子区域，其中CRISPR/Cas9技术中使用的gRNA靶向小鼠的LMNA基因的第二外显子区域。
其中，LMNA基因位于小鼠3号染色体，基因位置为GRCm39 NC_000069.7(88388455..88413842)。
在一个具体的实施方式中，用于靶向所述第二外显子区域的gRNA选自SEQ ID NO:1所示的第一gRNA和SEQ ID NO:2所示的第二gRNA中的一种或两种。
在一个具体的实施方式中，用于靶向所述第二外显子区域的gRNA为SEQ ID NO:1所示的第一gRNA和SEQ ID NO:2所示的第二gRNA两种。
在一个具体的实施方式中，对小鼠进行基因敲除的方法包括以下步骤：制备包含Cas9 mRNA和用于靶向所述第二外显子区域的gRNA的基因编辑注射液；将所述基因编辑注射液注射到小鼠的受精卵内；将注射后的受精卵分裂得到的二细胞移植到假孕小鼠中，以得到F0代小鼠。
其中，基因编辑注射液的制备方法可以通过本领域的各种已知方法制备。
在一个具体的实施方式中，制备包含Cas9 mRNA和用于靶向所述第二外显子区域的gRNA的基因编辑注射液包括以下步骤：构建包含用于靶向所述第二外显子区域的gRNA的载体，并将载体通过体外转录，以得到gRNA注射液；将包含Cas9 mRNA的载体通过体外转录，以得到Cas9 mRNA注射液；将所述gRNA注射液和所述Cas9 mRNA注射液混合，以得到基因编辑注射液。
其中，包含gRNA的载体，以及包含Cas9 mRNA的载体的构建可以通过本领域已知的方法。
在一个具体的实施方式中，通过酶切酶连的方式将gRNA构建到pUC57载体上。
在一个具体的实施方式中，制备包含Cas9 mRNA和用于靶向所述第二外显子区域的gRNA的基因编辑注射液包括以下步骤：构建包含第一gRNA的载体和包含第二gRNA的载体，将载体通过体外转录，以得到gRNA注射液；将包含Cas9 mRNA的载体通过体外转录，以得到Cas9 mRNA注射液；将所述gRNA注射液和所述Cas9 mRNA注射液混合，以得到基因编辑注射液。
在一个具体的实施方式中，所述基因编辑注射液中Cas9 mRNA、所述第一gRNA和所述第二gRNA的摩尔比为(2～3):(1～5)：(1～5)，例如可以为2:1:1、2:1:2、2:1:3、2:1:4、2:1:5、2:2:1、1:1:1、2:2:3、2:2:4、2:2:5、2:3:1、2:3:2、2:3:3、2:3:4、2:3:5、2:4:1、2:4:2、2:4:3、2:4:4、2:4:5、2:5:1、2:5:2、2:5:3、2:5:4、2:5:5、3:1:1、3:1:2、3:1:3、3:1:4、3:1:5、3:2:1、3:2:2、3:2:3、3:2:4、3:2:5、3:3:1、3:3:2、3:3:4、3:3:5、3:4:1、3:4:2、3:4:3、3:4:4、3:4:5、3:5:1、3:5:2、3:5:3、3:5:4、3:5:5等。
进一步地，所述基因编辑注射液还可以包括荧光素，可以为本领域已知的各种类型的荧光素，例如荧光素钠。荧光素的加入可用于后续二细胞的筛选，例如上述受精卵分裂得到的二细胞可以为携带荧光的二细胞。
在一个具体的实施方式中，荧光素在所述基因编辑注射液中的浓度为0.5-2mg/mL，例如可以为0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL、1mg/mL、1.1mg/mL、1.2mg/mL、1.3mg/mL、1.4mg/mL、1.5mg/mL、1.6mg/mL、1.7mg/mL、1.8mg/mL、1.9mg/mL、2mg/mL。
在一个具体的实施方式中，上述注射为显微注射。显微注射的具体操作是本领域已知的。对于得到的F0代小鼠，由于受精卵早期卵裂速度很快，因此得到的F0代小鼠为杂合子，不一定具备稳定遗传的能力，需要进行传代以获得可稳定遗传的F1代小鼠，因此本申请的方法还可以进一步包括：基于F0代小鼠筛选LMNA基因敲除的纯合子代，以得到LMNA基因敲除的小鼠。
在一个具体的实施方式中，对小鼠进行基因敲除的方法包括以下步骤：构建包含第一gRNA的载体和包含第二gRNA的载体，并将载体通过体外转录，以得到gRNA注射液；将包含Cas9 mRNA的载体通过体外转录，以得到Cas9mRNA注射液；将所述gRNA注射液和所述Cas9mRNA注射液混合，以得到基因编辑注射液；将所述基因编辑注射液注射到小鼠的受精卵内；将注射后的二细胞移植到假孕小鼠中以得到F0代小鼠；基于F0代小鼠筛选LMNA基因敲除的纯合子代，以得到LMNA基因敲除的小鼠。其中，第一gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，第二gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。所述基因编辑注射液中Cas9 mRNA、所述第一gRNA和所述第二gRNA的摩尔比为2:1:1。所述注射为显微注射。
在一个具体的实施方式中，所述小鼠是C57BL/6J小鼠。
