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CN106755328A - 一种蚕豆ssr指纹图谱的构建方法 - Google Patents

一种蚕豆ssr指纹图谱的构建方法 Download PDF

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CN106755328A CN201611062135.6A CN201611062135A CN106755328A CN 106755328 A CN106755328 A CN 106755328A CN 201611062135 A CN201611062135 A CN 201611062135A CN 106755328 A CN106755328 A CN 106755328A
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Abstract

本发明提供一种蚕豆SSR指纹图谱的构建方法，属于植物品种鉴别与育种技术领域。本发明提供21对蚕豆基因组SSR引物组成的标记组合，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑42所示，利用PCR扩增技术、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳检测技术对蚕豆品种进行鉴定，可在短时间内完成蚕豆种子品种鉴定与遗传多样性评价工作，具有省时、高效，快速、准确、操作方便、鉴定结果不易受环境影响等优点。本发明的方法可以对蚕豆种子真伪进行有效监控，从DNA水平揭示品种的遗传变异与亲缘关系，保护了作物品种，防止假冒伪劣品种进入市场，也为蚕豆品种选育过程中优异种质的合理利用提供了技术支持，具有良好的应用前景。

Description

一种蚕豆SSR指纹图谱的构建方法
技术领域
本发明涉及分子生物学和植物品种鉴别技术领域，特别是涉及一种蚕豆SSR指纹图谱的构建方法以及利用构建得到的不同品种蚕豆的指纹图谱鉴别蚕豆品种的方法及应用。
背景技术
蚕豆(Vicia faba L.)作为一种粮食、蔬菜和饲料、绿肥兼用作物,在我国农作物中占有重要地位。蚕豆在世界各洲均有生产和分布，全世界有超过43个国家生产蚕豆。蚕豆在我国已有2000余年的栽培历史，全国除山东、海南和东北三省极少种植外，其余各地均有种植。近10年，中国蚕豆的种植面积达140多万hm2，占世界总种植面积50％左右，是世界第一蚕豆生产大国。蚕豆可通过与根瘤菌共生结瘤，固定大气中的氮素，在改善土壤营养结构中起着重要的作用。蚕豆营养丰富，蛋白质平均含量为27.6％，维生素含量均超过大米和小麦。因此开展蚕豆品种的有效甄别显得尤为重要。
目前我国对蚕豆品种进行鉴定主要方法是按照NY/T2345-2013《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南蚕豆》进行田间测定来鉴定的。该方法简便、经济，但由于许多形态学性状鉴定周期长、易受环境影响，不能精确、快捷地为新品种侵权案件提供鉴定依据，同时也常出现不同测试人员对某些性状的认识存在偏差，导致判定结果不一致的问题。随着育种亲本的利用集中化，传统的形态学和细胞学鉴定方法测试性状多、工作量大，很难做到准确而真实的鉴定蚕豆的品种差别，为此需要在分子水平上进行分析鉴定。
随着生物技术的发展，基于分子标记技术而建立起来的DNA指纹图谱(fingerprint)在品种、品系鉴别方面发挥着重要作用。品种DNA指纹数据库的构建在蚕豆品种纯度及真实性鉴定、种子质量标准化、品种审 定及产权登记保护、真假种辨别、品种纠纷等方面具有重要应用价值，在探究我国蚕豆种质资源的亲缘关系、杂种优势群划分、种质资源创新利用及新品种选育等方面发挥着显著作用。当前用于构建作物DNA指纹图谱的标记技术主要有RFLP、RAPD、AFLP、EST、ISSR、SSR等。简单重复序列(Simple sequencerepeat,SSR)，是第二代基于PCR技术的分子标记技术。与其它类型分子标记相比，SSR标记具有多态性丰富、遗传信息多、操作便利、共显性、高度可重复性等优点，已被广泛应用于植物资源遗传研究和分子辅助育种实践中。
DNA指纹图谱能够从DNA水平上鉴定出品种间的差异或遗传相似性。微卫星(又称为简单重复序列，SSR)是由1-6个核苷酸组成的短序列串联重复多次而组成的一段DNA。由于微卫星中重复单元的重复次数不同，因而扩增出的微卫星序列的长度呈现多态性。微卫星序列具有多态性较高，重复性和稳定性好等特点，是十分有效的分子标记，被广泛应用于品种鉴定、指纹图谱构建等领域。为了有效保护我国蚕豆的品种知识产权，有必要在我国开展蚕豆开发微卫星标记开发，并应用于蚕豆优良品种“分子身份证”构建的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蚕豆SSR指纹图谱的构建方法，本发明的另一目的在于提供一种高效、准确、低成本的利用基因组SSR指纹图谱鉴别蚕豆品种的方法。本发明的目的还在于提供该方法的应用。
为实现上述目的，本发明以48份代表性蚕豆品种基因组DNA为模板，通过分析蚕豆基因组序列和EST序列，合成核心基因组SSR和EST-SSR引物。经过筛选，分别有15对基因组SSR和6对EST-SSR引物组成的分子标记组合可完全鉴别48份蚕豆品种的差异。所述的48份代表性蚕豆品种见表1。
表1 48份蚕豆品种
经过多次筛选，选择在连锁群上的均匀分布、多态性较高、PCR扩增较稳定，同时满足常规非变性凝胶电泳检测和毛细管荧光电泳检测两种技术平台，最终筛选出在蚕豆品种间多态性信息含量值最高、等位位点数最多、重复性好、扩增带型清晰度高、染色体分布均匀的SSR引物作为蚕豆品种指纹图谱库构建的核心引物。
基于上述筛选方法，本发明提供用于鉴别蚕豆品种的分子标记组合，其特征在于，含有15个SSR分子标记和6个EST-SSR分子标记，分别为SSR11908、EST181、SSR11771、SSR12080、SSR13683、SSR12396、SSR14328、EST1672、EST1280、EST1741、SSR17991、SSR10911、SSR13106、SSR760、EST1142、SSR11052、SSR13771、SSR11885、SSR12536、SSR12868、EST1584；
