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CN113039208B - 一种抗pd-l1抗原结合蛋白及其应用 - Google Patents

一种抗pd-l1抗原结合蛋白及其应用 Download PDF

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Abstract

提供一种PD‑L1抗原结合蛋白，其能够以1×10‑8M或更低的KD值结合源自灵长类动物的PD‑L1。所述的抗原结合蛋白能够阻断PD‑1和CD80与PD‑L1的结合，刺激免疫细胞中细胞因子的分泌，能够抑制肿瘤生长和/或肿瘤细胞增殖。还提供一种融合蛋白，其包括人TGFBRII或其片段和所述抗原结合蛋白。还提供所述抗原结合蛋白和/或所述融合蛋白在预防和治疗肿瘤或癌症中的应用。

Description

一种抗PD-L1抗原结合蛋白及其应用
技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种抗PD-L1抗原结合蛋白及其应用，以及一种抗PD-L1和抗TGFB的融合蛋白及其应用。
背景技术
程序性死亡受体配体1(PD-L1)，也称为分化簇274(CD274)或B7同源蛋白1(B7-H1)，是一个40KDa的I型跨膜蛋白，一般在活化的T细胞、B细胞、单核细胞、树突状细胞、巨噬细胞及许多非造血细胞上表达。
PD-L1能与程序性死亡受体1(PD-1)和B7-1(CD80)结合。其中PD-L1/PD-1信号通路是免疫反应中非常重要的共抑制信号途径，负调节T细胞免疫应答，抑制T细胞活性，减弱细胞因子的分泌。研究发现PD-L1能在许多肿瘤组织中表达，包括胃癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、结肠癌、肥大细胞性肿瘤以及恶性黑色素瘤等，以及在浸润肿瘤微环境的骨髓细胞中表达，保护肿瘤细胞逃避免疫攻击。转化生长因子-B(TGFB)是对免疫系统有显著影响的强效细胞因子，参与许多增殖性和非增殖性细胞过程，如细胞增殖和分化、胚胎发育、细胞外基质形成、骨骼发育、伤口愈合、造血作用以及免疫和炎症反应。现有治疗技术手段无论是化学疗法或是肿瘤靶向疗法，影响其疗效的一个重要瓶颈是肿瘤细胞产生免疫耐受。肿瘤细胞在肿瘤微环境中利用多种免疫抑制机制来逃避机体免疫系统识别和攻击，这些免疫抑制机制包括免疫抑制型的细胞因子(如TGFB)、调节性T细胞(Tregs)、共抑制信号通路分子、髓系抑制性细胞等等。
免疫抑制的多种机制可能会阻碍免疫治疗具有有效性。在一些情况下，肿瘤对于单药免疫治疗来说是难治的并且只有一小部分的癌症有完全反应。因此，研发具备阻断PD-L1/PD-1信号通路能力的药物以及在抑制PD-1/PD-L1通路的基础上靶向中和肿瘤微环境的免疫抑制型细胞因子TGFB，能为肿瘤及多种免疫系统相关疾病的治疗带来全新的解决方法。
发明内容
本申请提供了一种PD-L1抗原结合蛋白，其能够以1×10-8M或更低的KD值结合源自灵长类动物的PD-L1。所述的抗原结合蛋白能够阻断PD-1和CD80与PD-L1的结合，刺激免疫细胞中IFN-γ和/或IL2的分泌，能够抑制肿瘤生长和/或肿瘤细胞增殖。本申请还提供了一种融合蛋白，其包括人TGFBRII或其片段和所述抗原结合蛋白。本申请还提供了所述抗原结合蛋白和/或所述融合蛋白在预防和治疗肿瘤或癌症中的应用。
一方面，本申请提供了一种结合PD-L1的分离的抗原结合蛋白，其包含抗体重链可变区VH中的至少一个CDR，所述VH包含SEQ ID NO：193所示的氨基酸序列；优选地，所述VH包含SEQ ID NOs：90-93、95和97-104中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包含抗体轻链可变区VL中的至少一个CDR，所述VL包含SEQ ID NO：194所示的氨基酸序列；优选地，所述VL包含SEQ ID NOs：108-114、116和118中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包括抗体或其抗原结合片段；优选地，所述抗体其中所述抗体选自下组：单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体；优选地，所述抗原结合片段包括Fab，Fab’，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv并且/或者dAb。
在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包含轻链可变区VL和重链可变区VH，轻链可变区VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含如SEQ ID NO：181所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含如SEQ ID NO：182所示的氨基酸序列，所述LCDR3包含如SEQ ID NO：191所示的氨基酸序列；其中重链可变区VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含如SEQID NO：5所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含如SEQ ID NO：179所示的氨基酸序列，所述HCDR3包含如SEQ ID NO：180所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述LCDR1包含SEQ ID NOs：181、48-51中任一项所示的氨基酸序列；所述LCDR2包含SEQ ID NOs：182、63-64中任一项所示的氨基酸序列；所述LCDR3包含SEQ ID NOs：191、77-79中任一项所示的氨基酸序列；HCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；HCDR2包含SEQ ID NOs：179、14、16和17中任一项所示的氨基酸序列；HCDR3包含SEQ ID NOs：180、29-33中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述LCDR1包含如SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列；所述LCDR2包含如SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列；所述LCDR3包含如SEQ ID NO：77所示的氨基酸序列；所述HCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；所述HCDR2包含如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列；所述HCDR3包含如SEQ ID NO：29所示；或者，
所述LCDR1包含如SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列、所述LCDR2包含如SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列、所述LCDR3包含如SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列、所述HCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列、所述HCDR2包含如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列且所述HCDR3包含如SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列；或者，
所述LCDR1包含如SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列、所述LCDR2包含如SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列、所述LCDR3包含如SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列、所述HCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列、所述HCDR2包含如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列且所述HCDR3包含如SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列；或者，
所述LCDR1包含如SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列、所述LCDR2包含如SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列、所述LCDR3包含如SEQ ID NO：77所示的氨基酸序列、所述HCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列、所述HCDR2包含如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列且所述HCDR3包含如SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列；或者，
所述LCDR1包含如SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列、所述LCDR2包含如SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列、所述LCDR3包含如SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列、所述HCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列、所述HCDR2包含如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列且所述HCDR3包含如SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列；或者，
所述LCDR1包含如SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列、所述LCDR2包含如SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列、所述LCDR3包含如SEQ ID NO：77所示的氨基酸序列、所述HCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列、所述HCDR2包含如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列且所述HCDR3包含如SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列；或者，
所述LCDR1包含如SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列、所述LCDR2包含如SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列、所述LCDR3包含如SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列、所述HCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列、所述HCDR2包含如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列且所述HCDR3包含如SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列；或者，
所述LCDR1包含如SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列、所述LCDR2包含如SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列、所述LCDR3包含如SEQ ID NO：77所示的氨基酸序列、所述HCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列、所述HCDR2包含如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列且所述HCDR3包含如SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列；或者，
所述LCDR1包含如SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列、所述LCDR2包含如SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列、所述LCDR3包含如SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列、所述HCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列、所述HCDR2包含如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列且所述HCDR3包含如SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列；或者，
所述LCDR1包含如SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列、所述LCDR2包含如SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列、所述LCDR3包含如SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列、所述HCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列、所述HCDR2包含如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列且所述HCDR3包含如SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列；或者，
所述LCDR1包含如SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列、所述LCDR2包含如SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列、所述LCDR3包含如SEQ ID NO：77所示的氨基酸序列、所述HCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列、所述HCDR2包含如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列且所述HCDR3包含如SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列；或者，
所述LCDR1包含如SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列、所述LCDR2包含如SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列、所述LCDR3包含如SEQ ID NO：77所示的氨基酸序列、所述HCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列、所述HCDR2包含如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列且所述HCDR3包含如SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列；或者，
所述LCDR1包含如SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列、所述LCDR2包含如SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列、所述LCDR3包含如SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列、所述HCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列、所述HCDR2包含如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列且所述HCDR3包含如SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列；或者，
所述LCDR1包含如SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列、所述LCDR2包含如SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列、所述LCDR3包含如SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列、所述HCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列、所述HCDR2包含如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列且所述HCDR3包含如SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列；或者，
所述LCDR1包含如SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列、所述LCDR2包含如SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列、所述LCDR3包含如SEQ ID NO：77所示的氨基酸序列、所述HCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列、所述HCDR2包含如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列且所述HCDR3包含如SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列；或者，
所述LCDR1包含如SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列、所述LCDR2包含如SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列、所述LCDR3包含如SEQ ID NO：77所示的氨基酸序列、所述HCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列、所述HCDR2包含如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列且所述HCDR3包含如SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗体重链可变区VH包括框架区H-FR1，H-FR2，H-FR3，和H-FR4；优选地，所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端相连，包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；并且/或者所述H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列；并且/或者所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，包含SEQ ID NO：192所示的氨基酸序列；并且/或者所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端相连，包含SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列；进一步优选地，所述H-FR3包含SEQ ID NOs：21、22和24中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗体轻链可变区VL包括框架区L-FR1，L-FR2，L-FR3，和L-FR4；优选地，所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端相连，包含SEQ ID NO：185所示的氨基酸序列；并且/或者所述L-FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间，包含SEQ ID NO：186所示的氨基酸序列；并且/或者所述L-FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间，包含SEQ ID NO：187所示的氨基酸序列；并且/或者所述L-FR4的N末端与所述LCDR3的C末端相连，包含SEQ ID NO：188所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述L-FR1包含SEQ ID NOs：41-44中任一项所示的氨基酸序列；并且/或者所述L-FR2包含SEQ ID NOs：56-59中任一项所示的氨基酸序列；并且/或者所述L-FR3包含SEQ ID NOs：69-72中任一项所示的氨基酸序列；并且/或者所述L-FR4包含SEQID NOs：85-86中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗体重链可变区VH包含SEQ ID NO：193所示的氨基酸序列；所述抗体轻链可变区VL包含SEQ ID NO：194所示的氨基酸序列；
优选地，所述抗体重链可变区VH包含SEQ ID NOs：90-93、95和97-104中任一项所示的氨基酸序列；
优选地，所述抗体轻链可变区VL包含SEQ ID NOs：108-114、116和118中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗体重链可变区VH包含SEQ ID NO：90所示的氨基酸序列，所述抗体轻链可变区VL包括SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列；或者，
所述抗体重链可变区VH包含如SEQ ID NO：90所示的氨基酸序列，所述抗体轻链可变区VL包含如SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列；或者，
所述抗体重链可变区VH包含如SEQ ID NO：91所示的氨基酸序列，所述抗体轻链可变区VL包含如SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列；或者，
所述抗体重链可变区VH包含如SEQ ID NO：90所示的氨基酸序列，所述抗体轻链可变区VL包含如SEQ ID NO：111所示的氨基酸序列；或者，
所述抗体重链可变区VH包含如SEQ ID NO：92所示的氨基酸序列，所述抗体轻链可变区VL包含如SEQ ID NO：112所示的氨基酸序列；或者，
所述抗体重链可变区VH包含如SEQ ID NO：93所示的氨基酸序列，所述抗体轻链可变区VL包含如SEQ ID NO：113所示的氨基酸序列；或者，
所述抗体重链可变区VH包含如SEQ ID NO：90所示的氨基酸序列，所述抗体轻链可变区VL包含如SEQ ID NO：114所示的氨基酸序列；或者，
所述抗体重链可变区VH包含如SEQ ID NO：95所示的氨基酸序列，所述抗体轻链可变区VL包含如SEQ ID NO：116所示的氨基酸序列；或者，
所述抗体重链可变区VH包含如SEQ ID NO：97所示的氨基酸序列，所述抗体轻链可变区VL包含如SEQ ID NO：118所示的氨基酸序列；或者，
所述抗体重链可变区VH包含如SEQ ID NO：98所示的氨基酸序列，所述抗体轻链可变区VL包含如SEQ ID NO：118所示的氨基酸序列；或者，
所述抗体重链可变区VH包含如SEQ ID NO：99所示的氨基酸序列，所述抗体轻链可变区VL包含如SEQ ID NO：113所示的氨基酸序列；或者，
所述抗体重链可变区VH包含如SEQ ID NO：100所示的氨基酸序列，所述抗体轻链可变区VL包含如SEQ ID NO：113所示的氨基酸序列；或者，
所述抗体重链可变区VH包含如SEQ ID NO：101所示的氨基酸序列，所述抗体轻链可变区VL包含如SEQ ID NO：114所示的氨基酸序列；或者，
所述抗体重链可变区VH包含如SEQ ID NO：102所示的氨基酸序列，所述抗体轻链可变区VL包含如SEQ ID NO：114所示的氨基酸序列；或者，
所述抗体重链可变区VH包含如SEQ ID NO：103所示的氨基酸序列，所述抗体轻链可变区VL包含如SEQ ID NO：116所示的氨基酸序列；或者，
所述抗体重链可变区VH包含如SEQ ID NO：104所示的氨基酸序列，所述抗体轻链可变区VL包含如SEQ ID NO：116所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包括抗体重链恒定区，且所述抗体重链恒定区包括人IgG恒定区；优选地，其中所述抗体重链恒定区包含如SEQ ID NOs：172-175中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包含抗体重链HC，且所述HC包含如SEQ ID NOs：122-125、127和129-137中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包括抗体轻链恒定区，其中所述抗体轻链恒定区包含如SEQ ID NO：170所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包含抗体轻链LC，且所述LC包含如SEQ ID NOs：150-156、158和160-163中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白具有下述性质中的一种或多种：
1)能够以1×10-8M或更低的KD值结合源自灵长类动物的PD-L1；
2)能够阻断PD-1与PD-L1的结合；
3)能够阻断CD80与PD-L1的结合；
4)能够刺激免疫细胞中IFN-γ并且/或者IL2的分泌；
5)能够抑制肿瘤生长并且/或者肿瘤细胞增殖；
6)与对照抗体相比，结合与源自灵长类动物的PD-L1的不完全重叠的表位，
其中所述对照抗体包含SEQ ID NO：52所示的LCDR1、SEQ ID NO：65所示的LCDR2和SEQ ID NO：81所示的LCDR3，且所述对照抗体包含SEQ ID NO：6所示的HCDR1、SEQ ID NO：15所示的HCDR2和SEQ ID NO：34所示的HCDR3；
或者，
其中所述对照抗体包含SEQ ID NO：53所示的LCDR1、SEQ ID NO：66所示的LCDR2和SEQ ID NO：82所示的LCDR3，且所述对照抗体包含SEQ ID NO：5所示的HCDR1、SEQ ID NO：18所示的HCDR2和SEQ ID NO：35所示的HCDR3；
或者，
所述对照抗体包含SEQ ID NO：55所示的LCDR1、SEQ ID NO：68所示的LCDR2和SEQID NO：84所示的LCDR3，且所述对照抗体包含SEQ ID NO：8所示的HCDR1、SEQ ID NO：20所示的HCDR2和SEQ ID NO：37所示的HCDR3。
在某些实施方式中，所述灵长类动物包括人并且/或者猴。
另一方面，本申请提供了一种融合蛋白，其包含：a)人TGFBRII或其片段；以及b)所述的分离的抗原结合蛋白。
在某些实施方式中，所述的融合蛋白包含第一多肽和第二多肽，其中所述第一多肽包含所述分离的抗原结合蛋白的重链或其片段以及所述人TGFBRII或其片段；且所述第二多肽包含所述分离的抗原结合蛋白的轻链或其片段；优选地，所述抗体重链或其片段与所述人TGFBRII或其片段框内融合而形成所述第一多肽；进一步优选地，其中所述抗体重链或其片段的C端直接或间接与所述人TGFBRII或其片段的N端连接。
在某些实施方式中，所述第一多肽的所述重链或其片段包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，HCDR1包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；HCDR2包含SEQ ID NOs：179、14、16和17中任一项所示的氨基酸序列；HCDR3包含SEQ ID NOs：180、29-33中任一项所示的氨基酸序列；并且/或者所述第二多肽包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，LCDR1包含SEQ ID NOs：181、48-51中任一项所示的氨基酸序列；LCDR2包含SEQ ID NOs：182、63-64中任一项所示的氨基酸序列；LCDR3包含SEQ ID NOs：191、77-79中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，LCDR1包含如SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列，LCDR2包含如SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列，LCDR3包含如SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列；HCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，HCDR2包含如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，HCDR3包含如SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列；或者，
LCDR1包含如SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列，LCDR2包含如SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列，LCDR3包含如SEQ ID NO：77所示的氨基酸序列；HCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，HCDR2包含如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，HCDR3包含如SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列；或者，
LCDR1包含如SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列，LCDR2包含如SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列，LCDR3包含如SEQ ID NO：77所示的氨基酸序列；HCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，HCDR2包含如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列，HCDR3包含如SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列；或者，
LCDR1包含如SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列，LCDR2包含如SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列，LCDR3包含如SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列；HCDR1包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列，HCDR3包含如SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列；或者，
LCDR1包含如SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列，LCDR2包含如SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列，LCDR3包含如SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列；HCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，HCDR2包含如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，HCDR3包含如SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗体重链或其片段通过连接子与所述人TGFBRII或其片段相连；优选地，其中所述连接子为肽连接子，且所述肽连接子包含SEQ ID NOs：167-169中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述人TGFBRII或其片段包含人TGFBRII的胞外结构域；优选地，所述人TGFBRII或其片段包含SEQ ID NOs：176-178中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第一多肽的所述重链或其片段与所述第二多肽的所述轻链或其片段组合后形成特异性结合PD-L1的抗原结合部分。
在某些实施方式中，所述第一多肽包含SEQ ID NOs：138、139、142、143和145-148中任一项所示的氨基酸序列；其中所述第二多肽包含SEQ ID NOs：162-163中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第一多肽包含如SEQ ID NO：138所示的氨基酸序列，且所述第二多肽包含SEQ ID NO：162所示的氨基酸序列；或者，
所述第一多肽包含SEQ ID NO：139所示的氨基酸序列，且所述第二多肽包含SEQID NO：162所示的氨基酸序列；或者，
所述第一多肽包含SEQ ID NO：142所示的氨基酸序列，且所述第二多肽包含SEQID NO：162所示的氨基酸序列；或者，
所述第一多肽包含SEQ ID NO：143所示的氨基酸序列，且所述第二多肽包含SEQID NO：162所示的氨基酸序列；或者，
所述第一多肽包含SEQ ID NO：145所示的氨基酸序列，且所述第二多肽包含SEQID NO：163所示的氨基酸序列；或者，
所述第一多肽包含SEQ ID NO：146所示的氨基酸序列，且所述第二多肽包含SEQID NO：163所示的氨基酸序列；或者，
所述第一多肽包含SEQ ID NO：147所示的氨基酸序列，且所述第二多肽包含SEQID NO：162所示的氨基酸序列；或者，
所述第一多肽包含SEQ ID NO：148所示的氨基酸序列，且所述第二多肽包含SEQID NO：162所示的氨基酸序列。
另一方面，本申请提供了分离的一种或多种核酸分子，其编码所述的分离的抗原结合蛋白或所述的融合蛋白。
另一方面，本申请提供了载体，其包含所述的核酸分子。
另一方面，本申请提供了细胞，其包含所述的核酸分子或所述的载体。
另一方面，本申请提供了制备所述的分离的抗原结合蛋白或所述的融合蛋白的方法，所述方法包括在使得所述的分离的抗原结合蛋白所述的融合蛋白表达的条件下，培养所述的细胞。
另一方面，本申请提供了嵌合抗原受体，其包含所述的分离的抗原结合蛋白。
另一方面，本申请提供了基因修饰的细胞，其包含所述的嵌合抗原受体。
另一方面，本申请提供了抗体药物偶联物，其包含细胞毒性剂，以及所述的分离的抗原结合蛋白。
另一方面，本申请提供了药物组合物，其包含所述的分离的抗原结合蛋白、所述的融合蛋白、所述的核酸分子、所述的载体、所述的细胞、所述的嵌合抗原受体、所述的基因修饰的细胞和/或所述的抗体药物偶联物，以及任选地药学上可接受的载体；较佳地，所述药物组合物还含有由激素制剂、靶向小分子制剂、蛋白酶体抑制剂、成像剂、诊断剂、化疗剂、溶瘤药物、细胞毒性剂、细胞因子、共刺激分子的激活剂、抑制性分子的抑制剂以及疫苗组成的群组中的一种或多种。
另一方面，本申请提供了所述的分离的抗原结合蛋白、所述的融合蛋白、所述的核酸分子、所述的载体、所述的细胞、所述的嵌合抗原受体、所述的基因修饰的细胞和/或所述的抗体药物偶联物和/或所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解并且/或者治疗肿瘤或癌症，抑制肿瘤生长并且/或者抑制肿瘤细胞增殖；优选地，所述肿瘤或癌症为PD-L1表达异常的肿瘤或癌症；优选地，所述肿瘤或癌症包括结直肠癌。
另一方面，本申请提供了一种预防、缓解或治疗肿瘤，抑制肿瘤生长并且/或者抑制肿瘤细胞增殖的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用所述的分离的抗原结合蛋白、所述的融合蛋白、所述的核酸分子、所述的载体、所述的细胞、所述的嵌合抗原受体、所述的基因修饰的细胞和/或所述的抗体药物偶联物和/或所述的药物组合物；优选地，其中所述肿瘤或癌症为PD-L1表达异常的肿瘤或癌症；优选地，所述肿瘤或癌症包括结直肠癌。
另一方面，本申请提供了一种所述的分离的抗原结合蛋白、所述的融合蛋白、所述的核酸分子、所述的载体、所述的细胞、所述的嵌合抗原受体、所述的基因修饰的细胞和/或所述的抗体药物偶联物和/或所述的药物组合物，其用于治疗癌症，抑制肿瘤生长并且/或者抑制肿瘤细胞增殖。
另一方面，本申请提供了一种抑制PD-L1和或CD80与PD-1结合的方法，所述方法包括施用所述的分离的抗原结合蛋白、所述的融合蛋白、所述的核酸分子、所述的载体、所述的细胞、所述的嵌合抗原受体、所述的基因修饰的细胞和/或所述的抗体药物偶联物和/或所述的药物组合物。
另一方面，本申请提供了一种试剂盒，其包括所述的分离的抗原结合蛋白、所述的融合蛋白、所述的核酸分子、所述的载体、所述的细胞、所述的嵌合抗原受体、所述的基因修饰的细胞和/或所述的抗体药物偶联物和/或所述的药物组合物；优选地，所述试剂盒还包括(i)施用装置；和/或(ii)使用说明。本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明书如下：
图1显示的是本申请所述抗原结合蛋白结合过表达人PD-L1的CHO-K1细胞；
图2显示的是本申请所述抗原结合蛋白结合过表达食蟹猴PD-L1的CHO-K1细胞。
图3显示的是本申请所述抗原结合蛋白结合人PD-L1蛋白；
图4显示的是本申请所述抗原结合蛋白结合食蟹猴PD-L1蛋白；
图5显示的是本申请所述抗原结合蛋白阻断人PD-1与过表达人PD-L1的CHO-K1细胞的结合；
图6显示的是本申请所述抗原结合蛋白阻断人PD-1与过表达人PD-L1的CHO-K1细胞的结合；
图7显示的是本申请所述抗原结合蛋白阻断生物素化的人PD-1蛋白与人PD-L1蛋白的结合；
图8显示的是本申请所述抗原结合蛋白阻断生物素化的人B7-1(CD80)蛋白与人PD-L1蛋白的结合；
图9显示的是本申请所述抗原结合蛋白对PD-1信号通路的抑制作用；
图10显示的是本申请所述抗原结合蛋白对PD-1信号通路的抑制作用；
图11显示的是本申请所述抗原结合蛋白与人PD-L1的亲和力：(A)PR000265的单浓度抗原结合解离曲线，(B)PR000266的单浓度抗原结合解离曲线，(C)PR000265的多浓度抗原结合解离曲线，(D)PR000151的多浓度抗原结合解离曲线，(E)PR001598的多浓度抗原结合解离曲线；
图12显示的是本申请所述抗原结合蛋白在混合淋巴细胞反应(MLR)中刺激细胞因子分泌：在第一组供体配对的MLR实验中，(A)120小时后上清中的IFN-γ水平，(B)72小时后上清中的IL-2水平；在第二组供体配对的MLR实验中，(C)120小时后上清中的IFN-γ水平，(D)72小时后上清中的IL-2水平；
图13显示的是本申请所述抗原结合蛋白的抗体依赖的细胞毒性结果：(A-C)三个不同供体的PBMC对肿瘤细胞MDA-MB-231的杀伤；(D-F)三个不同供体的PBMC对肿瘤细胞NCI-H292的杀伤；
图14显示的是本申请所述抗原结合蛋白的体内抑制肿瘤活性，分别为肿瘤体积变化(A)和小鼠体重变化(B)；
图15显示的是本申请所述融合蛋白结合过表达人PD-L1的CHO-K1细胞：(A)表20-1所列融合蛋白，(B)表20-2所列融合蛋白；
图16显示的是本申请所述融合蛋白阻断人PD-1与过表达人PD-L1的CHO-K1细胞的结合：(A)表21-1所列融合蛋白，(B)表21-2所列融合蛋白；
图17显示的是本申请所述融合蛋白对PD-1信号通路的抑制作用；
图18显示的是本申请所述融合蛋白结合TGFB1：(A)表23-1所列融合蛋白，(B)表23-2所列融合蛋白，(C)表23-3所列融合蛋白；
图19显示的是本申请所述融合蛋白对TGFB1诱导Smad信号通路激活的抑制作用；
图20显示的是本申请所述融合蛋白在混合淋巴细胞反应(MLR)中，在没有或外加TGFB1的条件下，刺激T淋巴细胞分泌细胞因子的水平：(A)72小时后上清中的IL-2水平，(B)120小时后上清中的IFN-γ水平；
图21显示的是本申请所述融合蛋白的抗体依赖的细胞毒性结果：(A-C)三个不同供体的PBMC对肿瘤细胞MDA-MB-231的杀伤；(D-F)三个不同供体的PBMC对肿瘤细胞NCI-H292的杀伤；
图22显示的是本申请所述融合蛋白PR001902的药代动力学结果；
图23显示的是本申请所述融合蛋白PR001488的药代动力学结果；
图24显示的是本申请所述融合蛋白对肿瘤动物体内模型的抗肿瘤活性，分别为肿瘤体积变化(A)和小鼠体重变化(B)。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
在本申请中，术语“抗原结合蛋白”通常是指包含结合抗原的部分的蛋白质，以及任选地允许结合抗原的部分采用促进抗原结合蛋白与抗原结合的构象的支架或骨架部分。可典型地包含抗体轻链可变区(VL)、抗体重链可变区(VH)或上述两者。VH和VL区可进一步被区分为称为互补决定区(CDR)的高变区，它们散布在称为框架区(FR)的更保守的区域中。每个VH和VL可由三个CDR和四个FR区构成，它们从氨基端至羧基端可按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗原结合蛋白的实例包括但不限于抗体、抗原结合片段(Fab，Fab’，F(ab)2，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb)、免疫缀合物、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体片段、抗体衍生物、抗体类似物或融合蛋白等，只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。
在本申请中，术语“融合蛋白”通常是指由两种或多种多肽构成的蛋白质，在天然状态下通常不结合，但是各自的氨基和羧基末端可通过直接或间接结合在一起以形成一个连续多肽。在某些情形中，提及本申请所述的融合蛋白时，术语“融合蛋白”可与“抗体”互换的使用。在某些情形中，提及本申请所述的融合蛋白时，术语“融合蛋白”可与“抗原结合蛋白”互换的使用。