本申请还提供一种LMNA基因敲除的小鼠模型的构建方法，所述方法包括：利用基因编辑技术，破坏小鼠的LMNA基因的第二外显子区域。
在一个具体的实施方式中，本申请通过CRISPR/Cas9技术，破坏小鼠的LMNA基因的第二外显子区域，其中CRISPR/Cas9技术中使用的gRNA靶向小鼠的LMNA基因的第二外显子区域。
在一个具体的实施方式中，LMNA基因敲除的小鼠模型的构建方法包括以下步骤：制备包含Cas9 mRNA和用于靶向所述第二外显子区域的gRNA的基因编辑注射液；将所述基因编辑注射液注射到小鼠的受精卵内；将注射后的受精卵分裂得到的二细胞移植到假孕小鼠中，以得到F0代小鼠。
在一个具体的实施方式中，对小鼠进行基因敲除的方法包括以下步骤：构建包含第一gRNA的载体和包含第二gRNA的载体，并将载体通过体外转录，以得到gRNA注射液；将包含Cas9的载体通过体外转录，以得到Cas9 mRNA注射液；将所述gRNA注射液和所述Cas9mRNA注射液混合，以得到基因编辑注射液；将所述基因编辑注射液注射到小鼠的受精卵内；将注射后的受精卵分裂得到的二细胞移植到假孕小鼠中以得到F0代小鼠；基于F0代小鼠筛选LMNA基因敲除的纯合子代，以得到LMNA基因敲除的小鼠模型。其中，第一gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，第二gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。所述基因编辑注射液中Cas9 mRNA、所述第一gRNA和所述第二gRNA的摩尔比为2:1:1。所述注射为显微注射。
本申请还提供通过上述方法构建得到的小鼠模型。
实施例
本申请所用仪器：
电泳仪(BiO-RAD，PowerPacTM Basic)，超微量分光光度计(鼎昊源，NanoPro2010)，ProFlex PCR System(赛默飞，ProFlex 3×32well PCR system)，化学发光凝胶成像分析系统(伯乐，Universal HoodⅡ)，精密恒温培养箱(一恒，BPH-9162)，雪花制冰机(厦门国仪，GYXH-35)，高速冷冻离心机(赛默飞，Sorvall Legend Micro 21R)，体视镜(奥林巴斯，SZX7)，持卵针(北京吉田生物)，注射针(北京吉田生物)、MicroloaderTM-微量上样针(eppendorf，5242956003)荧光倒置显微镜(奥林巴斯，IX73)，微量操作装置(成茂，ON4)，气动注射器(成茂，IM-12)，。
本申请所用试剂：
ECO31I(赛默飞，ER0291)，MinElute PCR Purification Kit(QIAGEN，2084)，T4DNA Ligase kit(索莱宝，T1410)，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase(诺唯赞，P505)，MinElute PCR Purification Kit(德国凯杰，28004)，MEGAshortscript T7Transcription Kit(赛默飞，AM1354)，M5 HiPer RNAclean Mini Kit(聚合美，MF746-01)，RNAsecure(赛默飞，AM7005),AgeI(西酶，SE1464S),mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit(赛默飞，AM1345),QIANGEN RNeasy Mini Kits(德国凯杰，74904),透明质酸酶(南京爱贝，M2215)，M2培养液(Sigma，M7167)，M16培养液(Sigma，R-010)，组织培养油(北京谨明SAGE，M10037ARF-4008P-5P),孕马血清激素PMSG(宁波三生生物)，人绒毛促性腺激素hCG(宁波三生生物)，PBS溶液(索莱宝，P1010)，荧光素钠(sigma，F6377)，TSINGKE TSE030 T3 SuperPCR Mix(TSINGKE，TSE030)，小提中量试剂盒(TIANGEN，DP118)，琼脂糖快速胶回收试剂盒(Generay，GK7045-200)，PCR产物纯化试剂盒(Generay，GK2052-100)，5min TA/Blunt-ZeroCloning Kit(诺唯赞，C601)。
实施例1
1gRNA设计
在小鼠LMNA基因的第二外显子处，设计敲除用的gRNA两条，分别为gRNA1和gRNA2。
其中，gRNA1的序列为：AACCCAGCCTCAGAAACTGG(SEQ ID NO:1)
gRNA2的序列为：GAGCTGTCTAGGGAGACAGG(SEQ ID NO:2)
2靶点单核苷酸多态性检测
使用NCBI Primer-BLAST，设计一对扩增包含所有gRNA的引物，使用该引物扩增需编辑基因组后无非特异性条带产生。其中，正向引物的序列为：GGGAGGGAAGCAAGCTGAAT(SEQID NO:3)，反向引物的序列为：AAAGTAGCGGACACTGCACA(SEQ ID NO:4)。
