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CN115073601A - Gitr结合蛋白及其用途 - Google Patents

Gitr结合蛋白及其用途 Download PDF

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CN115073601A
CN115073601A CN202210251377.9A CN202210251377A CN115073601A CN 115073601 A CN115073601 A CN 115073601A CN 202210251377 A CN202210251377 A CN 202210251377A CN 115073601 A CN115073601 A CN 115073601A
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CN
China
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ser
present application
seq
binding protein
antigen binding
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CN202210251377.9A
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廖雪梅
曹媛媛
刘阳
陈娜
施伟军
王瓅
栾珊珊
李贵祥
夏广新
柯樱
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Shanghai Pharmaceuticals Holding Co Ltd
Original Assignee
Shanghai Pharmaceuticals Holding Co Ltd
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Abstract

本申请涉及一种GITR结合蛋白及其用途，具体涉及一种分离的抗原结合蛋白，包含HCDR3，所述HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。本申请还提供了所述抗原结合蛋白在预防和治疗疾病中的应用。

Description

GITR结合蛋白及其用途
技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种GITR结合蛋白及其用途。
背景技术
免疫检查点糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR，又名AITR,TNFRSF18)是属于TNFRSF超家族的一种I型跨膜蛋白，其它成员还包含OX40、CD27、CD40和4-1BB。
目前正在研究的GITR抗体数量少，已有的GITR抗体存在安全性差和预防效果和/或治疗效果不佳的问题，因此迫切需要开发更多亲和力高、活性好的靶向GITR的药物，以进一步提高疾病和/或病症的预防效果和/或治疗效果。
发明内容
本申请提供了一种分离的抗原结合蛋白，其可以具有以下的一种或多种优势：(1)与GITR具有高亲和力；(2)与表达于细胞上的人GITR结合；(3)具有激动剂活性，例如激活GITR-NFκB信号通路；(4)具有良好的肿瘤抑制效果，例如降低小鼠肿瘤体积，但不影响小鼠体重。
一方面，本申请提供一种分离的抗原结合蛋白，其包含HCDR3，所述HCDR3包含SEQID NO:3所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含HCDR2，所述HCDR2包含SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含HCDR1，所述HCDR1包含SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含LCDR3，所述LCDR3包含SEQ IDNO:6所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含LCDR2，所述LCDR2包含SEQ IDNO:5所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含LCDR1，所述LCDR1包含SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含H-FR1，所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接相连，且所述H-FR1包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含H-FR1，所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接相连，且所述H-FR1包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含H-FR2，所述H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，且所述H-FR2包含SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含H-FR2，所述H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，且所述H-FR2包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ IDNO:13所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含H-FR3，所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，且所述H-FR3包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含H-FR3，所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，且所述H-FR3包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ IDNO:17所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含H-FR4，所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端直接或间接相连，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含H-FR4，所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端直接或间接相连，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含L-FR1，所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接相连，且所述L-FR1包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含L-FR1，所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接相连，且所述L-FR1包含SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或SEQ IDNO:22所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含L-FR2，所述L-FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间，且所述L-FR2包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含L-FR2，所述L-FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间，且所述L-FR2包含SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含L-FR3，所述L-FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间，且所述L-FR3包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含L-FR3，所述L-FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间，且所述L-FR3包含SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含L-FR4，所述L-FR4的N末端与所述LCDR3的C末端直接或间接相连，且所述L-FR4包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含L-FR4，所述L-FR4的N末端与所述LCDR3的C末端直接或间接相连，且所述L-FR4包含SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中所述HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，且所述HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述LCDR3包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，且所述LCDR1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含重链可变区(VH)，所述VH包含SEQID NO:47所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含VH，所述VH包含SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含轻链可变区(VL)，所述VL包含SEQID NO:48所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含VL，所述VL包含SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含VH和VL，其中所述VH包含SEQ IDNO:47所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含VH和VL，其中所述VH包含SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含VH和VL，其中所述VH包含SEQ IDNO:30所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含VH和VL，其中所述VH包含SEQ IDNO:31所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含VH和VL，其中所述VH包含SEQ IDNO:31所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含VH和VL，其中所述VH包含SEQ IDNO:31所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含VH和VL，其中所述VH包含SEQ IDNO:32所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含VH和VL，其中所述VH包含SEQ IDNO:32所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含VH和VL，其中所述VH包含SEQ IDNO:32所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含VH和VL，其中所述VH包含SEQ IDNO:33所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含VH和VL，其中所述VH包含SEQ IDNO:33所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含VH和VL，其中所述VH包含SEQ IDNO:33所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含VH和VL，其中所述VH包含SEQ IDNO:34所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含VH和VL，其中所述VH包含SEQ IDNO:34所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含VH和VL，其中所述VH包含SEQ IDNO:34所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含抗体重链恒定区。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白中所述抗体重链恒定区包含源自人抗体的重链恒定区。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白中所述抗体重链恒定区包含源自IgG、IgA、IgD、IgE和/或IgM的重链恒定区。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白中所述抗体重链恒定区包含源自IgG的重链恒定区。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白中所述抗体重链恒定区包含源自IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4的重链恒定区。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白中所述抗体重链恒定区包含源自IgG1的重链恒定区。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含抗体轻链恒定区。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白中所述抗体轻链恒定区包含源自人抗体的轻链恒定区。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白中所述抗体轻链恒定区包含源自人Igκ的恒定区。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白包含抗体或其抗原结合片段。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白中所述抗体包含单克隆抗体。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白中所述抗体选自以下组中的一种或多种：鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白中所述抗原结合片段选自以下组中的一种或多种：Fab，Fab′，Fv片段，F(ab')2，F(ab)2，scFv，di-scFv，VHH和dAb。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白能够特异性结合糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)或其功能活性片段。
在一种实施方式中，所述GITR包含人GITR。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白具有以约7.33μg/ml或更低的EC50值结合所述GITR或其功能片段的能力。
在一种实施方式中，所述GITR或其功能片段包含表达于细胞上的GITR或其功能片段。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白具有以约3.01E-09M或更低的KD值结合所述GITR或其功能片段的能力。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白具有激活所述GITR或其功能活性片段的能力。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白具有以约1.05μg/ml或更低的EC50值激活所述GITR或其功能活性片段的能力。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白具有核因子-κB(NF-κB)通路激活能力。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白具有以约8.57μg/ml或更低的EC50值结合所述GITR或其功能片段的能力。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白具有以约0.06μg/ml或更低的EC50值结合所述GITR或其功能片段的能力。
在一种实施方式中，所述GITR包含人GITR和/或猴GITR。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白具有肿瘤抑制能力。
在一种实施方式中，本申请的抗原结合蛋白具有以约39％或更高肿瘤体积抑制率抑制肿瘤的能力。
另一方面，本申请提供一种多肽，其包含本申请的抗原结合蛋白。
在一种实施方式中，其包含融合蛋白。
另一方面，本申请提供一种核酸分子，其编码本申请的抗原结合蛋白和/或本申请的多肽。
另一方面，本申请提供一种载体，其包含本申请的核酸分子。
另一方面，本申请提供一种免疫缀合物，其包含本申请的抗原结合蛋白和/或本申请的多肽。
另一方面，本申请提供一种细胞，其包含和/或表达本申请的抗原结合蛋白、包含和/或表达本申请的多肽、包含本申请的核酸分子、包含本申请的载体和/或包含本申请的免疫缀合物。
另一方面，本申请提供一种药物组合物，其包含本申请的抗原结合蛋白、本申请的多肽、本申请的核酸分子、本申请的载体、本申请的免疫缀合物和/或本申请的细胞，以及任选地药学上可接受的载剂。
在一种实施方式中，其还包含一种或多种的免疫检查点抑制剂。
另一方面，本申请提供一种药物组合，其包含本申请的抗原结合蛋白和/或本申请的多肽，以及一种或多种的免疫检查点抑制剂。
在一种实施方式中，其中所述免疫检查点抑制剂能够抑制PD-1和PD-L1的相互作用。
在一种实施方式中，其中所述免疫检查点抑制剂包含PD-1抑制剂和/或PD-L1抑制剂。
在一种实施方式中，其中所述免疫检查点抑制剂包含PD-1抗体或其抗原结合片段，和/或PD-L1抗体或其抗原结合片段。
在一种实施方式中，其中所述抗体包含选自：鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
在一种实施方式中，其中所述抗原结合片段选自：Fab，Fab′，Fv片段，F(ab')2，F(ab)2，scFv，di-scFv，VHH和dAb。
在一种实施方式中，其中所述免疫检查点抑制剂包含派姆单抗的HCDR1-3以及LCDR1-3。
在一种实施方式中，其中所述免疫检查点抑制剂包含派姆单抗的VH以及VL。
在一种实施方式中，其中所述免疫检查点抑制剂包含派姆单抗。
在一种实施方式中，其中所述的分离的抗原结合蛋白和/或所述多肽与所述免疫检查点抑制剂在所述药物组合中相互不混合。
在一种实施方式中，其中所述的分离的抗原结合蛋白和/或所述多肽与所述免疫检查点抑制剂各自分别存在于不同的容器中。
在一种实施方式中，其中所述药物组合包含第一制剂和第二制剂，所述第一制剂包含所述分离的抗原结合蛋白和/或所述多肽和药学上可接受的第一载体，且所述第二制剂包含所述免疫检查点抑制剂和药学上可接受的第二载体。
另一方面，本申请提供一种试剂盒，其包含本申请的抗原结合蛋白、本申请的多肽、本申请的核酸分子、本申请的载体、本申请的免疫缀合物、本申请的细胞、本申请的药物组合物和/或本申请的药物组合。
在一种实施方式中，其用于检测样品中GITR的存在和/或含量。
另一方面，本申请提供一种制备本申请的抗原结合蛋白和/或本申请的多肽的方法，包含在使得所述抗原结合蛋白和/或所述多肽表达的条件下，培养本申请的细胞。
在一种实施方式中，包含在使得所述抗原结合蛋白表达的条件下，培养所述细胞。
在一种实施方式中，包含在使得所述多肽表达的条件下，培养所述细胞。
另一方面，本申请提供一种检测样品中GITR的方法，包含施用本申请的抗原结合蛋白、施用本申请的多肽、施用本申请的核酸分子、施用本申请的载体、施用本申请的免疫缀合物、施用本申请的细胞、施用本申请的药物组合物、施用本申请的药物组合、和/或使用本申请的试剂盒。
另一方面，本申请提供一种本申请的抗原结合蛋白、本申请的多肽、本申请的核酸分子、本申请的载体、本申请的免疫缀合物、本申请的细胞、本申请的药物组合物和/或本申请的药物组合在制备试剂盒中的用途。
在一种实施方式中，其中所述试剂盒用于检测样品中GITR的存在和/或含量。
另一方面，本申请提供一种本申请的抗原结合蛋白、本申请的多肽、本申请的核酸分子、本申请的载体、本申请的免疫缀合物、本申请的细胞、本申请的药物组合物、本申请的药物组合和/或本申请的试剂盒在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗疾病和/或病症。
在一种实施方式中，其中所述疾病和/或病症包含肿瘤和/或感染。
在一种实施方式中，其中所述疾病和/或病症包含实体瘤和/或血液瘤。
在一种实施方式中，其中所述疾病和/或病症包含乳腺癌、胃癌、直肠癌、和/或结肠癌。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：
图1显示的是ELISA测定GITR抗原活性。
图2显示的是多只免疫小鼠的血清效价曲线。
图3显示的是基于流式细胞术测定法测定GITR结合蛋白与表达于细胞表面的GITR的结合曲线。
图4显示的是通过荧光素酶报告基因系统检测GITR结合蛋白的生物学活性。
图5、图6和图7显示的是基于流式细胞术测定法测定GITR结合蛋白与表达于细胞表面的GITR的结合曲线。
图8显示的是通过荧光素酶报告基因系统检测GITR结合蛋白的生物学活性。
图9，图10，图11和图12显示的是，GITR抗原结合蛋白与人GITR抗原的结合曲线。
图13，图14，图15和图16显示的是，GITR抗原结合蛋白与猴GITR抗原的结合曲线。
图17显示的是GITR结合蛋白Ab0在小鼠体内的抗肿瘤药效检测。
图18显示的是GITR结合蛋白Ab0施用后，小鼠的体重变化。
图19显示的是GITR结合蛋白Ab4、Ab5、Ab9分别和PD-1抗体联用在小鼠体内的抗肿瘤药效检测。
图20显示的是GITR结合蛋白Ab4、Ab5、Ab9分别和PD-1抗体联用施用后，小鼠的体重变化。
图21显示的是GITR结合蛋白Ab5和PD-L1抗体联用在小鼠体内的抗肿瘤药效检测。
图22显示的是GITR结合蛋白Ab5和PD-L1抗体联用施用后，小鼠的体重变化。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“GITR”通常是指“糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体”，也可以称为TNF受体超家族18(TNFRSF18)，例如，可以是来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物诸如灵长类(例如人、食蟹猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然GITR。例如，本申请的“GITR”可以包含“全长”GITR，未加工的GITR和/或因细胞中的加工所致的任何形式的GITR。本申请的“GITR”还可以包含GITR的天然发生变体，例如剪接变体或等位变体。人GITR氨基酸序列可以见于GenBank登记号Q9Y5U5。本申请的GITR蛋白还可以涵盖其功能活性片段，不限于在细胞中发生的加工和/或修饰后产生的包含GITR蛋白功能活性片段的蛋白。
在本申请中，术语“NF-κB”通常是指一种转录因子蛋白。例如，NF-κB可以是GITR的下游通路。人NF-κB可以包含GenBank登记号Q04206的蛋白。本申请的NF-κB蛋白还可以涵盖其功能活性片段，不限于在细胞中发生的加工和/或修饰后产生的包含NF-κB蛋白功能活性片段的蛋白。
在本申请中，术语“分离的”通常是指从天然状态下经人工手段获得的。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽可以称之为分离的。术语“分离的”可以不排除混有人工或合成的物质，也可以不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。
在本申请中，术语“分离的抗原结合蛋白”通常是指脱离了其天然存在状态的具有抗原结合能力的蛋白。本申请“分离的抗原结合蛋白”可以包含结合抗原的部分和任选地，允许抗原结合部分采用促进所述抗原结合部分结合抗原的构象的框架或构架部分。抗原结合蛋白可以包含例如抗体来源的蛋白框架区(FR)或具有移植的CDR或CDR衍生物的备选蛋白框架区或人工框架区。此类框架可以包括，但不限于包含被引入例如以稳定抗原结合蛋白的三维结构的突变的抗体来源的框架区以及包含例如生物相容性聚合物的完全合成的框架区。抗原结合蛋白的实例可以包括但不限于：人抗体、人源化抗体；嵌合抗体；重组抗体；单链抗体；双功能抗体；三功能抗体；四功能抗体；Fab，Fab’，Fv片段，F(ab’)2，F(ab)2，scFv，di-scFv，dAb，VHH，IgD抗体；IgE抗体；IgM抗体；IgG1抗体；IgG2抗体；IgG3抗体；和/或IgG4抗体以及其片段。
在本申请中，术语“CDR”也称“互补决定区”，通常是指抗体可变结构域中的区域，其序列可以是高度可变的和/或形成结构定义环。例如，抗体可以包括六个CDR；在VH中三个(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和在VL中三个(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。在某些实施方案中，仅由重链组成的天然存在的骆驼抗体在缺乏轻链的情况下，其功能也能够正常且稳定。抗体CDR可以通过多种编码系统来确定，如CCG、Kabat、Chothia、IMGT、综合考虑Kabat/Chothia等。这些编码系统为本领域内已知，具体可参见，例如，www.bioinf.org.uk/abs/index.html#kabatnum。例如，所述抗原结合蛋白的氨基酸序列编号可以按照IMGT编号方案(IMGT,theinternational ImMunoGeneTics information system@imgt.cines.fr；imgt.cines.fr；Lefranc等,1999,Nucleic Acids Res.27:209-212；Ruiz等,2000Nucleic Acids Res.28:219-221；Lefranc等,2001,Nucleic Acids Res.29:207-209；Lefranc等,2003,NucleicAcids Res.31:307-310；Lefranc等,2005,DevComp Immunol 29:185-203)。例如，所述抗原结合蛋白的CDR可以根据Kabat编号系统确定(参见例如Kabat EA&Wu TT(1971)Ann NYAcadSci 190:382-391和Kabat EAet al.,(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and HumanServices,NIH Publication No.91-3242)。
在本申请中，术语“FR”通常是指抗体可变结构域的更高度保守的部分，其被称为框架区。例如，天然重链和轻链的可变结构域各自可以包含四个FR区，即在VH中四个(H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4)，和在VL中四个(L-FR1，L-FR2，L-FR3和L-FR4)。
在本申请中，术语“可变结构域”与“可变区”可以互换使用，通常是指抗体重链和/或轻链的一部分。重链和轻链的可变结构域可以分别称为“VH”和“VL”(或者分别称为“VH”和“VL”)。这些结构域通常可以是抗体的变化最大的部分(相对于相同类型的其它抗体)，且可以包含抗原结合位点。在本申请中，术语“可变”通常是指在抗体之间可变结构域的某些区段在序列上可能存在较大差异。可变结构域介导抗原可以结合并决定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性可以并非在整个可变结构域范围内均匀分布。它可以通常集中在轻链和重链可变结构域中称为高变区(CDR或HVR)的三个区段中。可变结构域的更高度保守的部分可以称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自可以包含四个FR区，大多数采用β-折叠构型，通过三个CDR连接，其形成环形连接，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDR可以通过FR区紧密靠近地保持在一起，并且来自另一条链的CDR一同促进抗体的抗原结合位点的形成。
在本申请中，术语“抗体”通常是指免疫球蛋白或其片段或其衍生物，涵盖包括抗原结合位点的任何多肽，无论其是在体外还是体内产生的。该术语可以包括但不限于多克隆的、单克隆的、单特异性的、多特异性的、非特异性的、人源化的、单链的、嵌合的、合成的、重组的、杂化的、突变的和移植的抗体。除非另外被术语“完整的”修饰，如在“完整的抗体”中，为了本发明的目的，术语“抗体”也可以包括抗体片段，比如Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、VHH、dAb和保持抗原结合功能(例如，特异性结合人GITR)的其它抗体片段。通常，这样的片段可以包括抗原结合结构域。基本的4链抗体单元可以是由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链组成的异四聚体糖蛋白。IgM抗体可以由5个基本的异四聚体单元与另外一个称为J链的多肽组成，且含有10个抗原结合位点，而IgA抗体可以包括2-5个可以与J链相结合聚合形成多价组合的基本4链单元。就IgG而言，4链单元一般可以为约150,000道尔顿。每个L链可以通过一个共价二硫键与H链连接，而两个H链可以通过一个或多个取决于H链同种型的二硫键相互连接。每个H和L链还可以具有规则间隔的链内二硫化桥键。每个H链在N末端可以具有重链可变区(VH)，对于α和γ链各自继之以三个恒定结构域(CH)、对于μ和ε同种型继之以四个CH结构域。每个L链在N末端可以具有轻链可变区(VL)，在其另一端可以具有恒定结构域。VL与VH可以对应，且轻链恒定区(CL)与重链的第一恒定结构域(CH1)可以相对应。特定的氨基酸残基可以被认为在轻链和重链可变结构域之间形成界面。VH和VL可以配对一起形成单个抗原结合位点。来自任何脊椎动物物种的L链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列被分为两种明显不同的类型中的一种，称为κ和λ。根据重链恒定区(CH)恒定结构域的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白分为不同的类别或同种型。目前存在五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG例如IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4，和IgM，具有分别被命名为α、δ、ε、γ和μ的重链。
在本申请中，术语“抗原结合片段”通常是指具有特异结合抗原(例如，GITR)能力的一个或多个片段。在本申请中，所述抗原结合片段可以包括Fab，Fab’，F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2，scFv，di-scFv，VHH和/或dAb。
在本申请中，术语“Fab”通常是指抗体的抗原结合片段。如上所述，可以使用木瓜蛋白酶消化完整的抗体。抗体经木瓜蛋白酶消化后产生两个相同的抗原结合片段，即“Fab”片段，和残余的“Fc”片段(即Fc区)。Fab片段可以由一条完整的L链与一条重链的可变区和该H链(VH)的第一恒定区(CH1)组成。
在本申请中，术语“F(ab)2”通常是指抗体的抗原结合片段。例如，F(ab)2可以是由两个Fab片段连接的。
在本申请中，术语“Fab′”通常是指人单克隆抗体的单价抗原结合片段，该片段比Fab片段稍大。例如，Fab′片段可以包括所有轻链，所有重链可变区以及重链的所有或部分第一和第二恒定区。例如，Fab′片段还可包括重链的部分或所有的220-330个氨基酸残基。
在本申请中，术语“F(ab')2”通常是指通过胃蛋白酶消化完整抗体所产生的抗体片段。F(ab')2片段含有由二硫键维持在一起的两个Fab片段和部分铰链区。F(ab')2片段具有二价抗原结合活性并且能够交联抗原。
在本申请中，术语“Fv片段”通常是指人单克隆抗体的单价抗原结合片段，包括所有或部分重链可变区和轻链可变区，并且缺乏重链恒定区和轻链恒定区。重链可变区和轻链可变区包括例如CDR。例如，Fv片段包括重链和轻链的约110个氨基酸的所有或部分氨基端可变区。
在本申请中，术语“scFv”通常是指包含至少一个包括轻链的可变区抗体片段和至少一个包括重链的可变区的抗体片段的融合蛋白，其中所述轻链和重链可变区是邻接的(例如经由合成接头例如短的柔性多肽接头)，并且能够以单链多肽形式表达，且其中所述scFv保留其所来源的完整抗体的特异性。除非特别说明，否则如本申请中使用的那样，scFv可以以任何顺序(例如相对于多肽的N末端和C末端)具有所述的VL和VH可变区，scFv可以包括VL-接头-VH或可以包括VH-接头-VL。
在本申请中，术语“dAb”通常是指具有VH域或VL域组成的抗原结合片段，参考例如Ward等人(Nature,1989Oct 12；341(6242)：544-6)，参考Holt等人,TrendsBiotechnol.,2003,21(11)：484-490。
在本申请中，术语“VHH”通常是指包含重链抗体的可变抗原结合结构域的抗体(参见Vanlandschoot P.等人，2011，Antiviral Research 92，389-407)。VHH也可称为纳米抗体(Nanobody)(Nb)。
在本申请中，术语“单克隆抗体”通常是指单分子组成的抗体分子制备物。单克隆抗体通常针对单个抗原位点具有高度特异性。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体可以是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点在于它们可以通过杂交瘤培养合成，不受其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”可以表示从基本上同质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，本申请使用的单克隆抗体可以在杂交瘤细胞中制备，或者可以通过重组DNA方法制备。
在本申请中，术语“嵌合抗体”通常是指其中可变区源自一个物种，而恒定区源自另一个物种的抗体。通常，可变区源自实验动物诸如啮齿动物的抗体(“亲本抗体”)，且恒定区源自人类抗体，使得所得嵌合抗体与亲本(例如小鼠来源)抗体相比，在人类个体中引发不良免疫反应的可能性降低。
在本申请中，术语“人源化抗体”通常是指非人抗体(例如小鼠抗体)的CDR区以外的部分或全部有的氨基酸被源自人免疫球蛋白的相应的氨基酸置换的抗体。在CDR区中，氨基酸的小的添加、缺失、插入、置换或修饰也可以是允许的，只要它们仍保留抗体结合特定抗原的能力。人源化抗体可任选地包含人类免疫球蛋白恒定区的至少一部分。“人源化抗体”可以保留类似于原始抗体的抗原特异性。非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式可以最低限度地包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在某些情形中，可以将人免疫球蛋白(受体抗体)中的CDR区残基用具有所期望性质、亲和力和/或能力的非人物种(供体抗体)(诸如小鼠，大鼠，家兔或非人灵长类动物)的CDR区残基替换。在某些情形中，可以将人免疫球蛋白的FR区残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体中或在供体抗体中没有的氨基酸修饰。进行这些修饰可以是为了进一步改进抗体的性能，诸如结合亲和力。
在本申请中，术语“全人源抗体”通常是指仅包含人类免疫球蛋白蛋白质序列的抗体。如果其是在小鼠中、在小鼠细胞中或在衍生自小鼠细胞的杂交瘤中生产，那么全人源抗体可能含有鼠糖链。类似地，“鼠源抗体”、“小鼠抗体”或“大鼠抗体”分别指仅包含小鼠或大鼠免疫球蛋白序列的抗体。可通过噬菌体展示或其它分子生物学方法，在人体内、在具有人类免疫球蛋白种系序列的转基因动物体内生成全人源抗体。可用于制造抗体的示例性技术是本领域已知的。
在本申请中，术语“抗原结合蛋白”通常是指包含结合抗原的部分的蛋白质，以及任选地允许结合抗原的部分采用促进抗原结合蛋白与抗原结合的构象的支架或骨架部分。抗原结合蛋白的实例包括但不限于抗体、抗原结合片段(Fab，Fab’，F(ab)2，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv，VHH和/或dAb)、免疫缀合物、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体片段、抗体衍生物、抗体类似物或融合蛋白等，只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。本申请的“分离的抗原结合蛋白”可以包含结合抗原的部分和任选地，允许抗原结合部分采用促进所述抗原结合部分结合抗原的构象的支架或构架部分。
在本申请中，术语“多肽分子”和“多肽”、“肽”可以互换使用，通常是指氨基酸残基的聚合物。术语“融合蛋白”通常是指具有至少两个共价连接在一起的部分的多肽。其中每个部分可以是具有不同特性的多肽。该特性可以是生物学性质，例如体外或体内活性。该性质也可以是简单的化学或物理性质，例如与靶分子的结合，反应的催化等。这两个部分可以通过单个肽键或通过肽接头直接连接。
在本申请中，术语“核酸分子”通常是指任何长度的分离形式的核苷酸，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或从其天然环境分离的或人工合成的类似物。
在本申请中，术语“载体”通常是指可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可以通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内表达得以表达。一种载体可能含有多种控制表达的元件。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还有可能包括有协助其进入细胞的成分。
在本申请中，术语“细胞”通常是指可以是或已经是受试者质粒或载体的接受者的单个细胞、细胞系或细胞培养物，其包括本申请所述的核酸分子或本申请所述的载体。细胞可以包括单个细胞的后代。由于天然、偶然或有意的突变，后代可以不一定与原始母细胞完全相同(在总DNA互补体的形态上或在基因组上)。细胞可包括用本申请所述的载体在体外转染的细胞。
在本申请中，术语“免疫缀合物”通常是指所述其他试剂(例如，化疗剂、放射性元素、细胞生长抑制剂和细胞毒性剂)与所述抗体或其抗原结合片段缀合(例如，通过连接分子共价相连)而形成的缀合物，该缀合物可以通过所述抗体或其抗原结合片段与靶细胞上的抗原特异性结合，将所述其他试剂递送至靶细胞(例如，肿瘤细胞)。
在本申请中，术语“药物组合物”通常是指用于预防/治疗疾病或病症的组合物。所述药物组合物可以包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体和/或本申请所述的细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。此外，所述药物组合物还可以包含一种或多种(药学上有效的)载剂等合适的制剂。组合物的可接受成分在所用剂量和浓度下可以对接受者无毒。本发明的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。
在本申请中，术语“药学上可接受的载剂”通常是指药剂学可接受的载体、赋形剂或稳定剂，它们在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。生理学可接受的载体可包括合适的物质。指药剂学可接受的载体(carrier)与基因工程中用于插入核酸的载体(vector)通常并不是同一物质。
在本申请中，术语“免疫检查点抑制剂”通常是指能够抑制免疫检查点生物学活性的任何试剂。在本申请中，所述免疫检查点(immune checkpoint)可以为在免疫系统中起抑制作用的调节分子。所述免疫检查点可以表达于免疫细胞上，抑制免疫细胞的功能。所述免疫检查点可以与肿瘤免疫逃逸相关。在本申请中，所述免疫检查点可以包括PD-1和/或PD-L1。在本申请中，所述抑制剂可以包括能够抑制配体和受体(例如PD-1和PD-L1)之间相互作用的任何试剂。在本申请中，所述试剂可以为化学试剂，也可以为蛋白质和/或多肽。例如，所述试剂可以包括抗体或其抗原结合片段。
在本申请中，术语“PD-1”通常是指CD28家族的免疫抑制受体。PD-1可以表达于预先活化的T细胞，并与两个配体PD-L1和/或PD-L2结合。在本申请中，所述PD-1可以包括人PD-1(hPD-1)或其变体、同种型以及物种同源物，以及与hPD-1具有至少一个共同表位的类似物。hPD-1的GenBank登录号为U64863。本申请的PD-1蛋白还可以涵盖其功能活性片段，不限于在细胞中发生的加工和/或修饰后产生的包含PD-1蛋白功能活性片段的蛋白。
在本申请中，术语“PD-L1”通常是指PD-1的一种细胞表面糖蛋白配体之一。所述PD-L1可以与PD-1结合。所述PD-L1可以与PD-1结合时下调T细胞的活化和/或细胞因子的分泌。在本申请中，所述PD-L1可以包括人PD-L(hPD-L1)或其变体、同种型以及物种同源物，以及与hPD-L1具有至少一个共同表位的类似物。hPD-L1的GenBank登录号为Q9NZQ7。本申请的PD-L1蛋白还可以涵盖其功能活性片段，不限于在细胞中发生的加工和/或修饰后产生的包含PD-L1蛋白功能活性片段的蛋白。
在本申请中，术语“实体瘤”通常是指可以通过临床检查(例如X线照射、CT扫描、B超或触诊等)手段检测到的有形的肿瘤。所述肿瘤可以包括异常细胞生长形成的赘生物或实体病变。
在本申请中，术语“乳腺癌”通常是指发生在或源自乳腺腺上皮组织的肿瘤，例如可以是发生在或源自乳腺腺上皮组织的癌症。
在本申请中，术语“直肠癌”通常是指发生在或源自直肠的肿瘤。例如，可以发生在或源自从齿状线至直肠乙状结肠交界处之间的肿瘤，例如可以是发生在或源自从齿状线至直肠乙状结肠交界处之间的癌症。
在本申请中，术语“结肠癌”通常是指发生于或源自结肠部位的消化道的肿瘤。例如，所述结肠癌可以发生于或源自直肠与乙状结肠交界处。例如，所述结肠癌可以是发生于或源自结肠部位的消化道的癌症。
在本申请中，术语“直接相连”可以与术语“间接相连”相对，术语“直接相连”通常是指直接连接。例如，所述直接相连可以为物质间没有间隔子而直接相连的情况。所述间隔子可以是连接子。例如，所述连接子可以为肽连接子。术语“间接相连”通常是指物质间不直接相连的情况。例如，所述间接相连可以为通过间隔子而连接的情况。例如，在本申请所述的分离的抗原结合蛋白中，所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端可以直接或间接相连。
在本申请中，术语“感染”通常是指病原体引发的疾病，包括例如病毒感染、细菌感染、真菌感染或者原生动物例如寄生虫感染。
在本申请中，术语“di-scFv”通常是指二价scFv，例如可以是两个scFv分子通过短接头缀合的分子。
在本申请中，术语“特异性结合”或“特异性的”通常是指可测量的和可再现的相互作用，例如靶标和抗体之间的结合，可在分子(包括生物分子)的异质群体存在的情况决定靶标的存在。例如，特异性结合靶标(其可以为表位)的抗体可以是以比它结合其它靶标更大的亲和性、亲合力、更容易、和/或以更大的持续时间结合该靶标的抗体。在某些实施方案中，抗体特异性结合蛋白质上的表位，所述表位在不同种属的蛋白质中是保守的。在某些实施方案中，特异性结合可以包括但不要求排他性地结合。
在本申请中，术语“受试者”通常是指人类或非人类动物，包括但不限于猫、狗、马、猪、奶牛、羊、兔、小鼠、大鼠或猴。
在本申请中，术语“肿瘤”通常是指任何新的病理性的组织增生。肿瘤细胞可以局部地或通过血流和淋巴系统扩散到身体其他部分。在本申请中，所述肿瘤可以包括良性肿瘤和恶性肿瘤。在本申请中，所述肿瘤可以包括实体瘤和/或血液瘤。在本申请中，所述肿瘤可以包括癌症。在本申请中，所述肿瘤的实例包括但不限于结肠癌。
在本申请中，涉及的蛋白质、多肽和/或氨基酸序列，还应理解为至少包含以下的范围：与该所述蛋白质或多肽具备相同或类似功能的变体或同源物。
在本申请中，所述变体可以为，例如在所述蛋白质和/或所述多肽(例如，特异性结合GITR的抗体或其片段)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸的蛋白质或多肽。例如，所述功能性变体可包含已经通过至少1个，例如1-30个、1-20个或1-10个，又例如1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失和/或插入而具有氨基酸改变的蛋白质或多肽。所述功能性变体可基本上保持改变(例如取代、缺失或添加)之前的所述蛋白质或所述多肽的生物学特性。例如，所述功能性变体可保持改变之前的所述蛋白质或所述多肽的至少60％，70％，80％，90％，或100％的生物学活性(例如抗原结合能力)。例如，所述取代可以为保守取代。例如，所述变体也可以为涵盖其功能活性片段的多肽，不限于在细胞中发生的加工和/或修饰后产生的包含所述蛋白功能活性片段的多肽。
在本申请中，所述同源物可以为与所述蛋白质和/或所述多肽(例如，特异性结合GITR的抗体或其片段)的氨基酸序列具有至少约85％(例如，具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同源性的蛋白质或多肽。
在本申请中，所述同源性通常是指两个或多个序列之间的相似性、类似或关联。可以通过以下方式计算“序列同源性百分比”：将两条待比对的序列在比较窗中进行比较，确定两条序列中存在相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中的总位置数(即，窗大小)，并且将结果乘以100，以产生序列同源性百分比。为了确定序列同源性百分数而进行的比对，可以按本领域已知的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内或目标序列区域内最大比对所需要的任何算法。所述同源性也可以通过以下的方法测定：FASTA和BLAST。对FASTA算法的描述可以参见W.R.Pearson和D.J.Lipman的“用于生物学序列比较的改进的工具”，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)，85：2444-2448，1988；和D.J.Lipman和W.R.Pearson的“快速灵敏的蛋白质相似性搜索”，Science，227：1435-1441，1989。对BLAST算法的描述可参见S.Altschul、W.Gish、W.Miller、E.W.Myers和D.Lipman的“一种基本的局部对比(alignment)搜索工具”，分子生物学杂志，215：403-410，1990。
在本申请中，术语“包含”通常是指包括、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由……组成”的含义。
在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。
发明详述
一方面，本申请提供一种分离的抗原结合蛋白。
抗体的CDR又称互补决定区，是可变区的一部分。该区域的氨基酸残基可以与抗原或抗原表位接触。抗体CDR可以通过多种编码系统来确定，如CCG、Kabat、Chothia、IMGT、综合考虑Kabat/Chothia等。这些编码系统为本领域内已知，具体可参见，例如，www.bioinf.org.uk/abs/index.html#kabatnum。本领域技术人员可以根据抗体的序列和结构，用不同的编码系统确定出CDR区。使用不同的编码系统，CDR区可能存在差别。在本申请中，所述CDR涵盖根据任何CDR划分方式划分得到的CDR序列；也涵盖其变体，所述变体包括所述CDR的氨基酸序列经过取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸。例如1-30个、1-20个或1-10个，又例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸取代、缺失和/或插入；也涵盖其同源物，所述同源物可以为与所述CDR的氨基酸序列具有至少约85％(例如，具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同源性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述CDR可以由Kabat编号方案来确定。
一方面，本申请提供了一种分离的抗原结合蛋白，其可以包含HCDR3，所述HCDR3可以包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以具有GITR结合能力。例如，所述CDR可以由Kabat编号方案来确定。例如，所述HCDR3可以包含Ab0、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、或Ab12的HCDR3。例如，所述HCDR3可以包含Ab0、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、或Ab12的重链可变区中的HCDR3。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白还可以包含HCDR2，所述HCDR2可以包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以具有GITR结合能力。例如，所述CDR可以由Kabat编号方案来确定。例如，所述HCDR2可以包含Ab0、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、或Ab12的HCDR2。例如，所述HCDR2可以包含Ab0、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、或Ab12的重链可变区中的HCDR2。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白还可以包含HCDR1，所述HCDR1可以包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以具有GITR结合能力。例如，所述CDR可以由Kabat编号方案来确定。例如，所述HCDR1可以包含Ab0、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、或Ab12的HCDR1。例如，所述HCDR1可以包含Ab0、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、或Ab12的重链可变区中的HCDR1。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含HCDR3，HCDR2和HCDR1。例如，所述分离的抗原结合蛋白的HCDR3可以包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，HCDR2可以包含SEQID NO:2所示的氨基酸序列，且HCDR1可以包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以具有GITR结合能力。例如，所述CDR可以由Kabat编号方案来确定。例如，所述HCDR3，HCDR2和HCDR1可以包含Ab0、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、或Ab12的HCDR3，HCDR2和HCDR1。例如，所述HCDR3，HCDR2和HCDR1可以包含Ab0、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、或Ab12的重链可变区中的HCDR3，HCDR2和HCDR1。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含LCDR3，所述LCDR3可以包含如SEQID NO:6所示的氨基酸序列。例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以具有GITR结合能力。例如，所述CDR可以由Kabat编号方案来确定。例如，所述LCDR3可以包含Ab0、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、或Ab12的LCDR3。例如，所述LCDR3可以包含Ab0、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、或Ab12的轻链可变区中的LCDR3。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白还可以包含LCDR2，所述LCDR2可以包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以具有GITR结合能力。例如，所述CDR可以由Kabat编号方案来确定。例如，所述LCDR2可以包含Ab0、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、或Ab12的LCDR2。