所述分子标记分别通过以下引物对扩增得到：SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.3-4、SEQ ID NO.5-6、SEQ ID NO.7-8、SEQ ID NO.9-10、SEQ ID NO.11-12、SEQ ID NO.13-14、SEQ ID NO.15-16、SEQ ID NO.17-18、SEQ ID NO.19-20、SEQ ID NO.21-22、SEQ ID NO.23-24、SEQ ID NO.25-26、SEQ ID NO.27-28、SEQ ID NO.29-30、SEQ ID NO.31-32、SEQ IDNO.33-34、SEQ ID NO.35-36、SEQ ID NO.37-38、SEQ ID NO.39-40、SEQ ID NO.41-42所示的引物。
本发明提供一种引物组合，含有以下21对特异性引物对，其核苷酸序列分别如SEQID NO.1-42所示。
本发明提供含有上述引物组合的试剂盒。
本发明提供了上述分子标记组合或引物组合在鉴定蚕豆品种中的应用。
本发明提供了上述分子标记组合或引物组合在蚕豆种质资源改良中的应用。
本发明提供了上述分子标记组合或引物组合在构建蚕豆SSR植物 图谱中的应用。
本发明还提供一种蚕豆品种SSR指纹图谱的构建方法，以本发明所述的含有上述21对引物的引物组合对不同蚕豆品种的DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测或对PCR产物进行荧光毛细管电泳检测，
纯合位点的等位变异大小数据记录为X/X，其中X为该位点等位变异的大小；
杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异；
无效等位变异的大小记录为0/0；
上述“/”前为小片段，“/”后为大片段；
通过对不同位点的数据整合，形成不同蚕豆品种的SSR指纹图谱。
其中，PCR扩增方法为：
反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性35s，60℃退火40s，72℃延伸45s，共32个循环；72℃延伸5min，10℃保温5min；
10μL扩增体系为：2×Taq PCR Master Mix5μL，2μM/μL的上、下游引物各1μL，DNA模板1.5μL，ddH2O 2.5μL。
其中，当采用非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测时，是采用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，电压300V，电流280mA，功率260W。
当采用荧光毛细管电泳检测时，为引物加入荧光标记，详细情况见表2。
本发明提供了利用上述构建方法构建得到的蚕豆品种指纹图谱。
本发明构建得到的蚕豆品种指纹图谱，其如表5-表16所示。
本发明进而提供一种鉴定蚕豆品种的方法，包括如下步骤：
(1)提取待检蚕豆品种的DNA，以权利要求2所述的引物组合中的21对引物对分别对检蚕豆品种的DNA进行PCR扩增；
(2)扩增产物通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，银染显色，根据扩增产物在电泳凝胶上的相对位置；或
对扩增产物进行荧光毛细管电泳检测，根据扩增产物的相对位置，
纯合位点的等位变异大小数据记录为X/X，其中X为该位点等位变异的大小；
杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异；
无效等位变异的大小记录为0/0；上述“/”前为小片段，“/”后为大片段；
(3)结果对照表5-表16的蚕豆品种指纹图谱，品种间差异位点数≥3，则为不同品种；品种间差异位点数<3，则为近似品种。
本发明提供了上述方法在蚕豆种质资源改良中的应用。
本发明蚕豆DNA指纹图谱的构建方法，利用了SSR引物组合对某一蚕豆品种DNA进行扩增，得到一组特有的DNA指纹，于是本发明方法采用引物组合鉴别的方法对蚕豆品种进行分析和筛选，使每一个品种都找到了它特有的DNA指纹。本发明的SSR和EST-SSR引物的扩增产物带型间大小差异明显，能够很好的区分不同的品种。对同一品种内的个体间的扩增产物，其带型一致。本发明的检测方法在短时间内即可完成蚕豆种子品种鉴定与遗传多样性评价工作，具有高效、准确、低成本、操作简便等优势。同时本发明的检测方法可以有效的对蚕豆种子真伪进行监控，从DNA水平揭示品种的遗传变异与亲缘关系，保护了作物品种，防止假冒伪劣品种进入市场，也为蚕豆品种选育过程中优异种质的合理利用提供了技术参考。
附图说明
图1为48份代表性蚕豆品种聚类分析结果图。
图2为实施例2中48份代表性蚕豆品种的PCR扩增结果电泳图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限 制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。
本发明品种判定原则遵照以下国家标准进行，NY/T 2594-2014植物品种鉴定DNA指纹方法总则；NY/T 2345-2013《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南蚕豆》；GB/T19557.1植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总则。
实施例1用于鉴定蚕豆品种的SSR和EST-EST引物的筛选
本实施例以我国蚕豆主产区代表性推广的48个蚕豆(见表1)品种基因组DNA为模板，通过分析蚕豆基因组序列和EST序列，合成核心基因组SSR和EST-SSR引物。经过筛选，分别有15对基因组SSR和6对EST-SSR引物组成的分子标记组合可完全鉴别48份蚕豆品种的差异。
最终筛选得到15对基因组SSR分子标记和6对EST-SSR分子标记。
表2 21对SSR核心引物
上述表1的引物分别对应序列表中的SEQ ID NO.1-42。
实施例2蚕豆品种特征指纹图谱的构建与蚕豆品种鉴定方法的建立
1、蚕豆品种总DNA提取
采用改良CTAB法提取供试品种DNA：取2g左右的新鲜幼嫩叶片，在液氮中研磨成粉末状装入2.0ml离心管中，放入-80℃冰箱保存待用；将预热到65℃的2×CTAB提取液，按占溶液容量的1％的比例加入β-巯基乙醇，充分混匀；取出研磨好的叶片组织，每份样品中加入800μL预热后的CTAB提取液，涡旋1-2min，65℃水浴1h(每15min上下颠倒轻翻一次，充分混匀)；水浴加热结束后，加入800μL氯仿/异戊醇(24：1)溶液于 离心管中，混合15-20min，之后10000rpm离心15min；吸取600μL左右上清液移至新离心管(量可适当减少，但切不可接触蛋白质层)，后加入95％等体积乙醇，摇匀后于-20℃冰箱放置2h或者4℃冰箱过夜，保证充分沉淀；12000rpm离心10min，倒掉上清，保留沉淀；用90％乙醇500μL清洗白色沉淀，10000rpm离心5min，小心倒掉上清；室温风干，加入100μLddH2O充分溶解沉淀。利用Nanodrop2000/2000C仪器检测样品DNA浓度，将DNA浓度稀释到50ng/μL，4℃保存备用。
2、以实施例1所述48份蚕豆品种为材料，利用实施例1筛选得到的用于扩增21个分子标记的引物分别对实施例1所述的48份代表性蚕豆品种的DNA进行PCR扩增，反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性35s，60℃退火40s，72℃延伸45s，共32个循环；72℃延伸5min，10℃保温5min；10μL扩增体系为：2×Taq PCR Master Mix5μL，2μM/μL的上、下游引物各1μL，DNA模板1.5μL，ddH2O 2.5μL。
3、PCR扩增产物凝胶电泳及银染显色：扩增产物采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳缓冲液为0.5×TBE，200V稳压电泳2-2.5h，至加样缓冲液移到凝胶底部时电泳结束。银染显色，照相记录。
(1)玻璃板清洗 用清水和洗涤剂将平、凹玻璃板充分清洗干净，然后用蒸馏水冲洗，置于玻璃板架晾干；为防止灌胶时有气泡产生，灌胶前用酒精擦洗玻璃板，晾干备用；将组装好的玻璃板水平放齐，用夹子固定。
(2)灌胶 在45ml 8％PAGE胶中加入TEMED 45μL和10％过硫酸铵450μLTEMED(TEMED和过硫酸铵的使用量应依据环境温度做出相应调整)，迅速混匀后灌胶。待胶液充满玻璃板夹层时，在上部轻轻插入梳子(根据上样量自行调整梳子插入深度)，使其聚合25min左右(具体聚合时间应随不同环境温度做出相应调整)。在灌胶过程中，应防止气泡的产生(若出现小气泡，可借助塑料薄片将其赶出)。
(3)PCR扩增产物预处理 在10μLPCR扩增产物中加入2.5μL6× Loading buffer，混匀30s待用。
(4)电泳 用移液器吹吸加样槽，清除杂质和气泡。每加样孔点入1.5μL产物进行检测，电泳1-1.5小时(电压300V，电流280mA，功率260W)，电泳时间长短可根据目标片段大小和实际功率适度调节。待上部的指示带(二甲苯青)到达胶板底部，电泳结束，小心剥离聚丙烯酰胺凝胶，待染色。
(5)银染 漂洗：使用蒸馏水快速漂洗聚丙烯酰胺凝胶1次，时间不超过10s。银染：按以下银染液配比对凝胶进行染色，然后平行震荡染色10min。
表3
清洗：染色10min后，将染色液倒入废液桶，继续用蒸馏水漂洗2次，每次不超过15s。显色：按以下显色液配比，加入适当的显色液于塑料盒中，轻轻混匀后置于平行震荡仪，使凝胶与显色液充分作用，直至条带清晰。
表4
洗涤：将显影液倒掉并用蒸馏水清洗2-3次，每次不超过15s。
保存：清洗干净后，将凝胶平铺在玻璃板上，用保鲜膜将其密封，读出条带结果并统计记录，然后照相留存。
结果记录：纯合位点的等位变异大小数据记录为X/X，其中X为该位点等位变异的大小；杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，其中X、Y为 该位点上两个不同的等位变异(小片段在前，大片段在后)；无效等位变异的大小记录为0/0。从图2可以看出引物的多态性好，能够很好的鉴别品种。构建的48份蚕豆的指纹图谱见表5-表16。
4、与上述步骤3平行的检测方法，还可采用对PCR扩增产物进行荧光毛细管电泳检测，具体如下：
PCR产物样品准备及电泳分析结果
将FAM(蓝色)和HEX(绿色)荧光标记的PCR产物用超纯水稀释25倍，分别取等体积的上述2种稀释后溶液混合形成混合液，吸取1μL混合液、0.1μL LIZ500分子量内标和8.9μL去离子甲酰胺分别加入到DNA分析仪专用深孔板孔中；然后将其在PCR仪上95℃变性5min，取出后立即置于碎冰上，冷却15min左右；瞬时离心10s，进行毛细管电泳检测，用GENEMAPPER进行图像分析和数据采集。以DNA MarkerI为DNA分子量标准，纯合位点的等位变异大小数据记录为X/X，其中X为该位点等位变异的大小；杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异；无效等位变异的大小记录为0/0(注：小片段在前，大片段在后)。通过对多个位点的数据整合，最终形成不同蚕豆品种的SSR指纹图谱(表5-表16)。除待测样品外，每个SSR位点还应同时包括3～5个参照品种的扩增产物。
不同荧光标记的扩增产物的最适稀释倍数最好通过预试验确定。
检测结果判定：品种间差异位点数≥3，则为不同品种；品种间差异位点数<3，则为近似品种；比较48份品种的指纹数据，发现任意两个品种间的差异位点数都大于3，说明这21对核心引物可以有效的把这些品种鉴别开；利用Power Marker和MEGA软件进行品种聚类，分析品种间的遗传关系，从图中可以发现在遗传相似系数小于0.11时可以把全部品种区分开(图1)。表5-表16中的C1-C48分别对应表1中的各蚕豆品种名称。
表5
表6
SSR13771 EST1142 EST1584 SSR11771 SSR12868 EST1672 SSR13683
C1 163/163 213/219 183/183 149/149 144/146 181/187 147/150
C2 157/161 206/217 184/187 136/142 143/146 190/190 145/145
C3 158/158 230/236 185/185 139/146 146/146 181/184 146/150
C4 164/164 206/206 185/185 149/149 144/146 187/193 144/144
C5 163/163 206/217 184/184 143/143 143/143 186/186 149/149
C6 162/162 208/218 187/187 146/146 144/147 181/181 144/144
C7 162/162 217/221 188/188 146/146 144/144 190/190 150/150
C8 159/159 206/206 185/185 142/142 143/143 187/187 150/150
C9 163/167 206/206 184/184 142/142 143/143 181/193 144/144
C10 160/164 206/208 188/188 141/146 144/144 181/181 145/145
C11 159/159 219/219 187/187 142/146 143/143 186/186 150/150
C12 159/159 219/237 182/182 146/149 144/147 181/181 144/147
表7
SSR760 SSR10911 SSR13106 SSR11052 SSR14328 SSR12536 SSR17991
C1 168/168 166/169 167/167 187/187 177/177 192/198 181/181
C2 165/168 163/169 167/177 184/184 177/179 202/202 158/181
C3 165/174 160/176 167/167 184/184 177/177 195/195 158/158
C4 165/174 166/180 167/171 184/193 177/177 198/198 159/181
C5 171/171 166/166 167/167 193/193 171/178 198/198 158/158
C6 168/168 158/158 167/169 193/193 177/177 198/198 159/159
C7 168/171 157/166 169/169 184/184 171/171 198/198 158/158
C8 168/168 163/163 167/167 193/193 178/178 198/198 159/159
C9 168/167 166/166 167/167 184/193 177/182 198/198 159/180
C10 159/159 163/176 169/169 193/193 177/177 201/201 158/158
C11 168/168 166/166 167/167 184/184 170/170 201/201 159/159
C12 158/168 166/169 164/164 184/187 177/177 192/198 158/158
表8
表9
SSR13771 EST1142 EST1584 SSR11771 SSR12868 EST1672 SSR13683
C13 161/161 210/219 186/186 136/136 143/143 181/181 150/150
C14 159/159 218/218 185/185 136/136 146/146 181/190 146/148
C15 161/167 217/217 187/187 136/136 143/143 181/181 147/147
C16 162/162 217/217 182/182 136/136 143/143 181/181 144/144
C17 160/160 221/221 188/188 146/146 144/144 187/187 147/147
C18 161/161 230/230 187/187 136/142 143/146 180/192 144/150
C19 163/163 226/226 187/187 136/136 146/146 181/181 147/147
C20 159/159 224/226 180/184 142/149 147/147 190/190 147/147
C21 159/159 217/219 183/187 142/146 144/144 187/187 146/146
C22 161/161 206/215 184/184 136/146 144/147 181/193 144/144
C23 157/161 206/206 187/187 136/146 144/144 187/190 147/150
C24 159/159 208/218 184/184 146/146 146/146 181/187 144/144
表10
SSR760 SSR10911 SSR13106 SSR11052 SSR14328 SSR12536 SSR17991
C13 168/168 163/163 169/169 187/187 177/177 199/199 160/181
C14 168/168 158/158 171/173 184/184 177/177 193/198 180/180
C15 165/165 169/169 167/167 184/184 178/178 195/198 157/157
C16 165/165 169/169 167/167 178/178 178/178 192/192 159/159
C17 159/174 166/166 171/171 178/178 177/177 198/198 158/158
C18 165/165 169/169 165/165 187/187 177/177 192/198 157/157
C19 174/174 166/169 167/167 187/193 178/181 193/193 159/159
C20 171/174 169/169 171/171 184/193 179/179 198/198 180/180
C21 174/174 166/166 167/169 187/187 171/178 198/198 158/158
C22 168/168 166/166 171/171 193/193 178/181 201/201 158/179
C23 159/168 163/163 169/169 178/193 178/178 193/201 158/180
C24 168/168 163/169 167/167 193/193 178/178 195/198 158/181
表11
表12
SSR13771 EST1142 EST1584 SSR11771 SSR12868 EST1672 SSR13683
C25 157/157 217/221 185/188 146/146 144/150 181/181 146/150
C26 159/159 206/206 187/187 136/136 146/146 181/181 145/145
C27 159/159 206/206 187/187 146/146 143/143 193/193 144/144
C28 158/167 213/217 187/187 146/146 146/146 181/193 145/147
C29 160/160 223/225 188/188 136/142 144/147 181/184 145/145
C30 159/159 212/227 187/187 136/146 146/146 181/181 146/146
C31 161/161 221/221 187/187 146/146 144/144 187/187 145/145
C32 159/159 217/226 182/182 136/149 144/147 187/193 145/145
C33 161/163 216/216 187/187 146/146 144/147 187/187 145/145
C34 163/163 218/218 187/187 146/146 144/144 187/187 145/145
C35 159/159 206/206 188/188 146/146 144/144 187/187 145/145
C36 159/159 221/221 188/188 143/143 143/143 187/187 144/144
表13
SSR760 SSR10911 SSR13106 SSR11052 SSR14328 SSR12536 SSR17991
C25 159/168 166/166 165/165 184/196 171/178 195/195 160/181
C26 168/168 163/163 167/167 193/193 181/181 202/202 158/158
C27 168/168 158/166 171/171 193/193 178/178 198/198 158/158
C28 171/171 166/169 167/171 184/184 177/177 198/198 180/180
C29 158/167 168/171 171/177 184/184 178/178 198/198 158/158
C30 168/171 166/169 165/165 178/184 177/177 198/198 157/180
C31 168/168 163/163 171/171 136/136 178/178 198/198 158/158
C32 174/174 163/169 167/167 187/187 171/181 198/201 180/180
C33 168/168 166/166 171/171 193/193 177/177 198/198 158/158
C34 174/174 163/163 169/171 193/239 177/177 198/198 181/181
C35 174/174 166/166 169/169 194/194 177/177 199/199 158/158
C36 168/168 163/163 171/171 236/236 178/178 198/198 158/158
表14
表15
SSR13771 EST1142 EST1584 SSR11771 SSR12868 EST1672 SSR13683
C37 164/164 221/221 186/186 146/146 144/144 187/187 145/145
C38 162/162 206/206 185/185 146/146 144/144 187/187 145/145
C39 163/163 219/219 186/188 136/136 143/143 187/187 150/150
C40 162/162 219/219 188/188 146/146 144/144 181/187 147/147
C41 159/159 206/206 185/185 146/146 143/143 181/181 145/145
C42 159/159 217/217 183/183 143/143 146/146 187/187 150/150
C43 159/159 211/211 185/185 146/146 147/147 181/181 146/146
C44 159/159 204/204 185/185 127/127 143/143 190/190 147/147
C45 159/159 225/230 184/187 136/136 146/146 187/187 144/149
C46 160/165 221/228 185/188 146/146 144/144 187/183 144/144
C47 161/161 212/219 185/188 136/146 147/147 187/193 145/150
C48 160/160 217/217 188/188 146/146 144/144 187/187 145/145
表16
SSR760 SSR10911 SSR13106 SSR11052 SSR14328 SSR12536 SSR17991
C37 174/174 158/158 171/171 237/237 178/178 203/203 158/158
C38 174/174 163/163 169/169 237/237 178/178 199/199 158/158
C39 168/168 163/163 167/167 184/184 170/178 195/202 160/160
C40 168/168 163/163 167/167 184/193 170/177 196/203 157/157
C41 168/168 163/163 167/167 184/184 177/177 201/201 159/159
C42 158/158 169/169 165/167 184/184 178/178 199/199 158/158
C43 165/165 169/169 167/167 187/187 181/181 198/198 158/158
C44 174/174 166/166 169/169 187/187 179/179 198/198 159/159
C45 165/174 166/169 167/167 184/184 178/178 192/198 157/157
C46 168/168 163/163 167/171 193/193 178/182 196/202 158/158
C47 159/171 163/166 167/169 193/193 178/182 199/199 159/159
C48 168/168 167/167 167/167 237/237 178/178 199/199 180/180
实施例3本发明鉴定蚕豆品种方法的应用
提取已知品种名称的6个蚕豆样品的叶片DNA，以本发明实施例1筛选得到的分子标记组合中的21对引物分别对待检蚕豆品种的DNA进行PCR扩增；参照本发明实施例2的PCR反应体系，PCR反应程序， 聚丙烯酰胺凝胶电泳和变异位点记录方法(方法1)，同时重复实验采用荧光毛细管电泳法和变异位点记录方法(方法2)，将得到的指纹代码与本发明得到的蚕豆品种的特征指纹图谱(表5-表16)进行比对，以验证本发明实施例2建立的鉴定方法准确度。
结果发现：21对引物组合对6个蚕豆品种进行PCR扩增，上述两种方法测得的6个蚕豆样品变异位点均一致，结果见表17-表19，且与本发明建立的蚕豆指纹图谱目标品种的品种间差异位点数＜3，F1-F6为待测6个蚕豆品种，经过对比鉴定得到F1-F6分别对应临蚕3号，启豆5号，青海4号，成胡11号，翼蚕二号，云豆83-63，与已知品种名称一致，准确度100％。表明本发明实施例1筛选得到的21对引物组合可以较好的可以区分不同蚕豆品种。
表17
DNA编号 EST181 SSR11885 SSR12396 SSR11908 SSR12080 EST1280 EST1741
F1 200/202 167/167 164/164 163/169 211/214 184/184 181/181
F2 208/208 167/167 171/171 166/166 207/207 186/186 186/186
F3 206/206 170/170 170/170 163/163 210/210 184/184 189/189
F4 208/208 168/171 164/164 160/163 211/211 184/186 181/181
F5 200/207 167/167 170/170 161/161 204/211 183/183 181/181
F6 208/208 167/167 170/170 166/166 204/204 198/198 180/180
表18
DNA编号 SSR13771 EST1142 EST1584 SSR11771 SSR12868 EST1672 SSR13683
F1 158/158 230/236 185/185 139/146 146/146 181/184 146/150
F2 159/159 219/219 187/187 142/146 143/143 186/186 150/150
F3 162/162 217/217 182/182 136/136 143/143 181/181 144/144
F4 157/157 217/221 185/188 146/146 144/150 181/181 146/150
F5 159/159 212/227 187/187 136/146 146/146 181/181 146/146
F6 163/163 218/218 187/187 146/146 144/144 187/187 145/145
表19
DNA编号 SSR760 SSR10911 SSR13106 SSR11052 SSR14328 SSR12536 SSR17991
F1 165/174 160/176 167/167 184/184 177/177 195/195 158/158
F2 168/168 166/166 167/167 184/184 170/170 201/201 159/159
F3 165/165 169/169 167/167 178/178 178/178 192/192 159/159
F4 159/168 166/166 165/165 184/196 171/178 195/195 160/181
F5 168/171 166/169 165/165 178/184 177/177 198/198 157/180
F6 174/174 163/163 169/171 193/239 177/177 198/198 181/181
说明应用本发明实施例2提供的鉴别蚕豆品种的方法准确性较高，适合推广使用。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
<120> 一种蚕豆SSR指纹图谱的构建方法
<130> KHP161117235.4
<160> 42
