CN114292270B - 一种btk抑制剂及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种BTK抑制剂及其制备方法与应用。该BTK抑制剂为如下式所示的化合物或其立体异构体、溶剂化物、前药、代谢产物、药学上可接受的盐或共晶；
Description
技术领域
本发明属于药物领域，具体涉及一种BTK抑制剂及其制备方法与应用。
背景技术
布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)是TEC非受体酪氨酸激酶家族的成员之一，在除T细胞外的所有造血谱系的细胞中表达，并在B细胞受体(BCR)和Fcγ受体(FcR)信号传导途径中起重要作用，调控B细胞的产生和激活。B细胞的异常激活在B细胞淋巴瘤和自身免疫疾病的发病历程中起到关键作用。BTK抑制剂被认为具有治疗血管系统恶性肿瘤以及自身免疫疾病的潜力。目前为止已有5个BTK抑制剂被批准上市，均为不可逆BTK抑制剂。Ibrutinib是首个上市的BTK抑制剂，由于其较好的活性和可接受的毒性，成为单药治疗B细胞淋巴瘤(如MCL、WM和CLL)的一线药物，但耐药的产生(主要为C481S突变)和安全性问题也限制了其使用范围。
靶向蛋白嵌合体(PROTAC)技术已经成为极具潜力的治疗干预手段。PROTAC是一种双功能分子，包括靶蛋白配体和E3泛素连接酶配体，中间由Linker连接。PROTAC能够同时结合靶蛋白(POI)以及E3泛素连接酶，形成三元体复合物，从而引起靶蛋白的泛素化以及后续的蛋白酶体降解，从而发挥其治疗作用。相对于传统小分子药物，PROTAC更为高效和安全，也扩大了可成药靶点的选择范围，具有十分良好的开发前景。寻找新靶点、提高体内体外活性、优化PROTAC分子的物理化学性质以及药代动力学性质成为当前PROTAC药物开发所面临的巨大挑战。
含氮杂环衍生物作为Linker有利于更高效地诱导三元体复合物的形成，提升化合物降解活性和降解效率，同时也能使PROTAC分子具有更好的理化性质、代谢稳定性生物利用度。目前还没有将含氮杂环衍生物作为Linker的有效药物，因此有必要开发一种含氮杂环衍生物作为Linker的有效药物。
发明内容
为了克服上述现有技术存在的问题，本发明的目的之一在于提供一种化合物或其立体异构体、溶剂化物、前药、代谢产物、药学上可接受的盐或共晶；本发明的目的之二在于提供这种化合物的制备方法；本发明的目的之三在于提供一种药物组合物；本发明的目的之四在于提供这种化合物或其立体异构体、溶剂化物、前药、代谢产物、药学上可接受的盐或共晶的应用。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明第一方面提供如式(Ⅰ)所示的化合物或其立体异构体、溶剂化物、前药、代谢产物、药学上可接受的盐或共晶；
式(Ⅰ)中，L选自
优选的，所述L结构中，当其中任一端基与式(Ⅰ)中的
相连时，则L的另一端基与
相连。
优选的，所述化合物包括如下所示的结构：
本发明第二方面提供根据本发明第一方面所述式(1)化合物的制备方法，包括以下步骤：将式(Ⅱ)所示的化合物与式(Ⅲ)所示的化合物、Boc-哌嗪和6-卤代烟酸叔丁酯混合，反应，得到如式(1)所示化合物；
式(Ⅱ)中，X选自卤原子；
优选的，所述式(Ⅱ)中，X选自氟、氯、溴；进一步优选的，所述式(Ⅱ)中，X为氟。
本发明第三方面提供根据本发明第一方面所述式(2)-式(5)化合物的制备方法，包括以下步骤：将式(Ⅲ)所示的化合物、式(Ⅳ)所示的化合物、式(Ⅴ)所示的化合物与4-哌啶甲醇或氮杂环丁烷-3-基甲醇混合，反应，得到所述式(2)-式(5)所示化合物；
式(Ⅳ)中，X选自卤原子；
优选的，所述式(Ⅳ)中，X选自氟、氯、溴；进一步优选的，所述式(Ⅳ)中，X为氟。
优选的，当式(Ⅳ)所示的化合物结构如式(Ⅱ)所示，反应原料为4-哌啶甲醇时，得到式(2)所示的化合物；当式(Ⅳ)所示的化合物结构如式(Ⅱ)所示，反应原料为氮杂环丁烷-3-基甲醇时，得到式(3)所示的化合物；当式(Ⅳ)所示的化合物结构如式(Ⅶ)所示，反应原料为4-哌啶甲醇时，得到式(4)所示的化合物；当式(Ⅳ)所示的化合物结构如式(Ⅶ)所示，反应原料为氮杂环丁烷-3-基甲醇时，得到式(5)所示的化合物；
式(Ⅱ)和式(Ⅶ)中，X选自卤原子。
本发明第四方面提供根据本发明第一方面所述式(6)-式(7)所示化合物的制备方法，包括以下步骤：将式(Ⅲ)所示的化合物、式(Ⅳ)所示的化合物与式(Ⅵ)所示的化合物混合，反应，得到所述式(6)-式(7)所示化合物；
式(Ⅳ)中，X选自卤原子；
优选的，当式(Ⅳ)所示的化合物结构如式(Ⅱ)所示，得到式(6)所示的化合物；当式(Ⅳ)所示的化合物结构如式(Ⅶ)所示，得到式(7)所示的化合物；
式(Ⅱ)和式(Ⅶ)中，X选自卤原子。
本发明第五方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包括根据本发明第一方面所述化合物或其立体异构体、溶剂化物、前药、代谢产物、药学上可接受的盐或共晶。
本发明第六方面提供根据本发明第一方面所述化合物或其立体异构体、溶剂化物、前药、代谢产物、药学上可接受的盐或共晶在制备治疗和/或预防和/或延缓和/或辅助治疗与BTK活性或表达量相关疾病的药物中的应用。
优选的，所述的疾病为肿瘤或自身免疫疾病。