对扩增后的产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示。其中M为D2000 Marker，条带分别为100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，1500bp，2000bp。将含目的条带的PCR原液送至公司进行测序检测，电泳检测结果显示目的条带为1014bp，引物无特异性条带，测序检测结果显示sgRNA所在位置无单核苷酸突变。
3质粒构建
将擎科公司合成的gRNA-F和gRNA-R混合后按表1程序退火；选择合适的克隆位点，采用酶切方法将pUC57-T7载体线性化，酶切体系如表2；按表3酶连体系连接，将连接产物转化，涂板，挑单克隆，最终通过菌液PCR确定载体pUC57-T7-gRNA成功构建。
表1gRNA退火程序
表2pUC57-T7载体酶切体系
表3酶连体系
4基因编辑显微注射液配制
4.1gRNA注射液获取
利用PCR扩增pUC57-T7-gRNA1和pUC57-T7-gRNA2表达载体上的T7启动子及gRNA(包括gRNA1和gRNA2)序列作为体外转录模板进行体外转录(结果如图2的左图所示)。反应体系如表4所示，PCR程序如表5所示。随后利用M5 HiPer RNAclean Mini Kit纯化转录后的gRNA，获得gRNA显微注射液。
表4体外转录体系
表5PCR程序
4.2Cas9 mRNA注射液获取
线性化pST1374-NLS-flag-linker-Cas9载体的体系如表6所示。随后利用MinElute PCR Purification Kit(50)纯化回收线性化pST1374-NLS-flag-linker-Cas9载体，利用mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit体外转录获取Cas9 mRNA(结果如图2的右图所示)，利用mMESSAGE mMACHINE T7 UHra Kit给Cas9 mRNA加Poly(A)尾，利用QIANGENRNeasy Mini Kits纯化转录后Cas9 mRNA获得Cas9 mRNA注射液。
表6pST1374-NLS-flag-linker-Cas9载体线性化程序
4.3基因编辑注射液获取
将Cas9 mRNA与gRNA1、gRNA2以2：1：1摩尔比混合，获得基因编辑注射液。另外基因编辑显微注射液还包括荧光素钠，荧光素钠终浓度为1mg/mL。具体的配制体系如表7所示。
表7显微注射体系
5 显微注射
5.1 雌鼠超数排卵
将PMSG和hCG稀释到50IU/ml，在15:30腹腔注射4周龄C57BL/6J雌性小鼠PMSG，10IU/只。注射PMSG 47小时后，腹腔注射hCG，10IU/只。注射hCG后立即与雄鼠(10w+)合笼，1只雄鼠与1-2只雌鼠合笼。
5.2培养滴准备
透明质酸酶消化滴：在35mm培养皿中制作200μl透明质酸酶滴一个，在周围制作50μl M2培养滴5个，并用矿物油覆盖，37℃培养箱预热过夜。
M2注射滴：在35mm培养皿中制作100μl M2滴并用矿物油覆盖，37℃培养箱预热过夜。
5.3显微注射
合笼次日早检查阴道栓，取见栓雌鼠。脱颈处死雌鼠(3-4w)，剖开背部暴露子宫、输卵管及卵巢，取输卵管；在纸上去除脂肪和血液；在消化滴油内撕破输卵管膨大部，将带有卵丘细胞的卵子拉入透明质酸酶滴中；等待1-2min轻微晃动培养皿7-8次。消化后捡卵至M2注射滴中准备显微注射。在MicroloaderTM-微量上样针加入2-3μL显微注射液，排除气泡。固定并在镜下调节注射针和持卵针，并显微镜下碰断注射针。调节eppendorf微量注射仪参数，注射压力100-500hPa，注射时间0.5-2.0s，补充压力5-10hPa。注射完成后，将受精卵在M2培养基中培养至二细胞，挑选携带荧光的二细胞移植到代孕母鼠输卵管，待小鼠出生后取鼠尾鉴定。
6LMNA基因敲除小鼠基因型的鉴定及验证
6.1LMNA基因敲除小鼠基因型的鉴定
待F0代鼠出生5天后采集0.5cm小鼠鼠尾，放入无菌离心管内，裂解之后完成鼠尾DNA粗提取。以鼠尾DNA为模板，用靶点单核苷酸鉴定引物进行PCR扩增。然后将扩增的产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图3所示。将F0代杂合小鼠与野生型小鼠杂交得到F1杂合小鼠，将F1杂合小鼠雌鼠与雄鼠杂交得到的F2小鼠采用同样的方法进行PCR鉴定，结果如图4所示。发现野生型小鼠只有一条带，条带大小为1014bp，杂合小鼠两条带，一条为1014bp，一条602bp，纯合小鼠只有一条带，大小为602bp。结果表明LMNA基因敲除小鼠模型构建成功。
6.2表型鉴定
待F0代鼠和F2代鼠出生两周进行外观检查，结果如图5所示。发现相比于野生型小鼠，LMNA基因敲除小鼠体长小，尾巴弯曲，结果进一步表明LMNA基因敲除小鼠模型构建成功。