例如，所述LCDR2可以包含Ab0、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、或Ab12的轻链可变区中的LCDR2。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白还可以包含LCDR1，所述LCDR1可以包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以具有GITR结合能力。例如，所述CDR可以由Kabat编号方案来确定。例如，所述LCDR1可以包含Ab0、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、或Ab12的LCDR1。例如，所述LCDR1可以包含Ab0、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、或Ab12的轻链可变区中的LCDR1。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含LCDR3，LCDR2和LCDR1。例如，所述分离的抗原结合蛋白的LCDR3可以包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，LCDR2可以包含SEQID NO:5所示的氨基酸序列，且LCDR1可以包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以具有GITR结合能力。例如，所述CDR可以由Kabat编号方案来确定。例如，所述LCDR3，LCDR2和LCDR1可以包含Ab0、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、或Ab12的LCDR3，LCDR2和LCDR1。例如，所述LCDR3，LCDR2和LCDR1可以包含Ab0、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、或Ab12的轻链可变区中的LCDR3，LCDR2和LCDR1。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含HCDR3，HCDR2，HCDR1，LCDR3，LCDR2和LCDR1。例如，本申请所述的分离的抗原结合蛋白HCDR3可以包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，HCDR2可以包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，HCDR1可以包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，LCDR3可以包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，LCDR2可以包含SEQID NO:5所示的氨基酸序列，且LCDR1可以包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以具有GITR结合能力。例如，所述HCDR3，HCDR2，HCDR1，LCDR3，LCDR2和LCDR1可以包含Ab0、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、或Ab12的HCDR3，HCDR2，HCDR1，LCDR3，LCDR2和LCDR1。在本申请中，所述CDR可以涵盖根据任何CDR划分方式划分得到的CDR序列；也可以涵盖其变体。例如，所述HCDR3，HCDR2，HCDR1，LCDR3，LCDR2和LCDR1可以包含Ab0、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、或Ab12的重链可变区中的HCDR3，HCDR2，HCDR1，以及其轻链可变区的LCDR3，LCDR2和LCDR1。例如，所述HCDR3，HCDR2，HCDR1，LCDR3，LCDR2和LCDR1可以包含Ab0的重链可变区中的HCDR3，HCDR2，HCDR1，以及其轻链可变区的LCDR3，LCDR2和LCDR1。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含H-FR1，所述H-FR1的C末端可以与所述HCDR1的N末端直接或间接相连。例如，所述H-FR1可以包含如X1VQLQESGPGLVKPSQX2LSLTCTVX3GX4SIX5所示的氨基酸序列，其中X1、X2、X3、X4、和X5可以各自独立地选自任一种氨基酸，例如天然氨基酸。所述H-FR1可以包含如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含H-FR1，所述H-FR1的C末端可以与所述HCDR1的N末端直接或间接相连，所述H-FR1可以包含如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含H-FR2，所述H-FR2可以位于所述HCDR1与所述HCDR2之间。例如，所述H-FR2可以包含如WIRQX6PGX7X8LEWX9G所示的氨基酸序列，其中X6、X7、X8、和X9可以各自独立地选自任一种氨基酸，例如天然氨基酸。所述H-FR2可以包含如SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含H-FR2，所述H-FR2可以位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，所述H-FR2可以包含如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含H-FR3，所述H-FR3可以位于所述HCDR2与所述HCDR3之间。例如，所述H-FR3可以包含如RX10X11X12X13X14DTSKNQFX15LX16LX17SVTX18X19DTAX20YYCAR所示的氨基酸序列，其中X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、和X20可以各自独立地选自任一种氨基酸，例如天然氨基酸。所述H-FR3可以包含如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含H-FR3，所述H-FR3可以位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，所述H-FR3可以包含如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含H-FR4，所述H-FR4的N末端可以与所述HCDR3的C末端相连。例如，所述H-FR4可以包含如WGQGTX21VTVSS所示的氨基酸序列，其中X21可以选自任一种氨基酸，例如天然氨基酸。所述H-FR4可以包含如SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含H-FR4，所述H-FR4的N末端可以与所述HCDR3的C末端相连，所述H-FR4可以包含如SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可以包含H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4。例如，所述分离的抗原结合蛋白的H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4可分别依次包含SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:40、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列。例如，所述分离的抗原结合蛋白的H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4可分别依次包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。例如，所述分离的抗原结合蛋白的H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4可分别依次包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。例如，所述分离的抗原结合蛋白的H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4可分别依次包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。例如，所述分离的抗原结合蛋白的H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4可分别依次包含SEQ ID NO:9、SEQID NO:12、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。例如，所述分离的抗原结合蛋白的H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4可分别依次包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含L-FR1，所述L-FR1的C末端可以与所述LCDR1的N末端直接或间接相连。例如，所述L-FR1可以包含如DIVMX22QSPX23SLAVSX24GEX25X26TX27X28C所示的氨基酸序列，其中X22、X23、X24、X25、X26、X27和X28可以各自独立地选自任一种氨基酸，例如天然氨基酸。所述L-FR1可以包含如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含L-FR1，所述L-FR1的C末端可以与所述LCDR1的N末端直接或间接相连，所述L-FR1可以包含如SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含L-FR2，所述L-FR2可以位于所述LCDR1与所述LCDR2之间。例如，所述L-FR2可以包含如WYQQKPGQX29PKLLIY所示的氨基酸序列，其中X29可以选自任一种氨基酸，例如天然氨基酸。所述L-FR2可以包含如SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含L-FR2，所述L-FR2可以位于所述LCDR1与所述LCDR2之间，所述L-FR2可以包含如SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含L-FR3，所述L-FR3可以位于所述LCDR2与所述LCDR3之间。例如，所述L-FR3可以包含如GVPDRFX30GX31GSGTDFTLTISSX32X33AEDX34AVYYC所示的氨基酸序列，其中X30、X31、X32、X33和X34可以各自独立地选自任一种氨基酸，例如天然氨基酸。所述L-FR3可以包含如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含L-FR3，所述L-FR3可以位于所述LCDR2与所述LCDR3之间，所述L-FR3可以包含如SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含L-FR4，所述L-FR4的N末端可以与所述LCDR3的C末端相连。例如，所述L-FR4可以包含如FGGGTKX35EIK所示的氨基酸序列，其中X35可以选自任一种氨基酸，例如天然氨基酸。所述L-FR4可以包含如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含L-FR4，所述L-FR4的N末端可以与所述LCDR3的C末端相连，所述L-FR4可以包含如SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含L-FR1，L-FR2，L-FR3和L-FR4。例如，所述分离的抗原结合蛋白的L-FR1，L-FR2，L-FR3和L-FR4可分别依次包含SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列。例如，所述分离的抗原结合蛋白的L-FR1，L-FR2，L-FR3和L-FR4可分别依次包含SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。例如，所述分离的抗原结合蛋白的L-FR1，L-FR2，L-FR3和L-FR4可分别依次包含SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列。例如，所述分离的抗原结合蛋白的L-FR1，L-FR2，L-FR3和L-FR4可分别依次包含SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列。例如，所述分离的抗原结合蛋白的L-FR1，L-FR2，L-FR3和L-FR4可分别依次包含SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含VH，所述VH可以包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以具有GITR结合能力。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含VH，所述VH可以包含SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以具有GITR结合能力。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含VL，所述VL可以包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以具有GITR结合能力。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含VL，所述VL可以包含SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以具有GITR结合能力。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含所述VH和VL。在某些实施方式中，所述VH可以包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列，且所述VL可以包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。
例如，所述VH可以包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，且所述VL可以包含SEQID NO:35所示的氨基酸序列。例如，所述VH可以包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，且所述VL可以包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。例如，所述VH可以包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，且所述VL可以包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。例如，所述VH可以包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，且所述VL可以包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。例如，所述VH可以包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，且所述VL可以包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。例如，所述VH可以包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，且所述VL可以包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。例如，所述VH可以包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，且所述VL可以包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。例如，所述VH可以包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，且所述VL可以包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。例如，所述VH可以包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，且所述VL可以包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。例如，所述VH可以包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，且所述VL可以包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。例如，所述VH可以包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，且所述VL可以包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。例如，所述VH可以包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，且所述VL可以包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。例如，所述VH可以包含SEQ IDNO:34所示的氨基酸序列，且所述VL可以包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以具有GITR结合能力。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含本申请所述的VH中的至少一个CDR。在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含本申请所述的VL中的至少一个CDR。所述CDR可以根据任何划分方式划分得到。在本申请中，所述CDR可以涵盖根据任何CDR划分方式划分得到的CDR序列；也可以涵盖其变体。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含本申请所述VH中的HCDR1，HCDR2和HCDR3。所述VH可以包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以具有GITR结合能力。在本申请中，所述CDR可以涵盖根据任何CDR划分方式划分得到的CDR序列；也可以涵盖其变体。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含本申请所述VH中的HCDR1，HCDR2和HCDR3。所述VH可以包含SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以具有GITR结合能力。在本申请中，所述CDR可以涵盖根据任何CDR划分方式划分得到的CDR序列；也可以涵盖其变体。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含本申请所述VL中的LCDR1，LCDR2和LCDR3。所述VL可以包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以具有GITR结合能力。在本申请中，所述CDR可以涵盖根据任何CDR划分方式划分得到的CDR序列；也可以涵盖其变体。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含本申请所述VL中的LCDR1，LCDR2和LCDR3。所述VL可以包含SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以具有GITR结合能力。在本申请中，所述CDR可以涵盖根据任何CDR划分方式划分得到的CDR序列；也可以涵盖其变体。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包括抗体重链恒定区。所述抗体重链恒定区可以源自人IgG、IgA、IgD、IgE和/或IgM重链恒定区。所述抗体重链恒定区可以源自人IgG重链恒定区。在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白可以包括抗体重链恒定区，且所述抗体重链恒定区可以源自人IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4重链恒定区。在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白可以包括抗体重链恒定区，且所述抗体重链恒定区可以源自人IgG1重链恒定区。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包括抗体轻链恒定区。所述抗体轻链恒定区可以源自人Igκ恒定区。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，所述抗原结合片段可以包括Fab，Fab’，Fv片段，F(ab’)2，F(ab)2，scFv，di-scFv，VHH和/或dAb。
在某些实施方式中，所述抗体可以包括单克隆抗体。在某些实施方式中，所述抗体可以包括鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和/或全人源抗体。
例如，所述嵌合抗体的VH可以包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，且所述嵌合抗体的VL可以包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。
例如，所述人源化抗体的VH可以包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，且所述人源化抗体的VL可以包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。例如，所述人源化抗体的VH可以包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，且所述人源化抗体的VL可以包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。例如，所述人源化抗体的VH可以包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，且所述人源化抗体的VL可以包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。例如，所述人源化抗体的VH可以包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，且所述人源化抗体的VL可以包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。例如，所述人源化抗体的VH可以包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，且所述人源化抗体的VL可以包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。例如，所述人源化抗体的VH可以包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，且所述人源化抗体的VL可以包含SEQ IDNO:37所示的氨基酸序列。例如，所述人源化抗体的VH可以包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，且所述人源化抗体的VL可以包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。例如，所述人源化抗体的VH可以包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，且所述人源化抗体的VL可以包含SEQID NO:36所示的氨基酸序列。例如，所述人源化抗体的VH可以包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，且所述人源化抗体的VL可以包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。例如，所述人源化抗体的VH可以包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，且所述人源化抗体的VL可以包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。例如，所述人源化抗体的VH可以包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，且所述人源化抗体的VL可以包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。例如，所述人源化抗体的VH可以包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，且所述人源化抗体的VL可以包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。例如，所述人源化抗体的VH可以包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，且所述人源化抗体的VL可以包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。例如，本申请的人源化抗体可以具有GITR结合能力。
在某些实施方式中，所述抗体可以包含轻链恒定区。例如，轻链恒定区可以是源自人抗体的轻链恒定区；例如，轻链恒定区可以包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列；例如，轻链恒定区可以包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗体可以包含重链恒定区。例如，重链恒定区可以是源自人抗体的重链恒定区；例如，重链恒定区可以包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列；例如，重链恒定区可以包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列；例如，重链恒定区可以包含SEQ IDNO:53所示的氨基酸序列；例如，重链恒定区可以包含SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列。