优选的，所述肿瘤包括非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤。
优选的，所述自身免疫疾病为类风湿关节炎或银屑病。
本发明的有益效果是：
本发明提供的化合物结构新颖，测试结果表明其具有优异的BTK蛋白降解效率和抑制淋巴瘤细胞增殖效果；该化合物的制备方法简便快捷，绿色安全，工艺路线成熟；该化合物或其立体异构体、溶剂化物、前药、代谢产物、药学上可接受的盐或共晶可广泛应用于制备治疗与BTK活性或表达量相关疾病的药物中。
具体来说，本发明具有如下优点：
1.本发明提供的能化合物够降解Ramos细胞或Mino细胞中的BTK蛋白，能够降解Hela细胞中C481S突变的BTK蛋白，能够抑制人套细胞淋巴瘤细胞Mino的增殖，该化合物结构新颖，活性高。
2.本发明提供的化合物的制备方法简便快捷，绿色安全，工艺路线成熟，具有可工业规模化生产的优势。
3.本发明提供的化合物具有优异的BTK蛋白降解效率和抑制淋巴瘤细胞增殖效果，该化合物或其立体异构体、溶剂化物、前药、代谢产物、药学上可接受的盐或共晶可广泛应用于制备治疗与BTK活性或表达量相关疾病的药物中。
附图说明
图1为实施例1化合物1的核磁氢谱图。
图2为实施例1化合物1的核磁碳谱图。
图3为实施例2化合物2的核磁氢谱图。
图4为实施例2化合物2的核磁碳谱图。
图5为实施例3化合物3的核磁氢谱图。
图6为实施例3化合物3的核磁碳谱图。
图7为实施例4化合物4的核磁氢谱图。
图8为实施例4化合物4的核磁碳谱图。
图9为实施例5化合物5的核磁氢谱图。
图10为实施例5化合物5的核磁碳谱图。
图11为实施例6化合物6的核磁氢谱图。
图12为实施例6化合物6的核磁碳谱图。
图13为实施例7化合物7的核磁氢谱图。
图14为实施例7化合物7的核磁碳谱图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器末注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
本发明的己知起始原料可以采用或按照本领域己知的方法来合成，或可购买于泰坦科技、安耐吉化学、上海德默、成都科龙化工、韶远化学科技、百灵威科技等公司；薄层层析硅胶板使用烟台黄海HSGF254或青岛GF254硅胶板，薄层色谱法(TLC)使用的硅胶板采用的规格是0.15mm-0.20mm，薄层层析分离纯化产品采用的规格是0.4mm-0.5mm；柱层析使用烟台黄海硅胶200-300目硅胶为载体；化合物的结构是通过核磁共振(NMR)来确定的。NMR位移以(ppm)的单位给出。NMR的测定是用(Bruker Avance III 400)核磁仪，测定溶剂为氘代二甲基亚砜(DMSO-de)，氘代氯仿(CDC13)，氘代甲醇(CD3OD)，内标为四甲基硅烷(TMS)。
实施例1
本例BTK抑制剂的反应路线如下；
将2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-5-氟异吲哚啉-1,3-二酮记为化合物1a，其具体结构如下所示，其具体制备步骤见专利WO2017197056；
将2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-5-(哌嗪-1-基)异吲哚啉-1,3-二酮盐酸盐记为化合物1b，其具体结构如下所示，
化合物1b的具体制备步骤如下：
将500mg(1.81mmol)化合物1a与337.15mg(1.81mmol)Boc-哌嗪溶于5mL DMF溶液中，加入615.67μL(3.62mmol)DIPEA(N,N-二异丙基乙胺)升温至80℃反应3h。反应结束后，反应体系中加入20mL乙酸乙酯，依次用水、饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂后得粗品。经硅胶柱层析(0％-5％甲醇/二氯甲烷，V/V)纯化后得中间产物4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-5-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(300mg收率37.46％)。在冰浴中，将中间产物(300mg，0.68mmol)溶于5mL氯化氢/二氧六环溶液中，室温下反应1h，有固体析出。过滤、干燥后得到232mg产物化合物1b(收率90.33％)。
将6-(4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-5-基)哌嗪-1-基)烟酸记为化合物1c，其具体结构如下所示，
化合物1c的具体制备步骤如下；
将化合物1b(200mg；0.53mmol)与6-氯烟酸叔丁酯(112.7mg；0.53mmol)溶于DMF中，加入无水碳酸钠(111.9mg，1.06mmol)，室温下反应3h。反应结束后，反应体系中加入10mL二氯甲烷，依次用水、饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂后得粗品，经硅胶柱层析(0％-20％乙酸乙酯/二氯甲烷，V/V)纯化后得6-(4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-5-基)哌嗪-1-基)烟酸叔丁酯。该产物冰浴下加入5mL三氟乙酸/二氯甲烷溶液(1:3，V/V)，缓慢升至室温搅拌2h，减压蒸除溶剂后即得产品化合物1c(88mg，总收率35.96％)。