Claims (2)

1.一种LMNA基因敲除的小鼠模型的构建方法，其中所述方法包括：
构建包含用于靶向所述第二外显子区域的gRNA的载体，并将载体通过体外转录，以得到gRNA注射液；
将包含Cas9 mRNA的载体通过体外转录，以得到Cas9 mRNA注射液；
将所述gRNA注射液和所述Cas9 mRNA注射液混合，以得到基因编辑注射液；
将所述基因编辑注射液注射到小鼠的受精卵内；
将注射后的受精卵分裂得到的二细胞移植到假孕小鼠中，以得到F0代小鼠；
基于F0代小鼠筛选LMNA基因敲除的纯合子代，以得到LMNA基因敲除的小鼠模型；
其中用于靶向所述第二外显子区域的gRNA选自SEQ ID NO:1所示的第一gRNA和SEQ IDNO:2所示的第二gRNA；
小鼠LMNA基因的第二外显子区域的靶序列如SEQ ID NO:5所示；
所述基因编辑注射液中Cas9 mRNA、所述第一gRNA和所述第二gRNA的摩尔比为(2～3):(1～5)：(1～5)；
所述基因编辑注射液还包括荧光素，荧光素在所述基因编辑注射液中的浓度为0.5-2mg/mL。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述注射为显微注射。
CN202310506530.2A 2023-05-06 2023-05-06 小鼠进行基因敲除的方法及构建的lmna基因敲除小鼠模型 Active CN116497029B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310506530.2A CN116497029B (zh) 2023-05-06 2023-05-06 小鼠进行基因敲除的方法及构建的lmna基因敲除小鼠模型

