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WO2022017223A1 - 丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体及其应用 - Google Patents

丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体及其应用 Download PDF

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WO2022017223A1
WO2022017223A1 PCT/CN2021/105989 CN2021105989W WO2022017223A1 WO 2022017223 A1 WO2022017223 A1 WO 2022017223A1 CN 2021105989 W CN2021105989 W CN 2021105989W WO 2022017223 A1 WO2022017223 A1 WO 2022017223A1
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WO
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gene
mutant
promoter
protein
pyruvate carboxylase
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Application number
PCT/CN2021/105989
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孙际宾
刘娇
郑平
石拓
周文娟
陈久洲
郭轩
马延和
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中国科学院天津工业生物技术研究所
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Publication date
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    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/15—Corynebacterium

Definitions

  • Amino acids including lysine, threonine, glutamic acid, etc.
  • the main production strains include Enterobacter, Corynebacterium and other microorganisms, and due to the physiological superiority of Corynebacterium, Corynebacterium has become the most important production strain in the industry.
  • reports of metabolic engineering of Corynebacterium to improve its amino acid production have gradually increased. These modifications include enhancing the expression of enzymes related to amino acid synthesis pathways, and weakening the expression of enzymes related to competitive pathways.
  • the present disclosure provides a mutant of a pyruvate carboxylase gene promoter, wherein the mutant (i) is at positions 279 to 279 of the promoter corresponding to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO. 21.
  • One or more mutated nucleotides are present in the core region at position 317.
  • mutant (iii) comprises the reverse complement of a sequence capable of hybridizing to the nucleotide sequence shown in (i) or (ii) under high stringency hybridization conditions or very high stringency hybridization conditions sequence.
  • mutant (iv) comprises a nucleotide sequence having at least 90% sequence identity to the nucleotide sequence set forth in (i) or (ii). Specifically, having at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% compared to the nucleotide sequence shown in (i) or (ii) , 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% sequence identity.
  • the mutant of the pyruvate carboxylase gene promoter has 1-17 times more enhanced promoter activity than the pyruvate carboxylase gene promoter of the sequence shown in SEQ ID NO. 21.
  • the mutated promoter activity is enhanced by at least 1.8 times, preferably 3 times, 5 times, 8 times, preferably 10 times, 11 times, 12 times, 13 times, more preferably 14 times, 15 times, 16 times or more.
  • the mutant of the promoter of the present disclosure is an improved promoter of the pyruvate carboxylase gene of Corynebacterium glutamicum, which has higher promoter activity than the wild-type promoter, such as at least 1.8 times, 3 times, 5 times higher times, 8 times, preferably 10 times, 11 times, 12 times, 13 times, more preferably 14 times, 15 times, 16 times or more.
  • the "expression cassette” has the meaning generally understood by those skilled in the art, that is, it contains a promoter, a target gene and an element capable of expressing the target gene.
  • the present disclosure provides the mutant of the pyruvate carboxylase gene promoter described in the first aspect, the expression cassette or expression vector described in the second aspect, and the recombinant host cell described in the third aspect in the following ( Use in at least one of a)-(c):
  • mutants of the pyruvate carboxylase gene promoter are used for expression of genes related to organic acid synthesis.
  • the present disclosure provides a method for producing a target product using oxaloacetate as a precursor, the method comprising culturing a mutant containing the pyruvate carboxylase gene promoter and using oxaloacetate as a precursor
  • the genes involved in the synthesis of the target product are operably linked to the host cell, and the resulting target product is collected.
  • the method for producing a target product using oxaloacetate as a precursor described in the present disclosure on the basis of the mutant of the pyruvate carboxylase gene promoter in the present disclosure is used.
  • the method also includes the step of recovering the target product from the cells or the culture medium.
  • Methods for recovering the product of interest from cells or culture medium are well known in the art and include, but are not limited to: filtration, anion exchange chromatography, crystallization and HPLC.