此外，需要说明的是，本申请所述分离的抗原结合蛋白可以包含与其存在一个或多个保守序列修饰的重链和/或轻链序列。所谓“保守序列修饰”是指不会显著影响或改变抗体结合特性的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸替换、添加和删除。可以通过领域内已知的标准技术，例如点突变和PCR介导的突变，将修饰引入本申请所述分离的抗原结合蛋白中。保守氨基酸替换是氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基进行替换。具有相似侧链的氨基酸残基组在领域内已知。这些氨基酸残基组包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。在某些实施方式中，本申请所述分离的抗原结合蛋白的CDR区中的一个或多个氨基酸残基可以用同侧链组的其他氨基酸残基替换。本领域内的技术人员知道，一些保守序列修改不会使抗原结合性消失，具体可以参见，例如，Brummell et al.,(1993)Biochem 32:1180-8；de Wildtet al.,(1997)Prot.Eng.10:835-41；Komissarov et al.,(1997)J.Biol.Chem.272:26864-26870；Hall et al.,(1992)J.Immunol.149:1605-12；Kelley and O'Connell(1993)Biochem.32:6862-35；Adib-Conquy et al.,(1998)Int.Immunol.10:341-6andBeers et al.,(2000)Clin.Can.Res.6:2835-43。
可以通过本领域已知的各种测定鉴别、筛选或表征本申请所述的GITR抗原结合蛋白。
例如，可以通过已知方法诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫印迹(例如，蛋白质印迹)、流式细胞术(例如，FACS)、免疫组织化学、免疫荧光等来测试本申请抗原结合蛋白或融合蛋白的抗原结合活性。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白能够特异性结合GITR或其功能活性片段。
在某些实施方式中，GITR或其功能活性片段可以是全长的GITR或其功能活性片段，或是发挥GITR功能活性的片段，例如，GITR功能活性可以是激活GITR下游通路的能力，如核因子-κB(NF-κB)通路。在某些实施方式中，GITR或其功能活性片段可以是分离的GITR或其功能活性片段，或是各种形式GITR或其功能活性片段的混合物。例如，GITR或其功能活性片段可以是人GITR或其功能活性片段；例如，GITR或其功能活性片段可以是表达在细胞表面的GITR或其功能活性片段；例如，GITR或其功能活性片段可以是结合在固相介质上的GITR或其功能活性片段。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白可以通过FACS方法测定抗原结合蛋白与抗原的结合活性。例如，本申请所述抗原结合蛋白可以以小于或等于约7.33μg/ml的EC50值与细胞表面人GITR结合。例如，本申请所述抗原结合蛋白可以以小于或等于约7.32μg/ml、小于或等于约7.30μg/ml、小于或等于约7.00μg/ml、小于或等于约6.50μg/ml、小于或等于约6.40μg/ml、小于或等于约6.00μg/ml、小于或等于约5.00μg/ml、小于或等于约4.70μg/ml、小于或等于约4.00μg/ml、小于或等于约3.90μg/ml、小于或等于约3.80μg/ml、小于或等于约3.60μg/ml、小于或等于约3.50μg/ml、小于或等于约3.00μg/ml、小于或等于约2.40μg/ml、小于或等于约2.20μg/ml、小于或等于约2.10μg/ml、小于或等于约1.30μg/ml、小于或等于约1.00μg/ml、小于或等于约0.96μg/ml、小于或等于约0.93μg/ml、小于或等于约0.71μg/ml、小于或等于约0.70μg/ml、小于或等于约0.43μg/ml、或小于或等于约0.40μg/ml的EC50值与细胞表面人GITR结合。
在某些实施方式中，检测GITR结合蛋白与细胞表达的GITR结合后引起Jurkat-GITR-NFκB细胞的荧光素酶表达量的变化来比较本申请GITR结合蛋白的亲和力筛选。例如，本申请所述抗原结合蛋白可以以1.05μg/ml或更低的EC50值激活GITR的信号通路，例如NFκB信号通路。例如，本申请所述抗原结合蛋白可以以1.04μg/ml或更低、0.78μg/ml或更低、0.73μg/ml或更低、0.55μg/ml或更低、0.49μg/ml或更低、或0.48μg/ml或更低的EC50值激活GITR的信号通路，例如NFκB信号通路。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白可以通过Biacore进行亲和力筛选。例如，所述分离的抗原结合蛋白可以以3.10E-09M或更低的KD值与GITR蛋白相结合。例如，所述分离的抗原结合蛋白可以以3.01E-09M或更低、2.40E-09M或更低、2.00E-09M或更低、1.99E-09M或更低、1.64E-09M或更低、1.33E-09M或更低、1.00E-09M或更低、9.76E-10M或更低、9.58E-10M或更低、9.50E-10M或更低、9.17E-10M或更低、9.00E-10M或更低、8.00E-10M或更低、7.48E-10M或更低、6.81E-10M或更低、或6.00E-10M或更低的KD值与GITR蛋白相结合。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白可以通过酶联免疫吸附剂测定法(ELISA)测定抗原结合蛋白与抗原的结合活性。例如，所述分离的抗原结合蛋白可以具有以约8.57μg/ml或更低的EC50值结合所述GITR或其功能片段的能力。例如，所述GITR或其功能片段可以包含猴的GITR；所述分离的抗原结合蛋白可以具有以约8.57μg/ml或更低、约8.00μg/ml或更低、约5.00μg/ml或更低、约4.60μg/ml或更低、约4.56μg/ml或更低、约4.24μg/ml或更低、约1.00μg/ml或更低、约0.20μg/ml或更低、约0.19μg/ml或更低、约0.12μg/ml或更低、约0.09μg/ml或更低、约0.08μg/ml或更低、约0.07μg/ml或更低、约0.06μg/ml或更低、约0.05μg/ml或更低、约0.04μg/ml或更低、约0.03μg/ml或更低、约0.02μg/ml或更低、或约0.01μg/ml或更低的EC50值结合所述GITR或其功能片段的能力。例如，所述GITR或其功能片段可以包含人的GITR；所述分离的抗原结合蛋白可以具有以约0.06μg/ml或更低、约0.05μg/ml或更低、约0.04μg/ml或更低、约0.03μg/ml或更低、约0.02μg/ml或更低、或约0.01μg/ml或更低的EC50值结合所述GITR或其功能片段的能力。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白能够抑制肿瘤生长。例如，所述分离的抗原结合蛋白能够以约30％或更高肿瘤体积抑制率抑制肿瘤生长，例如结肠癌。例如，所述分离的抗原结合蛋白能够以约16％或更高、约20％或更高、约39％或更高、约41％或更高、约54％或更高、约70％或更高、约91％或更高、约97％或更高、或约98％或更高的肿瘤体积抑制率抑制肿瘤生长。
一方面，本申请提供一种多肽分子、核酸分子、载体、免疫缀合物、细胞和药物组合物。
另一方面，本申请提供了多肽分子，其可以包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白。
在某些实施方式中，所述多肽分子可以包含融合蛋白。在某些实施方式中，所述多肽分子可以为融合蛋白。在某些实施方式中，所述多肽分子为多特异性(例如，双特异性，三特异性或其他多特异性)抗体。所述多特异性抗体可以包含：1)本申请所述的分离的抗原结合蛋白，以及2)一个或多个结合其他抗原、和/或结合相同抗原的其他表位的靶向部分。在某些实施方式中，本申请的多肽分子可以包含氨基酸以外的结构，例如，本申请的多肽分子可以包含核酸、多糖、脂质、小分子，以及前述的任意组合。
另一方面，本申请提供了分离的核酸分子，其可以编码本申请所述的分离的抗原结合蛋白。例如，其可以是通过以下方法产生或合成的：(i)在体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应(PCR)扩增产生的；(ii)通过克隆重组产生的；(iii)纯化的，例如通过酶切和凝胶电泳分级分离；或者(iv)合成的，例如通过化学合成。
另一方面，本申请提供了一种载体，其可以包含本申请所述的核酸分子。此外，所述载体中还可包含其他基因，例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该载体的标记基因。此外，所述载体还可包含允许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。这样的控制元件为本领域技术人员所熟知的，例如，可包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件等。所述载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内表达得以表达。所述载体可以包括，例如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或者在例如遗传工程中通常使用的其他载体。例如，所述载体为表达载体。此外，所述载体还可以包括有协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。
另一方面，本申请提供了一种细胞，其可以包含本申请所述的核酸分子或本申请所述的载体。在某些实施方式中，每种或每个宿主细胞可包含一个或一种本申请所述的核酸分子或载体。在某些实施方式中，每种或每个宿主细胞可包含多个(例如，2个或以上)或多种(例如，2种或以上)本申请所述的核酸分子或载体。例如，可将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，例如真核细胞，如来自植物的细胞、真菌或酵母细胞等。在某些实施方式中，所述细胞可以是细菌细胞(例如，大肠杆菌)、酵母细胞或其它真核细胞，例如COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、CHO-K1细胞、LNCAP细胞、HeLa细胞、293T细胞、COS-1细胞、SP2/0细胞、NS0细胞或骨髓瘤细胞。可通过本领域已知的方法将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，例如电穿孔、lipofectine转染、lipofectamin转染等。
另一方面，本申请还提供了免疫缀合物，其可以包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白。
在某些实施方式中，可以将本申请所述的分离的抗原结合蛋白或其片段与另一试剂，如化学治疗剂、毒素、免疫治疗剂、成像探针、分光镜探针等的连接。该连接可以通过一个或多个共价键，或非共价相互作用，并且可以包括螯合作用。可以使用多种接头(所述接头可以为本领域所知)以形成免疫缀合物。此外，可以以融合蛋白质的形式提供免疫缀合物，其可以由编码免疫缀合物的多核苷酸表达。所述免疫缀合物还可以包含例如抗体-药物缀合物(ADC)。在ADC中，抗体和治疗剂可以通过接头交联，该接头可以是可切割的接头，例如可以是体内和/或体外可酶切的接头，例如可以是肽类接头、二硫类接头或腙类接头。
另一方面，本申请还提供了药物组合物，其可以包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白、本申请所述的多肽分子、本申请所述的免疫缀合物、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体和/或本申请所述的细胞，以及任选地药学上可接受的载剂。
在某些实施方案中，所述药物组合物还可以包含一种或多种(药学上有效的)佐剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂和/或防腐剂的合适的制剂。组合物的可接受成分在所用剂量和浓度下可以对接受者无毒。本发明的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。
在某些实施方案中，所述药物组合物还可含有多于一种活性化合物，通常为不会不利地影响彼此的具有互补活性的那些活性化合物。此类药物的类型和有效量可以取决于例如制剂中存在的拮抗剂的量和类型，以及受试者的临床参数。
在某些实施方案中，所述药学上可接受的载剂可以包括与药物给药相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、等渗剂和吸收延迟剂，通常安全、无毒。
在某些实施方案中，所述药物组合物可以包含肠胃外、经皮、腔内、动脉内、鞘内和/或鼻内施用或直接注射到组织中。例如，所述药物组合物可以通过输注或注射施用于患者或者受试者。在某些实施方案中，所述药物组合物的施用可以通过不同的方式进行，例如静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部或真皮内施用。在某些实施方案中，所述药物组合物可以不间断施用。所述不间断(或连续)施用可以通过患者佩戴的小泵系统来实现，以测量流入患者体内的治疗剂。
在某些实施方案中，所述药物组合物还包含一种或多种的免疫检查点抑制剂。例如，所述免疫检查点抑制剂可以包含PD-1抑制剂和/或PD-L1抑制剂。例如，所述免疫检查点抑制剂可以包含PD-1抗体或其抗原结合片段，和/或PD-L1抗体或其抗原结合片段。例如，免疫检查点抑制剂可以包含派姆单抗(pembrolizumab)中的一个CDR，例如可以是LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2或HCDR3。例如，免疫检查点抑制剂可以包含派姆单抗中的3个CDR，例如可以是LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2或HCDR3中的任意3个。例如，免疫检查点抑制剂可以包含派姆单抗中的6个CDR，例如可以是LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3。例如，免疫检查点抑制剂可以包含派姆单抗中重链可变区VH的一个CDR，例如可以是HCDR1、HCDR2或HCDR3。例如，免疫检查点抑制剂可以包含派姆单抗中重链可变区VH的3个CDR。例如，免疫检查点抑制剂可以包含派姆单抗中轻链可变区VL的一个CDR，例如可以是LCDR1、LCDR2、或LCDR3。例如，免疫检查点抑制剂可以包含派姆单抗中轻链可变区VL的3个CDR。例如，免疫检查点抑制剂可以包含派姆单抗中重链可变区VH的3个CDR以及轻链可变区VL的3个CDR。例如，派姆单抗的HCDR1氨基酸序列可以如SEQ ID NO:60所示，派姆单抗的HCDR2氨基酸序列可以如SEQ ID NO:61所示，派姆单抗的HCDR3氨基酸序列可以如SEQ IDNO:62所示，派姆单抗的LCDR1氨基酸序列可以如SEQ ID NO:63所示，派姆单抗的LCDR2氨基酸序列可以如SEQ ID NO:64所示，派姆单抗的LCDR3氨基酸序列可以如SEQ ID NO:65所示，所述CDR区域可以根据抗体的序列和结构，用不同的编码系统确定出CDR区。使用不同的编码系统，CDR区可能存在差别。在本申请中，所述CDR涵盖根据任何CDR划分方式划分得到的CDR序列；也涵盖其变体，所述变体包括所述CDR的氨基酸序列经过取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸。例如1-30个、1-20个或1-10个，又例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸取代、缺失和/或插入；也涵盖其同源物，所述同源物可以为与所述CDR的氨基酸序列具有至少约85％(例如，具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同源性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述CDR由Kabat编号方案来确定。例如，免疫检查点抑制剂可以包含派姆单抗中的重链可变区VH。例如，免疫检查点抑制剂可以包含派姆单抗中的轻链可变区VL。例如，免疫检查点抑制剂可以包含派姆单抗中的重链可变区VH以及派姆单抗中的轻链可变区VL。例如，派姆单抗的重链可变区VH氨基酸序列可以如SEQ ID NO:66所示，派姆单抗的轻链可变区VL氨基酸序列可以如SEQ ID NO:67所示。例如，免疫检查点抑制剂可以包含派姆单抗的轻链。例如，免疫检查点抑制剂可以包含派姆单抗的重链。例如，免疫检查点抑制剂可以包含派姆单抗的轻链以及重链，例如，派姆单抗的重链氨基酸序列可以如SEQ ID NO:68所示，派姆单抗的轻链氨基酸序列可以如SEQ ID NO:69所示。
一方面，本申请提供一种药物组合。
在某些实施方案中，本申请的药物组合可以包含本申请的分离的GITR结合蛋白和/或包含GITR结合蛋白的多肽，以及一种或多种的免疫检查点抑制剂。
例如，本申请的免疫检查点抑制剂可以抑制PD-1和PD-L1的相互作用。例如，本申请的免疫检查点抑制剂可以包含PD-1抑制剂和/或PD-L1抑制剂。例如，本申请的免疫检查点抑制剂可以包含PD-1抗体或其抗原结合片段和/或PD-L1抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，所述抗原结合片段可以包括Fab，Fab’，Fv片段，F(ab’)2，F(ab)2，scFv，di-scFv，VHH和/或dAb。在某些实施方式中，所述抗体可以包括单克隆抗体。在某些实施方式中，所述抗体可以包括鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和/或全人源抗体。
在某些实施方案中，本申请的免疫检查点抑制剂可以包含派姆单抗的HCDR1-3以及LCDR1-3。在某些实施方案中，本申请的免疫检查点抑制剂可以包含派姆单抗的VH以及VL。例如，本申请的免疫检查点抑制剂可以包含派姆单抗或其抗原结合片段。例如，所述药物能够以约91％或更高、约97％或更高或约98％或更高肿瘤体积抑制率抑制肿瘤生长。
在某些实施方案中，本申请的分离的GITR结合蛋白和/或包含GITR结合蛋白的多肽与所述免疫检查点抑制剂在药物组合中相互不混合，例如，本申请的分离的GITR结合蛋白和/或包含GITR结合蛋白的多肽与所述免疫检查点抑制剂各自分别存在于不同的容器中。
在某些实施方式中，其中所述药物组合包含第一制剂和第二制剂，所述第一制剂包含所述本申请的分离的GITR结合蛋白和/或包含GITR结合蛋白的多肽和药学上可接受的第一载体，且所述第二制剂包含所述免疫检查点抑制剂和药学上可接受的第二载体。
在某些实施方式中，其包含药物组合物，且所述药物组合物中包含本申请的分离的GITR结合蛋白和/或包含GITR结合蛋白的多肽和所述免疫检查点抑制剂。
一方面，本申请提供一种试剂盒。
例如，其中试剂盒可以包含本申请的分离的GITR结合蛋白、包含GITR结合蛋白的多肽、编码本申请的分离的GITR结合蛋白的核酸分子、包含编码本申请的分离的GITR结合蛋白的核酸分子的载体、包含本申请的分离的GITR结合蛋白的免疫缀合物、包含上述物质的细胞、本申请的物组合物和/或本申请的药物组合。
在某些实施方式中，其中试剂盒可以用于检测样品中GITR的存在和/或含量。
一方面，本申请提供一种制备方法。
另一方面，本申请提供了制备本申请的分离的GITR结合蛋白和/或包含GITR结合蛋白的多肽的方法。所述方法可以包括，在使得本申请的分离的GITR结合蛋白和/或包含GITR结合蛋白的多肽表达的条件下，培养所述本申请所述的宿主细胞。例如，可通过使用适当的培养基、适当的温度和培养时间等，这些方法是本领域普通技术人员所了解的。
任何适于产生单克隆抗体的方法都可用于产生本申请的抗原结合蛋白。例如，可以用连接或天然存在的GITR或其片段，免疫动物。可以使用合适的免疫接种方法，包括佐剂、免疫刺激剂、重复加强免疫接种，可以使用一种或多种途径。例如，可以使用杂交瘤制备方法，获取已经过免疫的小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，经过HAT筛选出杂交瘤细胞株。
任何合适形式的GITR都可以作为免疫原(抗原)，用于产生对GITR特异的非人抗体，筛选所述抗体的生物学活性。例如，激发免疫原可以是全长的成熟人GITR，包括天然的同源二聚体，或含单个/多个表位的肽。免疫原可以单独使用，或与本领域已知的一种或多种免疫原性增强剂组合使用。
嵌合人源抗体可以选自任何种类的免疫球蛋白，包括IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在本申请中，抗体可以是IgG抗体，可以使用IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型。可以通过用本领域的生物学测定筛选抗体实现必需恒定结构域序列的优化，以产生所需生物学活性。同样，任一类轻链都可以在本申请的化合物和方法中使用。例如，本申请的化合物和方法中可以使用κ链或其变体。
一方面，本申请提供一种方法和用途。
另一方面，本申请提供一种检测样品中GITR的方法，可以包含施用本申请的分离的GITR结合蛋白、施用包含GITR结合蛋白的多肽、施用编码本申请的分离的GITR结合蛋白的核酸分子、施用包含编码本申请的分离的GITR结合蛋白的核酸分子的载体、施用包含本申请的分离的GITR结合蛋白的免疫缀合物、施用包含上述物质的细胞、施用本申请的药物组合物、施用本申请的药物组合和/或使用本申请的试剂盒。
在某些情形中，所述检测样品中GITR的方法可以是体外方法。在某些情形中，所述检测样品中GITR的方法可以为非治疗目的的方法。在某些情形中，所述检测样品中GITR的方法可以不是诊断方法。
另一方面，本申请提供一种本申请的分离的GITR结合蛋白、包含GITR结合蛋白的多肽、编码本申请的分离的GITR结合蛋白的核酸分子、包含编码本申请的分离的GITR结合蛋白的核酸分子的载体、包含本申请的分离的GITR结合蛋白的免疫缀合物、包含上述物质的细胞、本申请的物组合物和/或本申请的药物组合在制备试剂盒中的用途。例如，试剂盒可以用于检测样品中GITR的存在和/或含量。
一方面，本申请提供一种预防和/或治疗用途。GITR可以作为一种新的靶点，靶向GITR的抗体可以具有激活GITR-NFκB信号通路的能力。现有的数据可以表明，靶向GITR的抗体可以激活免疫反应，GITR的抗体可以被开发成为一种预防和/或治疗疾病和/或病症的药物，或者可以将GITR的抗体用于一种预防和/或治疗疾病和/或病症的方法。
另一方面，本申请提供一种本申请的分离的GITR结合蛋白、包含GITR结合蛋白的多肽、编码本申请的分离的GITR结合蛋白的核酸分子、包含编码本申请的分离的GITR结合蛋白的核酸分子的载体、包含本申请的分离的GITR结合蛋白的免疫缀合物、包含上述物质的细胞、本申请的物组合物、本申请的药物组合和/或本申请的试剂盒可以在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗疾病和/或病症。例如，本申请的疾病和/或病症可以是免疫相关的障碍和/或增生性相关的障碍。例如，本申请的疾病和/或病症可以是GITR蛋白表达异常或功能异常相关的疾病。例如，本申请的疾病和/或病症可以是GITR阳性肿瘤。例如，本申请的疾病和/或病症可以是GITR高表达肿瘤。
在本申请中，所述疾病和/或病症可以是GITR相关的疾病和/或病症。
在本申请中，所述疾病和/或病症可以包括肿瘤和/或感染。在本申请中，所述疾病和/或病症可以包括细胞过度生长或增殖的病症。在本申请中，所述疾病和/或病症可以包括增生性疾病、赘生性疾病和/或免疫性疾病。例如，本申请的肿瘤和/或感染可以是GITR蛋白表达异常或功能异常相关的肿瘤和/或感染。例如，本申请的肿瘤可以是GITR阳性肿瘤。例如，本申请的疾病和/或病症可以是GITR高表达肿瘤。
在本申请中，所述肿瘤可以包括实体瘤和/或血液瘤。
在本申请中，所述疾病和/或病症可以包括乳腺癌、胃癌、直肠癌、和/或结肠癌。
另一方面，本申请提供一种本申请的分离的GITR结合蛋白、包含GITR结合蛋白的多肽、编码本申请的分离的GITR结合蛋白的核酸分子、包含编码本申请的分离的GITR结合蛋白的核酸分子的载体、包含本申请的分离的GITR结合蛋白的免疫缀合物、包含上述物质的细胞、本申请的物组合物、本申请的药物组合和/或本申请的试剂盒，其可以用于预防和/或治疗疾病和/或病症。例如，本申请的疾病和/或病症可以是免疫相关的障碍和/或增生性相关的障碍。例如，本申请的疾病和/或病症可以是GITR蛋白表达异常或功能异常相关的疾病。例如，本申请的疾病和/或病症可以是GITR阳性肿瘤。例如，本申请的疾病和/或病症可以是GITR高表达肿瘤。
在本申请中，所述疾病和/或病症可以是GITR相关的疾病和/或病症。
在本申请中，所述疾病和/或病症可以包括肿瘤和/或感染。在本申请中，所述疾病和/或病症可以包括细胞过度生长或增殖的病症。在本申请中，所述疾病和/或病症可以包括增生性疾病、赘生性疾病和/或免疫性疾病。例如，本申请的肿瘤和/或感染可以是GITR蛋白表达异常或功能异常相关的肿瘤和/或感染。例如，本申请的肿瘤可以是GITR阳性肿瘤。例如，本申请的疾病和/或病症可以是GITR高表达肿瘤。
在本申请中，所述肿瘤可以包括实体瘤和/或血液瘤。
在本申请中，所述疾病和/或病症可以包括乳腺癌、胃癌、直肠癌、和/或结肠癌。
另一方面，本申请提供一种预防和/或治疗疾病和/或病症的方法，可以包括向有需要的受试者施用本申请的分离的GITR结合蛋白、包含GITR结合蛋白的多肽、编码本申请的分离的GITR结合蛋白的核酸分子、包含编码本申请的分离的GITR结合蛋白的核酸分子的载体、包含本申请的分离的GITR结合蛋白的免疫缀合物、包含上述物质的细胞、本申请的物组合物、本申请的药物组合和/或本申请的试剂盒。
在本申请中，所述施用可以通过不同方式进行，例如静脉内、瘤内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部或真皮内施用。
在本申请中，所述疾病和/或病症可以是GITR相关的疾病和/或病症。
在本申请中，所述疾病和/或病症可以包括肿瘤和/或感染。在本申请中，所述疾病和/或病症可以包括细胞过度生长或增殖的病症。在本申请中，所述疾病和/或病症可以包括增生性疾病、赘生性疾病和/或免疫性疾病。例如，本申请的肿瘤和/或感染可以是GITR蛋白表达异常或功能异常相关的肿瘤和/或感染。例如，本申请的肿瘤可以是GITR阳性肿瘤。例如，本申请的疾病和/或病症可以是GITR高表达肿瘤。
在本申请中，所述肿瘤可以包括实体瘤和/或血液瘤。
在本申请中，所述疾病和/或病症可以包括乳腺癌、胃癌、直肠癌、和/或结肠癌。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的蛋白、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。
实施方案