在本申请中，术语“Fab”通常是指含有重链可变结构域和轻链可变结构域的片段，并且还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)；术语“Fab’”通常是指在重链CH1结构域的羧基端添加少量残基(包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸)而不同于Fab的片段；术语“F(ab′)2”通常是指Fab’的二聚体，包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。术语“Fv”通常是指含有完整抗原识别与结合位点的最小抗体片段。在某些情形中，该片段可以由一个重链可变区和一个轻链可变区以紧密非共价结合的二聚体组成；术语“dsFv”通常是指二硫键稳定的Fv片段，其单个轻链可变区与单个重链可变区之间的键是二硫键。术语“dAb片段”通常是指由VH结构域组成的抗体片段。在本申请中，术语“scFv”通常是指抗体的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域通过柔性肽连接子共价连接配对形成的单价分子；此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-连接子-VH-COOH或NH2-VH-连接子-VL-COOH。
在本申请中，术语“可变”通常是指这样的事实，即抗体的可变结构域的序列的某些部分变化强烈，它形成各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，变异性并非均匀地分布在抗体的整个可变区中。它集中在轻链和重链可变区中的三个区段，被称为互补决定区(CDR)或高变区(HVR)。可变域中更高度保守的部分被称为框架(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区(H-FR1，H-FR2，H-FR3，H-FR4，L-FR1，L-FR2，L-FR3，L-FR4)，大部分采用β-折叠构型，通过三个CDR结构环区连接。每条链中的CDR通过FR区紧密靠近在一起，并与来自另一条链的CDR一起形成抗体的抗原结合位点，恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体依赖的细胞毒性。在本领域中，可以通过多种方法来定义抗体的CDR，例如基于序列可变性的Kabat定义规则(参见，Kabat等人，免疫学的蛋白质序列，第五版，美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州(1991))和基于结构环区域位置的Chothia定义规则(参见，A1-Lazikani等人，JMol Biol273：927-48，1997)。在本申请中，还使用包含了Kabat定义和Chothia定义的Combined定义规则确定可变结构域序列和全长抗体序列中的氨基酸残基。抗体CDR定义方法请参见表1。
表1 抗体CDR定义方法
Figure GPA0000304275720000141
Figure GPA0000304275720000151
其中，Laa-Lbb可以指从抗体轻链的N端开始，第aa位(Chothia编码规则)至第bb位(Chothia编码规则)的氨基酸序列；Haa-Hbb可以指从抗体重链的N端开始，第aa位(Chothia编码规则)至第bb位(Chothia编码规则)的氨基酸序列。例如，L24-L34可以指从抗体轻链N端开始，按照Chothia编码规则的从第24位至第34位的氨基酸序列；H26-H32可以指从抗体重链N端开始，按照Chothia编码规则的从第26位至第32位的氨基酸序列。
在本申请中，术语“分离的”抗原结合蛋白通常是指已经从其产生环境(例如，天然的或重组的)的组分中识别，分离和/或回收的抗原结合蛋白。其产生环境的污染组分通常是干扰其研究、诊断或治疗用途的物质，可以包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。分离的抗原结合蛋白或抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。
在本申请中，术语“单克隆抗体”通常是指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即集群中的个别抗体是相同的，除了可能存在的少量的自然突变。单克隆抗体通常针对单个抗原位点具有高度特异性。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点在于它们可以通过杂交瘤培养合成，不受其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以在杂交瘤细胞中制备，或者可以通过重组DNA方法制备。
在本申请中，术语“全人源抗体”通常是指将人类编码抗体的基因转移至基因工程改造的抗体基因缺失动物中，使动物表达的抗体。抗体所有部分(包括抗体的可变区和恒定区)均由人类来源的基因所编码。全人源抗体可以大大减少异源抗体对人体造成的免疫副反应。本领域获得全人源抗体的方法可以有噬菌体展示技术、转基因小鼠技术、核糖体展示技术和RNA-多肽技术等。
在本申请中，术语“特异性结合”通常是指抗体通过其抗原结合域与表位结合，并且该结合需要抗原结合域和表位之间的一些互补性。根据该定义，当抗体相比于其将结合随机的、不相关的表位而言更容易通过其抗原结合域与表位结合时，抗体被称为“特异性结合”该抗原。“表位”是指抗原上与抗原结合蛋白(如抗体)结合的特定的原子基团(例如，糖侧链、磷酰基、磺酰基)或氨基酸。
在本申请中，术语“KD”、“KD”可互换地使用，通常是指平衡解离常数，“KD”是解离速率常数(kdis，也称为“解离率(off-rate)(koff)”或“kd”)与结合速率常数(kon，也称为“结合率(kon)”或“ka”)的比值。可使用结合速率常数(kon)、解离速率常数(kdis)和平衡解离常数(KD)表示抗原结合蛋白(例如抗体)对抗原的结合亲和力。确定结合和解离速率常数的方法为本领域熟知，包括但不限于生物膜干涉技术(BLI)、放射免疫法(RIA)、平衡透析法、表面等离子共振(SPR)、荧光共振能量迁移(FRET)、免疫共沉淀(Co-IP)以及蛋白质芯片技术。如果在不同的条件(例如盐浓度、pH)下测量，则所测得的某种特定蛋白-蛋白相互作用的亲和力可不同。
在本申请中，术语“PD-L1”通常是指程序性死亡配体1蛋白、其功能变体和/或其功能片段。PD-L1也称为分化簇274(CD274)或B7同源物1(B7-H1)，并且是由(人类中)CD274基因编码的蛋白。PD-L1结合其受体，例如程序性死亡1(PD-1)，所述PD-1在活化的T细胞、B细胞和巨噬细胞中表达(Ishida et al.，1992 EMBO J，11：3887-3395；Okazaki et al.，Autoimmune dilated cardiomyopathy in PD-1 receptor-deficient mice.Science，2001；291：319-22)。PD-L1和PD-1的络合通过抑制T细胞增殖和产生细胞因子IL-2和IFN-γ发挥免疫抑制作用(Freeman et al.，Engagement of PD-1 immunoinhibitory receptorby a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyteactivation，J.Exp.Med.2000，192：1027-1034；Carter et al.，PD-1：PD-L inhibitorypathway affects both CD4(+)and CD8(+)T cells and is overcome by IL-2.Eur.J.Immunol.2002，32：634-643)。术语“PD-L1”涵盖任何脊椎动物来源的任何天然PD-L1，所述任何脊椎动物来源包括哺乳动物，诸如灵长类(例如，人)和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。所述术语涵盖“全长”、未加工的PD-L1以及由细胞中的加工所产生的任何形式的PD-L1。PD-L1可作为跨膜蛋白或作为可溶性蛋白存在。所述术语还涵盖天然存在的PD-L1的变体，例如剪接变体或等位基因变体。PD-L1的基本结构包括4个结构域：胞外Ig样V型结构域和Ig样C2型结构域、跨膜结构域以及细胞质结构域。PD-L1序列是本领域已知的。例如可在NCBI Gene ID No.29126下找到关于人PD-L1基因(包括基因组DNA序列)的信息。又例如可在NCBI Gene ID No.60533下找到关于小鼠PD-L1基因(包括基因组DNA序列)的信息。又例如可在NCBI Gene ID No.102145573下找到关于食蟹猴PD-L1基因(包括基因组DNA序列)的信息。示例性的全长人PD-L1蛋白的氨基酸序列可在NCBI登录号NP_054862或UniProt登录号Q9NZQ7下找到。示例性的全长小鼠PD-L1蛋白序列可在NCBI登录号NP_068693或Uniprot登录号Q9EP73下找到。示例性的全长食蟹猴PD-L1蛋白序列可在NCBI登录号XP_005581836或Uniprot登录号G7PSE7下找到。
在本申请中，术语“PD-1”通常是指程序性死亡1受体(也称为CD279)、其功能变体和/或其功能片段。PD-1通常在T细胞、B细胞、自然杀伤T细胞、活化的单核细胞和树突细胞(DC)上表达。PD-1可以结合其配体PD-L1和PD-L2。在PD-1的定义之内还包括与天然存在的PD-1的氨基酸序列不同但保持特异性结合PD-L1的能力的变体。在PD-1的定义之内进一步包括增强PD-L1的生物活性的变体。PD-1序列是本领域已知的。例如，示例性的全长人PD-1蛋白序列可在NCBI登录号NP_005009下找到，示例性的全长食蟹猴的PD-1蛋白序列可在NCBI登录号NP_001271065或Uniprot登录号B0LAJ3下找到。
在本申请中，术语“CD80”通常是指分化簇蛋白80(也称为B7-1)、其功能变体和/或其功能片段。CD80通常在专职抗原递呈细胞(APC)上表达。CD80能与PD-L1结合。在CD80的定义之内还包括与天然存在的CD80的氨基酸序列不同但保持特异性结合PD-L1的能力的变体。如本文使用的术语“CD80”包括人CD80(hCD80)、hCD80的变体、异构体和种属同源体、以及具有至少一种含hCD80的常见表位的类似物。例如，术语“CD80”还涵盖来自其他种属比如其它哺乳动物(例如，大鼠、小鼠、兔、非人灵长类动物、猪或牛)的CD80。完整的人CD80序列可以在Uniprot登录号P33681中找到。
在本申请中，术语“TGFBRII”通常是指一种转化生长因子B(TGFB)的受体(也称为TGFBR2)。细胞表面的TGFBR可以被转化生长因子(TGFB)结合并激活，通过SMAD通路进行信号传递，具有调节生长，抗炎和免疫调节的活性。完整的人TGFBRII序列可以在Uniprot登录号P37173中找到。
在本申请中，术语“特定抗PD-L1抗体”通常是指可以与本申请的抗体竞争结合PD-L1的抗体。本申请的抗原结合蛋白可包括与特定抗PD-L1抗体具有相同氨基酸序列的那些抗体。
在本申请中，术语“对照抗体”通常是指在本申请实施例中以提供相对其来评价实验结果的标准的PD-L1抗体。在某些情形中，对照抗体可以指本申请实施例中的阳性对照，例如PR000151、PR001598和PR002466。
在本申请中，术语“灵长类动物”通常是指猴和猿物种，并包括猴物种，诸如来自弥猴属(诸如，和具体地，食蟹猴(食蟹猴(Macaca fascicularis))和或恒河猴(恒河猴(Macaca mulatta)))和狒狒(豚尾狒狒(Papio ursinus))的猴，以及狨猴(来自狨(Callithrix)属的物种)，松鼠猴(来自松鼠猴(Saimiri)属的物种)和绢毛猴(来自柽柳猴(Saguinus)属的物种)，以及猿物种，诸如黑猩猩(黑猩猩(Pan troglodytes))，并且还包括智人。
在本申请中，术语“表位”通常是指抗原结合蛋白(如抗体)特异性结合的抗原的某个区或区域。表位通常由诸如氨基酸或碳水化合物或糖侧链分子的化学活性表面群组组成，且通常具有特异性三维结构特征以及特异性电荷特征。表位可为“线性表位”或“构型表位”。在线性表位中，蛋白质与相互作用的分子(诸如抗体)之间的所有相互作用点沿蛋白质的一级氨基酸序列线性发生。在构型表位中，相互作用点于彼此分离的蛋白质上的氨基酸上交叉发生。给定抗原结合蛋白(如抗体)结合何种表位的方法(如，表位作图(EpitopeMapping))是本领域所公知的，包括例如免疫印迹和免疫沉淀测定，例如，测试重叠或邻接的肽(例如，来自PD-L1)与给定抗原结合蛋白(如抗-PD-L1抗体)的反应性。确定表位空间构象的方法包括本领域技术和本申请所述的那些技术，例如，X射线晶体学、二维核磁共振和HDX-MS(可参见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods inMolecularBiology，Vol.66，G.E.Morris，Ed.(1996))。术语“不完全重叠”的表位通常是指在提及两种或多种抗原结合蛋白(如抗体)时，各抗体结合不完全相同或不完全重叠的氨基酸残基群，如通过给定方法所测定的。用于确定本申请所述抗原结合蛋白是否与参比抗体结合相同表位的技术包括例如表位作图方法，诸如，抗原：抗体复合物的晶体的x射线分析，其提供表位的原子分辨率，和氢/氘交换质谱法(HDX-MS)。其他方法监测抗体与抗原片段或抗原的突变变化形式的结合，其中由于抗原序列内氨基酸残基的修饰所致的结合损失经常被视为可指示表位组分(例如，丙氨酸扫描诱变-Cunningham及Wells(1985)Science 244：1081)。另外，亦可使用表位定位的计算组合方法。
在本申请中，术语“受试者”通常是指哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如奶牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类(例如人和非人灵长类，诸如猴)、兔以及啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。
在本申请中，术语“核酸分子”通常是指从其天然环境中分离的或人工合成的任何长度的分离形式的核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。
在本申请中，术语“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。
在本申请中，术语“细胞”通常是指可以或已经含有包括本申请所述的核酸分子的质粒或载体，或者能够表达本申请所述的抗体或其抗原结合片段的个体细胞、细胞系或细胞培养物。所述细胞可以包括单个宿主细胞的子代。由于天然的、意外的或故意的突变，子代细胞与原始亲本细胞在形态上或在基因组上可能不一定完全相同，但能够表达本申请所述的抗体或其抗原结合片段即可。所述细胞可以通过使用本申请所述的载体体外转染细胞而得到。所述细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌)，也可以是真核细胞(例如酵母细胞，例如COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，HeLa细胞，HEK293细胞，COS-1细胞，NS0细胞或骨髓瘤细胞)。在某些情形中，所述细胞可以是哺乳动物细胞。例如，所述哺乳动物细胞可以是CHO-K1细胞。在本申请中，术语“重组细胞”通常是指在其中引入了重组表达载体的细胞。所述重组宿主细胞不仅包括某种特定的细胞，还包括这些细胞的后代。
在本申请中，术语“药物组合物”通常是指这样的制剂，其以允许活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对将施用所述组合物的对象具有不可接受的毒性的另外的成分。所述组合物是无菌的。“无菌”组合物是灭菌的，或不含所有活的微生物及它们的孢子。
在本申请中，术语“治疗”通常是指期望改变所治疗个体的天然病程，且可为实现防治或在临床病变过程中进行的临床介入。合乎需要的治疗效果包括但不限于防止疾病发生或复发性、减轻症状、减弱疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低疾病进展速率、改善或缓解疾病状态以及缓和或改善预后。在一些情形中，抗体(例如，抗PD-L1抗体)可用来延迟疾病发展或减缓疾病进展。
在本申请中，术语“施用”通常是指向受试者(例如，患者)给予一定剂量的化合物(例如，抗癌治疗剂)或药物组合物(例如，包含抗癌治疗剂的药物组合物)的方法。施用可通过任何合适的方式进行，包括肠胃外、肺内和鼻内，以及(如果局部治疗需要)损伤内施用。胃肠外输注包括例如肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。部分地根据施用是否为短暂的或长期的，给药可通过任何适合的途径进行，例如通过注射(诸如静脉内或皮下注射)进行。本文涵盖各种给药过程，包括但不限于单次施用或各种时间点内的多次施用、推注施用和脉冲输注。
在本申请中，术语“肿瘤”通常是指所有赘生性细胞生长和增殖(无论恶性还是良性)以及所有癌前和癌性细胞和组织。在本申请中，肿瘤可以包括结肠癌。
在本申请中，术语“在……之间”通常是指某种氨基酸片段的C端与第一氨基酸片段的N端直接或间接连接，并且其N端与第二氨基酸片段的C端直接或间接连接。在轻链中，例如，所述L-FR2的N末端与所述LCDR1的C末端直接或间接相连，且所述L-FR2的C末端与所述LCDR2的N末端直接或间接相连。又例如，所述L-FR3的N末端与所述LCDR2的C末端直接或间接相连，且所述L-FR3的C末端与所述LCDR3的N末端直接或间接相连。在重链中，例如，所述H-FR2的N末端与所述HCDR1的C末端直接或间接相连，且所述H-FR2的C末端与所述HCDR2的N末端直接或间接相连。又例如，所述H-FR3的N末端与所述HCDR2的C末端直接或间接相连，且所述H-FR3的C末端与所述HCDR3的N末端直接或间接相连。在本申请中，“第一氨基酸片段”和“第二氨基酸片段”可以为相同或不同的任意一段氨基酸片段。
在本申请中，术语“包括”通常是指包含、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由......组成”的含义。
在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。
抗原结合蛋白
在一个方面，本申请提供了一种抗原结合蛋白，其包含抗体轻链可变区VL中的至少一个CDR。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含LCDR1，且所述LCDR1可包含SEQ ID NO：181所示的氨基酸序列：
RASQSIX7X8WLA(SEQ ID NO：181)；其中，X7＝F，S或Y；X8＝I或S。例如，该序列可以是根据Chothia定义规则确定的序列。
在某些情形中，与SEQ ID NO：48所示抗原结合蛋白的LCDR1相比，所述LCDR1可至少包含在选自以下位置处的氨基酸取代：在X7和/或X8处的氨基酸取代。
在某些情形中，与SEQ ID NO：48所示抗原结合蛋白的LCDR1相比，所述LCDR1可至少包含在X7和/或X8处的氨基酸取代，其中X7处的氨基酸可被取代为Y或F；X8处的氨基酸可被取代为S。
例如，所述LCDR1可包含SEQ ID NOs：48-51中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含LCDR2，且所述LCDR2可包含SEQ ID NO：182所示的氨基酸序列：
KASSLEX7(SEQ ID NO：182)；其中，X7＝T或S。例如，该序列可以是根据Chothia定义规则确定的序列。
在某些情形中，与SEQ ID NO：63所示抗原结合蛋白的LCDR2相比，所述LCDR2可至少包含在选自以下位置处的氨基酸取代：在X7处的氨基酸取代。
在某些情形中，与SEQ ID NO：63所示抗原结合蛋白的LCDR2相比，所述LCDR2可至少包含在X7处的氨基酸取代，其中X7处的氨基酸可被取代为T。
例如，所述LCDR2可包含SEQ ID NOs：63-64中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含LCDR3，且所述LCDR3可包含SEQ ID NO：183所示的氨基酸序列：
QQYX4X5X6SRT(SEQ ID NO：183)；其中，X4＝Y或H；X5＝G，T或S；X6＝Y或S。例如，该序列可以是根据Chothia定义规则确定的序列。
在某些情形中，与SEQ ID NO：77所示抗原结合蛋白的LCDR3相比，所述LCDR3可至少包含在选自以下位置处的氨基酸取代：在X4、X5和/或X6处的氨基酸取代。
在某些情形中，与SEQ ID NO：77所示抗原结合蛋白的LCDR3相比，所述LCDR3可至少包含在X4、X5和/或X6处的氨基酸取代，其中X4处的氨基酸可被取代为H；X5处的氨基酸可被取代为S或T；X6处的氨基酸可被取代为S。
例如，所述LCDR3可包含SEQ ID NOs：77-80中任一项所示的氨基酸序列。
在另一些情形中，所述LCDR3可包含SEQ ID NO：191所示的氨基酸序列：
QQYYX5X6SRT(SEQ ID NO：191)；其中，X5＝G或S；X6＝Y或S。例如，该序列可以是根据Chothia定义规则确定的序列。
在一些具体的情形中，与SEQ ID NO：77所示抗原结合蛋白的LCDR3相比，所述LCDR3可至少包含在选自以下位置处的氨基酸取代：在X5和/或X6处的氨基酸取代。
在一些具体的情形中，与SEQ ID NO：77所示抗原结合蛋白的LCDR3相比，所述LCDR3可至少包含在X5和/或X6处的氨基酸取代，其中X5处的氨基酸可被取代为S；X6处的氨基酸可被取代为S。
例如，所述LCDR3可包含SEQ ID NOs：77-79中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述的抗原结合蛋白可包含框架区L-FR1。所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端相连，且所述的L-FR1可包含SEQ ID NO：185所示的氨基酸序列：
DIQMTQSPSTLSX13SVGX17RVTX21TC(SEQ ID NO：185)；其中，X13＝T或A；X17＝D或H；X21＝I或V。例如，该序列可以是根据Chothia定义规则确定的序列。
在某些情形中，与SEQ ID NO：41所示的抗原结合蛋白的L-FR1相比，所述L-FR1可至少包含在选自以下位置处的氨基酸取代：在X13、X17和/或X21处的氨基酸取代。
在某些情形中，与SEQ ID NO：41所示的抗原结合蛋白的L-FR1相比，所述L-FR1可至少包含在X13、X17和/或X21处的氨基酸取代，其中，X13处的氨基酸可被取代为A；X17处的氨基酸可被取代为H；X21处的氨基酸可被取代为V。
例如，所述L-FR1可包含SEQ ID NOs：41-44中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含L-FR2。所述的L-FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间，且所述的L-FR2可包含SEQ ID NO：186所示的氨基酸序列：
WYQQX5PGKAPX11LLIY(SEQ ID NO：186)；其中，X5＝K或H；X11＝K，N或D。例如，该序列可以是根据Chothia定义规则确定的序列。
在某些情形中，与SEQ ID NO：56所示的抗原结合蛋白的L-FR2相比，所述L-FR2至少包含在选自以下位置处的氨基酸取代：在X5和/或X11处的氨基酸取代。
在某些情形中，与SEQ ID NO：56所示的抗原结合蛋白的L-FR2相比，所述L-FR2可至少包含在X5和/或X11处的氨基酸取代，其中，X5处的氨基酸可被取代为H；X11处的氨基酸可被取代为D或N。
例如，所述L-FR2可包含SEQ ID NOs：56-59中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含L-FR3.所述的L-FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间，且所述的L-FR3包含SEQ ID NO：187所示的氨基酸序列：
GVPSRFSGX9GSGTEFTLTISSLQPDDFX28TYX31C(SEQ ID NO：187)；其中，X9＝S或N；X28＝A或T；X31＝Y或F。例如，该序列可以是根据Chothia定义规则确定的序列。
在某些情形中，与SEQ ID NO：69所示的L-FR3相比，所述L-FR3可至少包含在选自以下位置处的氨基酸取代：在X9、X28和/或X31处的氨基酸取代。
在某些情形中，与SEQ ID NO：69所示的抗原结合蛋白的L-FR3相比，所述L-FR3可至少包含在X9、X28和/或X31处的氨基酸取代，其中，X9处的氨基酸可被取代为N；X28处的氨基酸可被取代为T；X31处的氨基酸可被取代为F。
例如，所述L-FR3可包含SEQ ID NOs：69-72中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含L-FR4，所述的L-FR4的N末端与所述LCDR3的C末端相连，且所述的L-FR4可包含SEQ ID NO：188所示的氨基酸序列：
FGQGTKVEIX10(SEQ ID NO：188)；其中，X10＝K或R。例如，该序列可以是根据Chothia定义规则确定的序列。
在某些情形中，与SEQ ID NO：85所示的抗原结合蛋白的L-FR4相比，所述L-FR4至少包含在选自以下位置处的氨基酸取代：在X10处的氨基酸取代。
在某些情形中，与SEQ ID NO：85所示的L-FR4相比，所述L-FR4可至少包含在X10处的氨基酸取代，其中，X10处的氨基酸可被取代为R。
例如，所述L-FR4可包含SEQ ID NOs：85-86中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含轻链可变区VL，且所述VL可包含SEQ IDNO：190所示的氨基酸序列：
DIQMTQSPSTLSX13SVGX17RVTX21TCRASQSIX30X31WLAWYQQX39PGKAPX45LLIYKASSLEX56GVPSRFSGX65GSGTEFTLTISSLQPDDFX84TYX87CQQYX92X93X94SRTFGQGTKVEIX107(SEQ ID NO：190)；其中，X13＝T或A；X17＝D或H；X21＝I或V；X30＝F，S或Y；X31＝I或S；X39＝K或H；X45＝K，N或D；X56＝S或T；X65＝S或N；X84＝A或T；X87＝Y或F；X92＝Y或H；X93＝G，T或S；X94＝Y或S；X107＝K或R。例如，该序列可以是根据Chothia定义规则确定的序列。
在某些情形中，与SEQ ID NO：108所示的VL相比，所述VL可至少包含在选自以下位置处的氨基酸取代：在X13、X17、X21、X30、X31、X39、X45、X56、X65、X84、X87、X92、X93、X94、X107处的氨基酸取代。
在某些情形中，与SEQ ID NO：108所示的VL相比，所述VL可至少包含在X13、X17、X21、X30、X31、X39、X45、X56、X65、X84、X87、X92、X93、X94、X107处的氨基酸取代，其中，X13处的氨基酸可被取代为A，X17处的氨基酸可被取代为H，X21处的氨基酸可被取代为V，X30处的氨基酸可被取代为S或Y，X31处的氨基酸可被取代为S，X39处的氨基酸可被取代为H，X45处的氨基酸可被取代为N或D，X56处的氨基酸可被取代为T，X65处的氨基酸可被取代为N，X84处的氨基酸可被取代为T，X87处的氨基酸可被取代为F，X92处的氨基酸可被取代为H，X93处的氨基酸可被取代为T或S，X94处的氨基酸可被取代为S，X107处的氨基酸可被取代为R。
例如，所述VL区可包含SEQ ID NOs：108-116和118中任一项所示的氨基酸序列。
在某些情形中，本申请所述VL可包含SEQ ID NO：194所示的氨基酸序列：
DIQMTQSPSTLSX13SVGX17RVTX21TCRASQSIX30X31WLAWYQQX39PGKAPX45LLIYKASSLEX56GVPSRFSGX65GSGTEFTLTISSLQPDDFX84TYX87CQQYYX93X94SRTFGQGTKVEIX107(SEQ ID NO：194)；其中，X13＝T或A；X17＝D或H；X21＝I或V；X30＝F，S或Y；X31＝I或S；X39＝K或H；X45＝K，N或D；X56＝S或T；X65＝S或N；X84＝A或T；X87＝Y或F；X93＝G或S；X94＝Y或S；X107＝K或R。例如，该序列可以是根据Chothia定义规则确定的序列。
在某些情形中，与SEQ ID NO：108所示的VL相比，所述VL可至少包含在选自以下位置处的氨基酸取代：在X13、X17、X21、X30、X31、X39、X45、X56、X65、X84、X87、X93、X94、X107处的氨基酸取代。
在某些情形中，与SEQ ID NO：108所示的VL相比，所述VL可至少包含在X13、X17、X21、X30、X31、X39、X45、X56、X65、X84、X87、X93、X94、X107处的氨基酸取代，其中，X13处的氨基酸可被取代为A，X17处的氨基酸可被取代为H，X21处的氨基酸可被取代为V，X30处的氨基酸可被取代为S或Y，X31处的氨基酸可被取代为S，X39处的氨基酸可被取代为H，X45处的氨基酸可被取代为N或D，X56处的氨基酸可被取代为T，X65处的氨基酸可被取代为N，X84处的氨基酸可被取代为T，X87处的氨基酸可被取代为F，X93处的氨基酸可被取代为S，X94处的氨基酸可被取代为S，X107处的氨基酸可被取代为R。
例如，所述VL区可包含SEQ ID NOs：108-114、116和118中任一项所示的氨基酸序列。
本申请所述抗原结合蛋白可包含轻链恒定区CL，且所述抗体轻链恒定区可包括人Igκ恒定区。例如，所述CL区可包含下述所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：170。
本申请所述抗原结合蛋白可包含抗体轻链LC，所述抗体轻链可包含SEQ ID NOs：150-158和160-163中任一项所示的氨基酸序列。或者，本申请所述的抗原结合蛋白的抗体轻链可包含SEQ ID NO：150-156、158和160-163中任一项所示的氨基酸序列。
本申请所述的抗原结合蛋白可包含抗体重链可变区VH中的至少一个CDR。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含HCDR1，且所述HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列：
GFTFSSY(SEQ ID NO：5)。例如，该序列可以是根据Chothia定义规则确定的序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含HCDR2，且所述HCDR2可包含SEQ ID NO：179所示的氨基酸序列：
KQX3X4SE(SEQ ID NO：179)；其中，X3＝D或E；X4＝G或A。例如，该序列可以是根据Chothia定义规则确定的序列。
在某些情形中，与SEQ ID NO：14所示抗原结合蛋白的HCDR2相比，所述HCDR2可至少包含在选自以下位置处的氨基酸取代：在X3和/或X4处的氨基酸取代。
在某些情形中，与SEQ ID NO：14所示抗原结合蛋白的HCDR2相比，所述HCDR2可至少包含在X3和/或X4处的氨基酸取代，其中，X3处的氨基酸可被取代为E，X4处的氨基酸可被取代为A。
例如，所述HCDR2可包含SEQ ID NOs：14、16和17中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含HCDR3，且所述HCDR3可包含SEQ ID NO：180所示的氨基酸序列：
DRX3VAGAX8X9X10(SEQ ID NO：180)；其中，X3＝A或P；X8＝F或S；X9＝D或A；X10＝I或F。例如，该序列可以是根据Chothia定义规则确定的序列。
在某些情形中，与SEQ ID NO：29所示抗原结合蛋白的HCDR3相比，所述HCDR3可至少包含在选自以下位置处的氨基酸取代：在X3、X8、X9和/或X10处的氨基酸取代。
在某些情形中，与SEQ ID NO：29所示抗原结合蛋白的HCDR3相比，所述HCDR3可至少包含在X3、X8、X9和/或X10处的氨基酸取代，其中X3处的氨基酸可被取代为P；X8处的氨基酸可被取代为S；X9处的氨基酸可被取代为A；X10处的氨基酸可被取代为F。
例如，所述HCDR3可包含SEQ ID NOs：29-33中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含框架区H-FR1。所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端相连，且所述的H-FR1可包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO：1)。例如，该序列可以是根据Chothia定义规则确定的序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含H-FR2，所述的H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，且所述的H-FR2可包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列：
WMSWVRQAPGKGLEWVANI(SEQ ID NO：9)。例如，该序列可以是根据Chothia定义规则确定的序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含H-FR3，所述的H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，且所述的H-FR3可包含SEQ ID NO：184所示的氨基酸序列：
KYYX4DSVKGRFTISRDNAKNSX22YLQMNSLRAEX33TAVX37YCAR(SEQ ID NO：184)；其中，X4＝V或G；X22＝L或Q；X33＝D或E；X37＝Y或F。例如，该序列可以是根据Chothia定义规则确定的序列。
在某些情形中，与SEQ ID NO：21所示的H-FR3相比，所述H-FR3可至少包含在选自以下位置处的氨基酸取代：在X4、X22、X33和/或X37处的氨基酸取代。
在某些情形中，与SEQ ID NO：21所示的抗体的H-FR3相比，所述H-FR3可至少包含在X4、X22、X33和/或X37处的氨基酸取代，其中，X4处的氨基酸可被取代为G；X22处的氨基酸可被取代为Q；X33处的氨基酸可被取代为E；X37处的氨基酸可被取代为F。
例如，所述H-FR3可包含SEQ ID NOs：21-24中任一项所示的氨基酸序列。
或者，本申请所述的H-FR3可包含SEQ ID NO：192所示的氨基酸序列：
KYYX4DSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEX33TAVX37YCAR(SEQ ID NO：192)；其中，X4＝V或G；X33＝D或E；X37＝Y或F。例如，该序列可以是根据Chothia定义规则确定的序列。
在某些情形中，与SEQ ID NO：21所示的H-FR3相比，所述H-FR3可至少包含在选自以下位置处的氨基酸取代：在X4、X33和/或X37处的氨基酸取代。
在某些情形中，与SEQ ID NO：21所示的抗体的H-FR3相比，所述H-FR3可至少包含在X4、X33和/或X37处的氨基酸取代，其中，X4处的氨基酸可被取代为G；X33处的氨基酸可被取代为E；X37处的氨基酸可被取代为F。
例如，所述H-FR3可包含SEQ ID NOs：21-22和24中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含H-FR4，所述的H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端相连，且所述的H-FR4可包含SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列：
WGQGTMVTVSS(SEQ ID NO：38)。例如，该序列可以是根据Chothia定义规则确定的序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含重链可变区VH，且所述VH可包含SEQ IDNO：189所示的氨基酸序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQX54X55SEKYYX61DSVKGRFTISRDNAKNSX79YLQMNSLRAEX90TAVX94YCARDRX101VAGAX106X107X108WGQGTMVTVSS(SEQ IDNO：189)；其中，X54＝D或E；X55＝G或A；X61＝V或G；X79＝L或Q；X90＝D或E，X94＝Y或F；X101＝A或P；X106＝F或S；X107＝D或A；X108＝I或F。例如，该序列可以是根据Chothia定义规则确定的序列。
在某些情形中，与SEQ ID NO：90所示的VH相比，所述VH可至少包含在选自以下位置处的氨基酸取代：在X54、X55、X61、X79、X90、X94、X101、X106、X107和/或X108处的氨基酸取代。
在某些情形中，与SEQ ID NO：90所示的VH相比，所述VH可至少包含在X54、X55、X61、X79、X90、X94、X101、X106、X107和/或X108处的氨基酸取代，其中，X54处的氨基酸可被取代为E，X55处的氨基酸可被取代为A，X61处的氨基酸可被取代为G，X79处的氨基酸可被取代为Q，X90处的氨基酸可被取代为E，X94处的氨基酸可被取代为F，X101处的氨基酸可被取代为P，X106处的氨基酸可被取代为S，X107处的氨基酸可被取代为A，X108处的氨基酸可被取代为F。
例如，所述VH区可包含SEQ ID NOs：90-95和97-104中任一项所示的氨基酸序列。
在某些情形中，本申请所述VH可包含SEQ ID NO：193所示的氨基酸序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQX54X55SEKYYX61DSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEX90TAVX94YCARDRX101VAGAX106X107X108WGQGTMVTVSS(SEQ ID NO：193)；其中，X54＝D或E；X55＝G或A；X61＝V或G；X90＝D或E，X94＝Y或F；X101＝A或P；X106＝F或S；X107＝D或A；X108＝I或F。例如，该序列可以是根据Chothia定义规则确定的序列。
在某些情形中，与SEQ ID NO：90所示的VH相比，所述VH可至少包含在选自以下位置处的氨基酸取代：在X54、X55、X61、X90、X94、X101、X106、X107和/或X108处的氨基酸取代。
在某些情形中，与SEQ ID NO：90所示的VH相比，所述VH可至少包含在X54、X55、X61、X90、X94、X101、X106、X107和/或X108处的氨基酸取代，其中，X54处的氨基酸可被取代为E，X55处的氨基酸可被取代为A，X61处的氨基酸可被取代为G，X90处的氨基酸可被取代为E，X94处的氨基酸可被取代为F，X101处的氨基酸可被取代为P，X106处的氨基酸可被取代为S，X107处的氨基酸可被取代为A，X108处的氨基酸可被取代为F。
例如，所述VH区可包含SEQ ID NOs：90-93、95和97-104中任一项所示的氨基酸序列。
本申请所述抗原结合蛋白可包含重链恒定区CH，且所述抗体重链恒定区可以包含人IgG恒定区。在某些情形中，所述人IgG恒定区可包含人IgG1恒定区。所述人IgG1恒定区可包括天然和人工合成的IgG1恒定区或其突变体。所述突变可包含以下一个或多个位置的突变：L234，L235，N297或K447。例如，可包含一个、两个或更多位置处的突变。突变可包括氨基酸的缺失、插入或置换。例如，所述人IgG1恒定区可包括的突变如下：1)N297A，2)K447缺失，3)N297A和K447缺失，4)L234A，L235A和K447缺失。例如，所述融合蛋白的人IgG1恒定区可包含SEQ ID NOs：172-175中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含LCDR1-3。其中，所述LCDR1可包含SEQ ID NO：181所示的氨基酸序列；所述LCDR2可包含SEQ ID NO：182所示的氨基酸序列；且所述LCDR3可包含SEQ ID NO：183所示的氨基酸序列。或者，本申请所述的抗原结合蛋白的LCDR1可包含SEQ ID NO：181所示的氨基酸序列；所述LCDR2可包含SEQ ID NO：182所示的氨基酸序列；且所述LCDR3可包含SEQ ID NO：191所示的氨基酸序列。
在某些情形中，本申请所述抗原结合蛋白的所述LCDR1可包含下述任一项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：48-51；所述LCDR2可包含下述任一项中所示的氨基酸序列：SEQID NO：63-64；且所述LCDR3可包含下述任一项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：77-80。在另一些情形中，本申请所述抗原结合蛋白的所述LCDR1可包含下述任一项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：48-51；所述LCDR2可包含下述任一项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：63-64；且所述LCDR3可包含下述任一项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：77-79。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000064相同的LCDR1-3。其中LCDR1可包含SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列，且LCDR3可包含SEQ ID NO：77所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000065相同的LCDR1-3，其中LCDR1可包含SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列，LCDR3可包含SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000066、PR000261、PR000262相同的LCDR1-3。其中LCDR1可包含SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列，且LCDR3可包含SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000067相同的LCDR1-3，其中LCDR1可包含SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列，LCDR3可包含SEQ ID NO：77所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000068相同的LCDR1-3。其中LCDR1可包含SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列，且LCDR3可包含SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000069、PR000263、PR000264相同的LCDR1-3，其中LCDR1可包含SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列，LCDR3可包含SEQ ID NO：77所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000070、PR000265、PR000266相同的LCDR1-3。其中LCDR1可包含SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列，且LCDR3可包含SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000071相同的LCDR1-3，其中LCDR1可包含SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列，LCDR3可包含SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000072、PR000267、PR000268相同的LCDR1-3。其中LCDR1可包含SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列，LCDR3可包含SEQ ID NO：77所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含L-FR1-4。其中，所述L-FR1可包含SEQ ID NO：185所示的氨基酸序列；所述L-FR2可包含SEQ ID NO：186所示的氨基酸序列；所述L-FR3可包含SEQ ID NO：187所示的氨基酸序列；且所述L-FR4可包含SEQ ID NO：188所示的氨基酸序列。