将3-(4-苯氧基苯基)-1-(哌啶-4-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺记为化合物1d，其具体结构如下所示，其具体制备步骤见文章Biochemistry，2018，57(26):3564-3575；
将5-(4-(5-(4-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-羰基)吡啶-2-基)哌嗪-1-基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异二氢吲哚-1,3-二酮记为化合物1，其具体结构如下所示，
化合物1的具体制备步骤如下；
将化合物1c(30mg，0.06mmol)和化合物1d(23.12mg，0.06mmol)溶于2mL DMF，加入34.12mg(0.09mmol)HATU(2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)，30.52μL(0.18mmol)DIPEA，室温下反应1h。反应结束后，反应体系中加入10mL乙酸乙酯，依次用水、饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂后得粗品，经柱层析(0％-10％甲醇/二氯甲烷，V/V)纯化后得产物化合物5(8mg，收率22.28％)。化合物1的核磁数据为1HNMR(400MHz，Chloroform-d)δ8.45–8.36(m，2H)，7.77–7.71(m，2H)，7.66(d，J＝8.4Hz，2H)，7.41(t，J＝7.8Hz，2H)，7.34–7.31(m，1H)，7.23–7.15(m，3H)，7.13–7.07(m，3H)，6.72–6.66(m，1H)，5.16–5.04(m，1H)，4.97(dd，J＝12.1，5.4Hz，1H)，3.95–3.81(m，5H)，3.65–3.58(m，4H)，3.28–3.16(m，2H)，2.96–2.71(m，4H)，2.46–2.35(m，2H)，2.19–2.09(m，3H).13CNMR(101MHz，Chloroform-d)δ171.27，168.57，167.57，166.81，157.72，156.36，155.37，153.81，148.08，143.37，134.61，133.77，129.89，127.98，123.92，119.42，119.20，119.06，112.27，98.51，89.28，62.19，54.38，52.91，48.92，31.40，31.15，30.08，22.67。图1为实施例1化合物1的核磁氢谱图，图2为实施例1化合物1的核磁碳谱图。
实施例2
本例BTK抑制剂的制备反应路线如下：
将2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-4-氟异吲哚啉-1,3-二酮记为化合物2a，其具体结构如下所示，其具体制备方法与化合物1a相同；
将1-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-4-甲醛记为2d，其结构式如下，
化合物2d的具体制备步骤如下：
将化合物1a(200mg，0.72mmol)与哌啶-4-基甲醇(83.4mg，0.72mmol)溶于5mLDMF，加入DIPEA(246.27μL，1.45mmol)，升温至80℃反应3h。反应结束后，反应体系中加入20mL乙酸乙酯，依次用水、饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂后得粗品，经柱层析(0％-5％甲醇/二氯甲烷，V/V)纯化后得中间产物(300mg，收率37.46％)。上步产物(200mg，0.54mmol)，溶于5mL二氯甲烷，冰浴下加入戴斯马丁氧化剂(456.81mg，1.08mmol)，室温下搅拌至反应完全。反应完全后，加入2mL硫代硫酸钠、碳酸氢钠(1:1，V/V)混合溶液，搅拌3～5min，分离有机相，水相用二氯甲烷洗涤(10mL*3)，合并有机相，有机相用饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂后得粗产物。粗产物经柱层析纯化后得到产物化合物2d(180mg，总收率33.9％)。
将1-(4-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-2-(哌嗪-1-基)乙烷-1-酮盐酸盐记为化合物2h，其制备反应路线如下，
化合物2h的制备步骤如下：
第一步：制备4-(2-(4-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-2-氧代乙基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯。
将化合物1d(2.0g，5.18mmol)与2-(4-(叔丁氧羰基)哌嗪-1-基)乙酸(1.26g，5.18mmol)，N,N,N',N'-四甲基氯代脲六氟磷酸盐(3.05g，10.87mmol)，N-甲基咪唑(1.44mL，18.11mmol)，溶于20mL二氯甲烷，室温搅拌30min。反应结束后，反应体系中加入水，分离有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂后得粗产品。粗产品经柱层析分离(0％～5％甲醇/二氯甲烷，V/V)得4-(2-(4-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-2-氧代乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(1.5g，收率47.30％)。其核磁数据如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.25(s，1H)，7.69–7.62(m，2H)，7.44(t，J＝7.9Hz，2H)，7.25–7.07(m，5H)，4.98(d，J＝4.4Hz，1H)，3.63(d，J＝12.7Hz，2H)，3.25(d，J＝8.6Hz，2H)，2.45(q，J＝4.1Hz，5H)，2.42–2.38(m，4H)，2.02–1.91(m，4H)，1.40(s，9H)。
第二步：制备化合物2h。
将上步产物溶于10mL氯化氢/二氧六环溶液中，室温下搅拌30min，过滤得到化合物2h(1.2g，收率89.28％)。
将5-(4-((4-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-2-氧代乙基)哌啶-1-基)甲基)哌啶-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮记为化合物2，其结构式如下，
化合物2的具体制备步骤如下：
将化合物2d(30mg，58.52μM)与化合物2h(21.62mg，58.62μM)，溶于5mL二氯甲烷，加入三乙胺(9μL，117.04μM)，室温下搅拌5min后，分批加入三乙酰氧基硼氢化钠(62.02mg，292.62μM)，室温下搅拌2h。反应完毕后，向反应体系中加入饱和碳酸氢钠溶液，分离有机相，无机相用二氯甲烷萃取(3mL*3)，合并有机相，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂后得粗产品。粗产品通过柱层析纯化(0％-10％甲醇/二氯甲烷，V/V)得产物化合物2(17.95mg，收率35.42％)。其核磁数据如下：1H NMR(400MHz，Chloroform-d)δ8.40(s，1H)，7.65(t，J＝8.3Hz，3H)，7.43–7.34(m，2H)，7.28–7.26(m，1H)，7.21–7.11(m，3H)，7.11–6.99(m，3H)，5.08–4.97(m，1H)，4.95(dd，J＝11.9，5.4Hz，1H)，4.79–4.71(m，1H)，4.34–4.25(m，1H)，3.98–3.86(m，2H)，3.71(s，2H)，3.34–3.14(m，3H)，3.01–2.70(m，6H)，2.65–2.48(m，7H)，2.44–2.35(m，2H)，2.28–2.17(m，3H)，2.16–2.02(m，3H)，1.92–1.83(m，2H)，1.82–1.72(m，1H).13C NMR(101MHz，Chloroform-d)δ172.02，169.23，168.05，167.97，167.28，158.39，157.90，156.27，155.31，153.76，143.72，134.32，129.90，129.87，127.74，125.34，123.97，119.41，119.04，118.36，117.62，108.47，99.92，98.47，67.00，64.10，61.17，54.06，53.43，52.97，49.06，47.91，44.72，41.17，33.10，31.72，31.49，31.14，30.03，22.75。图3为实施例2化合物2的核磁氢谱图，图4为实施例2化合物2的核磁碳谱图。
实施例3
本例BTK抑制剂的制备方法如下；
将1-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-5-基)氮杂环丁烷-3-醛记为化合物2e，其结构式如下，
化合物2e的具体制备步骤与化合物2d相同，以1a和氮杂环丁烷-3-基甲醇盐酸盐为原料，经两步反应得产物化合物2e(175mg，总收率59.00％)。
将5-(3-((4-(2-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-2-氧代乙基)哌嗪-1-基)甲基)氮杂环丁-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮记为化合物3，其结构式如下，
化合物3的合成方法同化合物2，以化合物化合物2h和化合物2e为原料，得产物化合物3 18.35mg，收率37.42％。其核磁数据如下：1H NMR(400MHz，Chloroform-d)δ8.40(s，1H)，7.66(d，J＝8.3Hz，2H)，7.49–7.35(m，3H)，7.22–7.13(m，4H)，7.09(d，J＝7.9Hz，2H)，6.58(d，J＝8.5Hz，1H)，5.08–4.88(m，2H)，4.76(d，J＝13.6Hz，1H)，4.43–4.35(m，2H)，4.33–4.24(m，1H)，3.98–3.90(m，2H)，3.34–3.17(m，3H)，3.02–2.67(m，6H)，2.65–2.51(m，6H)，2.45–2.21(m，3H)，2.17–2.06(m，3H)，2.00–1.78(m，2H).13C NMR(101MHz，Chloroform-d)δ170.13，167.83，167.56，166.83，158.46，157.80，156.26，151.26，145.58，143.67，134.62，133.75，131.81，129.90，129.87，127.72，124.00，119.46，119.19，119.04，112.32，61.08，58.53，56.94，53.03，52.80，52.17，48.92，44.70，31.39，29.63，27.50，24.23，22.62。图5为实施例3化合物3的核磁氢谱图，图6为实施例3化合物3的核磁碳谱图。
实施例4
本例BTK抑制剂的制备方法如下；
将1-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)哌啶-4-甲醛记为化合物2f，其结构式如下，
化合物2f的具体制备步骤与化合物2d相同，以化合物2a和4-羟甲基哌啶为原料，经两步反应得产物化合物2f(172mg，总收率62.17％)。
将4-(4-((4-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-2-氧代乙基)哌啶-1-基)甲基)哌啶-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮记为化合物4，其结构式如下，
化合物4的合成方法同化合物2，以化合物2h和化合物2f为原料，得产物化合物410mg，收率34.48％。其核磁数据如下：1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.41(s,1H),7.68–7.62(m,2H),7.60–7.54(m,1H),7.43–7.34(m,3H),7.20–7.13(m,4H),7.11–7.06(m,2H),5.08–4.95(m,2H),4.80–4.72(m,1H),4.36–4.25(m,1H),3.80–3.68(m,2H),3.34–3.16(m,3H),2.93–2.81(m,5H),2.81–2.69(m,1H),2.63–2.50(m,7H),2.44–2.34(m,2H),2.30–2.24(m,2H),2.15–2.06(m,4H),1.95–1.86(m,2H),1.75–1.64(m,1H),1.53–1.40(m,2H).13C NMR(101MHz，Chloroform-d)δ171.73，168.91，168.03，167.43，166.62，158.42，157.87，156.26，155.42，153.78，150.82，143.70，135.35，134.07，129.90，129.87，127.75，123.97，123.57，119.44，119.02，117.03，115.10，98.49，64.35，61.25，54.00，53.49，53.03，49.07，44.73，41.17，32.93，31.44，30.92，29.62，22.66。图7为实施例4化合物4的核磁氢谱图，图8为实施例4化合物4的核磁碳谱图。
实施例5
本例BTK抑制剂的制备方法如下；
将1-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氮杂环丁烷-3-醛记为化合物2g，其结构式如下，
化合物2g的具体制备步骤与化合物2d相同，以2a和氮杂环丁烷-3-基甲醇盐酸盐为原料，经两步反应得产物化合物2g(180mg，总收率55.84％)。
将4-(3-((4-(2-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-2-氧代乙基)哌嗪-1-基)甲基)氮杂环丁-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮记为化合物5，其结构式如下，
化合物5的合成方法同化合物2，以化合物2h和化合物2g为原料，得产物化合物520.6mg，收率23.12％。1H NMR(400MHz，Chloroform-d)δ8.40(s，1H)，7.66(d，J＝8.3Hz，2H)，7.49–7.35(m，3H)，7.22–7.13(m，4H)，7.09(d，J＝7.9Hz，2H)，6.58(d，J＝8.5Hz，1H)，5.08–4.88(m，2H)，4.76(d，J＝13.6Hz，1H)，4.43–4.35(m，2H)，4.33–4.24(m，1H)，3.98–3.90(m，2H)，3.34–3.17(m，3H)，3.02–2.67(m，6H)，2.65–2.51(m，6H)，2.45–2.21(m，3H)，2.17–2.06(m，3H)，2.00–1.78(m，2H).13C NMR(101MHz，Chloroform-d)δ170.13，167.83，167.56，166.83，158.46，157.80，156.26，151.26，145.58，143.67，134.62，133.75，131.81，129.90，129.87，127.72，124.00，119.46，119.19，119.04，112.32，61.08，58.53，56.94，53.03，52.80，52.17，48.92，44.70，31.39，29.63，27.50，24.23，22.62。图9为实施例5化合物5的核磁氢谱图，图10为实施例5化合物5的核磁碳谱图。
实施例6
本例BTK抑制剂的制备反应路线如下：
将(6-(哌啶-4-乙炔基)吡啶-3-基)甲醇盐酸盐记为3a，其结构式如下，
化合物3a的具体制备步骤如下：
将2-氯-5-羟甲基吡啶(100mg，691.76μmol)，1-Boc-4-乙炔基哌啶(159.26mg，760.94μmol)，溶于DMF，加入双三苯基磷二氯化钯(48.56mg，69.18μmol)、碘化亚铜(26.35mg，138.35μmol)、三乙胺(287.68μL，2.08mmol)，N2保护下加热至80℃反应3h。反应结束后向体系中加入10mL乙酸乙酯，有机相用水洗涤(20mL*3)，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂后得中间产物。冰浴下，上述产物溶于3mL 4mol/L盐酸/二氧六环溶液中，搅拌至反应完全，过滤后得到产物化合物3a。
将6-((1-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-4-基)乙炔基)烟醛记为3b，其结构式如下，
化合物3b的具体制备步骤如下：
将化合物3a(50mg，197.06μmol)与化合物1a(49.48mg，179.15μmol)溶于1mL DMF，加入DIPEA(91.4μL，537.44μmol)，升温至80℃反应2h，反应结束后向体系中加入5mL乙酸乙酯，有机相用水洗涤(10mL*3)，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂后得粗产品。上述产物溶于3mL二氯甲烷，冰浴下加入戴斯马丁氧化剂(80.62mg，190.08μmol)，室温下搅拌至反应完全。反应完全后，加入3mL硫代硫酸钠、碳酸氢钠(1:1，V/V)混合溶液，搅拌3～5min，分离有机相，水相用二氯甲烷洗涤(10mL*3)，合并有机相，有机相用饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂后得粗产物。粗产物经柱层析(0％-3％甲醇/二氯甲烷，V/V)纯化后得到产物化合物3b(15mg，收率51.7％)。
将6-((1-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)哌啶-4-基)乙炔基)烟醛记为3c，其结构式如下，
化合物3c的合成方法同3b相同，以2a和3a为原料，经两步反应得到产物化合物3c(18mg，总收率31％)。
将5-(4-((5-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)甲基)哌啶-2-基)乙炔基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮记为化合物6，其结构式如下，
化合物6的合成方法同化合物2，以化合物3b和化合物1d为原料得产物(8mg，收率30.76％)。其核磁数据如下：1H NMR(400MHz，Chloroform-d)δ8.53–8.49(m，1H)，8.40(s，1H)，7.75–7.62(m，4H)，7.44–7.36(m，3H)，7.32(d，J＝2.3Hz，1H)，7.21–7.14(m，3H)，7.12–7.05(m，3H)，4.96(dd，J＝12.1，5.3Hz，1H)，4.86–4.78(m，1H)，3.82–3.71(m，1H)，3.60(s，2H)，3.44–3.31(m，2H)，3.06–2.96(m，2H)，2.94–2.70(m，4H)，2.51–2.39(m，2H)，2.36–2.24(m，2H)，2.20–2.12(m，1H)，2.09–2.00(m，3H)，1.97–1.87(m，4H).13C NMR(101MHz，Chloroform-d)δ171.37，168.62，167.91，167.19，158.33，157.76，156.37，155.24，153.74，150.27，136.73，134.32，129.91，129.88，126.62，125.39，123.90，119.40，119.09，118.94，117.91，108.72，98.47，59.60，52.63，49.09，46.43，31.43，31.20，30.44，29.63，27.20，22.71。图11为实施例6化合物6的核磁氢谱图，图12为实施例6化合物6的核磁碳谱图。
实施例7
本例BTK抑制剂的制备方法如下；
将4-(4-((5-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)甲基)哌啶-2-基)乙炔基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮记为化合物7，其结构式如下，
化合物7的合成方法同化合物2，以化合物3c和化合物1d为原料得产物(6.8mg，收率26.79％)。其核磁数据如下：1H NMR(400MHz，Chloroform-d)δ8.55–8.48(m，1H)，8.40(s，1H)，7.73–7.68(m，1H)，7.68–7.64(m，2H)，7.61–7.57(m，1H)，7.43–7.37(m，4H)，7.24–7.14(m，4H)，7.12–7.07(m，2H)，5.04–4.94(m，1H)，4.86–4.76(m，1H)，3.66–3.61(m，1H)，3.60(s，2H)，3.31–3.22(m，2H)，3.06–3.00(m，2H)，2.99–2.91(m，1H)，2.90–2.87(m，1H)，2.86–2.80(m，1H)，2.79–2.73(m，1H)，2.51–2.40(m，2H)，2.36–2.26(m，2H)，2.18–2.11(m，3H)，2.07–1.99(m，5H).13C NMR(101MHz，Chloroform-d)δ171.41，168.63，167.36，166.53，158.32，157.78，156.37，155.25，153.74，150.66，150.22，143.48，142.29，136.69，135.43，134.08，129.91，129.88，127.93，126.62，123.89，123.60，119.39，119.09，117.33，115.43，98.47，92.04，81.67，59.65，54.30，52.65，49.93，49.09，31.43，31.22，29.63，26.94，22.65。图13为实施例7化合物7的核磁氢谱图，图14为实施例7化合物7的核磁碳谱图。
对比例1
本例BTK抑制剂的结构如下；MT802的结构如下所示，其具体合成方法参考文献Biochemistry，2018，57(26)：3564-3575；
对比例2
本例BTK抑制剂的结构如下；Ibrutinib的结构如下所示，购买自安耐吉化学；
性能测试
测试所用仪器试剂来源：BTK一抗购自Abcam，EPR20445；β-Actin一抗购自弗得生物，FD0060；兔抗购自弗得生物，FDR007；鼠抗购自弗得生物，FDM007；1640培养基购自Gibco；CCK8购自GLPBIO，GK10001。
1.降解剂在Ramos细胞和Mino细胞中降解BTK活性测试
细胞培养：Ramos(人Burkitt’s淋巴瘤细胞)细胞培养基为RMPI1640+10％FBS+1％青霉素-链霉素溶液；Mino(人套细胞淋巴瘤细胞)细胞培养基为RMPI1640+15％FBS+1％青霉素-链霉素溶液。两种细胞均在37℃，5％CO2条件下培养。
铺板：6孔板中，每孔加入2×106个细胞，铺板后，向每孔中加入不同浓度的待测化合物溶液，至于37℃，5％CO2孵箱中培养24h。
准备蛋白样品：培养结束后，收集细胞加入含1％广谱蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂和PMSF的RIPA裂解液，于冰上裂解15min后，13000×g，4℃离心10min，收集上清蛋白样品，用BCA试剂盒进行蛋白定量，将稀释后的蛋白样品与1×Loading Buffer配置成浓度为1mg/mL的混合溶液，于100℃下加热变性5min，4℃下保存。
Western Blot实验:
1)配胶：配置不同浓度的SDS-PAGE凝胶。
2)上样：将配置好的蛋白样品按10μL/孔加入SDS-PAGE凝胶上样孔中。
3)电泳：蛋白样品在浓缩胶中电压为80V，待蛋白进入分离胶后，电压上调至120V继续电泳，待溴酚蓝达到分离胶底部时停止电泳。
4)转膜：将电泳完毕的胶完整的放在盛有电转液的玻璃皿中，将滤纸、PVDF膜、凝胶按正极-海绵-双层滤纸-PVDF膜-凝胶-双层滤纸-海绵-负极安装在转膜夹中，冰浴下恒流300mA转膜75min。
5)封闭：转膜完毕后，将PVDF膜取出，放入5％脱脂奶粉封闭液内，置于摇床(70转/分钟)，室温封闭90min。
6)一抗孵育：封闭结束后，将PVDF膜用TBST液洗涤5min×5次，加入按一定比例稀释的一抗，4℃下孵育过夜。
7)二抗孵育：一抗孵育结束后，吸走一抗，将PVDF膜用TBST液洗涤5min×5次，按一抗种属(兔抗或鼠抗)，加入按比例稀释的二抗，室温下孵育1h。
8)显影：二抗孵育结束后，吸走二抗，将PVDF膜用TBST液洗涤5min×5次。显色时将ECL显影液均匀涂在PVDF膜上，置于成像分析系统中显影、拍照。
数据处理：使用Image J软件处理Western Blot实验所得图片，计算灰度值，通过BTK和内参的灰度值计算BTK的相对丰度。并根据化合物浓度和BTK的相对丰度在GraphPadPrism 7软件中计算化合物的DC50。表1为化合物1-7在Ramos和Mino细胞中降解BTK活性测试结果。“DC50”是指降解50％蛋白时的剂量。
表1：实施例1-7和对比例1-2在Ramos和Mino细胞中降解BTK活性测试结果
表1的测试结果表明，实施例1-7的含氮环衍生物为作为Linker的BTK降解剂能够高效降解Ramos细胞或Mino细胞中的BTK蛋白，效果优于对比例1的MT802和对比例2的Ibrutinib。
2.化合物降解BTK C481S活性测试
细胞培养：Hela细胞(宫颈癌细胞)培养基为DMEM+10％FBS+1％青霉素-链霉素溶液，在37℃，5％CO2条件下培养。
表达BTK C481S蛋白：