1.分离的抗原结合蛋白，其包含HCDR3，所述HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
2.根据实施方案1所述的分离的抗原结合蛋白，其包含HCDR2，所述HCDR2包含SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。
3.根据实施方案1-2中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含HCDR1，所述HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
4.根据实施方案1-3中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含LCDR3，所述LCDR3包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
5.根据实施方案1-4中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含LCDR2，所述LCDR2包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
6.根据实施方案1-5中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含LCDR1，所述LCDR1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
7.根据实施方案1-6中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含H-FR1，所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接相连，且所述H-FR1包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。
8.根据实施方案1-7中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含H-FR1，所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接相连，且所述H-FR1包含SEQ ID NO:7、SEQIDNO:8或SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
9.根据实施方案1-8中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含H-FR2，所述H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，且所述H-FR2包含SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列。
10.根据实施方案1-9中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含H-FR2，所述H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，且所述H-FR2包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQID NO:12或SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
11.根据实施方案1-10中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含H-FR3，所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，且所述H-FR3包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列。
12.根据实施方案1-11中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含H-FR3，所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，且所述H-FR3包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
13.根据实施方案1-12中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含H-FR4，所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端直接或间接相连，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列。
14.根据实施方案1-13中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含H-FR4，所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端直接或间接相连，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:18或SEQID NO:19所示的氨基酸序列。
15.根据实施方案1-14中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含L-FR1，所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接相连，且所述L-FR1包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列。
16.根据实施方案1-15中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含L-FR1，所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接相连，且所述L-FR1包含SEQ ID NO:20、SEQID NO:21或SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
17.根据实施方案1-16中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含L-FR2，所述L-FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间，且所述L-FR2包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列。
18.根据实施方案1-17中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含L-FR2，所述L-FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间，且所述L-FR2包含SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
19.根据实施方案1-18中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含L-FR3，所述L-FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间，且所述L-FR3包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列。
20.根据实施方案1-19中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含L-FR3，所述L-FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间，且所述L-FR3包含SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
21.根据实施方案1-20中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含L-FR4，所述L-FR4的N末端与所述LCDR3的C末端直接或间接相连，且所述L-FR4包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列。
22.根据实施方案1-21中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含L-FR4，所述L-FR4的N末端与所述LCDR3的C末端直接或间接相连，且所述L-FR4包含SEQ ID NO:28或SEQID NO:29所示的氨基酸序列。
23.根据实施方案1-22中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中所述HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，且所述HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
24.根据实施方案1-23中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述LCDR3包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，且所述LCDR1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
25.根据实施方案1-24中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含重链可变区(VH)，所述VH包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。
26.根据实施方案1-25中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含VH，所述VH包含SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。
27.根据实施方案1-26中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含轻链可变区(VL)，所述VL包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。
28.根据实施方案1-27中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。
29.根据实施方案1-28中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含VH和VL，其中所述VH包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。
30.根据实施方案1-29中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含VH和VL，其中所述VH包含SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。
31.根据实施方案1-30中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含VH和VL，其中所述VH包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。
32.根据实施方案1-30中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含VH和VL，其中所述VH包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。
33.根据实施方案1-30中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含VH和VL，其中所述VH包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。
34.根据实施方案1-30中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含VH和VL，其中所述VH包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。
35.根据实施方案1-30中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含VH和VL，其中所述VH包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。
36.根据实施方案1-30中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含VH和VL，其中所述VH包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。
37.根据实施方案1-30中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含VH和VL，其中所述VH包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。
38.根据实施方案1-30中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含VH和VL，其中所述VH包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。
39.根据实施方案1-30中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含VH和VL，其中所述VH包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。
40.根据实施方案1-30中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含VH和VL，其中所述VH包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。
41.根据实施方案1-30中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含VH和VL，其中所述VH包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。
42.根据实施方案1-30中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含VH和VL，其中所述VH包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。
43.根据实施方案1-30中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含VH和VL，其中所述VH包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。
44.根据实施方案1-43中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含抗体重链恒定区。
45.根据实施方案44所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体重链恒定区包含源自人抗体的重链恒定区。
46.根据实施方案44-45中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体重链恒定区包含源自IgG、IgA、IgD、IgE和/或IgM的重链恒定区。
47.根据实施方案44-46中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体重链恒定区包含源自IgG的重链恒定区。
48.根据实施方案44-47中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体重链恒定区包含源自IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4的重链恒定区。
49.根据实施方案44-48中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体重链恒定区包含源自IgG1的重链恒定区。
50.根据实施方案1-49中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含抗体轻链恒定区。
51.根据实施方案50所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体轻链恒定区包含源自人抗体的轻链恒定区。
52.根据实施方案50-51中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体轻链恒定区包含源自人Igκ的恒定区。
53.根据实施方案1-52中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含抗体或其抗原结合片段。
54.根据实施方案53所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体包含单克隆抗体。
55.根据实施方案53-54中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体选自以下组中的一种或多种：鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
56.根据实施方案53所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合片段选自以下组中的一种或多种：Fab，Fab′，Fv片段，F(ab')2，F(ab)2，scFv，di-scFv，VHH和dAb。
57.根据实施方案1-56任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其能够特异性结合糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)或其功能活性片段。
58.根据实施方案57所述的分离的抗原结合蛋白，所述GITR包含人GITR。
59.根据实施方案57-58中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其具有以约7.33μg/ml或更低的EC50值结合所述GITR或其功能片段的能力。
60.根据实施方案57-59所述的分离的抗原结合蛋白，所述GITR或其功能片段包含表达于细胞上的GITR或其功能片段。
61.根据实施方案57-60中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其具有以约3.01E-09M或更低的KD值结合所述GITR或其功能片段的能力。
62.根据实施方案57-61中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其具有激活所述GITR或其功能活性片段的能力。
63.根据实施方案57-62中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其具有以约1.05μg/ml或更低的EC50值激活所述GITR或其功能活性片段的能力。
64.根据实施方案1-63中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其具有核因子-κB(NF-κB)通路激活能力。
65.根据实施方案57-64中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其具有以约8.57μg/ml或更低的EC50值结合所述GITR或其功能片段的能力。
66.根据实施方案57-65中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其具有以约0.06μg/ml或更低的EC50值结合所述GITR或其功能片段的能力。
67.根据实施方案65-66所述的分离的抗原结合蛋白，所述GITR包含人GITR和/或猴GITR。
68.根据实施方案1-67中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其具有肿瘤抑制能力。
69.根据实施方案1-68中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其具有以约39％或更高肿瘤体积抑制率抑制肿瘤的能力。
70.多肽，其包含实施方案1-69中任一项所述的分离的抗原结合蛋白。
71.根据实施方案70所述的多肽，其包含融合蛋白。
72.核酸分子，其编码实施方案1-69中任一项所述的分离的抗原结合蛋白和/或实施方案70-71中任一项所述的多肽。
73.载体，其包含实施方案72所述的核酸分子。
74.免疫缀合物，其包含实施方案1-69中任一项所述的分离的抗原结合蛋白和/或实施方案70-71中任一项所述的多肽。
75.细胞，其包含和/或表达实施方案1-69中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、包含和/或表达实施方案70-71中任一项所述的多肽、包含实施方案72所述的核酸分子、包含实施方案73所述的载体和/或包含实施方案74所述的免疫缀合物。
76.药物组合物，其包含实施方案1-69中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、实施方案70-71中任一项所述的多肽、实施方案72所述的核酸分子、实施方案73所述的载体、实施方案74所述的免疫缀合物和/或实施方案75所述的细胞，以及任选地药学上可接受的载剂。
77.根据实施方案76所述的药物组合物，其还包含一种或多种的免疫检查点抑制剂。
78.药物组合，其包含实施方案1-69中任一项所述的分离的抗原结合蛋白和/或实施方案70-71中任一项所述的多肽，以及一种或多种的免疫检查点抑制剂。
79.根据实施方案78所述的药物组合，其中所述免疫检查点抑制剂能够抑制PD-1和PD-L1的相互作用。
80.根据实施方案78-79中任一项所述的药物组合，其中所述免疫检查点抑制剂包含PD-1抑制剂和/或PD-L1抑制剂。
81.根据实施方案78-80中任一项所述的药物组合，其中所述免疫检查点抑制剂包含PD-1抗体或其抗原结合片段，和/或PD-L1抗体或其抗原结合片段。
82.根据实施方案81所述的药物组合，其中所述抗体包含选自：鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
83.根据实施方案81所述的药物组合，其中所述抗原结合片段选自：Fab，Fab′，Fv片段，F(ab')2，F(ab)2，scFv，di-scFv，VHH和dAb。
84.根据实施方案78-83中任一项所述的药物组合，其中所述免疫检查点抑制剂包含派姆单抗的HCDR1-3以及LCDR1-3。
85.根据实施方案78-84中任一项所述的药物组合，其中所述免疫检查点抑制剂包含派姆单抗的VH以及VL。
86.根据实施方案78-85中任一项所述的药物组合，其中所述免疫检查点抑制剂包含派姆单抗。
87.根据实施方案78-86中任一项所述的药物组合，其中所述的分离的抗原结合蛋白和/或所述多肽与所述免疫检查点抑制剂在所述药物组合中相互不混合。
88.根据实施方案78-87中任一项所述的药物组合，其中所述的分离的抗原结合蛋白和/或所述多肽与所述免疫检查点抑制剂各自分别存在于不同的容器中。
89.根据实施方案78-88中任一项所述的药物组合，其中所述药物组合包含第一制剂和第二制剂，所述第一制剂包含所述分离的抗原结合蛋白和/或所述多肽和药学上可接受的第一载体，且所述第二制剂包含所述免疫检查点抑制剂和药学上可接受的第二载体。
90.试剂盒，其包含实施方案1-69中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、实施方案70-71中任一项所述的多肽、实施方案72所述的核酸分子、实施方案73所述的载体、实施方案74所述的免疫缀合物、实施方案75所述的细胞、实施方案76-77中任一项所述的药物组合物和/或实施方案78-89中任一项所述的药物组合。
91.根据实施方案90所述的试剂盒，其用于检测样品中GITR的存在和/或含量。
92.制备实施方案1-69中任一项所述的分离的抗原结合蛋白和/或实施方案70-71中任一项所述的多肽的方法，包含在使得所述抗原结合蛋白和/或所述多肽表达的条件下，培养实施方案75所述的细胞。
93.根据实施方案92所述的方法，包含在使得所述抗原结合蛋白表达的条件下，培养所述细胞。
94.根据实施方案92所述的方法，包含在使得所述多肽表达的条件下，培养所述细胞。
95.检测样品中GITR的方法，包含施用实施方案1-69中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、施用实施方案70-71中任一项所述的多肽、施用实施方案72所述的核酸分子、施用实施方案73所述的载体、施用实施方案74所述的免疫缀合物、施用实施方案75所述的细胞、施用实施方案76-77中任一项所述的药物组合物、施用实施方案78-89中任一项所述的药物组合、和/或使用实施方案90-91中任一项所述的试剂盒。
96.实施方案1-69中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、实施方案70-71中任一项所述的多肽、实施方案72所述的核酸分子、实施方案73所述的载体、实施方案74所述的免疫缀合物、实施方案75所述的细胞、实施方案76-77中任一项所述的药物组合物和/或实施方案78-89中任一项所述的药物组合在制备试剂盒中的用途。
97.根据实施方案96所述的用途，其中所述试剂盒用于检测样品中GITR的存在和/或含量。
98.实施方案1-69中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、实施方案70-71中任一项所述的多肽、实施方案72所述的核酸分子、实施方案73所述的载体、实施方案74所述的免疫缀合物、实施方案75所述的细胞、实施方案76-77中任一项所述的药物组合物、实施方案78-89中任一项所述的药物组合和/或实施方案90-91中任一项所述的试剂盒在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗疾病和/或病症。
99.根据实施方案98所述的用途，其中所述疾病和/或病症包含肿瘤和/或感染。
100.根据实施方案98-99中任一项所述的用途，其中所述疾病和/或病症包含实体瘤和/或血液瘤。
101.根据实施方案98-100中任一项所述的用途，其中所述疾病和/或病症包含乳腺癌、胃癌、直肠癌、和/或结肠癌。
实施例
实施例1制备GITR抗原
1.抗原包被：用DPBS溶液配制浓度梯度稀释的GITR抗原(Human GITR Fc，Genscript，货号：Z03440)溶液，取96孔板，每孔加入100μl，37℃包被1小时。
2.清洗：PBST(含0.05％Tween 20)溶液清洗三遍。
3.封闭：采用DPBS(含3％BSA)对抗原进行封闭，每孔加入200μl，置于室温，封闭1小时。
4.配体结合：采用DPBS(含1％BSA)溶液稀释GITR配体(Bio-GITR Ligand，Acrobiosystem，货号：GIL-H82F8)至1μg/ml,每孔加入100μl，37℃包被1小时。
5.二抗结合：弃去反应液，PBST溶液清洗三遍，加入二抗(Goat anti-Ms IgG F(ab')2Secondary Antibody,HRP conjugate，来源:invitrogen，货号:31436)，每孔加入100μl，置于37℃反应1小时。
6.ELISA检测：弃去反应液，PBST溶液清洗三遍；每孔加入100μl的TMB溶液，轻微振荡反应至显蓝色；每孔加入50μl的H2SO4，轻微振荡反应至显黄色；450nm下检测OD值。
如图1所示，ELISA测定的GITR抗原活性。
实施例2GITR结合蛋白的制备
通过用6周龄的雌性BALB/c(北京维通利华实验动物技术有限公司，体重18克)小鼠进行免疫接种，获得GITR结合蛋白。
杂交瘤技术是通过融合经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，从而同时保持这两种细胞的主要特征。被特异性抗原免疫的小鼠脾细胞(B淋巴细胞)的主要特征是它的抗体分泌功能，但不能在体外进行连续培养，而小鼠骨髓瘤细胞具有所谓的永生性，能够在培养条件下无限分裂、增殖。在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才能形成具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。本试验通过人GITR蛋白(Genscript,货号：Z03440)和佐剂(Sigma Adjuvant System，Sigma，货号：S6322)免疫小鼠，再将获取的小鼠脾细胞和SP2/0细胞融合，获得能够表达阳性抗体的杂交瘤细胞。
如表1所示，试验动物及免疫信息。
表1试验动物及免疫信息
小鼠类型 BALB/c(北京维通利华实验动物技术有限公司)
免疫抗原 GITR抗原
免疫方法 25μg/只，肌肉注射
免疫次数 3
最后加强免疫 50μg GITR蛋白，腹腔注射(ip)，在融合前三天进行
小鼠免疫后检测免疫小鼠血清效价
1.抗原包被：采用DPBS溶液配制0.5μg/ml的GITR抗原(GITR his,Sinobiological,货号：H13643-H08H)溶液，取96孔板，每孔加入100μl，37℃包被1小时。
2.清洗：PBST(含0.05％Tween 20)溶液清洗三遍。
3.封闭：采用DPBS(含3％BSA)对抗原进行封闭，每孔加入200μl，置于室温，封闭1小时。
4.抗体结合：采用DPBS(含1％BSA)溶液稀释血清溶液，首个浓度稀释300倍，并依次进行三倍梯度稀释，稀释8个浓度，每孔加入100μl；阴性对照为未免疫小鼠的血清。阳性对照孔浓度为1μg/ml。置于室温，反应1小时。
5.二抗结合：弃去反应液，PBST溶液清洗三遍；加入二抗(Goat anti-Ms IgG F(ab')2 Secondary Antibody,HRP conjugate，来源:invitrogen，货号:31436)，每孔加入100μl，置于室温反应1小时。
6.ELISA检测：弃去反应液，PBST溶液清洗三遍；每孔加入100μl的TMB溶液，轻微振荡反应至显蓝色；每孔加入50μl H2SO4，轻微振荡反应至显黄色；450nm下检测OD值。
如图2所示，多只免疫小鼠的血清效价。
如表2所示，多只免疫小鼠的血清效价值。
表2免疫小鼠的血清效价
1# 2# 3# 4# 5#
218.7K 64K 0K 0K 0K
杂交瘤融合
电融合槽准备：用1％氢氧化钠，75％乙醇彻底浸泡电融合槽后，用PBS清洗干净后于超净台中吹干备用。
分离脾细胞
1.解剖：常规解剖取免疫小鼠脾脏。
2.收集脾细胞：将脾放入无菌平皿，边拎起边加入3-4ml无血清DMEM清洗，然后移入另外一个无菌、盛有20ml无血清DMEM的平皿中，放滤网并用注射器芯研磨，吸取全部上清，1200转/分钟离心5分钟，收集脾细胞。
3.裂解红细胞：去除上清，用10ml ACK裂解缓冲液(Gibco)重悬细胞。然后再加入5ml ACK裂解缓冲液。悬液静置5分钟后，1200转/分钟离心5分钟。去上清后用10ml基础培养基重悬细胞，然后再加入20ml PBS，1200转/分钟离心5分钟。去除上清后，细胞重悬于20mlPBS中并计数。
4.收集SP2/0：收集SP2/0细胞，1200转/分钟离心5分钟并弃上清。将收集的SP2/0细胞用PBS稀释10倍，混匀后吸取10μl，与10μl AOPI染液混合，进行细胞计数。
5.细胞融合：将SP2/0和脾细胞混合，1000转/分钟离心6分钟。去除上清后，用适量融合缓冲液重悬细胞。每个电融合皿中加入9ml细胞悬液进行电融合。融合结束后，细胞在电极匣中静置5分钟。电融合仪的参数设置可以根据本领域常用方式进行设置。
6.融合细胞铺板：取出细胞悬液并转移至筛选培养基，用含电融合缓冲液轻轻冲洗腔室2次，也转移至培养基中并铺板。将细胞板置于细胞培养箱培养，融合后第7天更换筛选培养基。培养第10天(或更久，根据细胞生长状态)后进行筛选。通过FACS和ELISA检测筛选出表达特异性GITR结合蛋白的杂交瘤细胞。筛选培养基配置可以采用本领域常用方法配置。
阳性杂交瘤细胞亚克隆
亚克隆步骤：准备一块96孔板，将96孔细胞板中第二列至第十二列加入100μl如上所述的基础培养基，将上述融合筛选出的阳性孔的细胞制成细胞悬液并加入第1列。将第1列细胞悬液取100μl加入第2列，充分混匀后取100μl加入下一列。重复上述步骤，直至最后一列；倍比稀释好的细胞悬液静止5-10分钟，待细胞全部沉至底面，镜下观察计数。取100个细胞对应的体积加入20ml如上所述的基础培养基中，并混匀铺板，每孔200μl。一周后显微镜下观察，判断并标记出单克隆孔，待测挑出阳性孔。
阳性杂交瘤单细胞筛选
通过FACS和ELISA检测筛选出表达特异性GITR结合蛋白的杂交瘤单克隆细胞。
细胞冻存：观察细胞状态，等细胞生长良好，活力>90％时，1000转/分钟离心5分钟，收集上清。用冻存液(90％FBS，10％DMSO)重悬细胞并分装至冻存管，放入程序降温盒中，-80℃冻存。
Trizol样品收集：观察细胞状态，等细胞生长良好，活力>90％时，1000转/分钟离心5分钟，收集上清。用Trizol溶液重悬细胞并分装至离心管，-80℃冻存。
抗原结合蛋白测序
本申请利用分子生物学技术，获得GITR阳性杂交瘤细胞中的抗原结合蛋白序列，并进行嵌合和人源化改造。
GITR结合蛋白的人源化设计
为了降低鼠源抗体的免疫原性，任选地可以将已筛选出的有生物学活性的抗体进行人源化。鼠源单克隆抗体的人源化根据本领域许多文献公示的方法进行。简言之，可以使用人抗体恒定结构域替代亲本(鼠源抗体)恒定结构域，根据鼠源抗体和人抗体的同源性选择人种系抗体序列，进行CDR移植。然后可以以鼠源抗体的三维结构为基础，通过VL和VH的氨基酸残基进行回复突变，将鼠源抗体的恒定区替换为人恒定区，得到最终的人源化结合蛋白。
如表3、表4和表5所示，本申请抗原结合蛋白的CDR、重链可变区VH、轻链可变区VL、FR，轻链恒定区CL和重链恒定区CH的氨基酸序列。
表3本申请抗原结合蛋白的CDR、重链可变区VH、轻链可变区VL的序列信息
Figure BDA0003546808190000461
Figure BDA0003546808190000471
表4本申请抗原结合蛋白的FR的序列信息
Figure BDA0003546808190000472
Figure BDA0003546808190000481
表5本申请抗原结合蛋白的轻链恒定区CL和重链恒定区CH的序列信息
轻链恒定区Kappa SEQ ID NO:49
轻链恒定区Lambda SEQ ID NO:50
重链恒定区IgG1 SEQ ID NO:51
重链恒定区IgG2 SEQ ID NO:52
重链恒定区IgG3 SEQ ID NO:53
重链恒定区IgG4 SEQ ID NO:54
抗体蛋白的表达和纯化
根据本申请的抗原结合蛋白序列构建质粒，使用大量抽提试剂盒提取抗体表达质粒，瞬转表达HEK293细胞。溶液1：用1ml培养液稀释15μg质粒，混匀。溶液2：用1ml培养液稀释60μl转染试剂，混匀。将溶液2加入溶液1中，混匀，37℃孵育15分钟后，将混合转染液逐滴加入细胞液中，边摇边加，放至摇床培养，表达一周，收集上清，8000转/分钟离心5分钟。
Protein A亲和层析柱纯化抗体蛋白。(1)平衡层析柱：1×PBS，流速1ml/分钟，20ml(2)上样：流速1ml/分钟(3)洗杂：1×PBS，流速1ml/分钟，20ml(4)洗脱：柠檬酸缓冲液(PH3.4)，1ml/分钟，分管收集，每管约500μl。共收集10管，使用NanoDrop仪器读取280nm吸光度值。(5)透析：将高浓度蛋白吸至透析袋放1×PBS的烧杯中透析。使用高效液相色谱仪LC-20AT及凝胶色谱柱的纯度检测合格，内毒素检测合格。
实施例3GITR结合蛋白与表达于细胞上的GITR的结合
基于流式细胞术测定法测定GITR结合蛋白与表达于HT1080细胞表面的人GITR的结合能力。通过比较不同GITR结合蛋白与表达于HT1080细胞表面的人GITR的结合曲线来测定其结合能力。
(1)将HT1080/hGITR细胞(康源博创)铺于96孔板中。
(2)用含2％FBS的PBS分别配制阳性对照抗体1(B-011B-PC-1，例如重链全长序列可以如SEQ ID NO:55所示，轻链全长序列可以如SEQ ID NO:56所示)或阳性对照抗体2(B-011B-PC-2，例如重链全长序列可以如SEQ ID NO:57所示，轻链全长序列可以如SEQ ID NO:56所示)、阴性对照抗体(人IgG)和本申请抗原结合蛋白抗体最大浓度为15μg/ml，5倍稀释，8个点，每管加入100μl，4摄氏度孵育1小时。
(3)用含2％FBS的PBS洗板3次。
(4)将PE标记的-人IgG(Biolegend,410708)分别用2％FBS的PBS 1:2000稀释，每孔加入100μl，4摄氏度孵育0.5小时。
(5)用含2％FBS的PBS洗板2次。用100μl含2％FBS的PBS重新悬浮细胞。
(6)使用流式细胞仪测定PE通道的中位荧光度值(MFI)。
在以上试验表明，本申请的嵌合GITR结合蛋白具有对于HT1080细胞上过表达的人GITR的结合能力。
如图3所示，基于流式细胞术测定法测定GITR结合蛋白与表达于细胞表面的GITR的结合曲线。
如表6所示，基于流式细胞术测定法测定GITR结合蛋白与表达于细胞表面的GITR结合的EC50值和最高MFI值。
表6 GITR结合蛋白与GITR结合的EC50值和最高MFI值
编号 EC<sub>50</sub>(μg/ml) 最高MFI值
阳性对照抗体1 0.5337 51807.92
阴性对照抗体 - 436.06
Ab0 2.3750 49478.89
实施例4GITR结合蛋白的生物学活性
GITR为细胞共刺激靶点，结合蛋白与之结合后能够活化激活GITR通路。通过荧光素酶报告基因系统检测GITR结合蛋白与细胞表达的GITR结合后引起Jurkat-GITR-NFκB细胞的荧光素酶表达量的变化来比较不同GITR结合蛋白的功能。
(1)为筛选有生物学活性的GITR结合蛋白，将编码人GITR(氨基酸序列可以如SEQID NO:58所示，核苷酸序列可以如SEQ ID NO:59所示)的cDNA克隆到pLVX-IRES-Puro(takara，632186)载体上，将获得的质粒和NF-kappaB luciferace报告基因质粒(Promega)共转染到Jurkat细胞(中科院细胞库，TCHU123)，产生过表达人GITR同时带有NF-kappaBluciferace报告基因系统的Jurkat-GITR-NFκB细胞；
将Jurkat-GITR-NFκB细胞铺于96孔底部透明的白板(Corning,3903)中，放入细胞培养箱中。
(2)抗体交联：分别将抗人的二抗(AffiniPure F(ab')2Fragment,Goat Anti-Human IgG,Fcγfragment specific，Jackson Immunoresearch,109-006-008)与阳性对照抗体1(B-011B-PC-1)、阴性对照抗体(人IgG)或本申请抗原结合蛋白加入检测培养基即含10％FBS的1640培养基中，使二抗的终浓度为80μg/ml，本申请抗原结合蛋白的终浓度为20μg/ml，轻轻混匀后至于细胞培养箱中孵育30分钟进行交联反应。
(3)抗体交联反应结束后，进行5倍梯度稀释，共稀释8个浓度梯度(含0点在内)。取40μl稀释抗体，加入至细胞孔中，然后放入细胞培养箱中孵育5小时。
(4)孵育结束后，在细胞板中按80μl/孔的体积加入Luciferase试验试剂(Promega,E6120)，室温避光振板5分钟。振板结束后，用酶标仪检测96孔板的生物荧光值。
在以上试验表明，本申请抗原结合蛋白结合Jurkat-hGITR-NFκB细胞上过表达的人GITR具有激活NFκB信号通路的能力。
如图4所示，通过荧光素酶报告基因系统检测GITR结合蛋白的生物学活性。
如表7所示，通过荧光素酶报告基因系统检测GITR结合蛋白激活NFκB信号通路的能力。
表7 GITR结合蛋白激活NFκB信号通路的能力
编号 EC<sub>50</sub>(μg/ml) 最高相对光单位
阳性对照抗体1 0.3523 7915
阴性对照抗体 - 4330
Ab0 0.7265 6200
实施例5GITR结合蛋白与表达于细胞上的GITR的结合
基于流式细胞术测定法测定GITR结合蛋白与表达于HT1080细胞表面的人GITR的结合能力。通过比较本申请不同GITR结合蛋白与表达于HT1080细胞表面的人GITR的结合曲线来测定其结合能力。
(1)将HT1080/hGITR细胞(康源博创)铺于96孔板中。
(2)用含2％FBS的PBS分别配制阳性对照抗体1(B-011B-PC-1)或阳性对照抗体2(B-011B-PC-2)、阴性对照抗体(人IgG)和本申请抗原结合蛋白最大浓度为15μg/ml，5倍稀释，8个点，每管加入100μl，4摄氏度孵育1小时。
(3)用含2％FBS的PBS洗板3次。
(4)将PE标记的-人IgG(Biolegend,410708)分别用2％FBS的PBS 1:2000稀释，每孔加入100μl，4摄氏度孵育0.5小时。
(5)用含2％FBS的PBS洗板2次。用100μl含2％FBS的PBS重新悬浮细胞。
(6)使用流式细胞仪测定PE通道的中位荧光度值(MFI)。
在以上试验表明，本申请的人源化GITR结合蛋白具有对于HT1080细胞上过表达的人GITR的结合能力。
如图5、图6和图7所示，基于流式细胞术测定法测定GITR结合蛋白与表达于细胞表面的GITR的结合曲线。
如表8所示，基于流式细胞术测定法测定GITR结合蛋白与表达于细胞表面的GITR结合的EC50值和最高MFI值。
表8 GITR结合蛋白与GITR结合的EC50值和最高MFI值
编号 EC<sub>50</sub>(μg/ml) 最高MFI值
阳性对照抗体1 2.0380 32639.88
阴性对照抗体 - 2444.76
Ab0 2.1300 30026.87
Ab1 3.5010 24888.67
Ab2 3.7840 24101.49
Ab3 3.8400 25861.52
Ab4 2.0460 28232.51
Ab5 0.9517 30979.69
Ab6 0.4267 32126.61
Ab7 0.9264 30482.57
Ab8 1.2030 32483.43
Ab9 0.7029 34321.76
Ab10 6.3850 25766.97
Ab11 7.3210 25575.57
Ab12 4.6490 24667.81
实施例6GITR结合蛋白的生物学活性
GITR为细胞共刺激靶点，结合蛋白与之结合后能够活化激活GITR通路。通过荧光素酶报告基因系统检测GITR结合蛋白与细胞表达的GITR结合后引起Jurkat-GITR-NFκB细胞的荧光素酶表达量的变化来比较不同GITR结合蛋白的功能。
(1)为筛选有生物学活性的GITR结合蛋白，将编码人GITR的cDNA克隆到pLVX-IRES-Puro(takara，632186)载体上，将获得的质粒和NF-kappaB luciferace报告基因质粒(Promega)共转染到Jurkat细胞(中科院细胞库，TCHU123)，产生过表达人GITR同时带有NF-kappaB luciferace报告基因系统的Jurkat-GITR-NFκB细胞；
将Jurkat-GITR-NFκB细胞铺于96孔底部透明的白板(Corning,3903)中，放入细胞培养箱中。
(2)抗体交联：分别将抗人的二抗(AffiniPure F(ab')2Fragment,Goat Anti-Human IgG,Fcγfragment specific，Jackson Immunoresearch,109-006-008)与阳性对照抗体1(B-011B-PC-1)、阳性对照抗体2(B-011B-PC-2)、阴性对照抗体(人IgG)或本申请抗原结合蛋白加入检测培养基即含10％FBS的1640培养基中，使二抗的终浓度为80μg/ml，本申请抗原结合蛋白的终浓度为20μg/ml，轻轻混匀后至于细胞培养箱中孵育30分钟进行交联反应。
(3)抗体交联反应结束后，进行5倍梯度稀释，共稀释8个浓度梯度(含0点在内)。取40μl稀释抗体，加入至细胞孔中，然后放入细胞培养箱中孵育5小时。
(4)孵育结束后，在细胞板中按80μl/孔的体积加入Luciferase试验试剂(Promega,E6120)，室温避光振板5分钟。振板结束后，用酶标仪检测96孔板的生物荧光值。
如图8所示，通过荧光素酶报告基因系统检测GITR结合蛋白的生物学活性。
在以上试验表明，本申请人源化抗原结合蛋白结合Jurkat-hGITR-NFκB细胞上过表达的人GITR具有激活NFκB信号通路的能力。
如表9所示，通过荧光素酶报告基因系统检测GITR结合蛋白激活NFκB信号通路的能力。
表9 GITR结合蛋白激活NFκB信号通路的EC50值和相对光单位
编号 EC<sub>50</sub>(μg/ml) 最高相对光单位
阳性对照抗体1 0.3052 8278
阴性对照抗体 - 5066
Ab0 0.7722 9928
Ab4 0.5408 9112
Ab5 0.4854 9334
Ab6 0.4743 8427
Ab9 1.0460 8630
实施例7GITR结合蛋白的结合亲和力
用Biacore检测不同GITR结合蛋白与抗原(GITR人重组蛋白(ECD,His Tag，SinoBiological，13643-H08H)蛋白的结合亲和性。
运行试剂：含10mM N-(2-羟乙基)哌嗪-N-2磺酸(HEPES)，150mM氯化钠(NaCl)，3mM乙二胺四乙酸(EDTA)，0.005％吐温-20(Tween-20)，pH调节至7.4；人IgG(Fc)捕获试剂盒(货号：BR-1008-39，GE)，其中包括：鼠抗人IgG(Fc)抗体(0.5mg/ml)，固定试剂(10mM醋酸钠，pH5.0)，再生试剂(3M氯化镁)；氨基偶联试剂盒(货号：BR100050，GE)，其中包括：115mgN-羟基丁二酰亚胺(NHS)，750mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和10.5ml 1M乙醇胺(pH 8.5)。将每管EDC和NHS分别加入10ml的去离子水，分装保存到-18℃至更低温度，保质期两个月。(参考GE氨基偶联指导手册《22-0510-62AG》)。
芯片制备。将鼠抗人IgG(Fc)抗体用固定试剂(10mM醋酸钠，pH 5.0)稀释到25μg/ml，芯片每个通道约使用约100μl鼠抗人IgG(Fc)抗体，固定两个通道约使用190μl固定试剂加入10μl鼠抗人IgG(Fc)抗体。首先，CM5芯片的表面用400mM EDC和100mM NHS以10μl/分钟的流速进行420秒的活化。其次，将25μg/ml的鼠抗人IgG(Fc)抗体以10μl/分钟的流速注入到实验通道(FC2)约420秒，固定量约为9000至14000RU。最后，芯片用1M乙醇胺以10μl/分钟进行420秒封闭。参比通道(FC1)与试验通道(FC2)进行相同的操作。(参考GE人IgG(Fc)捕获试剂盒指导手册《22-0648-88AD》)。
捕获配体。将阳性对照抗体1(B-011B-PC-1)或本申请抗原结合蛋白用运行试剂稀释至5μg/ml，并以10μl/分钟的流速注入到实验通道(FC2)，捕获40秒，参比通道(FC1)不需要进行配体的捕获。
分析物单浓度分析。将抗原用运行试剂稀释至200nM。捕获抗体后，将稀释后的抗原依次以30μl/分钟的流速，结合90秒，解离210秒，注入到实验通道与参比通道，同时每个抗原结合蛋白设定1个0浓度。每一个抗原结合蛋白分析后，芯片需要用3M氯化镁以20μl/分钟的流速再生30秒，洗掉配体以及未解离的分析物。
使用Biacore 8K分析软件计算每个本申请抗原结合蛋白的平衡解离常数(KD值)。参比通道(FC1)用于背景的扣减。
在以上试验表明，本申请抗原结合蛋白具有与抗原的结合亲和力。
如表10所示，用Biacore检测不同GITR结合蛋白与抗原蛋白的结合亲和性。
表10 GITR结合蛋白与抗原蛋白的结合亲和力
编号 ka(1/Ms) kd(1/s) K<sub>D</sub>(M)
阳性对照抗体1 5.33E+05 5.11E-04 9.58E-10
Ab0 6.70E+05 4.56E-04 6.81E-10
Ab1 7.67E+05 2.31E-03 3.01E-09
Ab2 4.69E+06 9.32E-03 1.99E-09
Ab3 7.62E+05 1.83E-03 2.40E-09
Ab4 2.74E+05 4.48E-04 1.64E-09
Ab5 3.54E+05 5.82E-04 1.64E-09
Ab6 3.70E+05 3.70E-04 1.00E-09
Ab7 3.33E+05 4.43E-04 1.33E-09
Ab8 2.63E+05 2.50E-04 9.50E-10
Ab9 4.00E+05 3.83E-04 9.58E-10
Ab10 2.85E+05 2.13E-04 7.48E-10
Ab11 3.03E+05 2.78E-04 9.17E-10
Ab12 5.76E+05 5.63E-04 9.76E-10
实施例8GITR结合蛋白的种属交叉反应试验
用PBS分别配制人GITR抗原和猴GITR抗原1μg/ml，加入96孔板(Corning,货号9018)中，4摄氏度过夜。次日弃掉包被液，用0.05％Tween20的PBS洗板3次。用含3％BSA的PBS 37摄氏度孵育2小时，用0.05％Tween20的DPBS洗板3次。用含1％BSA的PBS分别配制待测抗体最大浓度为15μg/ml，5倍稀释，12个浓度点。加入96孔板中,室温孵育1小时。用0.05％Tween20的PBS洗板3次。将二抗(HRP-Goat anti-Human IgG F(ab')2，Jackson，货号109-006-008)用含1％BSA的PBS按产品说明书稀释，稀释好的样品加入96孔板中,室温孵育0.5小时。用0.05％Tween20的PBS洗板3次。每孔加入100μl TMB底物显色液。每孔加入50μl2N H2SO4终止液，用酶标仪在450nm波长处读取数值并记录。
以上试验表明，本申请GITR抗原结合蛋白具有与人GITR抗原和猴GITR抗原的结合能力。
如图9，图10，图11和图12所示，GITR抗原结合蛋白与人GITR抗原的结合曲线。如图13，图14，图15和图16所示，GITR抗原结合蛋白与猴GITR抗原的结合曲线。
如表11所示，GITR抗原结合蛋白与人GITR抗原和猴GITR抗原的结合能力。
表11 GITR抗原结合蛋白与人和猴GITR抗原的结合能力
Figure BDA0003546808190000551
实施例9GITR结合蛋白的抗肿瘤药效试验
本试验采用MC38细胞接种hGITR转基因小鼠检测本申请的GITR结合蛋白的抗肿瘤作用。
人GITR转基因小鼠：雌性C57BL/6背景的人GITR转基因小鼠(约6周)购自百奥赛图江苏基因生物技术有限公司。小鼠在到达后适应性饲养7天，随后开始研究。
细胞：小鼠MC38细胞购自和元生物技术(上海)股份有限公司，按照说明书进行常规传代培养用于后续体内实验。离心收集细胞，在无血清培养基中重悬细胞。在第0天取0.1ml细胞悬液皮下接种至人GITR转基因小鼠右腋窝皮下来建立MC38-hGITR荷瘤小鼠模型。
给药：
在肿瘤细胞接种第7天，检测各只小鼠瘤体积，挑选出瘤体积在20mm3～60mm3范围内的小鼠按瘤体积平均分组(每组6只小鼠)，分别在接种后第7、10、13、16、19、22天给药，阴性对照抗体(人IgG)、阳性对照抗体1(B-011B-PC-1)、本申请抗原结合蛋白；给药期间监测各组小鼠瘤体积和体重变化，监测频率均为2次/周，连续监测3周。在每次给药前测定体重和肿瘤体积，接种后第24天计算肿瘤体积抑制率(TGI％)，计算公式如下：TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100；其中Ti：给药组肿瘤体积均数，T0：给药组D0天的肿瘤体积均数，Vi：阴性对照抗体组肿瘤体积均数，V0：阴性对照抗体组D0天的肿瘤体积均数。肿瘤体积测定：采用游标卡尺测定肿瘤的长径(a)和宽径(b)，肿瘤体积按如下公式计算：TV＝1/2×a×b2。采用电子天平测定体重。
如表12所示，给药剂量和方式。
表12给药试验设计
编号 给药剂量 给药次数 给药方式
阴性对照抗体 20mg/kg Q3DX6* 腹腔注射
阳性对照抗体1 20mg/kg Q3DX6* 腹腔注射
Ab0 20mg/kg Q3DX6* 腹腔注射
*每隔3天给药，共6次。
如图17所示，第一次试验中GITR结合蛋白Ab0在小鼠体内的抗肿瘤药效检测。
如图18所示，第一次试验中GITR结合蛋白Ab0施用后，小鼠的体重变化。
上述试验表明，本申请的GITR结合蛋白显著性抑制肿瘤的生长，并且对动物体重均没有明显影响。
如表13所示，第一次试验中在接种后第24天，本申请的GITR结合蛋白Ab0在20mg/kg剂量下均显著性抑制肿瘤的生长，肿瘤体积抑制率约为39％。
表13第一次试验中第24天本申请的GITR结合蛋白体内抑制肿瘤生长能力
编号 肿瘤体积(均数±标准误) 肿瘤体积抑制率
阴性对照抗体 2485.12±403.50 /
阳性对照抗体1 1698.99±455.73 32％
Ab0 1525.98±228.19 39％
实施例10GITR结合蛋白与PD-1抗体联用
本试验采用MC38/hPDL1细胞接种人hPD-1//hGITR转基因小鼠检测本申请的GITR结合蛋白与PD-1抗体联用的抗肿瘤作用。
人hPD-1//hGITR转基因小鼠：雌性C57BL/6背景的B-hPD-1//hGITR转基因小鼠(约6周)购自百奥赛图江苏基因生物技术有限公司。小鼠在到达后适应性饲养7天，随后开始研究。
细胞：小鼠MC38/hPDL1(mPDL1 KO)细胞购自康源博创生物科技(北京)有限公司，按照说明书进行常规传代培养用于后续体内实验。离心收集细胞，在无血清培养基中重悬细胞。在第0天取0.1ml细胞悬液皮下接种至人B-hPD-1//hGITR转基因小鼠右腋窝皮下来建立MC38/hPDL1荷瘤小鼠模型。
给药：
肿瘤细胞接种第7天，检测各只小鼠瘤体积，挑选出瘤体积在100mm3～180mm3范围内的小鼠按瘤体积平均分组(每组6只小鼠)，在接种后第7天单次给药，PD-1抗体(Pembrolizumab，来源：泰州市百英生物科技有限公司，货号：B2014-CHO)；分别在接种后第7、10、14、17、21、24天给药，阴性对照抗体(人IgG)、本申请抗原结合蛋白；给药期间监测各组小鼠瘤体积和体重变化，监测频率均为2次/周，连续监测3周。在每次给药前测定体重和肿瘤体积，细胞接种后第28天计算肿瘤体积抑制率(TGI％)，计算公式如下：TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100；其中Ti：给药组肿瘤体积均数，T0：给药组D0天的肿瘤体积均数，Vi：阴性对照抗体组肿瘤体积均数，V0：阴性对照抗体组D0天的肿瘤体积均数。肿瘤体积测定：采用游标卡尺测定肿瘤的长径(a)和宽径(b)，肿瘤体积按如下公式计算：TV＝1/2×a×b2。采用电子天平测定体重。
如表14所示，给药剂量和方式。
表14给药试验设计
编号 给药剂量 给药次数 给药方式
阴性对照抗体 10mg/kg BIWX6* 腹腔注射
PD-1抗体 10mg/kg 单次 腹腔注射
Ab4 10mg/kg BIWX6* 腹腔注射
Ab5 10mg/kg BIWX6* 腹腔注射
Ab9 10mg/kg BIWX6* 腹腔注射
PD-1抗体+Ab4 10mg/kg+10mg/kg 单次+BIWX6* 腹腔注射
PD-1抗体+Ab5 10mg/kg+10mg/kg 单次+BIWX6* 腹腔注射
PD-1抗体+Ab9 10mg/kg+10mg/kg 单次+BIWX6* 腹腔注射
*每周2次给药，共6次。
如图19所示，GITR结合蛋白Ab4、Ab5、Ab9分别和PD-1抗体联用在小鼠体内的抗肿瘤药效检测。
如图20所示，GITR结合蛋白Ab4、Ab5、Ab9分别和PD-1抗体联用施用后，小鼠的体重变化。
上述试验表明，本申请的GITR结合蛋白和PD-1抗体联用显著性抑制肿瘤的生长，并且对动物体重均没有明显影响。
如表15所示，在接种后第28天，本申请的GITR结合蛋白Ab4、Ab5、Ab9在10mg/kg剂量下肿瘤体积抑制率分别为16％、54％、41％，PD-1抗体在10mg/kg剂量下肿瘤体积抑制率为62％，GITR结合蛋白白Ab4、Ab5、Ab9分别和PD-1抗体联用剂量下肿瘤体积抑制率分别为98％、97％、91％；本申请的GITR结合蛋白Ab4、Ab5、Ab9分别和PD-1抗体联用均显示出显著性协同抑制肿瘤生长的能力；并且对动物体重均没有明显影响。
表15第28天本申请的GITR结合蛋白Ab4、Ab5、Ab9分别和PD-1抗联用体内抑制肿瘤生长能力
编号 肿瘤体积(均数±标准误) 肿瘤体积抑制率
阴性对照抗体 2482.82±210.32 -
PD-1抗体 1017.41±274.32** 62％
Ab4 2109.17±374.07 16％
Ab5 1215.53±167.15** 54％
Ab9 1519.43±134.50** 41％
PD-1抗体+Ab4 190.14±93.35**且# 98％
PD-1抗体+Ab5 208.40±80.98**且# 97％
PD-1抗体+Ab9 347.34±136.14** 91％
其中，**表示与阴性对照抗体肿瘤体积相比，P<0.01；#表示与PD-1抗体肿瘤体积相比，P<0.05。
实施例11GITR结合蛋白与PD-L1抗体联用
本试验采用MC38/hPDL1细胞接种人B-hPD-1/hPD-L1/hGITR转基因小鼠检测本申请的GITR结合蛋白与PD-L1抗体联用的抗肿瘤作用。
人B-hPD-1/hPD-L1/hGITR转基因小鼠：
雌性C57BL/6背景的B-hPD-1/hPD-L1/hGITR转基因小鼠(约6周)购自百奥赛图江苏基因生物技术有限公司。小鼠在到达后适应性饲养7天，随后开始研究。
细胞：小鼠MC38/hPDL1细胞为百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司构建，进行常规传代培养用于后续体内实验。离心收集细胞，在无血清培养基中重悬细胞。在第0天取0.1ml细胞悬液皮下接种至人B-hPD-1/hPD-L1/hGITR转基因小鼠右腋窝皮下来建立MC38/hPDL1荷瘤小鼠模型。
给药：
肿瘤细胞接种第6天，检测各只小鼠瘤体积，挑选出瘤体积在合适范围内的小鼠按瘤体积平均分组(每组6只小鼠)，分别在接种后第6、9、13、16和20天给药，阴性对照抗体(人IgG)、PD-L1抗体(阿特珠单抗Atezolizumab，来源：杭州皓阳生物技术有限公司，货号：HSP099-20)、阳性对照抗体1(B-011B-PC-1)、本申请抗原结合蛋白Ab5；给药期间监测各组小鼠瘤体积和体重变化，监测频率均为2次/周，连续监测3周。在每次给药前测定体重和肿瘤体积，细胞接种后第23天计算肿瘤体积抑制率(TGI％)，计算公式如下：TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100；其中Ti：给药组肿瘤体积统计数，例如均数，T0：给药组D0天的肿瘤体积统计数，例如均数，Vi：阴性对照抗体组肿瘤体积统计数，例如均数，V0：阴性对照抗体组D0天的肿瘤体积统计数，例如均数。肿瘤体积测定：采用游标卡尺测定肿瘤的长径(a)和宽径(b)，肿瘤体积按如下公式计算：TV＝1/2×a×b2。采用电子天平测定体重。
如表16所示，给药剂量和方式。
表16给药试验设计
编号 给药剂量 给药次数 给药方式
阴性对照抗体 10mg/kg BIWX5* 腹腔注射
PD-L1抗体 3mg/kg BIWX5* 腹腔注射
阳性对照抗体1 10mg/kg BIWX5* 腹腔注射
Ab5 10mg/kg BIWX5* 腹腔注射
PD-L1抗体+阳性对照抗体1 3mg/kg+10mg/kg BIWX5*+BIWX5* 腹腔注射
PD-L1抗体+Ab5 3mg/kg+10mg/kg BIWX5*+BIWX5* 腹腔注射
*每周2次给药，共5次。
如图21所示，GITR结合蛋白Ab5和PD-L1抗体联用在小鼠体内的抗肿瘤药效检测。
如图22所示，GITR结合蛋白Ab5和PD-L1抗体联用施用后，小鼠的体重变化。
上述试验表明，本申请的GITR结合蛋白和PD-L1抗体联用显著性抑制肿瘤的生长，并且对动物体重均没有明显影响。
如表17所示，在接种后第23天，本申请的GITR结合蛋白Ab5在10mg/kg剂量下肿瘤体积抑制率分别为25％，PD-L1抗体在3mg/kg剂量下肿瘤体积抑制率为29％，GITR结合蛋白Ab5和PD-L1抗体联用剂量下肿瘤体积抑制率分别为66％；GITR结合蛋白Ab5和PD-1抗体联用显示显著性联合用药抑制肿瘤的生长。
表17第23天本申请的GITR结合蛋白和PD-L1抗联用体内抑制肿瘤生长能力
Figure BDA0003546808190000601
注：*：与阴性对照抗体肿瘤体积相比，P<0.05；**：与阴性对照抗体肿瘤体积相比，P<0.01。
本申请的GITR结合蛋白和PD-L1抗体联用显示显著性的协同抑制肿瘤生长的能力。
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本申请所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方案的范围内。
序列表
<110> 上海医药集团股份有限公司
<120> GITR结合蛋白及其用途
<130> 0124-PA-017
<160> 69
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HCDR1
<400> 1
Ser Gly Tyr Ala Trp Asn
1 5
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HCDR2
<400> 2
Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Ser Thr Phe Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HCDR3
<400> 3
Glu Ser Leu Tyr Gly Asn Tyr Asp Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LCDR1
<400> 4
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ile Ile Arg Asn Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LCDR2
<400> 5
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LCDR3
<400> 6
Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Arg Thr
1 5
<210> 7
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HFR1 Ab0
<400> 7
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr
20 25 30
<210> 8
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HFR1 Ab1-3
<400> 8
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser
20 25 30
<210> 9
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HFR1 Ab4-9
<400> 9
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr
20 25 30
<210> 10
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HFR2 Ab0
<400> 10
Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10
<210> 11
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HFR2 Ab1-3
<400> 11
Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 12
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HFR2 Ab4-9
<400> 12
Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10
<210> 13
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HFR2 Ab4-9
<400> 13
Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10
<210> 14
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HFR3 Ab0
<400> 14
Arg Ile Ser Phe Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu His
1 5 10 15
Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 15
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HFR3 Ab1-3
<400> 15
Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys
1 5 10 15
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 16
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HFR3 Ab4-6
<400> 16
Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys
1 5 10 15
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 17
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HFR3 Ab7-9
<400> 17
Arg Val Thr Phe Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys
1 5 10 15
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HFR4 Ab0
<400> 18
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 19
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HFR4 Ab1-9
<400> 19
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 20
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LFR1 Ab0
<400> 20
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys
20
<210> 21
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LFR1 Ab1+4+7
<400> 21
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys
20
<210> 22
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LFR1 Ab2+5+8
<400> 22
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys
20
<210> 23
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LFR2 Ab0
<400> 23
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 24
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LFR2 Ab1+4+7
<400> 24
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 25
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LFR3 Ab0
<400> 25
Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Asn Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 26
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LFR3 Ab1-2+4-5+7-8
<400> 26
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 27
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LFR3 Ab3+6+9
<400> 27
Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 28
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LFR4 Ab0
<400> 28
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 29
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LFR4 AB1-9
<400> 29
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 30
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH Ab0
<400> 30
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Ser Thr Phe Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Ser Phe Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu His Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ser Leu Tyr Gly Asn Tyr Asp Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 31
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH Ab1-3
<400> 31
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Ser Thr Phe Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ser Leu Tyr Gly Asn Tyr Asp Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 32
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH Ab4-6
<400> 32
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Ser Thr Phe Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ser Leu Tyr Gly Asn Tyr Asp Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 33
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH Ab7-9
<400> 33
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Ser Thr Phe Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Phe Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ser Leu Tyr Gly Asn Tyr Asp Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 34
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH Ab7-9
<400> 34
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Ser Thr Phe Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Phe Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ser Leu Tyr Gly Asn Tyr Asp Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 35
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL Ab0
<400> 35
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ile Ile Arg Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Asn Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 36
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL Ab1+4+7
<400> 36
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ile Ile Arg Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 37
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL Ab2+5+8
<400> 37
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ile Ile Arg Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 38
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL Ab3+6+9
<400> 38
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ile Ile Arg Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 39
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HFR1 通式
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = Asp或Gln
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> Xaa = Gly或Tyr
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> Xaa = Ser或Thr
<400> 39
Xaa Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Xaa Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Xaa Gly Xaa Ser Ile Xaa
20 25 30
<210> 40
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HFR2 通式
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa = Phe或His
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = Lys或Asn
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa = Gly或Lys
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> Xaa = Ile或Met
<400> 40
Trp Ile Arg Gln Xaa Pro Gly Xaa Xaa Leu Glu Trp Xaa Gly
1 5 10
<210> 41
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HFR3 通式
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa = Ile或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa = Phe或Ile
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa = Arg或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> Xaa = Phe或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> Xaa = His或Lys
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> Xaa = Asn或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> Xaa = Ala或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> Xaa = Ala或Glu
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> Xaa = Thr或Val
<400> 41
Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Xaa Leu Xaa
1 5 10 15
Leu Xaa Ser Val Thr Xaa Xaa Asp Thr Ala Xaa Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 42
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HFR4 通式
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa = Leu或Ser
<400> 42
Trp Gly Gln Gly Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 43
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LFR1 通式
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa = Asp或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa = Leu或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> Xaa = Lys或Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> Xaa = Ala或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> Xaa = Ile或Met
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> Xaa = Asn或Ser
<400> 43
Asp Ile Val Met Xaa Gln Ser Pro Xaa Ser Leu Ala Val Ser Xaa Gly
1 5 10 15
Glu Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Cys