在某些情形中，本申请所述抗原结合蛋白的所述L-FR1可包含下述任一项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：41-44；所述L-FR2可包含下述任一项中所示的氨基酸序列：SEQID NO：56-59；所述L-FR3可包含下述任一项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：69-72；且所述L-FR4可包含下述任一项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：85-86。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000064相同的L-FR1-4。其中L-FR1可包含SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列，L-FR2可包含SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列，L-FR3可包含SEQ ID NO：69所示的氨基酸序列，且L-FR4可包含SEQ ID NO：85所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000065相同的L-FR1-4。其中L-FR1可包含SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列，L-FR2可包含SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列，L-FR3可包含SEQ ID NO：69所示的氨基酸序列，且L-FR4可包含SEQ ID NO：85所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000066相同的L-FR1-4。其中L-FR1可包含SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列，L-FR2可包含SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列，L-FR3可包含SEQ ID NO：70所示的氨基酸序列，且L-FR4可包含SEQ ID NO：85所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000067相同的L-FR1-4。其中L-FR1可包含SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列，L-FR2可包含SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列，L-FR3可包含SEQ ID NO：69所示的氨基酸序列，且L-FR4可包含SEQ ID NO：85所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000068相同的L-FR1-4。其中L-FR1可包含SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列，L-FR2可包含SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列，L-FR3可包含SEQ ID NO：71所示的氨基酸序列，且L-FR4可包含SEQ ID NO：85所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000071相同的L-FR1-4。其中L-FR1可包含SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列，L-FR2可包含SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列，L-FR3可包含SEQ ID NO：69所示的氨基酸序列，且L-FR4可包含SEQ ID NO：85所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000069、PR000263、PR000264相同的L-FR1-4。其中L-FR1可包含SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列，L-FR2可包含SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列，L-FR3可包含SEQ ID NO：72所示的氨基酸序列，且L-FR4可包含SEQ IDNO：86所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000070、PR000265、PR000266相同的L-FR1-4。其中L-FR1可包含SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列，L-FR2可包含SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列，L-FR3可包含SEQ ID NO：69所示的氨基酸序列，且L-FR4可包含SEQ IDNO：85所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000072、PR000267、PR000268相同的L-FR1-4。其中L-FR1可包含SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列，L-FR2可包含SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列，L-FR3可包含SEQ ID NO：69所示的氨基酸序列，且L-FR4可包含SEQ IDNO：85所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000261、PR000262相同的L-FR1-4。其中L-FR1可包含SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列，L-FR2可包含SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列，L-FR3可包含SEQ ID NO：69所示的氨基酸序列，且L-FR4可包含SEQ ID NO：85所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含HCDR1-3。其中，所述HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO：179所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO：180所示的氨基酸序列。
在某些情形中，本申请所述抗原结合蛋白的所述HCDR1可包含下述所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：5；所述HCDR2可包含下述任一项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：14、16和17；且所述HCDR3可包含下述任一项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：29-33。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000064、PR000065、PR000067、PR000070相同的HCDR1-3。其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000066相同的HCDR1-3。其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000068相同的HCDR1-3。其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000069相同的HCDR1-3。其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000071、PR000072相同的HCDR1-3。其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000261相同的HCDR1-3。其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000262同的HCDR1-3。其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000263相同的HCDR1-3。其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000264同的HCDR1-3。其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000265相同的HCDR1-3。其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000266相同的HCDR1-3。其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000267相同的HCDR1-3。其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000268相同的HCDR1-3。其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含H-FR1-4。其中，所述H-FR1可包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO：184所示的氨基酸序列；且所述H-FR4可包含SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列。或者，所述H-FR1可包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQID NO：9所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO：192所示的氨基酸序列；且所述H-FR4可包含SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列。
在某些情形中，本申请所述抗原结合蛋白的所述H-FR1可包含下述所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：1；所述H-FR2可包含下述所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：9；所述H-FR3可包含下述任一项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：21-24；且所述H-FR4可包含下述任一项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：38。在另一些情形中，本申请所述抗原结合蛋白的所述H-FR1可包含下述所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：1；所述H-FR2可包含下述所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：9；所述H-FR3可包含下述任一项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：21-22和24；且所述H-FR4可包含下述任一项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：38。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含H-FR1-4，其中所述H-FR1可包含SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列，所述H-FR2可包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，所述H-FR3可包含SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列，且所述H-FR4可包含SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含H-FR1-4，其中所述H-FR1可包含SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列，所述H-FR2可包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，所述H-FR3可包含SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列，且所述H-FR4可包含SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含H-FR1-4，其中所述H-FR1可包含SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列，所述H-FR2可包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，所述H-FR3可包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列，且所述H-FR4可包含SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含H-FR1-4，其中所述H-FR1可包含SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列，所述H-FR2可包含SEQ ID NO 9所示的氨基酸序列，所述H-FR3可包含SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列，且所述H-FR4可包含SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含LCDR1-3和HCDR1-3。其中，所述LCDR1可包含SEQ ID NO：181所示的氨基酸序列；所述LCDR2可包含SEQ ID NO：182所示的氨基酸序列；且所述LCDR3可包含SEQ ID NO 183所示的氨基酸序列；所述HCDR1可包含SEQ IDNO：5所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO：179所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO：180所示的氨基酸序列。或者，所述LCDR1可包含SEQ ID NO：181所示的氨基酸序列；所述LCDR2可包含SEQ ID NO：182所示的氨基酸序列；且所述LCDR3可包含SEQ IDNO：191所示的氨基酸序列；所述HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO：179所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO：180所示的氨基酸序列。
在某些情形中，本申请所述抗原结合蛋白的所述LCDR1可包含下述任一项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NOs：48-51；所述LCDR2可包含下述任一项中所示的氨基酸序列：SEQID NOs：63-64；且所述LCDR3可包含下述任一项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NOs：77-80；所述HCDR1可包含下述所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：5；所述HCDR2可包含下述任一项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NOs：14、16和17；且所述HCDR3可包含下述任一项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NOs：29-33。在另一些情形中，本申请所述抗原结合蛋白的所述LCDR1可包含下述任一项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NOs：48-51；所述LCDR2可包含下述任一项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NOs：63-64；且所述LCDR3可包含下述任一项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NOs：77-79；所述HCDR1可包含下述所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：5；所述HCDR2可包含下述任一项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NOs：14、16和17；且所述HCDR3可包含下述任一项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NOs：29-33。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000064相同的LCDR1-3和HCDR1-3。其中LCDR1可包含SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列，且LCDR3可包含SEQ ID NO：77所示的氨基酸序列，其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，且HCDR3可包含SEQ IDNO：29所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000065相同的LCDR1-3和HCDR1-3。其中LCDR1可包含SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列，LCDR3可包含SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列，其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000066相同的LCDR1-3和HCDR1-3。其中LCDR1可包含SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列，且LCDR3可包含SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列，其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，且HCDR3可包含SEQ IDNO：30所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000067相同的LCDR1-3和HCDR1-3。其中LCDR1可包含SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列；LCDR2可包含SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列；LCDR3可包含SEQ ID NO：77所示的氨基酸序列，其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000068相同的LCDR1-3和HCDR1-3。其中LCDR1可包含SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列，且LCDR3可包含SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列，其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，且HCDR3可包含SEQ IDNO：31所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000069相同的LCDR1-3和HCDR1-3。其中LCDR1可包含SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列；LCDR2可包含SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列；LCDR3可包含SEQ ID NO：77所示的氨基酸序列，其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000070相同的LCDR1-3和HCDR1-3。其中LCDR1可包含SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列，且LCDR3可包含SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列，其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，且HCDR3可包含SEQ IDNO：29所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000071相同的LCDR1-3和HCDR1-3。其中LCDR1可包含SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列，且LCDR3可包含SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列，其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，且HCDR3可包含SEQ IDNO：33所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000072相同的LCDR1-3和HCDR1-3。其中LCDR1可包含SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列，LCDR3可包含SEQ ID NO：77所示的氨基酸序列，其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO33所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000261相同的LCDR1-3和HCDR1-3。其中LCDR1可包含SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列，且LCDR3可包含SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列，其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，且HCDR3可包含SEQ IDNO：30所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000262相同的LCDR1-3和HCDR1-3。其中LCDR1可包含SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列，且LCDR3可包含SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列，其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列，且HCDR3可包含SEQ IDNO：30所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000263相同的LCDR1-3和HCDR1-3。其中LCDR1可包含SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列，LCDR3可包含SEQ ID NO：77所示的氨基酸序列，其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000264相同的LCDR1-3和HCDR1-3。其中LCDR1可包含SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列，LCDR3可包含SEQ ID NO：77所示的氨基酸序列，其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000265和PR000416相同的LCDR1-3和HCDR1-3。其中LCDR1可包含SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列，且LCDR3可包含SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列，其中HCDR1可包含SEQID NO：5所示的氨基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000266相同的LCDR1-3和HCDR1-3。其中LCDR1可包含SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列，且LCDR3可包含SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列，其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列，且HCDR3可包含SEQ IDNO：29所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000267相同的LCDR1-3和HCDR1-3。其中LCDR1可包含SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列，LCDR3可包含SEQ ID NO：77所示的氨基酸序列，其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000268相同的LCDR1-3和HCDR1-3。其中LCDR1可包含SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列，LCDR3可包含SEQ ID NO：77所示的氨基酸序列，其中HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列，且HCDR3可包含SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含轻链可变区VL和重链可变区VH。所述VL可包含SEQ ID NO：194所示的氨基酸序列，且所述VH可包含SEQ ID NO：193所示的氨基酸序列。或者，所述VL可包含SEQ ID NO：190所示的氨基酸序列，且所述VH可包含SEQ ID NO：189所示的氨基酸序列。
在某些情形中，所述抗原结合蛋白的所述VL可包含SEQ ID NOs：108-116和118中任一项所示的氨基酸序列，且所述VH可包含SEQ ID NOs：90-95、97-104中任一项所示的氨基酸序列。在另一些情形中，所述抗原结合蛋白的所述VL可包含SEQ ID NOs：108-114、116和118中任一项所示的氨基酸序列，且所述VH可包含SEQ ID NOs：90-93、95和97-104中任一项所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000064相同的VL和VH，其中，所述VL可包含SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列，且所述VH可包含SEQ ID NO：90所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000065相同的VL和VH，其中，所述VL可包含SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列，且所述VH可包含SEQ ID NO：90所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000066相同的VL和VH，其中，所述VL可包含SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列，且所述VH可包含SEQ ID NO：91所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000067相同的VL和VH，其中，所述VL可包含SEQ ID NO：111所示的氨基酸序列，且所述VH可包含SEQ ID NO：90所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000068相同的VL和VH，其中，所述VL可包含SEQ ID NO：112所示的氨基酸序列，且所述VH可包含SEQ ID NO：92所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000069相同的VL和VH，其中，所述VL可包含SEQ ID NO：113所示的氨基酸序列，且所述VH可包含SEQ ID NO：93所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000070相同的VL和VH，其中，所述VL可包含SEQ ID NO：114所示的氨基酸序列，且所述VH可包含SEQ ID NO：90所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000071相同的VL和VH，其中，所述VL可包含SEQ ID NO：115所示的氨基酸序列，且所述VH可包含SEQ ID NO：94所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000072相同的VL和VH，其中，所述VL可包含SEQ ID NO：116所示的氨基酸序列，且所述VH可包含SEQ ID NO：95所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000261相同的VL和VH，其中，所述VL可包含SEQ ID NO：118所示的氨基酸序列，且所述VH可包含SEQ ID NO：97所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000262相同的VL和VH，其中，所述VL可包含SEQ ID NO：118所示的氨基酸序列，且所述VH可包含SEQ ID NO：98所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000263相同的VL和VH，其中，所述VL可包含SEQ ID NO：113所示的氨基酸序列，且所述VH可包含SEQ ID NO：99所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000264相同的VL和VH，其中，所述VL可包含SEQ ID NO：113所示的氨基酸序列，且所述VH可包含SEQ ID NO：100所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000265或PR000416相同的VL和VH，其中，所述VL可包含SEQ ID NO：114所示的氨基酸序列，且所述VH可包含SEQ ID NO：101所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000266相同的VL和VH，其中，所述VL可包含SEQ ID NO：114所示的氨基酸序列，且所述VH可包含SEQ ID NO：102所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000267相同的VL和VH，其中，所述VL可包含SEQ ID NO：116所示的氨基酸序列，且所述VH可包含SEQ ID NO：103所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000268相同的VL和VH，其中，所述VL可包含SEQ ID NO：116所示的氨基酸序列，且所述VH可包含SEQ ID NO：104所示的氨基酸序列。
在某些情形中，所述抗原结合蛋白可包含轻链恒定区和重链恒定区，其中，所述轻链恒定区可包含SEQ ID NO：170所示的氨基酸序列，且所述重链恒定区可包含SEQ ID NOs：172-175中任一项所示的氨基酸序列。
在某些情形中，所述抗原结合蛋白可包含抗体轻链LC和抗体重链HC，其中，所述抗体轻链LC可包含下述任一项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：150-158和160-163，且所述抗体重链HC可包含下述任一项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：122-127和129-137。
在某些情形中，所述抗原结合蛋白可包含抗体轻链LC和抗体重链HC，其中，所述抗体轻链LC可包含下述任一项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：150-156、158和160-163，且所述抗体重链HC可包含下述任一项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：122-125、127和129-137。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000064相同的LC和HC，其中，所述LC可包含SEQ ID NO：150所示的氨基酸序列，且所述HC可包含SEQ ID NO：122所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000065相同的LC和HC，其中，所述LC可包含SEQ ID NO：151所示的氨基酸序列，且所述HC可包含SEQ ID NO：122所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000066相同的LC和HC，其中，所述LC可包含SEQ ID NO：152所示的氨基酸序列，且所述HC可包含SEQ ID NO：123所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000067相同的LC和HC，其中，所述LC可包含SEQ ID NO：153所示的氨基酸序列，且所述HC可包含SEQ ID NO：122所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000068相同的LC和HC，其中，所述LC可包含SEQ ID NO：154所示的氨基酸序列，且所述HC可包含SEQ ID NO：124所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000069相同的LC和HC，其中，所述LC可包含SEQ ID NO：155所示的氨基酸序列，且所述HC可包含SEQ ID NO：125所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000070相同的LC和HC，其中，所述LC可包含SEQ ID NO：156所示的氨基酸序列，且所述HC可包含SEQ ID NO：122所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000071相同的LC和HC，其中，所述LC可包含SEQ ID NO：157所示的氨基酸序列，且所述HC可包含SEQ ID NO：126所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000072相同的LC和HC，其中，所述LC可包含SEQ ID NO：158所示的氨基酸序列，且所述HC可包含SEQ ID NO：127所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000261相同的LC和HC，其中，所述LC可包含SEQ ID NO：160所示的氨基酸序列，且所述HC可包含SEQ ID NO：129所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000262相同的LC和HC，其中，所述LC可包含SEQ ID NO：160所示的氨基酸序列，且所述HC可包含SEQ ID NO：130所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000263相同的LC和HC，其中，所述LC可包含SEQ ID NO：161所示的氨基酸序列，且所述HC可包含SEQ ID NO：131所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000264相同的LC和HC，其中，所述LC可包含SEQ ID NO：161所示的氨基酸序列，且所述HC可包含SEQ ID NO：132所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000265相同的LC和HC，其中，所述LC可包含SEQ ID NO：162所示的氨基酸序列，且所述HC可包含SEQ ID NO：133所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000266相同的LC和HC，其中，所述LC可包含SEQ ID NO：162所示的氨基酸序列，且所述HC可包含SEQ ID NO：134所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000267相同的LC和HC，其中，所述LC可包含SEQ ID NO：163所示的氨基酸序列，且所述HC可包含SEQ ID NO：135所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000268相同的LC和HC，其中，所述LC可包含SEQ ID NO：163所示的氨基酸序列，且所述HC可包含SEQ ID NO：136所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可包含与PR000416相同的LC和HC，其中，所述LC可包含SEQ ID NO：162所示的氨基酸序列，且所述HC可包含SEQ ID NO：137所示的氨基酸序列。
特定抗PD-L1抗体
本申请所述的分离的抗原结合蛋白，其可与特定抗PD-L1抗体竞争结合PD-L1。在本申请中，所述特定抗PD-L1抗体可包含LCDR1-3。其中，所述LCDR1可包含SEQ ID NO：181所示的氨基酸序列；所述LCDR2可包含SEQ ID NO：182所示的氨基酸序列；且所述LCDR3可包含SEQ ID NO：191所示的氨基酸序列。在某些情形中，本申请所述特定抗PD-L1抗体的所述LCDR1可包含下述任一项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NOs：48-51；所述LCDR2可包含下述任一项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NOs：63-64；且所述LCDR3可包含下述任一项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NOs：77-79。
在本申请中，所述特定抗PD-L1抗体可包含HCDR1-3。其中，所述HCDR1可包含SEQID NO：5所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO：179所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO：180所示的氨基酸序列。在某些情形中，本申请所述特定抗PD-L1抗体的所述HCDR1可包含下述所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：5；所述HCDR2可包含下述任一项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NOs：14、16和17；且所述HCDR3可包含下述任一项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NOs：29-33。