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tccatgggat cttcacaaca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcgaagtccc ttcatcatca 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gagaaaagcg gctgcttaga 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gctgtcaccg agaatgatga 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tcctccaggt ccaaaaacac 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aacccgatcc gtttcatct 19
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ccgatttcag caacctgttt 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gtgaccccat ttgcagactc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
aaatatgggt tggcgacttg 20
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gaattgacca ttgactctct tca 23
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gctagtggac ctcccattga 20
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tccaatgcaa actctccaaa c 21
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gcaccgtgct aagatgatga 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gggcccactc atttttgtta 20
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gctgacatat tgtctgcaat aacc 24
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
tgcggaaaac agtaatattg aaa 23
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tgctggaaca acaacctgaa 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
tgtgcactct ccgcatctac 20
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
cggccacaaa caaggttta 19
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
caatccaagc acaccaatca 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
cacctccacc ccgtactcta 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
aaacaaggtg cttccaccag 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
accaccttct gaggaacagc 20
<210> 24
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
ttgtgcaaat atgacatttt atttaag 27
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
ctctctagtg gcctgggtgt 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
cgatggggtg tttctctctc 20
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
gaattttcaa aacatgagtc cca 23
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
ccggatctga aaagacttgc 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
ccaaagcaaa cccaacaagt 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
cctttgcttc cagattctcc 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
tcctcaaaca tgcaggacag 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
ttgttccgag caacagtttg 20
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
cacccttctt gttccctttt t 21
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
ccggcggaac taggtatctt 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
ctccgcgagc atcactttat 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