20
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LFR2 通式
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa = Pro或Ser
<400> 44
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Xaa Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 45
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LFR3 通式
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa = Asn或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> Xaa = Leu或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> Xaa = Lys或Gln
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> Xaa = Leu或Val
<400> 45
Gly Val Pro Asp Arg Phe Xaa Gly Xaa Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Xaa Xaa Ala Glu Asp Xaa Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 46
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LFR4 通式
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa = Leu或Val
<400> 46
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Xaa Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 47
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH 通式
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = Asp或Gln
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> Xaa = Gly或Tyr
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(41)
<223> Xaa = Phe或His
<220>
<221> misc_feature
<222> (44)..(44)
<223> Xaa = Lys或Asn
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)..(45)
<223> Xaa = Gly或Lys
<220>
<221> misc_feature
<222> (49)..(49)
<223> Xaa = Ile或Met
<220>
<221> misc_feature
<222> (68)..(68)
<223> Xaa = Ile或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (69)..(69)
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (70)..(70)
<223> Xaa = Phe或Ile
<220>
<221> misc_feature
<222> (71)..(71)
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (72)..(72)
<223> Xaa = Arg或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (80)..(80)
<223> Xaa = Phe或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (82)..(82)
<223> Xaa = His或Lys
<220>
<221> misc_feature
<222> (84)..(84)
<223> Xaa = Asn或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (88)..(88)
<223> Xaa = Ala或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (89)..(89)
<223> Xaa = Ala或Glu
<220>
<221> misc_feature
<222> (93)..(93)
<223> Xaa = Thr或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (115)..(115)
<223> Xaa = Leu或Ser
<400> 47
Xaa Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Xaa Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Xaa Gly Xaa Ser Ile Xaa Ser Gly
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Xaa Pro Gly Xaa Xaa Leu Glu Trp
35 40 45
Xaa Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Ser Thr Phe Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Xaa
65 70 75 80
Leu Xaa Leu Xaa Ser Val Thr Xaa Xaa Asp Thr Ala Xaa Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ser Leu Tyr Gly Asn Tyr Asp Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 48
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL 通式
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa = Asp或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa = Leu或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> Xaa = Lys或Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> Xaa = Ala或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> Xaa = Ile或Met
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> Xaa = Asn或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (49)..(49)
<223> Xaa = Pro或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (69)..(69)
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (71)..(71)
<223> Xaa = Asn或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (84)..(84)
<223> Xaa = Leu或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (85)..(85)
<223> Xaa = Lys或Gln
<220>
<221> misc_feature
<222> (89)..(89)
<223> Xaa = Leu或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (110)..(110)
<223> Xaa = Leu或Val
<400> 48
Asp Ile Val Met Xaa Gln Ser Pro Xaa Ser Leu Ala Val Ser Xaa Gly
1 5 10 15
Glu Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ile Ile Arg Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Xaa Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Xaa Gly Xaa Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Xaa Xaa Ala Glu Asp Xaa Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Xaa Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 49
<211> 107
<212> PRT
<213> 人类（Homo sapiens）
<400> 49
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 50
<211> 106
<212> PRT
<213> 人类（Homo sapiens）
<400> 50
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
35 40 45
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 51
<211> 330
<212> PRT
<213> 人类（Homo sapiens）
<400> 51
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 52
<211> 326
<212> PRT
<213> 人类（Homo sapiens）
<400> 52
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 53
<211> 377
<212> PRT
<213> 人类（Homo sapiens）
<400> 53
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro
100 105 110
Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
115 120 125
Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys
130 135 140
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
145 150 155 160
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
165 170 175
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
180 185 190
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr
195 200 205
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
210 215 220
Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
225 230 235 240
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
245 250 255
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
260 265 270
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
275 280 285
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
290 295 300
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn
305 310 315 320
Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
325 330 335
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile
340 345 350
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
355 360 365
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375
<210> 54
<211> 327
<212> PRT
<213> 人类（Homo sapiens）
<400> 54
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 55
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> B011-B-PC-1重链
<400> 55
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Thr Trp Tyr Ala Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ser Met Val Arg Gly Leu Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 56
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> B011-B-PC-1+2轻链
<400> 56
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 57
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> B011-B-PC-2重链
<400> 57
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Glu Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ser Met Val Arg Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly
450
<210> 58
<211> 241
<212> PRT
<213> 人类（Homo sapiens）
<400> 58
Met Ala Gln His Gly Ala Met Gly Ala Phe Arg Ala Leu Cys Gly Leu
1 5 10 15
Ala Leu Leu Cys Ala Leu Ser Leu Gly Gln Arg Pro Thr Gly Gly Pro
20 25 30
Gly Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu Gly Thr Gly Thr Asp Ala Arg
35 40 45
Cys Cys Arg Val His Thr Thr Arg Cys Cys Arg Asp Tyr Pro Gly Glu
50 55 60
Glu Cys Cys Ser Glu Trp Asp Cys Met Cys Val Gln Pro Glu Phe His
65 70 75 80
Cys Gly Asp Pro Cys Cys Thr Thr Cys Arg His His Pro Cys Pro Pro
85 90 95
Gly Gln Gly Val Gln Ser Gln Gly Lys Phe Ser Phe Gly Phe Gln Cys
100 105 110
Ile Asp Cys Ala Ser Gly Thr Phe Ser Gly Gly His Glu Gly His Cys
115 120 125
Lys Pro Trp Thr Asp Cys Thr Gln Phe Gly Phe Leu Thr Val Phe Pro
130 135 140
Gly Asn Lys Thr His Asn Ala Val Cys Val Pro Gly Ser Pro Pro Ala
145 150 155 160
Glu Pro Leu Gly Trp Leu Thr Val Val Leu Leu Ala Val Ala Ala Cys
165 170 175
Val Leu Leu Leu Thr Ser Ala Gln Leu Gly Leu His Ile Trp Gln Leu
180 185 190
Arg Ser Gln Cys Met Trp Pro Arg Glu Thr Gln Leu Leu Leu Glu Val
195 200 205
Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala Arg Ser Cys Gln Phe Pro Glu Glu Glu
210 215 220
Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu Glu Lys Gly Arg Leu Gly Asp Leu Trp
225 230 235 240
Val
<210> 59
<211> 726
<212> DNA
<213> 人类（Homo sapiens）
<400> 59
atggcacagc acggggcgat gggcgcgttt cgggccctgt gcggcctggc gctgctgtgc 60
gcgctcagcc tgggtcagcg ccccaccggg ggtcccgggt gcggccctgg gcgcctcctg 120
cttgggacgg gaacggacgc gcgctgctgc cgggttcaca cgacgcgctg ctgccgcgat 180
tacccgggcg aggagtgctg ttccgagtgg gactgcatgt gtgtccagcc tgaattccac 240
tgcggagacc cttgctgcac gacctgccgg caccaccctt gtcccccagg ccagggggta 300
cagtcccagg ggaaattcag ttttggcttc cagtgtatcg actgtgcctc ggggaccttc 360
tccgggggcc acgaaggcca ctgcaaacct tggacagact gcacccagtt cgggtttctc 420
actgtgttcc ctgggaacaa gacccacaac gctgtgtgcg tcccagggtc cccgccggca 480
gagccgcttg ggtggctgac cgtcgtcctc ctggccgtgg ccgcctgcgt cctcctcctg 540
acctcggccc agcttggact gcacatctgg cagctgagga gtcagtgcat gtggccccga 600
gagacccagc tgctgctgga ggtgccgccg tcgaccgaag acgccagaag ctgccagttc 660
cccgaggaag agcggggcga gcgatcggca gaggagaagg ggcggctggg agacctgtgg 720
gtgtga 726
<210> 60
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> pembrolizumab HCDR1
<400> 60
Asn Tyr Tyr Met Tyr
1 5
<210> 61
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> pembrolizumab HCDR2
<400> 61
Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asn
<210> 62
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> pembrolizumab HCDR3
<400> 62
Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 63
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> pembrolizumab LCDR1
<400> 63
Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 64
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> pembrolizumab LCDR2
<400> 64
Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser
1 5
<210> 65
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> pembrolizumab LCDR3
<400> 65
Gln His Ser Arg Asp Leu Pro Leu Thr
1 5
<210> 66
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> pembrolizumab VH
<400> 66
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 67
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> pembrolizumab VL
<400> 67
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 68
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> pembrolizumab重链
<400> 68
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 69
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> pembrolizumab轻链
<400> 69
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215

Claims (10)

1.分离的抗原结合蛋白，其包含HCDR3，所述HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；优选地，所述抗原结合蛋白包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中所述HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，且所述HCDR1包含SEQID NO:1所示的氨基酸序列；以及所述抗原结合蛋白包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述LCDR3包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，且所述LCDR1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
2.多肽，其包含权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白。
3.核酸分子，其编码权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白和/或权利要求2所述的多肽。
4.载体，其包含权利要求3所述的核酸分子。
5.免疫缀合物，其包含权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白和/或权利要求2所述的多肽。
6.细胞，其包含和/或表达权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白、包含和/或表达权利要求2所述的多肽、包含权利要求3所述的核酸分子、包含权利要求4所述的载体和/或包含权利要求5所述的免疫缀合物。
7.药物组合物，其包含权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白、权利要求2所述的多肽、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的载体、权利要求5所述的免疫缀合物和/或权利要求6所述的细胞，以及任选地药学上可接受的载剂。
8.药物组合，其包含权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白和/或权利要求2所述的多肽，以及一种或多种的免疫检查点抑制剂。
9.试剂盒，其包含权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白、权利要求2所述的多肽、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的载体、权利要求5所述的免疫缀合物、权利要求6所述的细胞、权利要求7所述的药物组合物和/或权利要求8所述的药物组合。
10.权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白、权利要求2所述的多肽、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的载体、权利要求5所述的免疫缀合物、权利要求6所述的细胞、权利要求7所述的药物组合物、权利要求8所述的药物组合和/或权利要求9所述的试剂盒在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗疾病和/或病症。
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