在本申请中，所述特定抗PD-L1抗体可包含LCDR1-3和HCDR1-3。其中，所述LCDR1可包含SEQ ID NO：181所示的氨基酸序列；所述LCDR2可包含SEQ ID NO：182所示的氨基酸序列；且所述LCDR3可包含SEQ ID NO：191所示的氨基酸序列；所述HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO：179所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO：180所示的氨基酸序列。在某些情形中，本申请所述特定抗PD-L1抗体的所述LCDR1可包含下述任一项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NOs：48-51；所述LCDR2可包含下述任一项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NOs：63-64；且所述LCDR3可包含下述任一项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NOs：77-79；所述HCDR1可包含下述所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：5；所述HCDR2可包含下述任一项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NOs：14、16和17；且所述HCDR3可包含下述任一项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NOs：29-33。
在本申请中，所述特定抗PD-L1抗体可包含轻链可变区VL和重链可变区VH。所述VL可包含SEQ ID NO：194所示的氨基酸序列，且所述VH可包含SEQ ID NO：193所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述特定抗PD-L1抗体的所述VL可包含SEQ ID NOs：108-114、116和118中任一项所示的氨基酸序列，且所述VH可包含SEQ ID NOs：90-93、95、97-104中任一项所示的氨基酸序列。
检测方法
可通过本领域已知的各种测定鉴别、筛选或表征本申请所述的PD-L1抗原结合蛋白或融合蛋白的物理/化学特性和/或生物活性。
在一个方面，例如可通过已知方法诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫印迹(例如，蛋白质印迹)、流式细胞术(例如，FACS)、免疫组织化学、免疫荧光等来测试本申请抗原结合蛋白或融合蛋白的抗原结合活性。
本申请中，所述的分离的抗原结合蛋白能够以1×10-8M或更低的KD值结合源自灵长类动物的PD-L1。所述灵长类动物PD-L1抗原结合蛋白对PD-L1的结合亲和力可通过本领域已知的任何方法测定。在某些情形中，结合亲和力可通过表面等离子共振法(SPR)、酶联免疫法(ELISA)、结合抗原沉淀法、平衡透析法、生物膜干涉(BLI)测定。在某些情形中，PD-L1抗原结合蛋白对PD-L1的结合亲和力和KD值可通过生物膜干涉(BLI)测定。例如，可使用ForteBio Octet分子相互作用分析仪，来进行抗原抗体之间的结合动力学分析。
本申请中，所述分离的抗原结合蛋白能够以1×10-8M或更低的KD值结合源自灵长类动物的PD-L1。例如，所述KD的值可以以约1×10-8M或以下、约9×10-9M或以下、约8×10-9M或以下、约7×10-9M或以下、约6×10-9M或以下、约5×10-9M或以下、约4×10-9M或以下、约3×10-9M或以下、约2×10-9M或以下、约1×10-9M或以下的值结合源自人的PD-L1，例如，使用使用FortieBio Octet分子相互作用分析仪所检测的。
在另一情形中，本申请所述PD-L1抗原结合蛋白与PD-L1的结合活性可使用流式细胞术或酶联免疫法测定进行检测。例如，在FACS检测中，使用稳定表达人PD-L1的宿主细胞(如CHOK1细胞)，所述PD-L1抗原结合蛋白与PD-L1的EC50值在约0.0001nM至约100nM之间，例如，约0.001nM至约10nM之间，约0.01nM至约10nM之间，约0.05nM至约5nM之间，约0.05nM至约1nM之间。又例如，在ELISA中，使用人PD-L1抗原蛋白，所述PD-L1抗原结合蛋白与PD-L1的EC50值在约0.0001nM至约100nM之间，例如，约0.001nM至约10nM之间，约0.001nM至约5nM之间，约0.001nM至约1nM之间，约0.01nM至约0.5nM之间，约0.01nM至约0.1nM之间。
在另一个方面，竞争测定可用来鉴别与本申请所述的任一种抗原结合蛋白竞争结合到PD-L1的抗体。在某些情形中，这种竞争性抗体结合到与由本申请所述的任一种抗原结合蛋白所结合的重叠表位(例如，线性或构象表位)。用于对抗原结合蛋白所结合到的表位进行作图的示例性方法包括但不限于X射线共晶体和低温电子显微镜法(cryo-EM)、基于阵列的寡肽扫描法、定点诱变作图、交联耦合质谱法和生物膜干涉法。
在另一个方面，本申请所述的抗原结合蛋白能够阻断PD-1与PD-L1的结合。在某些情形中，所述的抗原结合蛋白阻断PD-1与PD-L1的结合可通过流式细胞技术FACS、酶联免疫法ELISA测定。例如，首先将稳定表达PD-L1的宿主细胞(如CHOK1细胞)与递减量的未标记的所述抗原结合蛋白孵育，随后用生物素标记的PD-1蛋白孵育。然后，使用FACS分析细胞，以证实所述抗原结合蛋白阻断PD-1与PD-L1结合。又例如，首先将PD-L1抗原蛋白包被在板上，将递减量的未标记的所述抗原结合蛋白和生物素标记的PD-1蛋白混合后，共同孵育。然后，使用ELISA分析细胞，以证实所述抗原结合蛋白可以阻断PD-1和PD-L1的结合。
在另一个方面，本申请所述的抗原结合蛋白能够阻断CD80与PD-L1的结合。在某些情形中，所述的抗原结合蛋白阻断CD80与PD-L1的结合可通过流式细胞技术FACS、酶联免疫法ELISA测定。例如，首先将稳定表达PD-L1的宿主细胞(如CHOK1细胞)与递减量的未标记的所述抗原结合蛋白孵育，随后用生物素标记的CD80蛋白孵育。然后，使用FACS分析细胞，以证实所述抗原结合蛋白阻断CD80与PD-L1结合。又例如，首先将PD-L1抗原蛋白包被在板上，将递减量的未标记的所述抗原结合蛋白和生物素标记的CD80蛋白混合后，共同孵育。然后，使用ELISA分析细胞，以证实所述抗原结合蛋白可以阻断CD80和PD-L1的结合。
本申请所述抗原结合蛋白能够刺激免疫细胞中IFN-γ和/或IL2的分泌。所述免疫细胞可包括淋巴细胞，例如B细胞、T细胞，天然杀伤细胞，髓样细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、嗜碱细胞和粒细胞。可用本领域任何技术人员已知的方法测定免疫细胞中细胞因子的分泌，例如，通过酶联免疫法(ELISA)定量测定免疫细胞(例如T细胞)增殖情况或由免疫细胞产生的细胞因子(例如由T细胞产生的IFN-γ或IL-2)。
对照抗体
本申请所述抗原结合蛋白与对照抗体相比，能够结合与源自灵长类动物的PD-L1的不完全重叠的表位。在某些情形中，所述对照抗体可以是抗PD-L1抗体avelumab(阿维鲁单抗)，即，本申请所述抗体PR001598。PR001598可包含轻链可变区和重链可变区，所述对照抗体的轻链可变区可包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO：66所示的氨基酸序列，所述LCDR3包含SEQ ID NO：82所示的氨基酸序列；所述对照抗体的重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列；所述对照抗体的轻链可变区包含SEQ ID NO：119所示的氨基酸序列，所述对照抗体的重链可变区包含SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列。
在另一些情形中，所述对照抗体可以是抗PD-L1抗体atezolizumab(阿特珠单抗)，即，本申请所述抗体PR000151。PR000151可包含轻链可变区和重链可变区，所述对照抗体的轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO：65所示的氨基酸序列，所述LCDR3包含SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列；所述对照抗体的重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQID NO：34所示的氨基酸序列；所述对照抗体的轻链可变区包含SEQ ID NO：117所示的氨基酸序列，所述对照抗体的重链可变区包含SEQ ID NO：96所示的氨基酸序列。
在另一些情形中，所述对照抗体可以是Hengrui融合蛋白9，即，本申请所述抗体PR002466。PR002466可包含轻链可变区和重链可变区，所述对照抗体的轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列；所述LCDR2包含SEQID NO：68所示的氨基酸序列；所述LCDR3包含SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列，所述对照抗体的重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列；所述HCDR2包含SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列；所述HCDR3包含SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列；所述对照抗体的轻链可变区包含SEQ ID NO：121所示的氨基酸序列，所述对照抗体的重链可变区包含SEQ ID NO 107所示的氨基酸序列。
本领域测定表位的方法包括但不限于合成肽法，免疫信息学预测法，多肽活性测定，表位肽扫描技术，蛋白质切割法，噬菌体展示技术，X射线衍射与核磁共振分析，以及利用计算机软件进行表位预测。在某些实施方式中，可以使用基于生物膜干涉法(BLI)Octet分子相互作用分析平台进行本申请所述抗原结合蛋白与所述对照抗体对抗原表位的竞争性结合。例如，将第一种抗体与抗原混合，再加入第二种抗体，利用ForteBioOctet测定第二种抗体对第一种抗体的竞争性抑制率，当竞争性抑制率低于85％时(例如，低于84％、低于83％、低于80％或更低)，可以说第一抗体与第二种抗体结合抗原的表位不完全重叠。
融合蛋白
另一方面，本申请提供了一种融合蛋白，其可包含：a)人TGFBRII或其片段；以及b)本申请上文所述的抗原结合蛋白。
本申请所述融合蛋白的所述人TGFBRII或其片段可包含人TGFBRII的胞外结构域。在某些情形中，所述人TGFBRII或其片段可包含SEQ ID NOs：176-178中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述融合蛋白可包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白。所述分离的抗原结合蛋白可包含轻链可变区VL和重链可变区VH。在某些情形中，所述VL可包含SEQID NO：190所示的氨基酸序列，且所述VH可包含SEQ ID NO：189所示的氨基酸序列。
所述分离的抗原结合蛋白还可包含抗体重链恒定区，且所述重链恒定区可以包含人IgG恒定区。在某些情形中，所述人IgG恒定区可包含人IgG1恒定区。所述人IgG1恒定区可包括天然和人工合成的IgG1恒定区或其突变体。所述突变可包含以下一个或多个位置的突变：L234，L235，N297或K447。例如，可包含一个、两个或更多位置处的突变。突变可包括氨基酸的缺失、插入或置换。例如，所述人IgG1恒定区可包括的突变如下：1)N297A，2)K447缺失，3)N297A和K447缺失，4)L234A，L235A和K447缺失。例如，所述融合蛋白的人IgG1恒定区可包含SEQ ID NOs：172-175中任一项所示的氨基酸序列。
本申请所述融合蛋白的分离的抗原结合蛋白可包含抗体重链或其片段。在某些情形中，所述抗体重链或其片段可包含下述任一项中所示的氨基酸序列或其一部分：SEQ IDNOs：122-127和129-137。例如，所述抗体重链或其片段可包含下述任一项中所示的氨基酸序列或其一部分：SEQ ID NOs：122和133-137。本申请所述融合蛋白的分离的抗原结合蛋白可包含抗体轻链或其片段。在某些情形中，所述抗体轻链或其片段可包含下述任一项中所示的氨基酸序列或其一部分：SEQ ID NOs：150-158和160-163。例如，所述抗体轻链或其片段可包含下述任一项中所示的氨基酸序列或其一部分：SEQ ID NOs：156和162-163。所述融合蛋白的所述重链或其片段与所述轻链或其片段组合后可形成特异性结合PD-L1的抗原结合部分。
本申请所述融合蛋白包含的所述抗原结合蛋白的所述抗体重链或其片段与所述人TGFBRII或其片段框内融合而形成融合多肽。在某些情形中，所述抗体重链或其片段的N端可以直接或间接与所述人TGFBRII或其片段的C端连接。在某些情形中，所述抗体重链或其片段的C端可以直接或间接与所述人TGFBRII或其片段的N端连接。例如，所述抗体重链或其片段的C端可以直接与所述人TGFBRII或其片段的N端连接。在另一些情形中，所述抗体重链或其片段可以通过连接子与所述人TGFBRII或其片段相连，例如，所述肽连接子可包含SEQ ID NOs：167-169中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述融合蛋白可包含第一多肽和第二多肽。所述第一多肽可包含所述分离的抗原结合蛋白的重链或其片段以及所述人TGFBRII或其片段。在某些情形中，所述第一多肽从N端至C端可以包括所述抗原结合片段的重链或其片段，所述肽连接子，以及所述人TGFBRII或其片段。例如，所述第一多肽可包含SEQ ID NOs：138-139、142-143和145-148中任一项所示的氨基酸序列。所述第二多肽可包含所述分离的抗原结合蛋白的轻链或其片段，例如，所述第二多肽可包含SEQ ID NOs：162-163中任一项所示的氨基酸序列。
例如，所述融合蛋白的所述第一多肽可包含SEQ ID NO：138所示的氨基酸序列，且所述第二多肽可包含SEQ ID NO：162所示的氨基酸序列，例如，所述融合蛋白可包含与PR001487相同的第一多肽和第二多肽；
所述第一多肽可包含SEQ ID NO：139所示的氨基酸序列，且所述第二多肽可包含SEQ ID NO：162所示的氨基酸序列，例如，所述融合蛋白可包含与PR001488相同的第一多肽和第二多肽；
所述第一多肽可包含SEQ ID NO：142所示的氨基酸序列，且所述第二多肽可包含SEQ ID NO：162所示的氨基酸序列，例如，所述融合蛋白可包含与PR001901相同的第一多肽和第二多肽；
所述第一多肽可包含SEQ ID NO：143所示的氨基酸序列，且所述第二多肽可包含SEQ ID NO：162所示的氨基酸序列，例如，所述融合蛋白可包含与PR001902相同的第一多肽和第二多肽；
所述第一多肽可包含SEQ ID NO：145所示的氨基酸序列，且所述第二多肽可包含SEQ ID NO：163所示的氨基酸序列，例如，所述融合蛋白可包含与PR002247相同的第一多肽和第二多肽
所述第一多肽可包含SEQ ID NO：146所示的氨基酸序列，且所述第二多肽可包含SEQ ID NO：163所示的氨基酸序列，例如，所述融合蛋白可包含与PR002248相同的第一多肽和第二多肽；
所述第一多肽可包含SEQ ID NO：147所示的氨基酸序列，且所述第二多肽可包含SEQ ID NO：162所示的氨基酸序列，例如，所述融合蛋白可包含与PR002249相同的第一多肽和第二多肽；
所述第一多肽可包含SEQ ID NO：148所示的氨基酸序列，且所述第二多肽可包含SEQ ID NO：162所示的氨基酸序列，例如，所述融合蛋白可包含与PR002251相同的第一多肽和第二多肽。
本申请的所述的融合蛋白可包含两条所述第一多肽以及两条所述第二多肽。
在本申请中，所述抗体结合蛋白每个重链或轻链氨基酸序列的一部分与来自特定物种的抗体中相应氨基酸序列同源，或者属于特定的类别。例如，轻链和重链的可变区及恒定部分均来自一个动物物种(如人)的抗体的可变区及恒定区。在本申请中，所述同源物可以为，与所述蛋白质和/或所述多肽(例如，特异性结合PD-L1蛋白的抗体或其片段)的氨基酸序列具有至少约85％(例如，具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同源性的蛋白质或多肽。
在本申请中，所述同源性通常是指两个或多个序列之间的相似性、类似或关联。可以通过以下方式计算“序列同源性百分比”：将两条待比对的序列在比较窗中进行比较，确定两条序列中存在相同核酸碱基(例如，A、T、C、G)或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中的总位置数(即，窗大小)，并且将结果乘以100，以产生序列同源性百分比。为了确定序列同源性百分数而进行的比对，可以按本领域已知的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内或目标序列区域内最大比对所需要的任何算法。所述同源性也可以通过以下的方法测定：FASTA和BLAST。对FASTA算法的描述可以参见W.R.Pearson和D.J.Lipman的“用于生物学序列比较的改进的工具”，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)，85：2444-2448，1988；和D.J.Lipman和W.R.Pearson的“快速灵敏的蛋白质相似性搜索”，Science，227：1435-1441，1989。对BLAST算法的描述可参见S.Altschul、W.Gish、W.Miller、E.W.Myers和D.Lipman的“一种基本的局部对比(alignment)搜索工具”，分子生物学杂志，215：403-410，1990。
核酸、载体、宿主细胞和制备方法
在另一个方面，本申请还提供了分离的一种或多种核酸分子。所述一种或多种核酸分子可编码本申请所述的抗原结合蛋白。例如，所述一种或多种核酸分子中的每一个核酸分子可以编码完整的所述抗原结合蛋白，也可以编码其中的一部分(例如，HCDR1-3、LCDR1-3、VL、VH、轻链或重链中的一种或多种)。
本申请所述的核酸分子可以为分离的。例如，其可以是通过以下方法产生或合成的：(i)在体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应(PCR)扩增产生的，(ii)通过克隆重组产生的，(iii)纯化的，例如通过酶切和凝胶电泳分级分离，或者(iv)合成的，例如通过化学合成。在某些实施方式中，所述分离的核酸是通过重组DNA技术制备的核酸分子。
在本申请中，可以通过本领域已知的多种方法来制备编码所述抗体、其抗原结合片段的核酸，这些方法包括但不限于，采用限制性片段操作或采用合成性寡核苷酸的重叠延伸PCR，具体操作可参见Sambrook等人，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989；和Ausube等人Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York N.Y.，1993。
在另一个方面，本申请提供了一种或多种载体，其包含本申请所述的一种或多种核酸分子。每种载体中可包含一种或多种所述核酸分子。此外，所述载体中还可包含其他基因，例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该载体的标记基因。此外，所述载体还可包含允许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。这样的控制元件为本领域技术人员所熟知的，例如，可包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件等。在某些实施方式中，所述表达控制序列为可调的元件。所述表达控制序列的具体结构可根据物种或细胞类型的功能而变化，但通常包含分别参与转录和翻译起始的5’非转录序列和5’及3’非翻译序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。例如，5’非转录表达控制序列可包含启动子区，启动子区可包含用于转录控制功能性连接核酸的启动子序列。所述表达控制序列还可包括增强子序列或上游活化子序列。在本申请中，适当的启动子可包括，例如用于SP6、T3和T7聚合酶的启动子、人U6RNA启动子、CMV启动子及其人工杂合启动子(如CMV)，其中启动子的某部分可与其他细胞蛋白(如人GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因启动子的某部分融合，其可包含或不包含另外的内含子。本申请所述的一种或多种核酸分子可以与所述表达控制元件可操作地连接。
所述载体可以包括，例如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或者在例如遗传工程中通常使用的其他载体。例如，所述载体为表达载体。
在另一个方面，本申请提供了宿主细胞，所述宿主细胞可包含本申请所述的一种或多种核酸分子和/或本申请所述的一种或多种载体。在某些实施方式中，每种或每个宿主细胞可包含一个或一种本申请所述的核酸分子或载体。在某些实施方式中，每种或每个宿主细胞可包含多个(例如，2个或以上)或多种(例如，2种或以上)本申请所述的核酸分子或载体。例如，可将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，例如真核细胞，如来自植物的细胞、真菌或酵母细胞等。可通过本领域已知的方法将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，例如电穿孔、lipofectine转染、lipofectamin转染等。
在另一个方面，本申请提供了制备所述的抗体或其抗原结合片段的方法。所述方法可包括，在使得所述的抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养所述本申请所述的宿主细胞。例如，可通过使用适当的培养基、适当的温度和培养时间等，这些方法是本领域普通技术人员所了解的。
在某些情形中，所述方法还可包括分离和/或纯化所述抗体或其抗原结合片段的步骤。例如，可以采用蛋白G-琼脂糖或蛋白A-琼脂糖进行亲和层析，还可通过凝胶电泳和/或高效液相色谱等来纯化和分离本申请所述的抗体或其抗原结合片段。
药物组合物、方法、用途
在另一个方面，本申请提供了一种药物组合物，其可包含本申请所述的抗原结合蛋白和/或所述融合蛋白，所述的核酸分子，所述的载体，所述的宿主细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。
所述药学上可接受的佐剂在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒性，并且可包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六烃季铵(hexamethonium chloride)、氯化苯二甲羟铵(benzalkonium chloride)、氯化苄甲乙氧铵(benzethonium chloride)、苯酚、丁醇或苄醇；对羟苯甲酸烷酯，诸如对羟苯甲酸甲酯或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间-甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、凝胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯基吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷酰氨酸、天冬酰氨酸、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖以及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子，诸如钠离子；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。本申请中的药物组合物还可含有多于一种活性化合物，通常为不会不利地影响彼此的具有互补活性的那些活性化合物。此类药物的类型和有效量取决于例如制剂中存在的拮抗剂的量和类型，以及受试者的临床参数。
所述药物组合物可以用于抑制肿瘤生长。例如，本申请的药物组合物可以抑制或延缓疾病的发展或进展，可以减小肿瘤大小(甚至基本消除肿瘤)，和/或可以减轻和/或稳定疾病状态。
本申请所述的药物组合物可以包含预防和/或治疗有效量的所述抗体、其抗原结合片段。所述预防和/或治疗有效量是能够预防和/或治疗(至少部分治疗)患有或具有发展风险的受试者中的疾病或病症和/或其任何并发症而所需的剂量。
另一方面，本申请提供了所述抗原结合蛋白和/或所述融合蛋白在制备药物中的用途。所述药物用于治疗癌症，抑制肿瘤生长和/或抑制肿瘤细胞增殖。在某些实施方式中，所述肿瘤或癌症包含结直肠肿瘤或癌症。在某些实施方式中，所述肿瘤或癌症为PD-L1表达异常的肿瘤或癌症。本申请还提供了以下描述的检测生物样品中PD-L1表达的方法。在某些情形中，所述方法包括使生物样品与本申请所述的抗原结合蛋白和/或融合蛋白在容许所述抗原结合蛋白和/或融合蛋白结合PD-L1的条件下接触，和检测在所述抗原结合蛋白和/或融合蛋白与PD-L1之间是否形成复合物。例如，所述肿瘤或癌症为与非肿瘤或癌症样品相比，PD-L1表达升高的肿瘤或癌症。此类方法可以是体外或体内方法。本申请所述抗原结合蛋白和/或融合蛋白可用于例如免疫测定中，所述免疫测定包括例如免疫组织化学(IHC)、免疫荧光(IF)、免疫印迹(例如，蛋白质印迹)、流式细胞术(例如，FAGS)和酶联免疫吸附测定(ELISA)。在某些情形中，例如当PD-L1为用于选择患者的生物标记时，所述抗原结合蛋白和/或融合蛋白用来选择适于用本申请所述抗原结合蛋白和/或融合蛋白进行的疗法的受试者。本申请还提供了所述抗原结合蛋白和/或融合蛋白在诊断患有病症(例如，癌症或免疫功能失调)的受试者的方法中的用途，所述方法包括：通过使样品与本发明的所述抗原结合蛋白和/或融合蛋白接触并检测结合的所述抗原结合蛋白和/或融合蛋白的存在来确定获自受试者的样品中PD-L1的存在或表达水平。
另一方面，本申请提供了抑制PD-L1与PD-1结合的方法，包括施用本申请所述的抗原结合蛋白。所述方法可以是离体或体外方法。在某些情形中，所述方法可包括使生物样品与本申请所述的抗原结合蛋白和/或PD-1在容许所述抗原结合蛋白和/或PD-1结合PD-L1的条件下接触，检测在所述抗原结合蛋白与PD-L1之间是否形成复合物，和检测PD-1与PD-L1之间是否形成复合物。
另一方面，本申请提供了抑制PD-L1与CD80结合的方法，包括施用本申请所述的抗原结合蛋白。所述方法可以是离体或体外方法。在某些情形中，所述方法包括使生物样品与本申请所述的抗原结合蛋白和/或CD80在容许所述抗原结合蛋白和/或CD80结合PD-L1的条件下接触，检测在所述抗原结合蛋白与PD-L1之间是否形成复合物，和检测CD80与PD-L1之间是否形成复合物。
另一方面，本申请提供了抑制TGFB与TGFBRII结合的方法，包括施用本申请所述的融合蛋白。所述方法可以是离体或体外方法。在某些情形中，所述方法包括使生物样品与本申请所述的融合蛋白和/或表达TGFBRII的报告基因细胞在容许所述融合蛋白和/或表达TGFBRII的报告基因细胞结合TGFB的条件下接触，检测在所述融合蛋白是否抑制了TGFB结合TGFBRII诱导的Smad信号通路。
在一些情况下，生物样品包括组织或细胞样品。例如，生物样品可包括来自正常或癌症患者的细胞或组织。在某些情况下，组织或细胞样品的来源可为如来自新鲜、冷冻和/或防腐器官或组织样品或活检物或吸出物的固体组织；血液或任何血液成分；体液，诸如脑脊髓液、羊水、腹膜液或间质液；来自受试者妊娠或发育的任何时间的细胞。在另一些情形中，所述生物样品获自体外组织或细胞培养物。本申请中的生物样品的实例包括但不限于肿瘤活检、循环肿瘤细胞、血清或血浆、循环血浆蛋白、腹水、来源于肿瘤的或展现出肿瘤样特性的原代细胞培养物或细胞系，以及保存的肿瘤样品，诸如福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤样品或冷冻的肿瘤样品。
本申请还提供了抗原结合蛋白在诊断患有肿瘤或癌症的受试者的方法中的用途，所述方法包括：通过使样品与本申请的抗原结合蛋白接触并检测结合的抗体的存在来确定获自受试者的样品中PD-L1的存在或表达水平。在一些情况下，所述样品可选自由以下组成的组：组织样品、全血样品、血清样品和血浆样品。在一些情况下，所述组织样品可以为肿瘤样品。在一些情况下，所述肿瘤样品可包含肿瘤浸润性免疫细胞、肿瘤细胞、基质细胞及其任何组合。
另一方面，本申请提供了治疗受试者中的癌症、抑制受试者中肿瘤生长和/或抑制肿瘤细胞增殖的方法，包括向有需要的受试者或所述肿瘤细胞施用本申请所述的抗原结合片段和/或所述融合蛋白、所述的分子核酸、所述的载体、所述的宿主细胞和/或所述的药物组合物。可通过任何合适的方法来施用，所述合适的方法包括例如：以静脉内方式、以肌内方式、以皮下方式、以皮内方式、以经皮方式、以动脉内方式、以腹膜内方式、以损伤内方式、以颅内方式、以关节内方式、以前列腺内方式、以胸膜内方式、以气管内方式、以鞘内方式、以鼻内方式、以阴道内方式、以直肠内方式、以局部方式、以肿瘤内方式、以腹膜方式、以结膜下方式、以囊内方式、以粘膜方式、以心包内方式、以脐内方式、以眼内方式、以眶内方式、以口服方式、以局部方式、以透皮方式、以玻璃体内方式(例如，通过玻璃体内注射)、通过滴眼剂、通过吸入、通过注射、通过植入、通过输注、通过连续输注、通过直接沐浴靶细胞的局部灌注、通过导管、通过灌洗、以乳膏形式或以脂质组合物形式。用于本文描述的方法中的组合物还可以全身方式或以局部方式施用。施用方法可以根据各种因素(例如，所施用的化合物或组合物以及所治疗的病状、疾病或病症的严重性)而变化。在某些实施方案中，以静脉内方式、以肌内方式、以皮下方式、以局部方式、以口服方式、以透皮方式、以腹膜内方式、以眶内方式、通过植入、通过吸入、以鞘内方式、以心室内方式或以鼻内方式施用抗癌疗法(例如，抗PD-L1抗体)。部分地根据施用是否为短暂的或长期的，给药可通过任何适合的途径进行，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射。本文涵盖各种给药排程，包括但不限于单次施用或各种时间点内的多次施用、推注施用和脉冲输注。
本文所述的抗原结合蛋白或药物组合物可以符合良好医疗实践的方式配制、给药和施用。在此情形下的考虑因素包括所治疗的特定病症、所治疗的特定哺乳动物、单个患者的临床病状、病症的病因、药剂递送部位、施用方法、施用排程和医学从业者已知的其他因素。治疗剂(例如，抗PD-L1抗体)无需但任选地与一种或多种当前用来预防或治疗所考虑的病症的药剂一起配制和/或同时施用。此类其他药剂的有效量取决于制剂中存在的治疗剂(例如，抗PD-L1抗体)的量、病症或治疗的类型以及以上论述的其他因素。这些药剂通常可以凭经验/临床上确定为适当的任何剂量且通过凭经验/临床上确定为适当的任何途径加以使用。与单个治疗相比，可减少组合治疗中施用的抗体的剂量。通过常规技术易于监测此疗法的进展。
嵌合抗原受体
另一方面，本申请提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，其可以包含本申请所述的核酸分子或本申请所述的抗原结合蛋白。在某些实施方式中，其可以包含能够结合抗原的胞外域(胞外结合结构域)、铰链结构域、跨膜结构域(跨膜区)和使胞质信号传到结构域的多肽(即胞内信号域)。铰链结构域可以被认为是用于向细胞外抗原结合区提供柔性的一部分。胞内信号域指经由确定的信号传导途径通过产生第二信使而将信息传递到细胞内以调节细胞活性的蛋白质、或通过相应于此类信使而作为效应子发挥作用的蛋白质，产生可以促进CAR的细胞(例如CAR-T细胞))的免疫效应子功能的信号。胞内信号域可以包含信号传导结构域，还可以包括源自共刺激分子的共刺激胞内结构域。例如，共刺激分子可以选自4-1BB，CD27，ICOS和/或CD28。另一方面，本申请提供了基因修饰的细胞，其可包含所述的嵌合抗原受体。在某些实施方式中，所述基因修饰的细胞可包括真核细胞。在某些实施方式中，所述基因修饰的细胞可包括分离的人细胞。在某些实施方式中，所述基因修饰的细胞可包括免疫细胞如T细胞，或NK细胞。
抗体药物偶联物
另一方面，本申请提供了一种抗体药物偶联物，其可以包含细胞毒性剂，以及本申请所述的抗原结合片段。抗体药物偶联物通常是指采用特定的连接子将抗体和小分子细胞毒药物连接起来，其主要组成成分可以包括抗体、连接子和小分子细胞毒药物。抗体药物偶联物的靶向性可以来自其中抗体部分(antibody)，毒性大部分可以来自小分子化药毒物部分(payload)，抗体部分也可以自带毒性(ADCC与CDC)。
试剂盒
另一方面，本申请提供了一种试剂盒，其可以包含本申请所述的抗原结合蛋白，嵌合抗原受体，基因修饰的细胞，抗体药物偶联物，和/或本申请所述的药物组合物。其可在单一常用容器中包括本申请所述的抗原结合蛋白，嵌合抗原受体，基因修饰的细胞，和/或抗体药物偶联物，也可任选地与一种或多种治疗剂组合，任选地一起配制于药物组合物中。
在某些情形中，所述试剂盒还可以包括施用本申请所述抗原结合蛋白，嵌合抗原受体，基因修饰的细胞，抗体药物偶联物或药物组合物的装置；例如，所述装置取决于内容物的施用方式。在某些情形中，所述试剂盒可包括包装插页，其包括关于试剂盒中的抗原结合蛋白、药物组合物和剂型的信息。通常，此类信息帮助患者和医师有效且安全地使用封装的抗原结合蛋白、药物组合物和剂型。用于此类试剂盒中的容器通常可包含至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其它适合容器，检测和/或治疗组合物中的一种或多种可置于其中，且优选适当等分。在还提供第二治疗剂的情况下，试剂盒也可含有第二不同容器，其中可放置该第二检测和/或治疗组合物。或者，多种化合物可制备成单一药物组合物，且可包装在单一容器装置诸如小瓶、烧瓶、注射器、瓶或其它适合单一容器中。
给药装置
另一方面，本申请提供了一种给药装置(例如塑料或小瓶，例如空心销或注射器圆筒)，它可以用来施用本申请所述的抗原结合蛋白或其药物组合物。该设备可以通过肠胃外途径(例如肌肉内部，皮下或静脉内)将一种物质引入患者体内。例如，注射设备可以是注射器(例如预先填充的具有本申请所述抗原结合蛋白或其药物组合物的注射器，例如自动注射器)，其可以包括用于容纳要注射的流体(例如本申请所述抗原结合蛋白或其药物组合物)的针筒和针(可以用于刺穿皮肤和/或血管)。给药方式可改变。给药途径可以包括口服，肌肉注射，皮下注射，经直肠给药等。
另一方面，本申请提供了以下实施方案：
1.分离的抗原结合蛋白，其包含抗体重链可变区VH中的至少一个CDR，所述VH包含SEQ ID NO：193所示的氨基酸序列。
2.根据实施方案1所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述VH包含SEQ ID NOs：90-93、95和97-104中任一项所示的氨基酸序列。
3.根据实施方案1-2中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含抗体轻链可变区VL中的至少一个CDR，所述VL包含SEQ ID NO：194所示的氨基酸序列。
4.根据实施方案3所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述VL包含SEQ ID NOs：108-114、116和118中任一项所示的氨基酸序列。
5.根据实施方案1-4中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包括抗体或其抗原结合片段。
6.根据实施方案5所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合片段包括Fab，Fab’，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb。
7.根据实施方案5-6中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体选自下组：单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
8.根据实施方案1-7中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其与特定抗PD-L1抗体竞争结合PD-L1，其中所述特定抗PD-L1抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述特定抗PD-L1抗体的轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO：181所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO：182所示的氨基酸序列，所述LCDR3包含SEQ ID NO：191所示的氨基酸序列；所述特定抗PD-L1抗体的重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO：179所示的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO：180所示的氨基酸序列。
9.根据实施方案8所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述特定抗PD-L1抗体的轻链可变区包含SEQ ID NO：194所示的氨基酸序列，所述特定抗PD-L1抗体的重链可变区包含SEQ ID NO：193所示的氨基酸序列。
10.根据实施方案1-9中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。
11.根据实施方案10所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述HCDR2包含SEQ ID NO：179所示的氨基酸序列。
12.根据实施方案10-11所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述HCDR2包含SEQ IDNOs：14、16和17中任一项所示的氨基酸序列。
13.根据实施方案10-12中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述HCDR3包含SEQ ID NO：180所示的氨基酸序列。
14.根据实施方案10-13所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述HCDR3包含SEQ IDNOs：29-33中任一项所示的氨基酸序列。
15.根据实施方案1-14中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述VH包括框架区H-FR1，H-FR2，H-FR3，和H-FR4。
16.根据实施方案15所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端相连，且所述H-FR1包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
17.根据实施方案15-16中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，且所述H-FR2包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。
18.根据实施方案15-17中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，且所述H-FR3包含SEQ ID NO：192所示的氨基酸序列。
19.根据实施方案15-18中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述H-FR3包含SEQ ID NOs：21、22和24中任一项所示的氨基酸序列。
20.根据实施方案15-19中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端相连，且所述H-FR4包含SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列。
21.根据实施方案1-20中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含抗体重链可变区VH，其中所述VH包含SEQ ID NO：193所示的氨基酸序列。
22.根据实施方案21所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述VH包含SEQ ID NOs：90-93、95和97-104中任一项所示的氨基酸序列。
23.根据实施方案1-22中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包括抗体重链恒定区，且所述抗体重链恒定区包括人IgG恒定区。
24.根据实施方案23所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体重链恒定区包含SEQ ID NOs：172-175中任一项所示的氨基酸序列。
25.根据实施方案1-24中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含抗体重链HC，且所述HC包含SEQ ID NOs：122-125、127和129-137中任一项所示的氨基酸序列。
26.根据实施方案3-25中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述VL包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，其中所述LCDR1包含SEQ ID NO：181所示的氨基酸序列。
27.根据实施方案26所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述LCDR1包含SEQ IDNOs：48-51中任一项所示的氨基酸序列。
28.根据实施方案26-27中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述LCDR2包含SEQ ID NO：182所示的氨基酸序列。
29.根据实施方案26-28中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述LCDR2包含SEQ ID NOs：63-64中任一项所示的氨基酸序列。
30.根据实施方案26-29中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述LCDR3包含SEQ ID NO：191所示的氨基酸序列。
31.根据实施方案26-30中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述LCDR3包含SEQ ID NOs：77-79中任一项所示的氨基酸序列。
32.根据实施方案3-31中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述VL包括框架区L-FR1，L-FR2，L-FR3，和L-FR4。
33.根据实施方案32所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端相连，且所述L-FR1包含SEQ ID NO：185所示的氨基酸序列。
34.根据实施方案32-33中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述L-FR1包含SEQ ID NOs 41-44中任一项所示的氨基酸序列。
35.根据实施方案32-34中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述L-FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间，且所述L-FR2包含SEQ ID NO：186所示的氨基酸序列。
36.根据实施方案32-35中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述L-FR2包含SEQ ID NOs：56-59中任一项所示的氨基酸序列。