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310506530.2A CN116497029B (zh) 2023-05-06 2023-05-06 小鼠进行基因敲除的方法及构建的lmna基因敲除小鼠模型

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN116497029A CN116497029A (zh) 2023-07-28
CN116497029B true CN116497029B (zh) 2024-09-17

Family

ID=87319918

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310506530.2A Active CN116497029B (zh) 2023-05-06 2023-05-06 小鼠进行基因敲除的方法及构建的lmna基因敲除小鼠模型

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116497029B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117778470A (zh) * 2024-02-07 2024-03-29 北京实验动物研究中心有限公司 小鼠进行基因敲除的方法及构建的Tyw5基因敲除小鼠模型
CN118109519A (zh) * 2024-03-05 2024-05-31 北京实验动物研究中心有限公司 一种小鼠lmna基因点突变打靶组合物及小鼠模型构建的方法
CN118147149A (zh) * 2024-04-16 2024-06-07 北京实验动物研究中心有限公司 小鼠进行基因敲除的方法及构建的miR-455基因敲除小鼠模型

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108410911B (zh) * 2018-03-09 2021-08-20 广西医科大学 基于CRISPR/Cas9技术构建的LMNA基因敲除的细胞系
CN112522261B (zh) * 2020-10-28 2023-07-25 南京启真基因工程有限公司 用于制备lmna基因突变的扩张型心肌病克隆猪核供体细胞的crispr系统及其应用
CN114990157B (zh) * 2021-03-01 2023-07-21 南京启真基因工程有限公司 用于构建lmna基因突变的扩张型心肌病模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GenBank: AK161221.1;NCBI database;《GenBank》;20101006 *
Generation and characterization of a conditional deletion allele for Lmna in mice;Youngjo Kim等;《Biochemical and Biophysical Research Communications》;20130830;第440卷;8-13 *
Single-dose CRISPR–Cas9 therapy extends lifespan of mice with Hutchinson–Gilford progeria syndrome;Ergin Beyret等;《Nature Medicine》;20190218;第25卷;419–422 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN116497029A (zh) 2023-07-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN116497029B (zh) 小鼠进行基因敲除的方法及构建的lmna基因敲除小鼠模型
US11369096B2 (en) Process for using crispr to transfect primordial germ cells in avians
CN111118019B (zh) 人源化细胞因子il3基因改造非人动物的构建方法及应用
CN107880132A (zh) 一种融合蛋白及使用其进行同源重组的方法
CN110628766B (zh) 与羊骨骼肌发育相关的lncRNA编码基因及其应用
US11913015B2 (en) Embryonic cell cultures and methods of using the same
CN117778470A (zh) 小鼠进行基因敲除的方法及构建的Tyw5基因敲除小鼠模型
CN108070613B (zh) 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
CN111100877B (zh) 肥厚型心肌病小鼠模型的制备方法及其应用
CN118389520B (zh) 小鼠进行基因敲除的方法及构建的ghr基因敲除小鼠模型
KR101703506B1 (ko) 형질전환동물 제작을 위한 형질주입 시스템
CN110218743B (zh) 一种基于CRISPR/Cas9技术的牛磺酸转运体基因敲除大鼠模型的构建方法
CN118147149A (zh) 小鼠进行基因敲除的方法及构建的miR-455基因敲除小鼠模型
CN112626122A (zh) hKDR人源化小鼠模型及其建立方法和应用
CN118109519A (zh) 一种小鼠lmna基因点突变打靶组合物及小鼠模型构建的方法
CN116355907A (zh) Fto基因敲除的猪细胞系及其构建方法
WO2019040744A1 (en) METHODS AND COMPOSITIONS FOR IN SITU GERMINAL GENOMIC GENE ENGINEERING
CN114747541B (zh) 一种psgl-1人源化非人类动物模型的构建方法及应用
CN118652933A (zh) Cd36基因过表达的山羊乳腺上皮细胞的构建方法及应用
US20230039930A1 (en) Methods and compositions for binding immunoglobulin protein targeting
CN118703565A (zh) Ltf基因过表达的山羊乳腺上皮细胞的构建方法及应用
Qi et al. Self-balanced regulation by the long non-coding RNA Lockd on the cell cycle progression of cortical neural progenitor cells through counteracting cis and trans roles
CN114846155A (zh) 体外受精中的hla i类分子和进一步的医学意义
CN112997966A (zh) 一种基于CRISPR/Cas9技术敲入miRNA-125a的小鼠模型及构建方法
CN114908097A (zh) 一种Dox调控的记录猪组织分化与器官发生的谱系示踪技术

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant