CN118652933A - Cd36基因过表达的山羊乳腺上皮细胞的构建方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供Cd36基因过表达的山羊乳腺上皮细胞的构建方法及应用，靶向山羊乳腺上皮细胞Cd36基因的gRNA，构建Cd36基因过表达山羊乳腺上皮细胞。该方法包括：利用基因编辑技术，将编码Cd36基因的启动子替换为内源性强表达b‑actin基因的启动子。本发明设计了特异靶向Cd36基因的gRNA，利用Cas9蛋白向Cd36基因的5’UTR前插入内源性强启动子，从而达到对乳腺上皮细胞进行基因过表达的目的。利用本发明方法得到的Cd36基因过表达的山羊乳腺上皮细胞，可有效保护乳腺上皮细胞免受LPS诱导的炎症反应。本方法提供了一种构建Cd36过表达的方法，为乳腺炎基因治疗领域提供理论支持。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及Cd36基因过表达的山羊乳腺上皮细胞的构建方法及应用。
背景技术
Cd36是一种多功能糖蛋白，广泛分布于血小板、单核吞噬细胞、脂肪细胞、肝细胞、肌细胞和一些上皮细胞中，可作为多种配体的受体，包括脂质相关配体(如长链脂肪酸、氧化低密度脂蛋白和氧化磷脂)，以及蛋白质相关配体(如血栓反应蛋白、淀粉样蛋白、胶原I和IV)。因此在脂质摄取、免疫调节、炎症和血管生成中起关键作用。研究发现，Cd36不仅可以在病原体诱导的信号传导中激活细胞因子的分泌，而且在细菌吞噬和清除中发挥重要作用。另外，缺乏吞噬能力的细胞在转染Cd36后会获得或增强吞噬功能。可见Cd36是机体内的重要中心分子，参与免疫反应的多个阶段。Cd36可单独激活细胞或与其他受体联合识别危险信号，从而消除潜在的自身或非自身威胁。目前，对Cd36基因的研究多集中在吞噬性细胞中，对其在非吞噬细胞中的功能也多集中在其介导脂质摄取方面，因此，研究Cd36在乳腺上皮细胞感染中的作用具有重要意义。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明目的是提供Cd36基因过表达的山羊乳腺上皮细胞的构建方法及应用，以山羊原代乳腺上皮细胞为材料，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，将编码Cd36基因的启动子替换为内源性强启动子，以达到高表达的目的。获得阳性克隆细胞系后，通过定量和蛋白免疫印迹评价重组效率，通过LPS诱导的炎症反应评价Cd36基因在乳腺炎模型中的功能，获得稳定过表达山羊Cd36基因和抗炎的乳腺上皮细胞。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：
Cd36基因过表达的山羊乳腺上皮细胞的构建方法，
利用基因编辑技术，将编码Cd36基因的启动子替换为内源性强表达b-actin基因的启动子，将Cd36基因过表达，获得稳定过表达山羊Cd36基因的原代乳腺上皮细胞；
具体包括如下步骤：
S1.修复片段b-actin启动子的扩增：以山羊的基因组DNA为模版，通过PCR扩增b-actin启动子并纯化；所述b-actin启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
S2.Cd36基因左同源臂、右同源臂的扩增：以山羊Cd36的基因组DNA为模版，将Cd36基因5’UTR前后各1kb作为左、右同源臂，进行PCR扩增并纯化；所述Cd36基因左同源臂的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；Cd36基因右同源臂的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
S3.Donor线性骨架制备：将pZ-Tomato质粒经Sal I内切酶和Hind III内切酶双酶切，纯化，获得Donor线性骨架；
S4.构建pZ-Tomato-Cd36质粒：将S1获得的b-actin启动子、S2获得的Cd36基因左同源臂、右同源臂片段进行酶切，连接，获得同源臂片段：左同源臂-启动子-右同源臂；将所述同源臂片段与S3获得的Donor线性骨架连接，构建pZ-Tomato-Cd36质粒；
S5.构建pX459-Cd36质粒：确定Cd36基因启动子的PAM位点，构建双链gRNA片段；pX459载体BbsI酶切后，将双链gRNA片段连接pX459质粒载体，获得pX459-Cd36质粒；转入大肠杆菌感受态细胞，筛选、验证阳性单克隆；
S6.将S5获得的pX459-Cd36质粒和S4获得的pZ-Tomato-Cd36质粒按照质量比1:1电转入山羊乳腺上皮细胞，抗性筛选，得到稳定过表达山羊Cd36基因的乳腺上皮细胞。
优选的，
所述gRNA的序列如SEQ ID No.10，SEQ ID No.11所示。
优选的，
所述S1中修复片段b-actin启动子的扩增采用的引物的序列如SEQ ID No.4，SEQID No.5所示。
优选的，
所述S2中Cd36基因的左同源臂扩增采用的引物的序列如SEQ ID No.6，SEQ IDNo.7所示；Cd36基因的右同源臂扩增采用的引物的序列如SEQ ID No.8，SEQ ID No.9所示。
优选的，
所述S5中Cd36-sgRNA质粒的验证引物序列如SEQ ID No.11，SEQ IDNo.12所示。
优选的，
所述S4中同源臂片段与Donor线性骨架通过Gibson连接，所述同源臂片段和Donor线性骨架质量比为2:1。
上述的方法构建的Cd36基因过表达的山羊乳腺上皮细胞。
上述的Cd36基因过表达的山羊乳腺上皮细胞在构建炎症反应动物模型中的应用。
优选的，
构建炎症反应动物模型的步骤为：
将野生型山羊乳腺上皮细胞、基因过表达乳腺上皮细胞复苏后，待细胞汇合度达70％～80％时，加10μg/mL LPS处理12h，提取细胞总mRNA，通过实时荧光定量PCR检测炎症因子基因的表达量。
优选的，
所述炎症因子PCR检测引物序列如SEQ ID No.13～SEQ ID No.24所示。
本发明的有益效果是：
本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，以山羊原代乳腺上皮细胞为材料，将编码Cd36基因的启动子替换为内源性强表达b-actin基因的启动子，将Cd36基因过表达获得了稳定过表达山羊Cd36基因的原代乳腺上皮细胞。本方法提供了一种构建Cd36过表达的方法，利用该方法得到的Cd36基因过表达的山羊乳腺上皮细胞，可有效保护乳腺上皮细胞免受LPS诱导的炎症反应，为乳腺炎基因治疗领域提供理论支持。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为基于CRISPR/Cas9系统的Cd36基因定点过表达策略
图2为靶向Cd36基因的pX459质粒骨架和pZ-Tomato质粒骨架图谱
图3为Cd36基因同源臂片段及b-actin promoter扩增片段图
图4为pZ-Tomato-Cd36质粒酶切PCR验证
图5为Cd36基因过表达后的稳转山羊乳腺上皮细胞图
图6为Cd36基因过表达的山羊乳腺上皮细胞的Cd36 mRNA和蛋白水平的表达结果图
图7为Cd36基因过表达的山羊乳腺上皮细胞攻毒后炎性基因mRNA的表达结果图
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实例进行说明，需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
定义
在本文中使用的术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用，是指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)或其类似物的聚合形式。多核苷酸的实例包括但不限于基因或基因片段的编码区或非编码区、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、小分子RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列分离的DNA、任何序列分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸中的一个或多个核苷酸可以经进一步修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸也可以在聚合之后修饰，例如通过与标记剂偶联。“CRISPR/Cas9”是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9基因编辑技术，则是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。以CRISPR/Cas9为基础的基因编辑技术在一系列基因治疗的应用领域都展现出极大的应用前景，例如血液病、肿瘤和其他遗传疾病。该技术成果已应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠以及细菌的基因组精确修饰。在本文中使用的术语“gRNA”、“向导RNA”和“CRISPR向导序列”可通篇互换使用并且是指包含决定CRISPR/Cas系统中Cas蛋白的特异性序列的RNA。gRNA与宿主细胞基因组中的靶核酸序列杂交(部分或完全互补)。与靶核酸序列杂交的gRNA或其部分的长度可介于15-25个核苷酸、18-22个核苷酸或19-21个核苷酸之间。在一些实施方式中，与靶核酸序列杂交的gRNA序列的长度可为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在一些实施方式中，与靶核酸杂交的gRNA序列的长度介于10-30或15-25个核苷酸之间。“sgRNA”是指人工CRISPR/Cas9系统中，单分子向导RNA或单链向导RNA，是指引导Cas蛋白特异性结合靶标DNA序列的RNA，是CRISPR基因敲除敲入系统中重要的组成部分。sgRNA包含靶向目标序列的指导序列。在优选实施方案中，sgRNA进一步包含tracr序列和tracr伴侣序列。
“指导序列”(guide sequence)是指指定靶向位点的约17-20bp的序列，且可与“引导序列”或“间隔子”互换使用。在形成CRISPR复合物的背景下，“靶序列”是指导序列经设计以与其具有互补性的序列，其中靶序列和指导序列间的杂交促进CRISPR复合物的形成，杂交要求“靶序列”和“指导序列”或称“引导序列”有足够的互补性，能引起杂交并促进CRISPR复合物形成即可，完全互补不是必须的。“互补”是指“指导序列”或称“引导序列”与靶核苷酸序列(就本发明而言为细胞系的FTO基因的第三外显子区域靶核苷酸序列)可以通过沃森和克里克发现的核苷酸配对原则杂交。本领域技术人员可以理解，只要具有足够的互补性，“指导序列”便可与靶核苷酸序列杂交，而不需要它们之间具有100％的完全互补。在一些实施方案中，当使用适当的比对算法最佳比对时，指导序列及其相应靶序列间的互补程度可为约或大于约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。最佳比对可使用用于比对序列的任何适当的算法确定，包括Smith-Waterman算法、Needleman-Wimsch算法、基于Burrows-Wheeler Transform的算法等。
通常，在内源CRISPR系统的背景下，CRISPR复合物的形成(包括指导序列与靶序列杂交并与一种或多种Cas蛋白复合)导致靶序列中或靶序列附近(例如，距离靶序列1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或更多碱基对的范围内)的一条链或两条链的切割。tracr序列可包含野生型tracr序列的全部或其一部分，例如野生型tracr序列约或大于约20、23、26、29、32、35、38、41、44、47、50、53、56、59、62、65、70、75、80、85或更多个核苷酸)或由上述组成的tracr序列还可形成CRISPR复合物的一部分，例如通过沿tracr序列的至少一部分与指导序列可操作连接的tracr伴侣序列的全部或一部分杂交。
在一些实施方式中，tracr序列与tracr伴侣序列具有足够的互补性以杂交并参与CRISPR复合物的形成。与“靶序列”和“指导序列”或称“引导序列”杂交的情况类似，完全互补并不是必须的，只要足以发挥其功能即可。在一些实施方案中，在最佳对齐的情况下，tracr序列与tracr伴侣序列的长度具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的互补性。
“基因过表达”或“过表达”是指对乳腺上皮细胞中的基因进行编辑(例如，对该基因进行插入、替换、和/或删除等改造)，使得该基因获得功能(例如，过表达功能性的蛋白)。可使用各种已知的分子生物学技术(例如，使用基于锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术和CRISPR/Cas(如CRISPR/Cas9)基因编辑技术)来编辑细胞基因组中的基因。
“载体”是指可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体包括但不限于：质粒；噬菌粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
本发明提供基于CRISPR/Cas9系统过表达Cd36基因的山羊乳腺上皮细胞构建方法及应用，包括：利用基因编辑技术，以山羊原代乳腺上皮细胞为材料，通过启动子替换的方法，将Cd36基因过表达以获得稳定过表达山羊Cd36基因和抗炎的乳腺上皮细胞。
在获知高效基因编辑区域(在本发明为Cd36基因的启动子区域)后，本领域技术人员可以用任何基因编辑方法，例如基于锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术和CRISPR/Cas(如CRISPR/Cas9)基因编辑技术以及今后发现的其它基因编辑方法，对所获知的高效基因编辑区域进行编辑，优化基因编辑条件，实现高效编辑的目的。因此，本发明涵盖通过任何可利用的基因编辑方法对本发明所鉴定的Cd36基因的启动子区域靶序列进行基因敲除的技术方案。
在一个具体的实施方式中，本发明通过CRISPR/Cas9技术，过表达乳腺上皮细胞的Cd36基因，其中CRISPR/Cas9技术中用于靶向乳腺上皮细胞的Cd36基因的gRNA包含与乳腺上皮细胞的Cd36基因的启动子区域互补的核苷酸序列。
图1为基于CRISPR/Cas9系统的Cd36基因定点过表达策略，图2为靶向Cd36基因的pX459-Cd36质粒和pZ-Tomato-Cd36质粒图谱。
实施例1
本发明所用仪器：
96孔板(离心机北京鼎昊源科技有限公司)，电子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)，倒置荧光显微镜(AMG公司)，恒温水浴锅(上海智城分析仪器制造有限公司)，琼脂糖水平电泳仪(北京六一生物科技有限公司)，蛋白转印仪(美国Bio-Rad公司)，实时荧光定量PCR仪器(美国ABI公司)，CO2恒温细胞培养箱(Thermo Fisher公司)，细胞电转染仪(NEPAGENE公司)。
本发明所用试剂：
血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN，DP304-02)，去内毒素质粒大提试剂盒(Magen，P1156-02)，KOD FX NEO高效率PCR酶(TOYOBO，KFX-201)，DH5α(康为世纪，CW0808B)，氨苄青霉素储存液(Coolaber，SL3810)，SalI限制性内切酶(NEB，R3138V)，BbsI限制性内切酶(NEB，R3539S)，HindIII限制性内切酶(R0104S，NEB)，T4 DNA连接酶(M0201S，NEB)，核酸染料(CooLaber，SL2140)，1kb DNA ladder(中科瑞泰，RTM417)，CloneExpressIIOne Step Clonging Kit(Vazyme，C112)，DMEM-F12培养基(Gibco，A4192001)，FBS(Gibco，16140071)，DMSO(Sigma，D2650)，青霉素链霉素双抗(Invitrogen，15140122)，重组人胰岛素(Solarbio，I8830-20)，重组人EGF(生工，c610033-0100)，地塞米松(生工，A601187-0005)，0.25％Trypsin-EDTA(1×)(Gibco，25200-072)，Trizol(Mei5，C0121)，StarScript III一管化去基因组反转录预混液(GenStar，A230-10)，Hieff qPCR SYBRGreen Master Mix(High Rox Plus)(YEASEN，11203ES08)，Prestained Protein Ladder(Life，26619)，重组Anti-CD36抗体(abcam，ab133625)，RIPA细胞裂解液(强)(Beyotime，P0013B)，RNasin Inhibitor(Promega，N2112S)，SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(Beyotime，P0012A)，TEMED(Beyotime，ST728)，30％ Arc-Bis(Beyotime，ST003)，1.0M Tris-HCl(pH6.8)(Beyotime，ST768)，PhosSTOP(Roche，04906845001)，1.5M Tris-HCl(pH 8.8)(Beyotime，ST789)，Western一抗稀释液(Beyotime，P0256)，Western二抗稀释液(Beyotime，P0258)，0.25％Trypsin-EDTA(Gibco，25200056)，PVDF膜(Beyotime，FFP24)，脱脂奶粉(伊利集团，422535)，PMSF(100mM)(Beyotime，ST506)。
本实施例提供基于CRISPR/Cas9系统定点过表达Cd36基因的山羊乳腺上皮细胞构建方法及应用，包括如下步骤：
步骤一，b-actin启动子(修复片段)的扩增
以山羊基因组DNA为模版，通过PCR扩增b-actin启动子(即修复片段)并纯化，核苷酸序列如表1中的SEQ ID No.1所示。PCR反应体系和反应条件如表2所示。RF F1/RF R1为包含同源臂的b-actin引物，核苷酸序列如表3中SEQ ID No.4，SEQ ID No.5所示。用1％的琼脂糖凝胶对PCR产物电泳(100V，15min)，于EB中染色30min，紫外灯下验证目标条带，目标条带大小为2kb，如图3所示。将所得PCR产物保存于-20℃冰箱，备用。
步骤二，Cd36基因同源臂的扩增
以山羊Cd36的基因组DNA为模版，将Cd36基因5‘UTR前后各1kb作为左右同源臂，核苷酸序列如表1中SEQ ID No.2，SEQ ID No.3所示，进行PCR扩增并纯化。反应体系和反应条件如表2所示，RF F2/RF R2和RF F3/RF R3为包含b-actin的左、右同源臂引物，核苷酸序列见表3中SEQ ID No.6，SEQ ID No.7(左同源臂)；SEQ ID No.8，SEQ ID No.9(右同源臂)所示。利用1％的琼脂糖凝胶对PCR产物电泳(100V，15min)于EB中染色30min，紫外灯下验证目标条带，目标条带大小均为1kb，如图3所示。将所得PCR产物保存于-20℃冰箱，备用。
表1b-actin启动子(修复片段)及Cd36基因左右同源臂序列表
表2PCR扩增反应体系和反应条件反应体系
反应条件
表3包含同源臂的b-actin引物及左右同源臂引物
步骤三，Donor线性骨架制备
Donor线性骨架酶切消化体系和反应条件见表4，经Hind III内切酶和Sal I内切酶双酶切，反应体系中所加的Sal I和Hind III依据pZ-Tomato质粒的模版量决定。经纯化获得Donor线性骨架。
表4Donor线性骨架模版酶切消化体系
步骤四，构建pZ-Tomato-Cd36质粒
将步骤一、步骤二获得的启动子序列和左、右同源臂序列进行左同源臂-启动子-右同源臂连接，获得同源臂片段，并与Donor线性骨架相连，构建pZ-Tomato-Cd36质粒；
(1)将扩增所得的左、右同源臂和启动子按质量比:1:1:2的量加入连接体系中，获得同源臂片段。同源臂片段和Donor线性骨架按质量比2:1的量加入连接体系中。启动子、同源臂片段和Donor线性骨架通过Gibson连接，制得pZ-Tomato-Cd36质粒，连接体系见表5，表6。将10μL各反应体系进行37℃，30min的PCR反应，获得反应液。
(2)取10μL反应液用于大肠杆菌转化。
(3)转化后菌体首先涂在LB-Amp平板上。待菌株长出后，将其划线于LB-Amp平板上，于37℃培养12h。挑取少量菌体转接于含5mL LB+Amp液体培养基的试管中培养12～16h(120rpm，37℃)。
(4)收集菌体，利用质粒DNA大量抽提试剂盒，从大肠杆菌中提取PZ-Tomato-Cd36质粒。
(5)酶切后，利用0.7％的琼脂糖凝胶，对PZ-Tomato-Cd36质粒及酶切产物进行电泳(100V，15min)，于EB中染色30min，紫外灯下验证目标条带，如图4所示，左图为PZ-Tomato-Cd36质粒构建示意图，其片段大小为11,577bp，经Hind III内切酶单酶切后预期产生8432bp，8283bp，3294bp,
3145bp和149bp条带；右图为挑取单克隆所提取PZ-Tomato-Cd36质粒酶切后琼脂糖凝胶图，7#、8#酶切后出现3kb左右及大于8kb条带，初步确定为预期质粒，可进行后续DNA纯化步骤。琼脂糖凝胶所用DNA Ladder
为1kb plus Marker。将所得的pZ-Tomato-Cd36质粒进行测序确认，获得序列正确的pZ-Tomato-Cd36质粒。
表5启动子、同源臂Gibson连接的反应体系
表6Donor线性骨架Gibson连接的反应体系
步骤五，构建pX459-Cd36质粒
(1)确定Cd36基因启动子的PAM位点，构建双链gRNA片段；以pX459质粒为载体，BbsI酶切后，将双链gRNA片段并连接到pX459载体，连接
得到gRNA质粒；
Cd36-sgRNA-F的核苷酸序列为
5’CACCGACGTTCACTTCATCTGGCTC 3’；(SEQ ID No.10)
Cd36-sgRNA-R的核苷酸序列为
5’AAACGAGCCAGATGAAGTGAACGTC 3’(SEQ ID No.11)。
(2)将gRNA质粒转入大肠杆菌感受态细胞，涂布平板培养并筛选、PCR反应验证单克隆，鉴定引物见表7中SEQ ID No.11，SEQ ID No.12，PCR体系及反应条件见表8。
(3)筛选阳性单克隆于含5mL LB+Amp液体培养基的试管中培养12～16h(120rpm，37℃)。
(4)收集菌体，利用质粒DNA大量抽提试剂盒，从大肠杆菌中提取gRNA质粒，进行测序确认，获得序列正确的gRNA质粒，命名为pX459-Cd36质粒。
表7gRNA质粒验证引物
表8gRNA质粒验证PCR反应体系及条件
步骤六，细胞转染及阳性筛选
将pX459-Cd36质粒和pZ-Tomato-Cd36质粒各10μg与100μL Opti-MEM液混合，电转入10*6个乳腺上皮细胞，电转条件见表9，结果如图5所示，乳腺上皮细胞可以检测到红色荧光(tdTomato蛋白)的表达，初步表明pX459-Cd36质粒和pZ-Tomato-Cd36质粒成功转入乳腺上皮细胞内。24h后过流式分选，待细胞汇合度至60～70％时，使用10μg/mL嘌呤霉素进行抗性筛选，得到稳定过表达山羊Cd36基因的乳腺上皮细胞。随后对收取的乳腺上皮细胞进行单克隆培养，两周后单个细胞生长为细胞团。
表9电转条件
步骤七，Cd36基因过表达鉴定
待单细胞生长成细胞团时，将其消化裂解，提取RNA和蛋白进行实时荧光定量和蛋白免疫印迹检测Cd36表达，结果如图6所示，结果显示与乳腺上皮细胞野生型(NC)相比，转染后的Cd36基因RNA及蛋白均有显著增加。表明gRNA使Cd36基因过表达成功，获得阳性克隆细胞系，并命名为GMEC-Cd36-OE-Cell line。
步骤八，LPS诱导乳腺炎症模型
将野生型乳腺上皮细胞、基因过表达乳腺上皮细胞GMEC-Cd36-OE-Cell line复苏后，待细胞汇合度达70％～80％时，加10μg/mL LPS处理12h后，使用Trizol法提取细胞总mRNA，通过实时荧光定量PCR检测炎症因子基因的表达量，结果如图7所示，结果显示在LPS诱导的乳腺炎模型中，过表达Cd36基因显著降低了炎症因子(IL-6，IL-1B，IL-8，NF-kB，TNF-a)的表达，表明在乳腺上皮炎症发生过程中，Cd36基因的过表达可以显著抑制炎症因子的表达，从而缓解细胞的炎症状态。
表10炎症因子Real-time PCR检测引物
本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.Cd36基因过表达的山羊乳腺上皮细胞的构建方法，其特征在于，
利用基因编辑技术，将编码Cd36基因的启动子替换为内源性强表达b-actin基因的启动子，将Cd36基因过表达，获得稳定过表达山羊Cd36基因的原代乳腺上皮细胞；
具体包括如下步骤：
S1.修复片段b-actin启动子的扩增：以山羊的基因组DNA为模版，通过PCR扩增b-actin启动子并纯化；所述b-actin启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
S2.Cd36基因左同源臂、右同源臂的扩增：以山羊Cd36的基因组DNA为模版，将Cd36基因5’UTR前后各1kb作为左、右同源臂，进行PCR扩增并纯化；所述Cd36基因左同源臂的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；Cd36基因右同源臂的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
S3.Donor线性骨架制备：将pZ-Tomato质粒经Sal I内切酶和Hind III内切酶双酶切，纯化，获得Donor线性骨架；
S4.构建pZ-Tomato-Cd36质粒：将S1获得的b-actin启动子、S2获得的Cd36基因左同源臂、右同源臂片段进行酶切，连接，获得同源臂片段：左同源臂-启动子-右同源臂；将所述同源臂片段与S3获得的Donor线性骨架连接，构建pZ-Tomato-Cd36质粒；
S5.构建pX459-Cd36质粒：确定Cd36基因启动子的PAM位点，构建双链gRNA片段；pX459载体BbsI酶切后，将双链gRNA片段连接pX459质粒载体，获得pX459-Cd36质粒；转入大肠杆菌感受态细胞，筛选、验证阳性单克隆；
S6.将S5获得的pX459-Cd36质粒和S4获得的pZ-Tomato-Cd36质粒按照质量比1:1电转入山羊乳腺上皮细胞，抗性筛选，得到稳定过表达山羊Cd36基因的乳腺上皮细胞。
2.根据权利要求1所述的Cd36基因过表达的山羊乳腺上皮细胞的构建方法，其特征在于，
所述gRNA的序列如SEQ ID No.10，SEQ ID No.11所示。
3.根据权利要求1所述的Cd36基因过表达的山羊乳腺上皮细胞的构建方法，其特征在于，
所述S1中修复片段b-actin启动子的扩增采用的引物的序列如SEQ ID No.4，SEQ IDNo.5所示。
4.根据权利要求1所述的Cd36基因过表达的山羊乳腺上皮细胞的构建方法，其特征在于，
所述S2中Cd36基因的左同源臂扩增采用的引物的序列如SEQ ID No.6，SEQ ID No.7所示；Cd36基因的右同源臂扩增采用的引物的序列如SEQ ID No.8，SEQ ID No.9所示。
5.根据权利要求1所述的Cd36基因过表达的山羊乳腺上皮细胞的构建方法，其特征在于，
所述S5中pX459-Cd36质粒的验证引物序列如SEQ ID No.11，SEQ ID No.12所示。
6.根据权利要求1所述的Cd36基因过表达的山羊乳腺上皮细胞的构建方法，其特征在于，
所述S4中同源臂片段与Donor线性骨架通过Gibson连接，所述同源臂片段和Donor线性骨架质量比为2:1。
7.权利要求1-6任一项所述的方法构建的Cd36基因过表达的山羊乳腺上皮细胞。
8.根据权利要求1-6任一项所述的Cd36基因过表达的山羊乳腺上皮细胞在构建炎症反应动物模型中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，
构建炎症反应动物模型的步骤为：
将野生型山羊乳腺上皮细胞、基因过表达乳腺上皮细胞复苏后，细胞汇合度达70％～80％时，加10μg/mL LPS处理12h，提取细胞总mRNA，通过实时荧光定量PCR检测炎症因子基因的表达量。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，
所述炎症因子PCR检测引物序列如SEQ ID No.13～SEQ ID No.24所示。
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