37.根据实施方案32-36中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述L-FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间，且所述L-FR3包含SEQ ID NO：187所示的氨基酸序列。
38.根据实施方案32-37中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述L-FR3包含SEQ ID NOs：69-72中任一项所示的氨基酸序列。
39.根据实施方案32-38中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述L-FR4的N末端与所述LCDR3的C末端相连，且所述L-FR4包含SEQ ID NO：188所示的氨基酸序列。
40.根据实施方案32-39中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述L-FR4包含SEQ ID NOs：85-86中任一项所示的氨基酸序列。
41.根据实施方案1-40中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含抗体轻链可变区VL，其中所述VL包含SEQ ID NO：194所示的氨基酸序列。
42.根据实施方案41所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述VL包含SEQ ID NOs：108-114、116和118中任一项所示的氨基酸序列。
43.根据实施方案1-42中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包括抗体轻链恒定区，其中所述抗体轻链恒定区包含SEQ ID NO：170所示的氨基酸序列。
44.根据实施方案1-43中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含抗体轻链LC，且所述LC包含SEQ ID NOs：150-156、158和160-163中任一项所示的氨基酸序列。
45.根据实施方案1-44中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其具有下述性质中的一种或多种：
1)能够以1×10-8M或更低的KD值结合源自灵长类动物的PD-L1；
2)能够阻断PD-1与PD-L1的结合；
3)能够阻断CD80与PD-L1的结合；
4)能够刺激免疫细胞中IFN-γ和/或IL2的分泌；
5)能够抑制肿瘤生长和/或肿瘤细胞增殖；
6)与对照抗体相比，结合与源自灵长类动物的PD-L1的不完全重叠的表位，
其中所述对照抗体包含SEQ ID NO：52所示的LCDR1、SEQ ID NO：65所示的LCDR2和SEQ ID NO：81所示的LCDR3，且所述对照抗体包含SEQ ID NO：6所示的HCDR1、SEQ ID NO：15所示的HCDR2和SEQ ID NO：34所示的HCDR3；
或者，
其中所述对照抗体包含SEQ ID NO：53所示的LCDR1、SEQ ID NO：66所示的LCDR2和SEQ ID NO：82所示的LCDR3，且所述对照抗体包含SEQ ID NO：5所示的HCDR1、SEQ ID NO：18所示的HCDR2和SEQ ID NO：35所示的HCDR3；
或者，
所述对照抗体包含SEQ ID NO：55所示的LCDR1、SEQ ID NO：68所示的LCDR2和SEQID NO：84所示的LCDR3，且所述对照抗体包含SEQ ID NO：8所示的HCDR1、SEQ ID NO：20所示的HCDR2和SEQ ID NO：37所示的HCDR3。
46.根据实施方案45所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述灵长类动物包括人和/或猴。
47.一种融合蛋白，其包含：a)人TGFBRII或其片段；以及b)实施方案1-46中任一项所述的分离的抗原结合蛋白。
48.根据实施方案47所述的融合蛋白，其中所述分离的抗原结合蛋白包含抗体重链或其片段，且所述抗体重链或其片段与所述人TGFBRII或其片段框内融合而形成所述融合多肽。
49.根据实施方案48所述的融合蛋白，其中所述抗体重链或其片段的C端直接或间接与所述人TGFBRII或其片段的N端连接。
50.根据实施方案48-49中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗体重链或其片段通过连接子与所述人TGFBRII或其片段相连。
51.根据实施方案50所述的融合蛋白，其中所述连接子为肽连接子，且所述肽连接子包含SEQ ID NOs：167-169中任一项所示的氨基酸序列。
52.根据实施方案47-51中任一项所述的融合蛋白，其中所述人TGFBRII或其片段包含人TGFBRII的胞外结构域。
53.根据实施方案47-52中任一项所述的融合蛋白，其中所述人TGFBRII或其片段包含SEQ ID NOs：176-178中任一项所示的氨基酸序列。
54.根据实施方案47-53中任一项所述的融合蛋白，其包含第一多肽和第二多肽，
其中所述第一多肽包含所述分离的抗原结合蛋白的重链或其片段以及所述人TGFBRII或其片段；且
所述第二多肽包含所述分离的抗原结合蛋白的轻链或其片段。
55.根据实施方案54所述的融合蛋白，其中所述第一多肽的所述重链或其片段与所述第二多肽的所述轻链或其片段组合后形成特异性结合PD-L1的抗原结合部分。
56.根据实施方案54-55中任一项所述的融合蛋白，其中所述第一多肽包含SEQ IDNOs：138、139、142、143和145-148中任一项所示的氨基酸序列。
57.根据实施方案54-56中任一项所述的融合蛋白，其中所述第二多肽包含SEQ IDNOs：162-163中任一项所示的氨基酸序列。
58.根据实施方案54-57中任一项所述的融合蛋白，其中，
所述第一多肽包含SEQ ID NO：138所示的氨基酸序列，且所述第二多肽包含SEQID NO：162所示的氨基酸序列；或者，
所述第一多肽包含SEQ ID NO：139所示的氨基酸序列，且所述第二多肽包含SEQID NO：162所示的氨基酸序列；或者，
所述第一多肽包含SEQ ID NO：142所示的氨基酸序列，且所述第二多肽包含SEQID NO：162所示的氨基酸序列；或者，
所述第一多肽包含SEQ ID NO：143所示的氨基酸序列，且所述第二多肽包含SEQID NO：162所示的氨基酸序列；或者，
所述第一多肽包含SEQ ID NO：145所示的氨基酸序列，且所述第二多肽包含SEQID NO：163所示的氨基酸序列；或者，
所述第一多肽包含SEQ ID NO：146所示的氨基酸序列，且所述第二多肽包含SEQID NO：163所示的氨基酸序列；或者，
所述第一多肽包含SEQ ID NO：147所示的氨基酸序列，且所述第二多肽包含SEQID NO：162所示的氨基酸序列；或者，
所述第一多肽包含SEQ ID NO：148所示的氨基酸序列，且所述第二多肽包含SEQID NO：162所示的氨基酸序列。
59.根据实施方案54-58中任一项所述的融合蛋白，其包含两条所述第一多肽以及两条所述第二多肽。
60.分离的一种或多种核酸分子，其编码实施方案1-46中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，和/或实施方案47-59中任一项所述的融合蛋白。
61.载体，其包含根据实施方案60所述的核酸分子。
62.细胞，其包含根据实施方案60所述的核酸分子或根据实施方案61所述的载体。
63.制备实施方案1-46中任一项所述的分离的抗原结合蛋白和/或实施方案47-59中任一项所述的融合蛋白的方法，所述方法包括在使得实施方案1-46中任一项所述的分离的抗原结合蛋白实施方案47-59中任一项所述的融合蛋白表达的条件下，培养根据实施方案49所述的细胞。
64.嵌合抗原受体，其包含实施方案1-46中任一项所述的分离的抗原结合蛋白。
65.基因修饰的细胞，其包含实施方案64所述的嵌合抗原受体。
66.抗体药物偶联物，其包含细胞毒性剂，以及实施方案1-46中任一项所述的分离的抗原结合蛋白。
67.药物组合物，其包含实施方案1-46中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、实施方案47-59中任一项所述的融合蛋白、实施方案60所述的核酸分子、实施方案61所述的载体、实施方案62所述的细胞、实施方案64所述的嵌合抗原受体、实施方案65所述的基因修饰的细胞和/或实施方案66所述的抗体药物偶联物，以及任选地药学上可接受的载体。
68.实施方案1-46中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、实施方案60所述的核酸分子、实施方案61所述的载体、实施方案62所述的细胞、实施方案64所述的嵌合抗原受体、实施方案65所述的基因修饰的细胞、实施方案66所述的抗体药物偶联物和/或实施方案67所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗肿瘤或癌症，抑制肿瘤生长和/或抑制肿瘤细胞增殖。
69.实施方案68所述的用途，其中所述肿瘤或癌症为PD-L1表达异常的肿瘤或癌症。
70.根据实施方案68-69中任一项所述的用途，其中所述肿瘤或癌症包括结直肠癌。
71.预防、缓解或治疗肿瘤，抑制肿瘤生长和/或抑制肿瘤细胞增殖的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用实施方案1-46中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、实施方案60所述的核酸分子、实施方案61所述的载体、实施方案62所述的细胞、实施方案64所述的嵌合抗原受体、实施方案65所述的基因修饰的细胞、实施方案66所述的抗体药物偶联物和/或实施方案67所述的药物组合物。
72.实施方案71所述的方法，其中所述肿瘤或癌症为PD-L1表达异常的肿瘤或癌症。
73.根据实施方案71-72中任一项所述的方法，其中所述肿瘤或癌症包括结直肠癌。
74.实施方案1-46中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、实施方案60所述的核酸分子、实施方案61所述的载体、实施方案62所述的细胞、实施方案64所述的嵌合抗原受体、实施方案65所述的基因修饰的细胞、实施方案66所述的抗体药物偶联物和/或实施方案67所述的药物组合物，其用于治疗癌症，抑制肿瘤生长和/或抑制肿瘤细胞增殖。
75.抑制PD-L1与PD-1结合的方法，所述方法包括施用实施方案1-46中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、实施方案60所述的核酸分子、实施方案61所述的载体、实施方案62所述的细胞、实施方案64所述的嵌合抗原受体、实施方案65所述的基因修饰的细胞、实施方案66所述的抗体药物偶联物和/或实施方案67所述的药物组合物。
76.抑制CD80与PD-L1结合的方法，所述方法包括施用实施方案1-46中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、实施方案60所述的核酸分子、实施方案61所述的载体、实施方案62所述的细胞、实施方案64所述的嵌合抗原受体、实施方案65所述的基因修饰的细胞、实施方案66所述的抗体药物偶联物和/或实施方案67所述的药物组合物。
77.试剂盒，其包括实施方案1-46中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、实施方案60所述的核酸分子、实施方案61所述的载体、实施方案62所述的细胞、实施方案64所述的嵌合抗原受体、实施方案65所述的基因修饰的细胞、实施方案66所述的抗体药物偶联物、实施方案67所述的药物组合物，和/或(i)施用装置。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的融合蛋白、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
下面显示的实施例意在说明本发明的具体实施方案，并且不意在以任何方式限制本说明书或权利要求书的范围。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法.这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniais，T.(1989)MolecuLarCloning：ALaboratory Manual，2nd edition，Cold spring Harbor Laboratory Press。
实施例1 抗原结合蛋白或融合蛋白的制备和表征分析
可以利用PD-L1抗原对实验动物进行免疫以获得针对PD-L1特异性结合的抗体分子，该实验动物可以是小鼠、大鼠、兔、羊、骆驼等。通常，其得到的抗体分子是非人源的。在获得非人源抗体后，需要对这些分子利用抗体工程技术进行人源化改造，以降低免疫原性并提高成药性。然而，抗体的人源化过程有其技术复杂性，经过人源化改造的分子往往会降低对抗原的亲和力。另一方面，转基因技术的进步使得可以培育出基因工程化小鼠，其携带人免疫球蛋白免疫库并使其内源的鼠的免疫库缺失。这种转基因小鼠产生的抗体具有全人源的序列，因而无需再进一步做人源化改造，大大提高了治疗性抗体开发的效率。HarbourH2L2小鼠(Harbour Antibodies BV)是一种携带人免疫球蛋白免疫库的转基因小鼠，其产生的抗体具有完整的人的抗体可变结构域和大鼠恒定结构域。
1.1用PD-L1抗原免疫小鼠
用可溶的重组人PD-L1-mFc融合蛋白(Novo Protein Inc.货号CM06，批号0330837)对Harbour H2L2小鼠进行多轮免疫。抗原蛋白与免疫佐剂混合成免疫原试剂，然后通过皮下经腹股沟注射或通过腹腔注射。在每一轮免疫中，每只小鼠接受的总注射剂量是100微升。在首轮免疫中，每只小鼠接受用50μg抗原蛋白(人PD-L1-mFc)与完全弗氏佐剂(Sigma，货号F5881)以体积比1∶1混合配制的免疫原试剂的免疫。在随后的每轮增强免疫中，每只小鼠接受用25μg抗原蛋白与Sigma Adjuvant System佐剂(Sigma，货号S6322)混合配制的免疫原试剂的免疫。每轮增强免疫的间隔时间至少为两周，通常不超过五轮增强免疫。免疫时间为第0、14、28、42、56、70天；并且在第49、77天，检测小鼠血清抗体滴度。在进行细胞融合前3天，以每只小鼠25μg抗原蛋白的剂量进行最后一次增强免疫。
1.2获得杂交瘤单克隆和抗体序列
当检测小鼠血清中PD-L1特异的抗体滴度达到一定的水平后，将小鼠的脾细胞取出并与骨髓瘤细胞系融合得到杂交瘤细胞；对杂交瘤细胞经过多轮筛选和克隆之后，分离出数个表达抗-PD-L1单克隆抗体分子的杂交瘤细胞，分离的杂交瘤细胞及其表达的单克隆抗体都使用对应的克隆号来表示，例如：63G11H3G9，91G3H5H3等等。分离的杂交瘤细胞表达具有完整的人可变结构域和大鼠恒定结构域的重链和轻链的抗体分子。对上述单克隆抗体进行进一步的鉴定，根据其对人PD-L1的结合能力、食蟹猴PD-L1的结合能力、抑制PD-L1与PD-1结合能力等参数，选出若干个杂交瘤克隆进行测序。利用常规的杂交瘤测序手段获得编码抗体分子可变结构域的核苷酸序列以及对应的氨基酸序列。在本实施例中，从免疫的Harbour H2L2小鼠得到的抗PD-L1单克隆抗体分子可变结构域的序列是人源抗体序列。抗体可变结构域的CDR序列可以通过Kabat或者Chothia或者其他CDR定义规则(如Combined定义规则)进行分析(见表1关于CDR定义)。表2列出了杂交瘤细胞及重组抗体的可变区序列以及CDR序列所对应的SEQ ID NO编号，其中CDR使用Chothia定义规则。
1.3制备全人重组抗体
在得到编码抗体分子的轻、重链可变结构域序列以后，可以采用常规的重组DNA技术，将轻、重链可变结构域序列和相应的人的抗体轻、重链恒定结构域序列进行融合表达，得到重组抗体分子。在本实施例中，抗体重链可变结构域序列(VH)通过基因合成并克隆到编码人IgG1抗体重链恒定结构域序列(SEQ ID NO：172)或者其含有氨基酸突变的变体序列(SEQ ID NO：173-175)的哺乳动物细胞表达质粒载体中，以编码产生人IgG抗体的全长重链(或其变体)；抗体轻链可变结构域序列(VL)通过基因合成并克隆到编码人抗体κ轻链恒定结构域序列(SEQ ID NO：170)的哺乳动物细胞表达质粒载体中，以编码产生抗体的全长κ轻链；或者将VL通过基因合成并克隆到编码人抗体λ轻链恒定结构域序列(SEQ ID NO：171)的哺乳动物细胞表达质粒载体中，以编码产生抗体的全长λ轻链。表2列出了本实施例中PD-L1抗体的轻、重链可变结构域氨基酸序列，轻链全长氨基酸序列，重链(人IgG1)全长氨基酸序列和根据Chothia定义规则定义的CDR的氨基酸序列。
将编码抗体重链的质粒和编码抗体轻链的质粒同时转染哺乳动物宿主细胞(如人胚肾细胞HEK293)，利用常规的重组蛋白表达和纯化技术，可以得到具有轻重链正确配对组装的纯化的PD-L1重组抗体。具体说来，将HEK293细胞在FreeStyleTM F17 ExpressionMedium培养基(Thermo，A1383504)中扩培。瞬时转染开始之前，调节细胞浓度至6～8x105细胞/ml，于37℃ 8％CO2摇床中培养24小时，细胞浓度在1.2x106细胞/ml。准备30ml培养的细胞。将上述编码抗体重链的质粒和编码抗体轻链的质粒以2∶3的比例混合共计30μg质粒溶解于1.5ml Opti-MEM减血清培养基(Thermo，31985088)，并用0.22μm滤膜过滤除菌。再取1.5ml Opti-MEM溶入1mg/ml PEI(Polysciences，23966-2)120μl，静置5分钟。把PEI缓慢加入质粒中，室温孵育10分钟，边摇晃培养瓶边缓慢滴入质粒PEI混合溶液，于37℃ 8％CO2摇床中培养5天。5天后观测细胞活率。收集培养物，以3300g转速离心10分钟后取上清；然后将上清高速离心去除杂质。用PBS(pH7.4)缓冲液平衡含有MabSelectTM(GE Healthcare LifeScience，71-5020-91 AE)的重力柱(Bio-Rad，7311550)，2-5倍柱体积冲洗。将上清样品过柱；用5-10倍柱体积的PBS冲洗柱子，再用pH3.5的0.1M甘氨酸洗脱目的蛋白，后用pH 8.0的Tris-HCl调节至中性，最后用超滤管(Millipore，UFC901024)浓缩换液至PBS缓冲液，得到纯化的重组蛋白溶液。最后用NanoDrop(Thermo ScientificTMNanoDropTM One)测定浓度，分装、存储备用。
表2 筛选得到的抗PD-L1杂交瘤单克隆及其重组抗体的序列号SEQ ID NO
Figure GPA0000304275720000611
1.4 PD-L1抗体的序列分析和表达纯化
抗体的重链可变结构域序列来源于染色体上重链基因群的胚系基因V、D、J基因片段的基因重排和体细胞高频突变等事件；轻链可变结构域序列来源于轻链基因群的胚系基因V、J基因片段的基因重排和体细胞高频突变等事件。基因重排和体细胞高频突变是增加抗体多样性的主要因素。来源于相同胚系V基因片段的抗体也可能产生不同的序列，但总体上相似性较高。利用一些算法，例如IMGT/DomainGapAlign(http：//imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi)或者NCBI/IgBLAST(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)可以从抗体的可变结构域序列推测出其发生基因重排时可能的胚系基因片段。将实施例1.3和表2中的抗体序列进行分析，其重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的胚系基因V基因片段列于表3。
蛋白质或多肽氨基酸链在细胞中翻译合成后有时会引入化学修饰，称为翻译后修饰(PTM)。对于抗体而言，一些PTM的位点是非常保守的，例如，在人的IgG1抗体的恒定结构域的第297位(EU编号)的保守的氨基酸天冬酰胺Asn通常会发生糖基化修饰形成糖链，而该糖链结构对于抗体结构和相关的效应子功能是至关重要的。但是，如果在抗体的可变结构域尤其是抗原结合区域(如CDR)中存在PTM，那么这些PTM的存在有可能会对抗原的结合有较大的影响，也可能对抗体的物理化学性质带来变化。例如，糖基化、脱酰胺、异构化、氧化等都可能增加抗体分子的不稳定性或异质性，从而增加抗体开发的难度和风险。因而避免一些潜在的PTM对于治疗性抗体的开发是非常重要的。随着经验的积累，人们发现一些PTM是和氨基酸序列的组成尤其是相邻氨基酸组成的“模式”是高度相关的，这样使得可以从蛋白质的一级氨基酸序列预测出潜在的PTM。例如，N-x-S/T(第一位是天冬酰胺，第二位是非脯氨酸以外的任意氨基酸，第三位是丝氨酸或者苏氨酸)的序列模式预测出N-连接糖基化位点。引起PTM的氨基酸序列模式有可能来源于胚系基因序列，例如人胚系基因片段IGHV3-33天然地在FR3区域存在糖基化模式NST；也可能来源于体细胞高频突变。表3列出了实施例1.3的抗体的可变结构域VH和VL的预测的PTM。具体说来，NGS或NLT可能是糖基化位点，DG可能引起天冬氨酸的异构化。
可以通过氨基酸突变来破坏PTM的氨基酸序列模式，从而降低或者去除特定PTM的形成。根据抗体序列和PTM序列模式的不同，有不同的突变设计方法。一种方法是将“热点”氨基酸(如NS模式中的N或S)替换成物理化学性质相似的氨基酸(如把N突变为Q)。如果PTM序列模式来源于体细胞高频突变，而并不存在于胚系基因序列中，那么另一种方法可以是把该序列模式替换成对应的胚系基因序列。实际操作中，对同一个PTM序列模式可能采用多种突变设计方法。
表4列出了对六个来自实施例1.3的具有潜在PTM位点的抗体的序列进行氨基酸突变得到的新的抗体分子(称为PTM变体)。表5-1列出了本实施例中这些PTM变体的轻、重链可变结构域氨基酸序列，轻链全长氨基酸序列，重链(人IgG1(N297A))全长氨基酸序列，和根据Chothia定义规则定义的CDR的氨基酸序列。所有设计出来的PTM变体按照实施例1.3中描述的方法得到纯化的重组抗体，并在后续的功能实验中进一步验证。
表3 PD-L1抗原结合蛋白序列的胚系基因分析和翻译后修饰位点(PTM)分析
Figure GPA0000304275720000621
Figure GPA0000304275720000631
表4 PD-L1抗原结合蛋白序列的突变位点设计
初始抗体 PTM变体 突变点 变体VH PTMs 变体VL PTMs
PR000066 PR000261 H：D54E；L：N65S / /
PR000066 PR000262 H：G55A；L：N65S / /
PR000069 PR000263 H：D54E / /
PR000069 PR000264 H：G55A / /
PR000070 PR000265 H：D54E / /
PR000070 PR000266 H：G55A / /
PR000072 PR000267 H：D54E / /
PR000072 PR000268 H：G55A / /
表5-1 突变PTM后得到的抗体的SEQ ID NO
Figure GPA0000304275720000632
Figure GPA0000304275720000641
表5-2列出了本申请的实施例中出现的对照抗体PR000151、PR001598和PR000265的Fc类型的转换抗体PR000416的分子的序列号，其中，PR000151是Roche的抗PD-L1抗体atezolizumab(阿特珠单抗)类似物，在本文中，PR000151与atezolizumab可互换地使用；PR001598是Merck KGaA的抗PD-L1抗体avelumab(阿维鲁单抗)类似物，在本文中，PR001598与avelumab可互换地使用。上述抗体通过实施例1.3的方法制备纯化。
表5-2 PR000265的Fc类型转换和对照抗体
抗体说明 抗体编号 轻链 重链 VL VH 恒定区类型
atezolizumab类似物 PR000151 159 128 117 96 hIgG1(N297A)
avelumab类似物 PR001598 164 140 119 105 hIgG1
PR000265的Fc类型转换 PR000416 162 137 114 101 hIgG1
实施例2 抗原结合蛋白与过表达人/食蟹猴PD-L1的细胞的结合(FACS)
本实施例为了研究PD-L1抗原结合蛋白体外结合人/食蟹猴PD-L1的活性，采用过表达人PD-L1的CHOK1细胞株(CHO-K1/hPD-L1，南京金斯瑞，M00543)或过表达食蟹猴PD-L1的CHOK1细胞株(CHOK1/cynoPD-L1，南京金斯瑞，M00573)进行细胞水平的结合实验。简言之，消化PD-L1细胞，并用F-12K完全培养基重悬，将细胞密度调整为1x106细胞/mL。以100μL细胞/孔接种于96孔V底板(Corning，3894)，随后加入100μL/孔，2倍于终浓度的5倍浓度梯度稀释的待测抗原结合蛋白，混合均匀，其中抗原结合蛋白最高终浓度为100nM，共8个浓度，同型抗体hIgG1 iso作为对照。将细胞放置于4℃，避光孵育1小时。之后，加入100μL/孔预冷PBS漂洗细胞两次，于500g，4℃下离心5分钟，弃上清。再加入100μL/孔荧光二抗(山羊抗人IgG(H+L)第二抗体Alexa Fluor 488 conjugate，Invitrogen，A11013，1：1000稀释)，4℃，避光孵育30分钟。用200μL/孔预冷PBS洗涤细胞两次，于500g，4℃下离心5分钟，弃上清。最后，200μL/孔预冷PBS重悬细胞。使用BD FACS CANTOII读取荧光发光信号值。使用流式细胞仪BD FACS CANTOII读取荧光发光信号值，并用软件FlowJo v10(FlowJo，LLC)处理和分析数据。应用软件GraphPad Prism 8进行数据处理和作图分析，通过四参数非线性拟合，得到结合曲线及EC50值等参数。
图1和表6的结果显示了本申请所述PD-L1抗原结合蛋白均能结合人PD-L1；图2和表7的结果显示了所述PD-L1抗原结合蛋白均能结合食蟹猴PD-L1；并且呈现浓度依赖效应。
表6 结合细胞表面的人PD-L1
抗原结合蛋白 MFI最大值 EC50(nM)
PR000064 7885 0.417
PR000065 7657 0.412
PR000066 7859 0.255
PR000067 7342 0.456
PR000068 7636 0.326
PR000069 7529 0.312
PR000070 7787 0.210
PR000071 6894 0.521
PR000072 7629 0.292
atezolizumab 6765 0.188
hIgG1对照 305 N.A.
表7 结合细胞表面的猴PD-L1
Figure GPA0000304275720000651
Figure GPA0000304275720000661
实施例3 抗原结合蛋白与人/食蟹猴PD-L1蛋白的结合
本实施例利用酶联免疫吸附测定法(ELISA)研究PD-L1抗原结合蛋白体外结合人/食蟹猴PD-L1蛋白的活性。
3.1抗原结合蛋白与人PD-L1蛋白的结合(ELISA)
将人PD-L1(Acrobiosystems，PD1-H5229)用PBS稀释为2μg/ml，加至96孔板(Corning，9018)中，每孔100μl，4℃下孵育过夜。弃去液体后用PBST缓冲液(pH7.4，含005％tween-20)洗板3次，加入250μl 2％BSA封闭液，37℃条件下孵育1小时。弃去封闭液，并用PBST缓冲液(pH7.4，含0.05％吐温-20)洗板3次，将待测抗原结合蛋白，自100nM浓度起，依次进行5倍浓度稀释，共8个浓度梯度，每个孔加入100μl，37℃孵育1小时，同型抗体hIgG1iso作为对照。PBST缓冲液(pH7.4，含0.05％吐温-20)清洗3次后，加入稀释4000倍的羊抗人HRP二抗(Invitrogen，A18805)，37℃条件下，避光孵育1小时。PBST缓冲液(pH7.4，含0.05％tween-20)清洗3次后，添加100μl/孔TMB(Biopanda，TMB-S-003)，室温避光放置约5分钟；每孔加入50μl/孔终止液(BBI life sciences，E661006-0200)终止反应。用酶标仪Enspire(PerkinElemer)检测450nm吸收值(OD450)。应用软件GraphPad Prism 8进行数据处理和作图分析，通过四参数非线性拟合，得到结合曲线及EC50值等参数。
图3和表8显示了本申请所述PD-L1抗原结合蛋白均能与人PD-L1蛋白结合，且PTM变体仍保留了亲本抗体的结合活性。
表8 结合人PD-L1蛋白
Figure GPA0000304275720000662
Figure GPA0000304275720000671
3.2抗原结合蛋白与食蟹猴PD-L1蛋白的结合(ELISA)
将食蟹猴(Cynomolgus)的PD-L1蛋白(Acrobiosystems，PD1-C52H4)用PBS稀释为2μg/ml，加至96孔板(Corning，9018)中，每孔100μl，4℃下孵育过夜。弃去液体后用PBST洗板3次，加入250μl的2％BSA封闭，室温条件下孵育1小时。弃去封闭液，并用PBST缓冲液(pH7.4，含0.05％tween-20)洗板3次，将待测抗原结合蛋白浓度稀释至5μg/ml，加入100μl/孔，37℃孵育1小时。PBST缓冲液(pH7.4，含0.05％tween-20)清洗3次后，加入稀释4000倍稀释的羊抗人HRP二抗(Invitrogen，A18805)，37℃孵育1小时。清洗后添加100μl/孔TMB(Biopanda，TMB-S-003)，室温避光放置5分钟；每孔加入50μl/孔终止液(BBI lifesciences，E661006-0200)终止反应。用酶标仪Enspire(PerkinElemer)检测450nm吸收值(OD450)。
结果如图4所示，本申请所述PD-L1抗原结合蛋白均能结合食蟹猴PD-L1蛋白。
实施例4 抗原结合蛋白阻断人PD-1与过表达人PD-L1的CHO-K1细胞的结合
为了研究人PD-L1结合蛋白体外阻断人PD-1与人PD-L1结合的活性，采用过表达人PD-L1的CHOK1细胞株(CHO-K1/hPD-L1，南京金斯瑞，M00543)进行细胞水平的人PD-1/人PD-L1结合阻断实验。简言之，消化CHO-K1/hPD-L1细胞，并用F-12K完全培养基重悬，将细胞密度调整为1x106细胞/mL。以100μL细胞/孔接种于96孔V底板(Corning，3894)，随后加入100μL/孔，2倍于终浓度的3倍浓度梯度稀释的待测抗原结合蛋白，混合均匀，其中抗原结合蛋白最高终浓度为100nM，共8个浓度，同型抗体hIgG1 iso作为对照。将细胞放置于4℃，避光孵育1小时。之后，4℃下离心5分钟，弃上清，随后加入50μL/孔，1μg/mL浓度的生物素标记的人PD-1蛋白(Acrobiosystems，PD1-H82F2)，4℃，避光孵育30分钟。加入100μL/孔预冷PBS漂洗细胞两次，于500g，4℃下离心5分钟，弃上清。加入100μL/孔荧光二抗PE Streptavidin(BDPharmingen，554061，1∶200稀释)，4℃，避光孵育30分钟。用200μL/孔预冷PBS洗涤细胞两次，于500g，4℃下离心5分钟，弃上清。最后，200μL/孔预冷PBS重悬细胞。使用BD FACSCANTOII读取荧光发光信号值。应用软件GraphPad Prism 8进行数据处理和作图分析，通过四参数非线性拟合，得到结合曲线及IC50值等参数。
图5和表9显示本申请所述PTM突变前的抗原结合蛋白均能阻断人PD-1与细胞表面的人PD-L1结合；图6和表10显示本申请所述PTM变体的抗原结合蛋白均能阻断人PD-1与细胞表面的人PD-L1结合；阻断能力与atezolizumab类似物的相当。
表9 阻断人PD-1与细胞表面的人PD-L1结合
抗原结合蛋白 最大抑制率(％) IC50(nM)
PR000064 91.46 0.938
PR000066 91.81 0.539
PR000067 91.16 0.894
PR000068 91.37 0.853
PR000069 92.35 0.836
PR000070 90.74 0.449
PR000071 91.58 0.987
PR000072 92.49 0.746
atezolizumab 91.45 0.536
hIgG1对照 N.A. N.A.
表10 阻断人PD-1与细胞表面的人PD-L1结合
Figure GPA0000304275720000681
Figure GPA0000304275720000691
实施例5 抗原结合蛋白阻断人PD-L1蛋白与其配体蛋白的结合
本实施例利用酶联免疫吸附测定法(ELISA)研究PD-L1抗原结合蛋白体外阻断人PD-L1蛋白与其配体蛋白PD-1或CD80的结合的能力。
5.1抗原结合蛋白阻断人PD-L1与人PD-1的结合(ELISA)
将人PD-L1(Acrobiosystems，EP-101-96tests，A001-214)用PBS稀释成2μg/ml加入到96孔板(Corning，9018)中，每孔100μl，4℃包被过夜。弃去液体后用PBST缓冲液(pH7.4，含0.05％tween-20)洗板3次，加入250μl 2％BSA封闭液，37℃条件下孵育1小时。弃去封闭液，并用PBST缓冲液(pH7.4，含0.05％tween-20)洗板3次，将待测抗原结合蛋白，用PBST with 0.5％(w/v)BSA稀释成不同浓度梯度，与0.6μg/ml人PD-1-Biotin蛋白(Acrobiosystems，EP-101-96tests，A002-214)混合后，加入孔板，同型抗体hIgG1 iso作为对照，37℃条件下孵育1小时。洗涤3次后每孔加入100μl Streptavidin-HRP(Acrobiosystems，EP-101-96tests，A003-214)，37℃条件下，避光反应1小时。洗涤3次后加入100μl TMB显色液，室温下避光显色5分钟。加入终止液终止反应。用酶标仪Enspire(PerkinElemer)检测450nm吸收值(OD450)。应用软件GraphPad Prism 8进行数据处理和作图分析，通过四参数非线性拟合，得到结合曲线及IC50值等参数。
图7和表11显示了本申请所述抗原结合蛋白能阻断人PD-1与人PD-L1蛋白结合；阻断能力与atezolizumab类似物的相当。
表11 阻断人PD-1与人PD-L1蛋白结合
Figure GPA0000304275720000692
Figure GPA0000304275720000701
5.2抗原结合蛋白阻断人PD-L1与人B7-1(CD80)的结合(ELISA)
将人PD-L1-hFc蛋白(Acrobiosystems，PD1-H5258)用PBS稀释成1μg/ml加入到96孔板(Corning，9018)中，每孔100μl，4℃包被过夜。弃去液体后用PBST缓冲液(pH7.4，含0.05％tween-20)洗板3次，加入250μl 2％BSA封闭液，37℃条件下孵育15小时。弃去封闭液，并用PBST缓冲液(pH7.4，含0.05％tween-20)洗板3次，将待测抗原结合蛋白，用PBSTwith 0.5％(w/v)BSA稀释成不同浓度梯度，与10μg/ml人B7-1-Biotin蛋白(Acrobiosystems，B71-H82F2)混合后，加入孔板，同型抗体hIgG1 iso作为对照，37℃条件下孵育1.5小时。洗涤3次后每孔加入100μl Streptavidin-HRP(SIGMA，S2438)，37℃条件下，避光反应1小时。洗涤3次后加入100μl TMB显色液，室温下避光显色5分钟。加入终止液终止反应。用酶标仪Enspire(PerkinElemer)检测450nm吸收值(OD450)。应用软件GraphPadPrism 8进行数据处理和作图分析，通过四参数非线性拟合，得到结合曲线及IC50值等参数。
图8和表12显示了本申请所述抗原结合蛋白均能阻断人B7-1(CD80)与人PD-L1蛋白结合。
表12 阻断人B7-1(CD80)与人PD-L1结合
Figure GPA0000304275720000702
Figure GPA0000304275720000711
实施例6 利用报告基因细胞系检测抗原结合蛋白对PD-1信号通路的抑制作用
将共表达人PD-L1和OS8(CD3单链抗体跨膜蛋白)的Hep3B(睿智化学(上海)构建)细胞接种到96孔板上，细胞量为1.25×104/孔，100μL/孔。37℃在5％CO2环境下孵育过夜。去除上清液，加入50μL/孔的待测抗原结合蛋白稀释液，起始浓度为100nM，5倍浓度稀释，同型抗体hlgG1 iso为对照组。加入5×104/孔的可持续表达PD-1和NFAT-荧光素酶报告基因的Jurkat报告细胞(睿智化学(上海)构建)50μL/孔。37℃在5％CO2环境下培养6小时。加入ONE-GloTM荧光素酶试剂(Promega，货号E6110)，室温孵育5分钟，酶标仪检测发光值。
图9和表13以及图10和表14显示了本申请所述抗原结合蛋白对PD-1信号通路有抑制作用；除PR000071以外，其余分子对PD-1信号通路的抑制作用与atezolizumab类似物的相当。
表13 对PD-1信号通路的抑制作用
Figure GPA0000304275720000712
Figure GPA0000304275720000721
表14 对PD-1信号通路的抑制作用
抗原结合蛋白 最大荧光值(RLU) EC50(nM)
atezolizumab 43162 0.416
hIgG1对照 N.A. N.A.
PR000265 50732 0.533
PR000266 48436 0.680
PR000267 42982 0.796
PR000268 45501 0.759
实施例7.利用BLI方法测定抗原结合蛋白与人PD-L1的亲和力
7.1测定抗原结合蛋白与人PD-L1的解离常数，单浓度抗原解离速率的比较
带有组氨酸标签的人PD-L1蛋白购自厂家NovoProtein(货号C315)；测试缓冲液为1x动力学缓冲液(从10x动力学缓冲液(ForteBio，货号18-1105)稀释)，用于亲和力测试以及抗原、抗体的稀释；通过生物膜干涉(BLI)技术，使用Octet分子相互作用分析仪(ForteBio，型号Octet Red96e)，来进行抗原抗体之间的结合动力学分析。
测定抗原和抗体的亲和力时，传感器转动速度为1000转/分钟。先将置于一列的2个AHC传感器在测试缓冲液中平衡10分钟，然后用AHC传感器捕获待测抗原结合蛋白，捕获高度0.9-1.1nm，然后将AHC传感器在测试缓冲液中平衡2分钟，然后将AHC传感器与抗原(60nM以及0nM)结合3分钟，最后解离15分钟。将AHC传感器浸入10mM甘氨酸(pH1.5)溶液进行再生，以洗脱结合在传感器上的蛋白。
使用Octet Data Analysis软件(Fortebio，版本11.0)进行数据分析时，选择单扣除模式(reference well)扣除参照信号，选择“1∶1 Local/full fitting”方法进行数据拟合，计算出抗原与抗体结合的动力学参数，得到kon(1/Ms)值、kdis(1/s)值和KD(M)值。
结果如图11(A-B)和表15-1所示，PR000265和PR000266与PD-L1均具有较高的亲和力。
表15-1 抗原结合蛋白与人PD-L1的亲和力
抗原结合蛋白 K<sub>on</sub>(1/Ms) k<sub>dis</sub>(1/s) K<sub>D</sub>(M)
PR000265 2.60E+05 1.06E-04 4.09E-10
PR000266 2.76E+05 9.62E-05 3.49E-10
7.2测定抗原结合蛋白与人PD-L1的结合常数和亲和力(多浓度抗原)
按照实施例7.1的方法，测定抗原(多浓度)和抗体的亲和力。测定抗原(多浓度)和抗体的亲和力时，传感器转动速度为1000转/分钟。先将两列AHC传感器(每列放置8个传感器；第一列称为参照AHC传感器，第二列称为测试AHC传感器)在测试缓冲液中平衡10分钟。然后，用8个测试AHC传感器捕获待测抗原结合蛋白(浓度40nM)，捕获时间30秒，捕获高度约0.7nm；8个测试AHC传感器在测试缓冲液中平衡2分钟后与梯度稀释的抗原蛋白(例如，抗原浓度可以为50-1.56nM的两倍梯度稀释以及0nM)结合，8个传感器可以分别浸入到最多8个不同浓度的抗原中；与抗原结合5分钟，然后解离15分钟；最后将AHC传感器浸入10mM甘氨酸(pH 1.5)溶液进行再生，以洗脱结合在传感器上的蛋白。参照AHC传感器的实验步骤与测试AHC传感器相同，唯一的区别是在第一步将8个参照AHC传感器浸入不含待测分子的测试缓冲液中30秒。
使用Octet Data Analysis软件(Fortebio，版本11.0)进行数据分析时，选择双扣除模式(double reference)扣除参照信号，选择“1∶1 Global fitting”方法进行数据拟合，计算出抗原与抗原结合蛋白结合的动力学参数，得到kon(1/Ms)值、kdis(1/s)值和KD(M)值。
结果如图11(C-E)和表15-2所示，PR000265与PD-L1的亲和力比PR000151(atezolizumab类似物)和PR001598(avelumab类似物)更高。
表15-2 抗原结合蛋白与人PD-L1的亲和力
Figure GPA0000304275720000731
Figure GPA0000304275720000741
实施例8 利用BLI方法测定抗原结合蛋白结合PD-L1的表位竞争
首先将人PD-L1蛋白(NovoProtein，C315)先利用生物素化试剂盒(EZ-LinkSulfo-NHS-LC-Biotin，ThermoFisher，A39257)按照说明书要求进行生物素化。然后使用ForteBio Octet平台对得到的抗原结合蛋白和PR000151(atezolizumab类似物)以及PR001598(avelumab类似物)进行表位竞争实验。第一步，获取抗体的100％信号：用SA传感器捕获生物素化的PD-L1蛋白，捕获高度为0.25nm。将传感器浸入抗体中(50nM)，时间500秒，将该抗体与PD-L1结合的最终信号记录为该抗体的100％信号。第二步，表位竞争实验：用SA传感器捕获生物素化的PD-L1蛋白，捕获高度为0.25nm。将传感器浸入第一抗体中(50nM)，时间500秒，再将SA传感器浸入第一抗体和第二抗体的混合物中(两种抗体的终浓度均为50nM)，时间500秒，将最终信号记录为该第二抗体的信号。抑制率通过下式计算，
抑制率(％)＝(A-B)/A*100
A：某抗体的100％信号(从第一步中获得)，B：该抗体作为第二抗体的信号(从第二步获得)。
若得到的抑制率大于85(％)，则意味着两种抗体的表位完全重叠；若抑制率小于85(％)，则意味着两种抗体结合的表位不完全重叠。
其中，抗体PR000416是将本申请所述抗原结合蛋白PR000265的重链恒定区更换为无突变的人IgG1恒定区得到的抗体。
结果显示PR000265(或PR000416)与对照抗体PR000151或PR001598的表位不完全重叠，见表16-1和表16-2。
表16-1 抗原结合蛋白的表位竞争
Figure GPA0000304275720000742
表16-2 抗原结合蛋白的表位竞争
Figure GPA0000304275720000743
Figure GPA0000304275720000751
实施例9 抗原结合蛋白在混合淋巴细胞反应(MLR)中刺激细胞因子分泌
用Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare，17144002)从第一供体全血中分离PBMC细胞，加入重组人源IL-4(R&D Systems，204-GMP)和重组人源GM-CSF(R&D Systems，215-GM/CF)诱导6天后，获得未成熟的人CD14+树突状细胞(iDC细胞)；继续加入1μg/ml的脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS；Sigma，L2630)，诱导24小时，获得成熟的树突状细胞(mDC细胞)。采用T细胞分离试剂盒(StemCell，17951)从第二供体的PBMC细胞中分离得到T淋巴细胞。将1×105/孔的T淋巴细胞和1×104/孔的mDC细胞按10∶1比例接种至96孔板，加入10μg/ml各抗原结合蛋白和及对照抗体，并做10倍或者对应倍数的稀释。于37℃，5％CO2培养箱孵育5天。分别收集72小时后和120小时后的上清液。采用IL2 ELISA试剂盒(Thermo，88-7025-88)检测72小时后上清液中的IL-2的水平；采用IFN-γELISA试剂盒(Thermo，88-7316-88)检测120小时后上清液中的IFN-γ的水平；具体操作参考试剂说明书。
本实施例使用了四个供体的PBMC分成了两组供体配对进行混合淋巴细胞反应(MLR)。结果如图12(A-D)所示，在两次独立的MLR实验中，抗原结合蛋白都能增强激活的T淋巴细胞分泌细胞因子IL-2和IFN-γ。
实施例10 抗体依赖的细胞毒性实验
本实施例测定抗体依赖的细胞毒性(ADCC)。本实施例使用PBMC作为效应细胞，使用多种PD-L1高表达的肿瘤细胞系作为靶细胞(如MDA-MB-231细胞(ATCC，HTB-26)，NCI-H292细胞(ATCC，CRL-1848))。具体说来，将新鲜的PBMC离心弃去上清，重悬到10％FBS-RPMI1640培养基中，37°培养箱培养过夜。然后收集PBMC细胞，离心弃上清，重悬到2％FBS-RPMI1640培养基中，计数，调整细胞密度至1×107/ml，将PBMC加入到U型底96孔板中，50μl/孔。收集靶细胞，离心弃去上清，重悬到2％FBS-RPMI1640培养基中，计数，调整细胞密度至4×105/ml，将靶细胞加入到U型底96孔板中，25μl/孔。效应细胞与靶细胞比例为50∶1。稀释抗体至中间浓度，起始浓度为1.6nM，5倍梯度稀释，共3个浓度。将样品加入到U型底96孔板中，25μl/孔，样品最终起始浓度为0.4nM。将细胞板放入培养箱中孵育3.5小时，向靶细胞最大释放孔和体积参照孔加入10μl裂解液，继续孵育30分钟，细胞和样品共同孵育总时间为4小时。取出50μl/孔上清至透明平底96孔板中，加入Promega LDH试剂盒(Promega LDH-GloTM，J2380)检测试剂50μl/孔。室温孵育20分钟，加入50μl反应终止液，终止反应。酶标仪读取OD450nm吸光值。根据下面计算公式计算细胞毒性。
细胞毒性(％)＝((ER-CMB)-(ESR-CMB)-(TSR-CMB))/(TMR-VCC)×100％
其中：
ER＝实验孔，样品+效应细胞+靶细胞
ESR＝效应细胞自然释放孔，效应细胞+培养基
TSR＝靶细胞自然释放孔，靶细胞+培养基
TMR＝靶细胞最大释放空，靶细胞+培养基+裂解液
VCC＝体积参照孔，培养基+裂解液
CMB＝培养基参照孔，培养基
本实施例使用了三个供体的PBMC和两个肿瘤细胞系，共六个独立ADCC实验。结果如图13(A-F)所示，PR000416(PR000416是将PR000265更换为无突变的人IgG1恒定区得到的抗体)比PR001598(avelumab类似物)有更强的ADCC作用。
实施例11 抗原结合蛋白的体内抑制肿瘤活性
将MC38-hPD-L1(过表达人PD-L1的MC38细胞)结肠癌细胞5×105个/0.1mL接种于雌性B-hPD-1人源化小鼠(百奥赛图)右侧皮下，待肿瘤生长到约118mm3时按肿瘤体积随机分组，每组10只，共5组，分别为：Human IgG1(3mg/kg，人IgG1同型对照组)、PR000151(3mg/kg，Atezolizumab低剂量组)、PR000151(10mg/kg，Atezolizumab高剂量组)、PR000265(3mg/kg，本申请抗体低剂量组)和PR000265(10mg/kg，本申请抗体高剂量组)。给药途径为腹腔注射，每2天给药1次，总计给药13次(q2dx13)。每周测量肿瘤体积及体重2次，记录小鼠体重和肿瘤体积。
在分组给药第20天时，hIgG1对照组肿瘤体积为1359±171mm3。抗PD-L1抗体PR000151在3mg/kg和10mg/kg剂量下肿瘤体积分别为898±233mm3和741±203mm3，TGI分别为33.9％和45.5％。抗PD-L1抗体PR000265在3mg/kg和10mg/kg剂量下肿瘤体积分别为881±169mm3和1035±472mm3，TGI分别为35.1％和23.8％。在分组给药第24天时，human IgG1对照组肿瘤体积为1876±203mm3。抗PD-L1抗体PR000151在3mg/kg和10mg/kg剂量下肿瘤体积分别为1349±306mm3和949±266mm3，TGI分别为28.1％和49.4％。抗PD-L1抗体PR000265在3mg/kg和10mg/kg剂量下肿瘤体积分别为1228±187mm3和937±225mm3，TGI分别为34.5％和50.1％。PR000151和PR000265在3mg/kg，10mg/kg剂量下都有明显的肿瘤抑制效果，且与hIgG1相比，有统计学差异(P＜0.05)。PR000151和PR000265药效相似，组间比较未见统计学差异(P＞0.05)。
结果如图14所示，PR000151和PR000265有明显肿瘤抑制效果，在实验过程中，各组动物体重均出现增长，表明动物对受试品耐受良好。未对动物产生明显毒性作用，安全性好。
实施例12 抗PD-L1和抗TGFB的双功能融合蛋白的制备和表征分析
12.1构建融合蛋白分子
在实施例1得到的抗原结合蛋白的C末端通过长度合适的柔性肽段(Linker)融合人TGFB受体(TGFBRII)胞外区的序列构建双功能融合蛋白分子。将编码多肽序列的质粒转染哺乳动物宿主细胞(如HEK293或者ExpiCHO)，利用实施例1.3所述方法进行融合蛋白的重组表达和纯化，得到本申请所述融合蛋白PR001487、PR001488、PR001901、PR001902、PR002247、PR002248、PR002249和PR002251，各部分结构见表17，抗体轻链、重链和各结构域的序列号见表18。另外，制备蛋白分子M7824(也称为PR001599，其为bintrafusp alfa类似物)，蛋白分子Hengrui融合蛋白9(也称为PR002466，其序列来源于专利WO2018205985A1)，以及TGFBRII Trap(也称为PR002040，其利用抗鸡溶菌酶的抗体克隆TEL16的序列与TGFBRII胞外区截短序列融合得到)作为实施例中的对照，其各部分结构和序列号见表17和表18。
表17 本申请所述融合蛋白各部分结构
Figure GPA0000304275720000771
Figure GPA0000304275720000781
表18 本申请所述融合蛋白的序列号SEQ ID NO
Figure GPA0000304275720000782
12.2利用HPLC-SEC分析蛋白纯度和多聚体
使用分析型分子尺寸排阻层析色谱法(SEC)来分析蛋白样品的纯度和聚体形式。将分析型色谱柱TSKgel G3000SWxl(Tosoh Bioscience，08541，5μm，7.8mmx30cm)连接到高压液相色谱仪(HPLC)(型号Agilent Technologies，Agilent 1260 Infinity II)，用PBS缓冲液室温下平衡至少1小时。适量蛋白样品(至少10μg，样品浓度调整到1mg/ml)用0.22μm滤膜过滤后注射入系统，并设定HPLC程序：用PBS(pH 7.4)缓冲液将样品以1.0ml/min的流速流过色谱柱，最长时间为20分钟；检测波长280nm。采集后用ChemStation软件对色谱图进行积分并计算相关数据，生成分析报告，报告出样品内不同分子尺寸组份的滞留时间。
12.3利用HPLC-HIC分析蛋白纯度和疏水性
使用分析型疏水相互作用层析色谱法(HIC)来分析蛋白样品的纯度和疏水性。将分析型色谱柱TSKge1 Buty1-NPR(Tosoh Bioscience，14947，4.6mmx3.5cm)连接到高压液相色谱仪(HPLC)(型号Agilent Technologies，Agilent 1260 Infinity II)，用PBS缓冲液室温下平衡至少1小时。设定方法由16分钟内从100％流动相A(20mM组氨酸，1.8M硫酸铵，pH6.0)至100％流动相B(20mM组氨酸，pH 6.0)的线性梯度，流速设定为0.7ml/min，蛋白样品浓度1mg/ml，进样体积20μl，检测波长280nm。采集后用ChemStation软件对色谱图进行积分并计算相关数据，生成分析报告，报告出样品内不同分子尺寸组份的滞留时间。
12.4利用DSF测定蛋白分子的热稳定性
差示扫描荧光法(Differential Scanning Fluorimetry，DSF)是一种常用的高通量的用来测定蛋白质热稳定性的方法。它使用实时荧光定量PCR仪器通过监测与去折叠的蛋白分子结合的染料的荧光强度的变化，来反映蛋白质的变性的过程，从而反映出蛋白分子的热稳定性。本实施例利用DSF方法来测定蛋白分子热变性温度(Tm)。10μg蛋白加入96-孔PCR板(Thermo，AB-0700/W)，接着加入2μl 100X稀释的染料SYPROTM(Invitrogen，2008138)，然后加入缓冲液使得终体积为40μl每孔。将PCR板密封，放置于实时荧光定量PCR仪器(Bio-Rad CFX96 PCR System)，先于25℃孵育5分钟，然后以0.2℃/0.2分钟的梯度逐渐从25℃升温至95℃，在测试结束时将温度降至25℃。使用FRET扫描模式并使用Bio-RadCFX Maestro软件进行数据分析并计算出样品的Tm。
12.5融合蛋白的表达和表征分析
实施例12.1所得的融合蛋白的表达和物理化学性质见表19。结果显示，PR001488和PR001902比对照蛋白PR002466、PR001599有更高的产量，PR001488和PR001902比对照蛋白PR001599有更好的亲水性(体现为在HPLC-HIC上更短的滞留时间)。总体上，PR001488和PR001902表现出比PR001599更稳定的物理化学物质。
表19 融合蛋白的表达和物理化学性质
Figure GPA0000304275720000791
Figure GPA0000304275720000801
实施例13 融合蛋白结合过表达人PD-L1的CHO-K1细胞
按照实施例2的方法检测本申请所述融合蛋白在体外结合人PD-L1的活性。
图15(A)和表20-1以及图15(B)和表20-2显示了本申请所述融合蛋白均能结合过表达人PD-L1的CHO-K1细胞。
表20-1 结合细胞表面的人PD-L1
融合蛋白 MFI最大值 EC50(nM)
atezolizumab 50075 0.3785
PR001487 52996 0.3137
PR001488 51536 0.5311
PR001598 42395 0.5069
PR001599 46184 0.7181
PR001901 46836 0.4884
PR001902 45373 0.5147
PR000416 40359 0.2585
表20-2 结合细胞表面的人PD-L1
融合蛋白 MFI最大值 EC50(nM)
PR002247 43412 0.8518
PR002248 43291 0.9836
PR002249 41931 0.5844
PR002251 41242 0.5012
PR000416 37937 0.2313
实施例14 融合蛋白阻断人PD-1与过表达人PD-L1的CHO-K1细胞的结合
按照实施例4的方法检测本申请所述融合蛋白体外阻断人PD-1与人PD-L1结合的活性。
图16(A)和表21-1以及图16(B)和表21-2显示了本申请所述融合蛋白均能阻断人PD-1与过表达人PD-L1的CHO-K1细胞的结合。
表21-1 阻断人PD-1与细胞表面的人PD-L1结合
融合蛋白 IC50(nM)
PR001487 0.2157
PR001488 0.2661
PR001598 0.4416
PR001599 0.3225
PR001901 0.2598
PR001902 0.3107
PR000416 0.1271
表21-2 阻断人PD-1与细胞表面的人PD-L1结合
融合蛋白 IC50(nM)
PR002247 0.3990
PR002248 0.4178
PR002249 0.3999
PR002251 0.3166
PR000416 0.1904
实施例15 利用报告基因细胞系检测融合蛋白对PD-1信号通路的抑制作用
按照实施例6的方法利用报告基因细胞系检测本申请所述的融合蛋白对PD-1信号通路的抑制作用。图17和表22显示了本申请所述融合蛋白对PD-1信号通路有抑制作用。
表22 对PD-1信号通路的抑制作用
融合蛋白 最大荧光值(RLU) EC50(nM)
PR000416 3656 0.077
PR001598 3786 0.068
PR001599 3626 0.091
PR001487 3600 0.056
PR001488 3549 0.049
实施例16 酶联免疫吸附实验法检测融合蛋白体外结合TGFB1的作用
以1μg/ml浓度的人源TGFB1(Novoprotein，CA59)为抗原，按100μl/孔包被96孔板，4℃过夜。200μl/孔1×PBST洗涤3次，加入200μl/孔2％BSA，37℃封闭2小时。加入200μl/孔1xPBST洗涤3次，加入5倍浓度梯度稀释的抗体，其中抗体的最高终浓度为100nM，37℃孵育1小时。200μl/孔1×PBST洗涤3次，每孔加入100μl/孔抗人FC-HRP二抗(Sigma-Aldrich，A0170，1∶4000稀释)，37℃孵育1小时。200μl/孔1×PBST洗涤3次，每孔再加入100μl/孔TMB，室温孵育10分钟后加入50μl/孔1M ELISA终止液停止反应。酶标仪上检测450nm及570nm测吸收值。应用软件GraphPad Prism 8进行数据处理和作图分析，通过四参数非线性拟合，得到结合曲线及EC50值等参数。其中，TGFBRII-Fc是TGFBRII胞外区融合蛋白(Novoprotein，CC10)，PR001599，PR002040为前述对照融合蛋白分子。
图18(A)和表23-1以及图18(B)和表23-2以及图18(C)和表23-3显示了本申请所述融合蛋白均能够有效地与TGFB1结合，并且有药物浓度剂量依赖效应。
表23-1 体外结合TGFB1
Figure GPA0000304275720000821
Figure GPA0000304275720000831
表23-2 体外结合TGFB1
融合蛋白 OD最大值 EC50(nM)
TGFBRII-Fc 1.626 1.132
PR002040 1.627 1.369
PR002247 1.560 1.330
表23-3 体外结合TGFB1
融合蛋白 OD最大值 EC50(nM)
TGFBRII-Fc 1.585 1.115
PR002040 1.638 1.281
PR002248 1.515 1.287
PR002249 1.520 1.426
PR002251 1.526 1.195
实施例17 融合蛋白对TGFB1诱导Smad信号通路激活的抑制作用
该实验使用高表达人源TGFBRI及融合SEAP报告基因的Smad3/4基因的HEK-BlueTMTGFB细胞(Invivogen，hkb-tgfb，)，在细胞水平上研究了融合蛋白对TGFB1诱导的Smad信号通路的激活的抑制作用。加入10μl/孔，5倍浓度梯度稀释的待测融合蛋白于96孔板中，最高终浓度为50nM。随后，加入10μl/孔，终浓度为1ng/ml的人TGFB1蛋白(R&D Systems，240-B/F)于96孔板中。以TGFB1抗体(Biointron，B5484)和TGFBRII-Fc融合蛋白(Novoprotein，CC10)为对照分子。将180μl，2.5×104细胞/孔接种于96孔板中，在二氧化碳培养箱中继续孵育过夜。然后每孔移取20μl细胞上清入另一块96孔板中，然后每孔加入180μl Quanti-Blue工作液(Invivogen，rep-qb1)，37℃下孵育1小时。酶标仪上检测655nm测吸收值。应用软件GraphPad Prism 8进行数据处理和作图分析，通过四参数非线性拟合，得到结合曲线及IC50值等参数。
结果如图19和表24所示，融合蛋白以剂量依赖性形式抑制TGFB1诱导的pSMAD3报告物活性。PR001902与阳性对照PR001599(M7824)具有相当的功效和IC50；其抑制活性和IC50较阳性对照PR002466(Hengrui融合蛋白9)及TGFB抗体强8倍。
表24 对TGFB1诱导Smad信号通路激活的抑制作用
融合蛋白 最大抑制率(％) IC50(nM)
PR002040 111.2 0.0093
PR001599 105.2 0.0090
PR002466 105.2 0.0769
PR001902 112.5 0.0103
TGFBRII-Fc 103.3 0.1402
TGFB1抗体 111.5 0.0876
实施例18 利用BLI测定融合蛋白与人PD-L1的亲和力的结果
使用实施例7.2所述方法测试融合蛋白与人PD-L1蛋白的亲和力。
结果如表25显示，本申请的融合蛋白与人PD-L1的亲和力KD值都小于1×10-8M。
表25 融合蛋白与人PD-L1的亲和力
融合蛋白 K<sub>D</sub>(M) K<sub>D</sub>误差 k<sub>on</sub>(1/Ms) k<sub>on</sub>误差 k<sub>dis</sub>(1/s) k<sub>dis</sub>误差 抗原浓度(nM)
PR001488 1.50E-10 1.21E-12 8.07E+05 2.44E+03 1.21E-04 9.06E-07 25-1.563
PR001599 2.82E-10 2.47E-12 5.42E+05 2.16E+03 1.53E-04 1.19E-06 25-1.563
PR001902 6.05E-11 2.40E-12 7.44E+05 5.06E+03 4.50E-05 1.76E-06 12.5-0.78
PR002249 5.95E-11 1.13E-12 1.07E+06 4.36E+03 6.37E-05 1.18E-06 12.5-0.78
PR002251 9.74E-11 1.17E-12 1.17E+06 4.95E+03 1.14E-04 1.28E-06 12.5-0.78
PR002466 7.16E-11 1.18E-12 1.28E+06 7.43E+03 9.16E-05 1.41E-06 6.25-0.39
实施例19 利用BLI方法测定融合蛋白与人TGFB1的亲和力
首先将人TGFB1蛋白(NovoProtein，CA59)先利用生物素化试剂盒(EZ-LinkSulfo-NHS-LC-Biotin，ThermoFisher，A39257)按照说明书要求进行生物素化。然后按照类似实施例7.2的所述方法，测定融合蛋白与人TGFB1的亲和力。特别地，先将两列SA传感器(每列放置8个传感器；第一列称为参照SA传感器，第二列称为测试SA传感器)在含有0.02％吐温的1×PBS的测试缓冲液中平衡10分钟。然后，测试SA传感器捕获生物素化的人TGFB1，设置捕获高度为0.3nm，而参照SA传感器浸入缓冲液中30秒。两列传感器再与梯度稀释的待测融合蛋白(例如，待测融合蛋白浓度可以为6.25-0.39nM的两倍梯度稀释以及0nM)结合；结合3分钟，然后解离10分钟。
使用Octet Data Analysis软件(Fortebio，版本11.0)进行数据分析时，选择双扣除模式(double reference)扣除参照信号，选择“1∶1 Global fitting”方法进行数据拟合，计算出抗原与抗原结合蛋白结合的动力学参数，得到kon(1/Ms)值、kdis(1/s)值和KD(M)值。
结果如表26显示，本申请融合蛋白与人TGFB1的KD值小于1×109M，且比对照分子PR001599和PR002466显示出更高的亲和力。
表26 与人TGFB1的亲和力
融合蛋白 K<sub>D</sub>(M) k<sub>on</sub>(1/Ms) k<sub>dis</sub>(1/s)
PR001599 1.04E-10 4.10E+06 4.24E-04
PR001902 7.81E-11 3.19E+06 2.50E-04
PR002466 1.28E-10 4.48E+06 5.73E-04
实施例20 利用BLI方法测定融合蛋白结合PD-L1的表位竞争
按照实施例8的方法对融合蛋白和对照分子进行表位竞争实验。结果如表27-1和表27-2所示，PR001488和PR001902与对照分子PR001599或PR002466的表位不完全重叠。
表27-1 融合蛋白的表位竞争
Figure GPA0000304275720000851
表27-2 融合蛋白的表位竞争
Figure GPA0000304275720000852
实施例21 MLR法体外检测融合蛋白对T细胞的激活作用
为了研究PD-L1/TGFB融合蛋白对T细胞的协同激活作用，收集和纯化人外周血单核细胞(PBMC)，分离单核细胞(Meltenyi，130-050-201)，采用完全培养基(RPI1640含50ng/mL IL-4，100ng/mLGM-CSF)培养6天，再加入1μg/ml LPS诱导24h，生成成熟的DC细胞。收集上述培养的细胞离心，用含2％FBS的PBS洗4次，重悬至新鲜的培养基中，调整密度为2x105细胞/mL，100μl/孔接种至96孔细胞培养板。同时，自异体新鲜PBMC中分离Pan T细胞(Meltenyi，130-096-535)新鲜培养基重悬，调整细胞密度为1×106细胞/ml，100μl/孔接种至96孔细胞培养板。将不同浓度的抗体50μl/孔，及终浓度为0.3ng/ml的人TGFB1蛋白(R&DSystems，240-B/F)以50μl/孔分别加入上述96孔细胞培养板的对应孔中，并将细胞培养板于37℃，5％CO2培养箱孵育5天。分别收集72小时后和120小时后的上清液。采用IL2 ELISA试剂盒(Thermo，88-7025-88)检测72小时后上清液中的IL-2的水平；采用IFN-γELISA试剂盒(Thermo，88-7316-88)检测120小时后上清液中的IFN-γ的水平；具体操作参考试剂说明书。
结果如图20所示，在外加TGFB1的条件下，融合蛋白能够增强激活的T淋巴细胞分泌细胞因子IL-2(图20(A))和IFN-γ(图20(B))，并且具有比PD-L1单抗PR000416和阳性对照PR001599和PR002446更强的激活作用。
实施例22 肿瘤细胞介导的抗体依赖的细胞毒性实验的结果
按照实施例10的方法检测本申请所述融合蛋白的肿瘤细胞介导的抗体依赖的细胞毒性。本实施例使用了三个供体的PBMC和两个肿瘤细胞系，共六个独立ADCC实验。结果如图21(A-F)所示，PR001488比阳性对照PR001599有更强的ADCC作用。
实施例23 融合蛋白的药代动力学研究
本实施例测试融合蛋白的药代动力学性能。其方法如下，选取体重18～22克的雌性C57BL/6小鼠3只，按9.53mg/kg PR001902和10mg/kg PR001488的剂量通过静脉注射给与融合蛋白药物；于给药前以及给药后0.5小时、24小时(1天)、第2天、第4天、第7天、第10天和第14天采集全血，将全血静置30分钟使其凝固，随后在4℃下以2,000rpm离心5分钟并将分离的血清样品在-80℃下冻存直至分析。本实施例采用两种ELISA方法来定量测定小鼠血清中的药物浓度。ELISA方法一，即Fc端检测方法，通过包被于96孔板的山羊抗人Fc多克隆抗体来捕获小鼠血清中的含有人Fc的融合蛋白，然后加入HRP标记的山羊抗人Fc第二抗体来检测；ELISA方法二，即TGFBRII端检测方法，通过包被于96孔板的人TGFB1蛋白来捕获小鼠血清中的含有人TGFBRII结构域的融合蛋白，然后加入HRP标记的的山羊抗人Fc第二抗体来检测。使用Phoenix WinNonlin软件6.4版，选用非房室模型(NCA)对血药浓度数据进行分析以评价其药代动力学。
图22和表28显示的是融合蛋白PR001902的药代动力学数据，结果表明，Fc端检测方法下，PR001902在小鼠体内的半衰期约为11天；TGFBRII端检测方法显示，PR001902在小鼠体内的半衰期约为8.5天。
表28 PR001902的药代动力学
Figure GPA0000304275720000871
图23和表29显示的是融合蛋白PR001488的药代动力学数据，结果表明，Fc端检测方法下，PR001488在小鼠体内的半衰期约为10天；TGFBRII端检测方法显示，PR001488在小鼠体内的半衰期约为5天。
表29 PR001488的药代动力学
Figure GPA0000304275720000872
实施例24 融合蛋白对结肠癌CT26-人PD-1/PD-L1转基因小鼠的动物体内模型的抗肿瘤活性
本实施例评价测试药物在小鼠结肠癌细胞CT26-人PDL1(tg)-小鼠PDL1(KO)(将小鼠结肠癌细胞CT26的内源性鼠PD-L1基因敲除并引入外源人PD-L1转基因，集萃药康生物科技)移植免疫检查点人源化小鼠BALB/c-人PD-1/PD-L1(将BALB/c小鼠同时引入外源人PD-1转基因和人PD-L1转基因，集萃药康生物科技)中的抗肿瘤作用。接种对数生长期的CT26-人PDL1(tg)-mPDL1(KO)细胞于人源化小鼠BALB/c-人PD-1/PD-L1腋右侧背部皮下，当平均肿瘤体积达到80-120mm3时，去除肿瘤体积过大的小鼠个体后，小鼠根据肿瘤体积随机分成3组，每组6只。共3个测试组，分别为：人IgG1(10.4mg/kg，人IgG1同型对照组)、M7824(12.3mg/kg，阳性对照)和PR001902(12.2mg/kg，本申请融合蛋白)。分组当天开始腹腔给药，每三天给一次药，共给药6次(q3d×6)。开始给药后，每周称量体重及瘤体积两次，瘤体积计算方式为：肿瘤体积(mm3)＝0.5×肿瘤长径×肿瘤短径2。实验结束后将荷瘤小鼠安乐死并剥瘤称重。计算各组动物的肿瘤体积、小鼠体重等实验结果以平均值±标准误差(Mean±SEM)表示。多组比较采用单因素方差分析(one way ANOVA)检验方法比较不同治疗组与对照组相比有无显著性差异。数据使用SPSS 18.0进行分析。P＜0.05为具有显著性差异。
结果如图24显示，融合蛋白PR001902与阳性对照M7824均能显著抑制CT26-人PD-1/PD-L1小鼠皮下移植瘤的生长；且在实验过程中，各组动物体重均出现增长，表明动物对受试品耐受良好，未对动物产生明显毒性作用，安全性好。
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本申请所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方案的范围内。
序列表
<110> 和铂医药（上海） 有限责任公司
<120> 一种抗PD-L1抗原结合蛋白及其应用
<130> 0113-PA-016CN
<160> 194
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HFWR1
<400> 1
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HFWR1
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HFWR1
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Gln
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Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ala
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<212> PRT
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<220>
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
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<220>
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<212> PRT
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<220>
<223> HFWR2
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<220>
<223> HFWR2
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1 5 10 15
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HFWR3
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Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
20 25 30
Asp Thr Ala Val Phe Tyr Cys Ala Arg
35 40
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HFWR3
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1 5 10 15
Asn Ala Lys Asn Ser Gln Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
20 25 30
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HFWR3
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Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
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Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HFWR3
<400> 25
Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HFWR3
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HFWR3
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Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Glu Gly Gln Val Thr Ile Ser Val Asp
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Lys Ser Ile Thr Thr Ala Tyr Leu His Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser
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Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HFWR3
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Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
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<220>
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HCDR3
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HCDR3
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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<220>
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LFWR1
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LFWR1
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
His Arg Val Thr Ile Thr Cys
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<210> 44
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LFWR1
<400> 44
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Val Thr Cys
20
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LFWR1
<400> 45
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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<400> 46
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
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Ser Ile Thr Ile Ser Cys
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LCDR1
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LCDR1
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Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala
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<210> 51
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LCDR1
<400> 51
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Ile Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 52
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LCDR1
<400> 52
Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 53
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LCDR1
<400> 53
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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<220>
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LFWR2
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<400> 60
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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<400> 62
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1 5 10 15
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Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Asn Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr
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Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
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<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LFWR3
<400> 71
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr
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Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Thr Thr Tyr Tyr Cys
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<211> 32
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys
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<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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<400> 73
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
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Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
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<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
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<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LFWR3
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Gly Ile Ser His Arg Phe Ser Ala Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Glu Leu Gln Pro Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
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Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
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<220>
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Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Ser Arg Thr
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LCDR3
<400> 82
Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Arg Val
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LCDR3
<400> 83
Ala Ser Tyr Thr Glu Ser Lys Thr Tyr Ile
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LCDR3
<400> 84
Gln Gln Ser Phe Glu Asp Pro Leu Thr
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<211> 10
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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<211> 10
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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<400> 86
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Arg
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<211> 10
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LFWR4
<400> 88
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
1 5 10
<210> 89
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LFWR4
<400> 89
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 90
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH
<400> 90
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 91
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH
<400> 91
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Asp Arg Ala Val Ala Gly Ala Ser Ala Phe Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 92
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH
<400> 92
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 93
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH
<400> 93
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Phe Tyr Cys
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100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 94
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH
<400> 94
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Gln Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Ala Val Ala Gly Ala Ser Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 95
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH
<400> 95
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Glu Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Ala Val Ala Gly Ala Ser Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 96
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH
<400> 96
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 97
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH
<400> 97
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Glu Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Asp Arg Ala Val Ala Gly Ala Ser Ala Phe Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 98
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH
<400> 98
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Ala Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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Ala Arg Asp Arg Ala Val Ala Gly Ala Ser Ala Phe Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 99
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH
<400> 99
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Asn Ile Lys Gln Glu Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
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Ala Arg Asp Arg Ala Val Ala Gly Ala Phe Ala Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 100
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH
<400> 100
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Arg Asp Arg Ala Val Ala Gly Ala Phe Ala Ile Trp Gly Gln Gly
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Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 101
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH
<400> 101
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Arg Asp Arg Ala Val Ala Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 102
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH
<400> 102
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Ala Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
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Ala Arg Asp Arg Ala Val Ala Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 103
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH
<400> 103
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 104
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH
<400> 104
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Asn Ile Lys Gln Asp Ala Ser Glu Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
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Ala Arg Asp Arg Ala Val Ala Gly Ala Ser Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 105
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH
<400> 105
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH
<400> 106
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ala Gly Tyr Ser Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Glu Gly Gln Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Ile Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu His Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Val Gly Gly Ala Pro Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
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<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH
<400> 107
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Gly Pro Asn Ser Gly Phe Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL
<400> 108
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ile Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Gly Tyr Ser Arg
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<220>
<223> VL
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Phe Ile Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Gly Ser Ser Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL
<400> 110
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
His Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ile Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asp Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Asn Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Gly Ser Ser Arg
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 111
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL
<400> 111
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Gly Tyr Ser Arg
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL
<400> 112
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Thr Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Ser Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL
<400> 113
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Ile Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Tyr Gly Tyr Ser Arg
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Ile Trp
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
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65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Gly Ser Ser Arg
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Thr Tyr Ser Arg
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL
<400> 116
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
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Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Gly Tyr Ser Arg
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL
<400> 117
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL
<400> 118
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
His Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ile Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asp Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Gly Ser Ser Arg
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL
<400> 119
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
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Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
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<210> 120
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL
<400> 120
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asp Ile Gly Arg Tyr
20 25 30
Asp Tyr Val Ser Trp Tyr Gln His Tyr Pro Asp Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Ile Ile Tyr Glu Val Lys His Arg Pro Ser Gly Ile Ser His Arg Phe
50 55 60
Ser Ala Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Glu Leu
65 70 75 80
Gln Pro Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Tyr Thr Glu Ser
85 90 95
Lys Thr Tyr Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 121
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL
<400> 121
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His
20 25 30
Gly Thr His Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe
85 90 95
Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 122
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HC
<400> 122
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Ala Val Ala Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
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Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 123
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HC
<400> 123
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Asp Arg Ala Val Ala Gly Ala Ser Ala Phe Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
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Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
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Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
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Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
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Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val
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Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 124
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HC
<400> 124
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Asp Arg Pro Val Ala Gly Ala Ser Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
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355 360 365
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385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
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435 440 445
Lys
<210> 125
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HC
<400> 125
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Arg Asp Arg Ala Val Ala Gly Ala Phe Ala Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
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Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
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<211> 449
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<223> HC
<400> 126
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1 5 10 15
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Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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65 70 75 80
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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
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435 440 445
Lys
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<220>
<223> HC
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Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Lys
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<223> HC
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<220>
<223> HC
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Lys
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325 330 335
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Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Lys
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<220>
<223> HC
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Lys
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<211> 449
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HC
<400> 132
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Lys
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Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 134
<211> 449
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HC
<400> 134
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1 5 10 15
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Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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<223> HC
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<220>
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<220>
<223> HC
<400> 139
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<220>
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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
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Gly Lys
450
<210> 141
<211> 607
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HC
<400> 141
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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195 200 205
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245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
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Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
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Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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<223> HC
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<220>
<223> HC
<400> 147
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Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu
515 520 525
Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu
530 535 540
Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu
545 550 555 560
Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly
565 570 575
Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn
580 585 590
Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HC
<400> 148
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Ala Val Ala Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
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Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
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Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
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Gly Gly Gly Ser Gly Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn
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Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu
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Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp
595 600 605
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<220>
<223> HC
<400> 149
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
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Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
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Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
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Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
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Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
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Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
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Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
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Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
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Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
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Gly Ser Gly Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp
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Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys
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Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met
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Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu
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<223> LC
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 151
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LC
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
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100 105 110
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165 170 175
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Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 152
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LC
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asp Leu Leu Ile
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Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 153
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LC
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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210
<210> 154
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LC
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
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50 55 60
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Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 155
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LC
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Ile Trp
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
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Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
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Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LC
<400> 156
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Ile Trp
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
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Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 157
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LC
<400> 157
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<210> 158
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LC
<400> 158
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
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195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 159
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LC
<400> 159
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 160
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LC
<400> 160
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
His Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ile Trp
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asp Leu Leu Ile
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Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 161
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LC
<400> 161
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Ile Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Tyr Gly Tyr Ser Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Arg Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 162
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LC
<400> 162
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Ile Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Gly Ser Ser Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 163
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LC
<400> 163
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Gly Tyr Ser Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 164
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LC
<400> 164
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys
145 150 155 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165 170 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180 185 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 165
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LC
<400> 165
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asp Ile Gly Arg Tyr
20 25 30
Asp Tyr Val Ser Trp Tyr Gln His Tyr Pro Asp Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Ile Ile Tyr Glu Val Lys His Arg Pro Ser Gly Ile Ser His Arg Phe
50 55 60
Ser Ala Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Glu Leu
65 70 75 80
Gln Pro Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Tyr Thr Glu Ser
85 90 95
Lys Thr Tyr Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
145 150 155 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165 170 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180 185 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 166
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LC
<400> 166
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His
20 25 30
Gly Thr His Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe
85 90 95
Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 167
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> linker
<400> 167
Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 168
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> linker
<400> 168
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 169
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> linker
<400> 169
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 170
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CK
<400> 170
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 171
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CL