ttgcacgatc tcaactcacc 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
cgttgcctgg ttcgtactct 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
acgacgaatt tccaccactc 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
aaattggtgg gagacaccag 20
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
aagaactacc ggaagcagac a 21
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
agccaatttg acccatcatt 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
tcctccctta gtggctcttg 20

Claims (10)

1.一种用于鉴别蚕豆品种的分子标记组合，其特征在于，含有15个SSR分子标记和6个EST-SSR分子标记，分别为SSR11908、EST181、SSR11771、SSR12080、SSR13683、SSR12396、SSR14328、EST1672、EST1280、EST1741、SSR17991、SSR10911、SSR13106、SSR760、EST1142、SSR11052、SSR13771、SSR11885、SSR12536、SSR12868、EST1584；
所述分子标记分别通过以下引物对扩增得到：SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.3-4、SEQ IDNO.5-6、SEQ ID NO.7-8、SEQ ID NO.9-10、SEQ ID NO.11-12、SEQ ID NO.13-14、SEQ IDNO.15-16、SEQ ID NO.17-18、SEQ ID NO.19-20、SEQ ID NO.21-22、SEQ ID NO.23-24、SEQID NO.25-26、SEQ ID NO.27-28、SEQ ID NO.29-30、SEQ ID NO.31-32、SEQ ID NO.33-34、SEQ ID NO.35-36、SEQ ID NO.37-38、SEQ ID NO.39-40、SEQ ID NO.41-42所示的引物。
2.一种引物组合，其特征在于，含有以下21对特异性引物对，其核苷酸序列分别如SEQID NO.1-42所示。
3.含有权利要求1所述分子标记组合或权利要求2所述引物组合的试剂盒。
4.权利要求1所述的分子标记组合或权利要求2所述的引物组合在鉴定蚕豆品种中的应用。
5.权利要求1所述的分子标记组合或权利要求2所述的引物组合在蚕豆种质资源改良中的应用。
6.一种蚕豆品种SSR指纹图谱的构建方法，其特征在于，以权利要求2所述的引物组合对不同蚕豆品种的DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测或对PCR产物进行荧光毛细管电泳检测，
纯合位点的等位变异大小数据记录为X/X，其中X为该位点等位变异的大小；
杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异；
无效等位变异的大小记录为0/0；
上述“/”前为小片段，“/”后为大片段；
通过对不同位点的数据整合，形成不同蚕豆品种的SSR指纹图谱。
7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，PCR扩增方法为：
反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性35s，60℃退火40s，72℃延伸45s，共32个循环；72℃延伸5min，10℃保温5min；
10μL扩增体系为：2×Taq PCR Master Mix5μL，2μM/μL的上、下游引物各1μL，DNA模板1.5μL，ddH2O 2.5μL。
8.权利要求6或7所述的构建方法构建得到的蚕豆品种指纹图谱。
9.如权利要求8所述的蚕豆品种指纹图谱，其为48种蚕豆品种的指纹图谱，分别如下：
和
和
和
和
和
和
和
和
和
和
和
上述C1-C48分别指代48种蚕豆品种，分别对应临夏大白蚕、临蚕2号、临蚕3号、启豆一号、通研一号、通沿三号、启豆四号、通沿二号、启豆三号、通蚕三号、启豆5号、青海三号、青海五号、青海1号、青海2号、青海4号、青海6号、青海8号、青海9号、青海10号、成胡一号、成胡二号、成胡九号、成胡10号、成胡11号、成胡12号、成胡13号、崇礼蚕豆、翼蚕一号、翼蚕二号、云豆83-324、云豆83-315、云豆83-190、云豆83-63、云豆81-37、云豆324、云豆690、凤豆1号、通蚕鲜6号、通蚕鲜7号启豆2号、青海马牙、青海13号、青海14号、青海15号、成胡14号、成胡15号、云南89147。
10.一种鉴定蚕豆品种的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取待检蚕豆品种的DNA，以权利要求2所述的引物组合中的21对引物对分别对检蚕豆品种的DNA进行PCR扩增；
(2)扩增产物通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，银染显色，根据扩增产物在电泳凝胶上的相对位置；或
对扩增产物进行荧光毛细管电泳检测，根据扩增产物的相对位置，
纯合位点的等位变异大小数据记录为X/X，其中X为该位点等位变异的大小；
杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异；
无效等位变异的大小记录为0/0；上述“/”前为小片段，“/”后为大片段；
(3)结果对照权利要求8或9的蚕豆品种指纹图谱，品种间差异位点数≥3，则为不同品种；品种间差异位点数<3，则为近似品种。
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