1)质粒提取：取5μL含BTK C481S质粒的大肠杆菌菌液(购自长沙优泽生物科技有限公司)，加入5mL配置好的无菌LB液体培养基(含0.5％卡那霉素)中，置于恒温摇床，37℃，220rpm摇晃16h，待培养基浑浊后，取1.0-5.0mL的菌液于EP管中，10kg离心1min，弃上清。使用
Plasmid Mini Kit I提取质粒，并测定质粒浓度。
2)铺板：6孔板中，每孔加入1×106个细胞，置于培养箱中(37℃，5％CO2)培养至细胞贴壁。
3)转染：细胞贴壁后，将培养基换为Opti-MEM培养基，加入配置好的质粒/Lipo3000混合液(2μg质粒/孔)，置于培养箱中培养6h。转染结束后，将培养基换为DMEM完全培养基，加入不同浓度的化合物继续培养96h。
培养结束后，按测试例1中方法提取蛋白，进行Western Blot实验，测试化合物的DC50，方法同性能测试1中的降解剂在Ramos细胞和Mino细胞中降解BTK活性测试。表2为实施例2-5和对比例1-2在降解BTK C481S活性测试结果。“DC50”是指降解50％蛋白时的剂量。
表2：实施例2-5和对比例1-2在降解BTK C481S活性测试结果
| 化合物 | DC50(nM) |
| 实施例2 | 116.6 |
| 实施例3 | 34.48 |
| 实施例4 | 75.95 |
| 实施例5 | 117.7 |
| 对比例1 | 333.7 |
| 对比例2 | >1000 |
上述结果显示，本申请制备的实施例2-5含氮环衍生物为作为Linker的BTK降解剂能够高效降解Hela细胞中C481S突变的BTK蛋白，效果优于对比例的Ibrutinib和MT802。
3.化合物抑制Mino细胞增殖活性测试
Mino(人套细胞淋巴瘤细胞)细胞培养基为RMPI1640+15％FBS+1％青霉素-链霉素溶液。两种细胞均在37℃，5％CO2条件下培养。
铺板：96孔板中，每孔加入50μL细胞悬液(含10000个细胞)，置于培养箱中培养过夜。加药：次日，每孔中加入50μL不同浓度的化合物，每个浓度设3个复孔，另设3个调零孔和3个空白孔，加药完毕后将96孔板置于培养箱中孵育72h。
细胞活力测定：72h后，向每孔中加入10μL CCK8，继续置于培养箱中孵育4h。4h后使用酶标仪测定吸光度。
数据处理：使用Graphpad Prism 8软件处理实验数据，计算化合物抑制细胞增殖的IC50值。表3为实施例2-5和对比例1-2抑制Mino细胞增殖活性的测试结果。
表3：实施例2-5和对比例1-2抑制Mino细胞增殖活性的测试结果
| 化合物 | IC50(nM) |
| 实施例2 | 9.092 |
| 实施例3 | 0.9438 |
| 实施例4 | 10.42 |
| 实施例5 | 6.047 |
| 对比例1 | 4971 |
| 对比例2 | 5065 |
表3的测试结果显示，含氮环衍生物为作为Linker的BTK降解剂能够显著抑制人套细胞淋巴瘤细胞Mino的增殖，效果均优于对比例的MT802和Ibrutinib。
上述实例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.式（Ⅰ）所示的化合物或其药学上可接受的盐；
式（Ⅰ）中，L选自
、
、
、
。
2.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于：所述化合物包括如下所示的结构：
3.一种化合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：将式（Ⅱ）所示的化合物与式（Ⅲ）所示的化合物、Boc-哌嗪和6-卤代烟酸叔丁酯混合，反应，得到如式（1）所示化合物；
式（Ⅱ）中，X选自卤原子；
4.一种化合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：将式（Ⅲ）所示的化合物、式（Ⅳ）所示的化合物、式（Ⅴ）所示的化合物与4-哌啶甲醇或氮杂环丁烷-3-基甲醇混合，反应，得到所述式（2）-式（5）所示化合物；
式（Ⅳ）中，X选自卤原子；
5.一种化合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：将式（Ⅲ）所示的化合物、式（Ⅳ）所示的化合物与式（Ⅵ）所示的化合物混合，反应，得到所述式（6）-式（7）所示化合物；
式（Ⅳ）中，X选自卤原子；
6.一种药物组合物，其特征在于：所述药物组合物包括权利要求1-2任一项所述化合物或其药学上可接受的盐。
7.权利要求1-2任一项所述化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防和/或延缓和/或辅助治疗与BTK活性或表达量相关疾病的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的疾病为肿瘤或自身免疫疾病。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述肿瘤包括非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述自身免疫疾病为类风湿关节炎或银屑病。
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