<400> 171
Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro
35 40 45
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 172
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CH
<400> 172
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 173
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CH
<400> 173
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 174
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CH
<400> 174
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 175
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CH
<400> 175
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 176
<211> 567
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TGFBR2
<400> 176
Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu
1 5 10 15
Trp Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val
20 25 30
Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro
35 40 45
Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln
50 55 60
Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro
65 70 75 80
Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr
85 90 95
Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile
100 105 110
Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys
115 120 125
Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn
130 135 140
Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu
145 150 155 160
Leu Leu Val Ile Phe Gln Val Thr Gly Ile Ser Leu Leu Pro Pro Leu
165 170 175
Gly Val Ala Ile Ser Val Ile Ile Ile Phe Tyr Cys Tyr Arg Val Asn
180 185 190
Arg Gln Gln Lys Leu Ser Ser Thr Trp Glu Thr Gly Lys Thr Arg Lys
195 200 205
Leu Met Glu Phe Ser Glu His Cys Ala Ile Ile Leu Glu Asp Asp Arg
210 215 220
Ser Asp Ile Ser Ser Thr Cys Ala Asn Asn Ile Asn His Asn Thr Glu
225 230 235 240
Leu Leu Pro Ile Glu Leu Asp Thr Leu Val Gly Lys Gly Arg Phe Ala
245 250 255
Glu Val Tyr Lys Ala Lys Leu Lys Gln Asn Thr Ser Glu Gln Phe Glu
260 265 270
Thr Val Ala Val Lys Ile Phe Pro Tyr Glu Glu Tyr Ala Ser Trp Lys
275 280 285
Thr Glu Lys Asp Ile Phe Ser Asp Ile Asn Leu Lys His Glu Asn Ile
290 295 300
Leu Gln Phe Leu Thr Ala Glu Glu Arg Lys Thr Glu Leu Gly Lys Gln
305 310 315 320
Tyr Trp Leu Ile Thr Ala Phe His Ala Lys Gly Asn Leu Gln Glu Tyr
325 330 335
Leu Thr Arg His Val Ile Ser Trp Glu Asp Leu Arg Lys Leu Gly Ser
340 345 350
Ser Leu Ala Arg Gly Ile Ala His Leu His Ser Asp His Thr Pro Cys
355 360 365
Gly Arg Pro Lys Met Pro Ile Val His Arg Asp Leu Lys Ser Ser Asn
370 375 380
Ile Leu Val Lys Asn Asp Leu Thr Cys Cys Leu Cys Asp Phe Gly Leu
385 390 395 400
Ser Leu Arg Leu Asp Pro Thr Leu Ser Val Asp Asp Leu Ala Asn Ser
405 410 415
Gly Gln Val Gly Thr Ala Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Glu Ser
420 425 430
Arg Met Asn Leu Glu Asn Val Glu Ser Phe Lys Gln Thr Asp Val Tyr
435 440 445
Ser Met Ala Leu Val Leu Trp Glu Met Thr Ser Arg Cys Asn Ala Val
450 455 460
Gly Glu Val Lys Asp Tyr Glu Pro Pro Phe Gly Ser Lys Val Arg Glu
465 470 475 480
His Pro Cys Val Glu Ser Met Lys Asp Asn Val Leu Arg Asp Arg Gly
485 490 495
Arg Pro Glu Ile Pro Ser Phe Trp Leu Asn His Gln Gly Ile Gln Met
500 505 510
Val Cys Glu Thr Leu Thr Glu Cys Trp Asp His Asp Pro Glu Ala Arg
515 520 525
Leu Thr Ala Gln Cys Val Ala Glu Arg Phe Ser Glu Leu Glu His Leu
530 535 540
Asp Arg Leu Ser Gly Arg Ser Cys Ser Glu Glu Lys Ile Pro Glu Asp
545 550 555 560
Gly Ser Leu Asn Thr Thr Lys
565
<210> 177
<211> 136
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TGFBR2
<400> 177
Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val Thr
1 5 10 15
Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp
20 25 30
Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys
35 40 45
Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val
50 55 60
Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp
65 70 75 80
Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro
85 90 95
Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met
100 105 110
Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu
115 120 125
Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp
130 135
<210> 178
<211> 137
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TGFBR2
<400> 178
Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val
1 5 10 15
Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys
20 25 30
Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn
35 40 45
Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala
50 55 60
Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His
65 70 75 80
Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser
85 90 95
Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe
100 105 110
Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser
115 120 125
Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp
130 135
<210> 179
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HCDR2通式1
<220>
<221> X
<222> (3)..(3)
<223> X=D或E
<220>
<221> X
<222> (4)..(4)
<223> X=G或A
<400> 179
Lys Gln Xaa Xaa Ser Glu
1 5
<210> 180
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HCDR3通式1
<220>
<221> X
<222> (3)..(3)
<223> X=A或P
<220>
<221> X
<222> (8)..(8)
<223> X=F或S
<220>
<221> X
<222> (9)..(9)
<223> X=D或A
<220>
<221> X
<222> (10)..(10)
<223> X=I或F
<400> 180
Asp Arg Xaa Val Ala Gly Ala Xaa Xaa Xaa
1 5 10
<210> 181
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LCDR1通式1
<220>
<221> X
<222> (7)..(7)
<223> X=F，S或Y
<220>
<221> X
<222> (8)..(8)
<223> X=I或S
<400> 181
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Xaa Xaa Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 182
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LCDR2通式1
<220>
<221> X
<222> (7)..(7)
<223> X=S或T
<400> 182
Lys Ala Ser Ser Leu Glu Xaa
1 5
<210> 183
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LCDR3通式1
<220>
<221> X
<222> (4)..(4)
<223> X=Y或H
<220>
<221> X
<222> (5)..(5)
<223> X=G，T或S
<220>
<221> X
<222> (6)..(6)
<223> X=Y或S
<400> 183
Gln Gln Tyr Xaa Xaa Xaa Ser Arg Thr
1 5
<210> 184
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H-FR3通式1
<220>
<221> X
<222> (4)..(4)
<223> X=V或G
<220>
<221> X
<222> (22)..(22)
<223> X=L或Q
<220>
<221> X
<222> (33)..(33)
<223> X=D或E
<220>
<221> X
<222> (37)..(37)
<223> X=Y或F
<400> 184
Lys Tyr Tyr Xaa Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
1 5 10 15
Asn Ala Lys Asn Ser Xaa Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
20 25 30
Xaa Thr Ala Val Xaa Tyr Cys Ala Arg
35 40
<210> 185
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> L-FR1
<220>
<221> X
<222> (13)..(13)
<223> X=T或A
<220>
<221> X
<222> (17)..(17)
<223> X=D或H
<220>
<221> X
<222> (21)..(21)
<223> X=I或V
<400> 185
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Xaa Ser Val Gly
1 5 10 15
Xaa Arg Val Thr Xaa Thr Cys
20
<210> 186
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> L-FR2通式1
<220>
<221> X
<222> (5)..(5)
<223> X=K或H
<220>
<221> X
<222> (11)..(11)
<223> X=K，N或D
<400> 186
Trp Tyr Gln Gln Xaa Pro Gly Lys Ala Pro Xaa Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 187
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> L-FR3通式1
<220>
<221> X
<222> (9)..(9)
<223> X=S或N
<220>
<221> X
<222> (28)..(28)
<223> X=A或T
<220>
<221> X
<222> (31)..(31)
<223> X=Y或F
<400> 187
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Xaa Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Xaa Thr Tyr Xaa Cys
20 25 30
<210> 188
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> L-FR4通式1
<220>
<221> X
<222> (10)..(10)
<223> X=K或R
<400> 188
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Xaa
1 5 10
<210> 189
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH通式1
<220>
<221> X
<222> (54)..(54)
<223> X=D或E
<220>
<221> X
<222> (55)..(55)
<223> X=G或A
<220>
<221> X
<222> (61)..(61)
<223> X=V或G
<220>
<221> X
<222> (79)..(79)
<223> X=L或Q
<220>
<221> X
<222> (90)..(90)
<223> X=D或E
<220>
<221> X
<222> (94)..(94)
<223> X=Y或F
<220>
<221> X
<222> (101)..(101)
<223> X=A或P
<220>
<221> X
<222> (106)..(106)
<223> X=F或S
<220>
<221> X
<222> (107)..(107)
<223> X=D或A
<220>
<221> X
<222> (108)..(108)
<223> X=I或F
<400> 189
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Xaa Xaa Ser Glu Lys Tyr Tyr Xaa Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Xaa Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Xaa Thr Ala Val Xaa Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Xaa Val Ala Gly Ala Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 190
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL通式1
<220>
<221> X
<222> (13)..(13)
<223> X13=T或A
<220>
<221> X
<222> (17)..(17)
<223> X=D或H
<220>
<221> X
<222> (21)..(21)
<223> X=I或V
<220>
<221> X
<222> (30)..(30)
<223> X=F，S或Y
<220>
<221> X
<222> (31)..(31)
<223> X=I或S
<220>
<221> X
<222> (39)..(39)
<223> X=K或H
<220>
<221> X
<222> (45)..(45)
<223> X=K，N或D
<220>
<221> X
<222> (56)..(56)
<223> X=S或T
<220>
<221> X
<222> (65)..(65)
<223> X=S或N
<220>
<221> X
<222> (84)..(84)
<223> X=A或T
<220>
<221> X
<222> (87)..(87)
<223> X=Y或F
<220>
<221> X
<222> (92)..(92)
<223> X=Y或H
<220>
<221> X
<222> (93)..(93)
<223> X=G，T或S
<220>
<221> X
<222> (94)..(94)
<223> X=Y或S
<220>
<221> X
<222> (107)..(107)
<223> X=K或R
<400> 190
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Xaa Ser Val Gly
1 5 10 15
Xaa Arg Val Thr Xaa Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Xaa Xaa Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Xaa Pro Gly Lys Ala Pro Xaa Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Xaa Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Xaa Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Xaa Thr Tyr Xaa Cys Gln Gln Tyr Xaa Xaa Xaa Ser Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Xaa
100 105
<210> 191
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LCDR3通式2
<220>
<221> X
<222> (5)..(5)
<223> X=G或S
<220>
<221> X
<222> (6)..(6)
<223> X=Y或S
<400> 191
Gln Gln Tyr Tyr Xaa Xaa Ser Arg Thr
1 5
<210> 192
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H-FR3通式2
<220>
<221> X
<222> (4)..(4)
<223> X=V或G
<220>
<221> X
<222> (33)..(33)
<223> X=D或E
<220>
<221> X
<222> (37)..(37)
<223> X=Y或F
<400> 192
Lys Tyr Tyr Xaa Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
1 5 10 15
Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
20 25 30
Xaa Thr Ala Val Xaa Tyr Cys Ala Arg
35 40
<210> 193
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH通式2
<220>
<221> X
<222> (54)..(54)
<223> X=D或E
<220>
<221> X
<222> (55)..(55)
<223> X=G或A
<220>
<221> X
<222> (61)..(61)
<223> X=V或G
<220>
<221> X
<222> (90)..(90)
<223> X=D或E
<220>
<221> X
<222> (94)..(94)
<223> X=Y或F
<220>
<221> X
<222> (101)..(101)
<223> X=A或P
<220>
<221> X
<222> (106)..(106)
<223> X=F或S
<220>
<221> X
<222> (107)..(107)
<223> X=D或A
<220>
<221> X
<222> (108)..(108)
<223> X=I或F
<400> 193
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Xaa Xaa Ser Glu Lys Tyr Tyr Xaa Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Xaa Thr Ala Val Xaa Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Xaa Val Ala Gly Ala Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 194
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL通式2
<220>
<221> X
<222> (13)..(13)
<223> X=T或A
<220>
<221> X
<222> (17)..(17)
<223> X=D或H
<220>
<221> X
<222> (21)..(21)
<223> X=I或V
<220>
<221> X
<222> (30)..(30)
<223> X=F，S或Y
<220>
<221> X
<222> (31)..(31)
<223> X=I或S
<220>
<221> X
<222> (39)..(39)
<223> X=K或H
<220>
<221> X
<222> (45)..(45)
<223> X=K，N或D
<220>
<221> X
<222> (56)..(56)
<223> X=S或T
<220>
<221> X
<222> (65)..(65)
<223> X=S或N
<220>
<221> X
<222> (84)..(84)
<223> X=A或T
<220>
<221> X
<222> (87)..(87)
<223> X=Y或F
<220>
<221> X
<222> (93)..(93)
<223> X=G或S
<220>
<221> X
<222> (94)..(94)
<223> X=Y或S
<220>
<221> X
<222> (107)..(107)
<223> X=K或R
<400> 194
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Xaa Ser Val Gly
1 5 10 15
Xaa Arg Val Thr Xaa Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Xaa Xaa Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Xaa Pro Gly Lys Ala Pro Xaa Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Xaa Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Xaa Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Xaa Thr Tyr Xaa Cys Gln Gln Tyr Tyr Xaa Xaa Ser Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Xaa
100 105

Claims (38)

1.结合PD-L1的分离的抗原结合蛋白，其包含轻链可变区VL和重链可变区VH，其中所述轻链可变区VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中重链可变区VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中，
所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 51所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO: 64所示、所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 78所示、所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 5所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 14所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 29所示；或者，
所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 51所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO: 64所示、所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 78所示、所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 5所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 16所示且所述HCDR3 的氨基酸序列如SEQ ID NO: 29所示；或者，
所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 51所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO: 64所示、所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 78所示、所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 5所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 17所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 29所示；或者，
所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 48所示；所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO: 63所示；所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 77所示；所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 5所示；所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 14所示；所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 29所示。
2.根据权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白，其包括抗体或其抗原结合片段。
3.根据权利要求2所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体选自下组：嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
4.根据权利要求2所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合片段包括Fab，Fab’，Fv片段，F(ab’)2，scFv或di-scFv。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体重链可变区VH包括框架区H-FR1，H-FR2，H-FR3，和H-FR4；所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端相连，包含SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；并且所述 H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，包含SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列；并且所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，包含SEQ ID NO: 192所示的氨基酸序列；并且所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端相连，包含SEQ ID NO: 38所示的氨基酸序列。
6.根据权利要求5所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述H-FR3包含SEQ ID NO: 21所示的氨基酸序列。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体轻链可变区VL包括框架区L-FR1，L-FR2，L-FR3，和L-FR4；所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端相连，包含SEQ ID NO: 185所示的氨基酸序列；并且所述L-FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间，包含SEQ ID NO: 186所示的氨基酸序列；并且所述L-FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间，包含SEQ ID NO: 187所示的氨基酸序列；并且所述L-FR4的N末端与所述LCDR3的C末端相连，包含SEQ ID NO: 188所示的氨基酸序列。
8.根据权利要求7所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述L-FR1包含SEQ ID NOs: 41或44所示的氨基酸序列；并且/或者所述L-FR2包含SEQ ID NOs: 56或57所示的氨基酸序列；并且/或者所述L-FR3包含SEQ ID NO: 69所示的氨基酸序列；并且/或者所述L-FR4包含SEQID NOs: 85所示的氨基酸序列。
9.根据权利要求1-4中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中，
所述抗体重链可变区VH包含如SEQ ID NO: 90所示的氨基酸序列，所述抗体轻链可变区VL包含如SEQ ID NO: 114所示的氨基酸序列；或者，
所述抗体重链可变区VH包含如SEQ ID NO: 101所示的氨基酸序列，所述抗体轻链可变区VL包含如SEQ ID NO: 114所示的氨基酸序列；或者，
所述抗体重链可变区VH包含如SEQ ID NO: 102所示的氨基酸序列，所述抗体轻链可变区VL包含如SEQ ID NO: 114所示的氨基酸序列；或者，
所述抗体重链可变区VH包含SEQ ID NO: 90所示的氨基酸序列，所述抗体轻链可变区VL包含SEQ ID NO: 108所示的氨基酸序列。
10.根据权利要求1-4中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包括抗体重链恒定区，且所述抗体重链恒定区包括人IgG恒定区。
11.根据权利要求10所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体重链恒定区包含如SEQID NOs: 172-175中任一项所示的氨基酸序列。
12.根据权利要求1-4中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含抗体重链HC，且所述HC包含如SEQ ID NOs: 122，133，134和137中任一项所示的氨基酸序列。
13.根据权利要求1-4中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包括抗体轻链恒定区，其中所述抗体轻链恒定区包含如SEQ ID NO:170所示的氨基酸序列。
14.根据权利要求1-4中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含抗体轻链LC，且所述LC包含如SEQ ID NOs: 150，156和162中任一项所示的氨基酸序列。
15.一种融合蛋白，其包含：a）TGFBRII胞外结构域；以及b）权利要求1-14中任一项所述的分离的抗原结合蛋白。
16.根据权利要求15所述的融合蛋白，其包含第一多肽和第二多肽，其中所述第一多肽包含所述分离的抗原结合蛋白的重链以及所述TGFBRII胞外结构域；且所述第二多肽包含所述分离的抗原结合蛋白的轻链。
17.根据权利要求16所述的融合蛋白，其中所述抗原结合蛋白的重链与所述TGFBRII胞外结构域框内融合而形成所述第一多肽。
18.根据权利要求17所述的融合蛋白，其中所述抗原结合蛋白的重链的C端直接或间接与所述TGFBRII胞外结构域的N端连接。
19.根据权利要求18所述的融合蛋白，其中，LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：51所示，LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：64所示，LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：78所示；HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示，HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示；或者，
LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：51所示，LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：64所示，LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：78所示；HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示，HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示；或者，
LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：51所示，LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：64所示，LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：78所示；HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示，HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示。
20.根据权利要求16-19中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗体重链通过连接子与所述TGFBRII胞外结构域相连。
21.根据权利要求20所述的融合蛋白，其中所述连接子为肽连接子，且所述肽连接子包含SEQ ID NOs: 167-169中任一项所示的氨基酸序列。
22.根据权利要求16-19中任一项所述的融合蛋白，所述TGFBRII胞外结构域包含SEQID NOs: 176-178中任一项所示的氨基酸序列。
23.根据权利要求16-19中任一项所述的融合蛋白，其中所述第一多肽的所述重链与所述第二多肽的所述轻链组合后形成特异性结合PD-L1的抗原结合部分。
24.根据权利要求16-19中任一项所述的融合蛋白，其中，
所述第一多肽包含SEQ ID NO: 138所示的氨基酸序列，且所述第二多肽包含SEQ IDNO: 162所示的氨基酸序列；或者，
所述第一多肽包含SEQ ID NO: 139所示的氨基酸序列，且所述第二多肽包含SEQ IDNO: 162所示的氨基酸序列；或者，
所述第一多肽包含SEQ ID NO: 142所示的氨基酸序列，且所述第二多肽包含SEQ IDNO: 162所示的氨基酸序列；或者，
所述第一多肽包含SEQ ID NO: 143所示的氨基酸序列，且所述第二多肽包含SEQ IDNO: 162所示的氨基酸序列；或者，
所述第一多肽包含SEQ ID NO: 147所示的氨基酸序列，且所述第二多肽包含SEQ IDNO: 162所示的氨基酸序列；或者，
所述第一多肽包含SEQ ID NO: 148所示的氨基酸序列，且所述第二多肽包含SEQ IDNO: 162所示的氨基酸序列。
25.分离的一种或多种核酸分子，其编码权利要求1-14中任一项所述的分离的抗原结合蛋白或权利要求15-24中任一项所述的融合蛋白。
26.载体，其包含根据权利要求25所述的核酸分子。
27.细胞，其包含根据权利要求25所述的核酸分子或根据权利要求26所述的载体。
28.制备权利要求1-14中任一项所述的分离的抗原结合蛋白或权利要求15-24中任一项所述的融合蛋白的方法，所述方法包括在使得权利要求1-14中任一项所述的分离的抗原结合蛋白或权利要求15-24中任一项所述的融合蛋白表达的条件下，培养根据权利要求27所述的细胞。
29.嵌合抗原受体，其包含权利要求1-14中任一项所述的分离的抗原结合蛋白。
30.基因修饰的细胞，其包含权利要求29所述的嵌合抗原受体。
31.抗体药物偶联物，其包含细胞毒性剂，以及权利要求1-14中任一项所述的分离的抗原结合蛋白。
32.药物组合物，其包含权利要求1-14中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、权利要求15-24中任一项所述的融合蛋白、权利要求29所述的嵌合抗原受体、权利要求30所述的基因修饰的细胞和/或权利要求31所述的抗体药物偶联物，以及任选地药学上可接受的载体。
33.根据权利要求32所述的药物组合物，其还含有由激素制剂、靶向小分子制剂、蛋白酶体抑制剂、成像剂、诊断剂、化疗剂、溶瘤药物、细胞毒性剂、细胞因子、共刺激分子的激活剂、抑制性分子的抑制剂以及疫苗组成的群组中的一种或多种。
34.权利要求1-14中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、权利要求15-24中任一项所述的融合蛋白、权利要求29所述的嵌合抗原受体、权利要求30所述的基因修饰的细胞和/或权利要求31所述的抗体药物偶联物和/或权利要求32-33中任一项所述的药物组合物在制备用于缓解并且/或者治疗PD-L1表达异常的肿瘤或癌症的药物中的用途。
35.根据权利要求34所述的用途，其中所述肿瘤或癌症包括结直肠癌。
36.非疾病诊断或治疗目的的抑制PD-L1和/或CD80与PD-1结合的方法，所述方法包括施用权利要求1-14中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、权利要求15-24中任一项所述的融合蛋白、权利要求29所述的嵌合抗原受体、权利要求30所述的基因修饰的细胞和/或权利要求31所述的抗体药物偶联物和/或权利要求32-33中任一项所述的药物组合物。
37.试剂盒，其包括权利要求1-14中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、权利要求15-24中任一项所述的融合蛋白、权利要求29所述的嵌合抗原受体、权利要求30所述的基因修饰的细胞和/或权利要求31所述的抗体药物偶联物和/或权利要求32-33中任一项所述的药物组合物。
38.根据权利要求37所述的试剂盒，其还包括(i)施用装置；任选地(ii)使用说明。
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