  • the nucleic acid molecule with enhanced promoter activity provided by the present disclosure exhibits higher promoter activity than wild-type, and can be used for the expression of target genes, especially the expression of genes related to amino acid production, such as It is operably linked to genes related to the synthesis of target products such as pyc gene, which can enhance the expression intensity of proteins related to the synthesis of target products such as pyruvate carboxylase, thereby improving the production of amino acids and derivatives of recombinant strains.
  • nucleotide sequence When a nucleotide sequence is represented by a DNA sequence (ie, A, T, G, C), this also includes an RNA sequence (ie, A, U, G, C), where "U” replaces "T".
  • polynucleotide refers to a polymer of nucleotides removed from other nucleotides (individual fragments or entire fragments), or may be a component or component of a larger nucleotide structure, such as an expression vector or polycistronic sequence. Polynucleotides include DNA, RNA and cDNA sequences.
  • the term “complementary” refers to hybridization or base pairing between nucleotides or nucleotides, such as between two strands of a double-stranded DNA molecule or an oligonucleotide primer and a Between primer binding sites on single-stranded nucleotides for sequencing or amplification, etc.
  • the present disclosure first constructs a characterization vector. Based on the pEC-XK99E plasmid backbone, the pyc gene promoter expresses the N-terminal 60 amino acids of the pyc gene, a linking peptide and a red color fluorescent protein gene. According to the published Corynebacterium glutamicum ATCC13032 genome sequence and pyc gene annotation information, the primer pyc-F/R was designed, and the ATCC13032 genome was used as a template to obtain the pyc gene promoter and N-terminal 180bp DNA fragment by PCR amplification.
  • CGATGT TTGATT GGGGAATCGGGGGT TACGAT ACTAGG was mutated, and the main sequences in the -35 and -10 regions of the promoter were underlined.
  • the mutation "NNNNNN TTGATT NNNNNNNNNNNNNNN TANNAT NNNNNN” is performed at the corresponding position of the above core region, and two fragments of the plasmid are amplified by pyc-M1/M2 and pyc-M3/M4 primers respectively, and cloned by Novozan's one-step recombination kit After ligation, all the cloned bacteria obtained were collected and plasmids were extracted to obtain a pyc gene promoter mutant library.
  • the composition of TSB plate medium is (g/L): glucose, 5g/L; yeast powder, 5g/L; soy peptone, 9g/L; urea, 3g/L; succinic acid, 0.5g/L; K 2 HPO 4 ⁇ 3H 2 O, 1g/L; MgSO 4 ⁇ 7H 2 O, 0.1g/L; Biotin, 0.01mg/L; Vitamin B1, 0.1mg/L; MOPS, 20g/L; Agar powder, 15g/L .
  • the present disclosure performs preliminary plate screening on more than 10,000 clones, and as shown in FIG. 2 , about 30 mutants with enhanced fluorescence intensity are obtained.
  • the primer sequences used above are shown in Table 2.
  • the strains obtained from the plate were inoculated into 96-well plates containing 200 ⁇ l of TSB liquid medium in each well with a toothpick, 3 parallel for each strain, and the plate shaker speed was 800 rpm. Strains with increased fluorescence intensity compared to wild-type controls were sequenced. The results are shown in Table 3, some of the promoter mutants have the same sequence, and finally the present disclosure successfully obtained 20 different promoter mutants with higher expression intensity than the wild-type promoter (the nucleotide sequence of the corresponding mutant promoter is compiled as SEQ. ID NO: 1 to 20), the increase fold range is 1.8-16.1 times, and it can provide abundant elements for modifying the expression of genes such as pyc.
  • the putA-1/2 and putA-3/4 primers were used to amplify the upstream and downstream homology arms inserted into the putA gene; the pEC-proB G149K proAproC plasmid was used as the template, and the ABC-F/R Primer to amplify the expression cassette fragment; at the same time, use pK18-1/2 primer to amplify the backbone of pK18mobsacB.
  • the above PCR fragments were cloned and ligated by Novozan's one-step recombination kit to obtain the pK18-proB G149K proAproC recombinant vector.
  • Examples of the present disclosure have demonstrated that enhanced pyc gene promoter mutants can be used for the production of the aspartate family amino acid lysine and the glutamate family amino acid proline. It has been confirmed that enhancing the expression and activity of Pyc can be used for the production of the above products, for example: 1) Peters-Wendisch PG et al. reported that overexpression of Pyc can increase the production of glutamate, lysine and threonine [5] . 2) Pyc is the main enzyme that catalyzes the generation of C4 oxaloacetate from C3 (PEP or pyruvate) in Corynebacterium glutamicum.
  • Patent document [7] discloses that the activity enhancement of related enzymes (phosphoenolpyruvate carboxylase or pyruvate carboxylase) that promotes oxaloacetate synthesis can improve the production of 5-aminolevulinic acid.
  • the pyc gene promoter mutation of Corynebacterium glutamicum pyruvate carboxylase can be used to enhance the expression and activity of Pyc, so the pyc gene promoter mutant of the present disclosure can also be used for 5-aminolevulinic acid production.

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Abstract

公开了一种谷氨酸棒杆菌丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体及其应用。该突变体比野生型启动子具有提高的启动子活性，可以用于增强目的基因表达，例如将其与丙酮酸羧化酶基因可操作地连接，增强了丙酮酸羧化酶的表达强度，由此提高了菌株的氨基酸生产效率。

Description

丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体及其应用 技术领域：
本公开属于生物技术领域，具体涉及丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体及其应用。
背景技术：
氨基酸，包括赖氨酸、苏氨酸、谷氨酸等是构成动物营养所需蛋白质的基本物质，被广泛应用于医药、健康、食品、动物饲料和化妆品等行业中，主要采用微生物发酵法来生产，目前，主要的生产菌株包括肠杆菌属、棒杆菌属等的微生物，而由于棒杆菌的生理优越性，棒杆菌已成为工业中最重要的生产菌株。随着生物技术的不断发展，对棒杆菌进行代谢工程改造来提高其氨基酸产量的报道逐渐增多，这些改造包括加强氨基酸合成途径相关酶的表达，减弱竞争性途径相关酶的表达等等。
丙酮酸羧化酶(Pyruvate carboxylase，由pyc基因编码)，被认为是棒杆菌回补途径中发挥重要作用的酶，该酶能够催化丙酮酸和二氧化碳生成草酰乙酸，从而进入TCA循环。已有大量的文献报道，过表达丙酮酸羧化酶可以增加菌株的氨基酸(如赖氨酸、谷氨酸、苏氨酸等)产量 [1-2]。而目前pyc基因的过表达大多是通过增加其拷贝数而实现的，然而拷贝数增加可能导致菌株的基因组不稳定，而启动子对基因的表达调控不存在以上缺陷，而且高性能的启动子还可于表达不同的目标基因。因此，本领域需要开发丰富的启动子元件，以便适度增强pyc等基因的表达，从而提高菌株目标化合物的生产效率。
引用文献：
[1]CN110603321A
[2]CN1275167A
发明内容：
第一方面，本公开提供一种丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体，其中，突变体(i)在对应于SEQ ID NO.21所示核苷酸序列的启动子的第279位至第317位的核心区存在一个或多个突变的核苷酸。
本公开中的术语“突变体”是指相对于“野生型”，或者“相比较的”多核苷酸或多肽，在一个或多个(例如，若干个)位置处包含改变(即，取代、插入和/或缺的多核苷酸，其中，取 代是指用不同的核苷酸置换占用一个位置的核苷酸。缺失是指去除占据某一位置的核苷酸。插入是指在邻接并且紧随占据位置的核苷酸之后添加核苷酸)。
具体的，谷氨酸棒杆菌丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体在对应SEQ ID NO:21所示核苷酸序列的279-317位中1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个或39个位置具有突变的核苷酸。
在一些实施方式中，突变体包含取代的核苷酸，取代是核苷酸中的碱基被另一个不同的碱基取代所引起的突变，也称为碱基置换突变(subsititution)或点突变(point mutation)。
在一些实施方式中，突变体(ii)包含与(i)所示核苷酸序列的反向互补序列。
在一些实施方式中，突变体(iii)包含在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，能够与(i)或(ii)所示的核苷酸序列杂交的序列的反向互补序列。
在一些实施方式中，突变体(iv)包含与(i)或(ii)所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列。具体而言，与(i)或(ii)所示的核苷酸序列相比，具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列。
其中，(i)-(iv)任一项所示的突变体在对应SEQ ID NO:21所示序列的第279-第317位的核苷酸序列不为CGATGTTTGATTGGGGGAATCGGGGGTTACGATACTAGG；优选地，与SEQ ID NO:21所示序列的丙酮酸羧化酶基因启动子相比，(i)-(iv)任一项所示的突变体具有增强的启动子活性。
在一些实施方式中，根据本公开所述的丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体，其中，所述突变体在对应于SEQ ID NO.21所示核苷酸序列的第279位至第317位的核苷酸序列如下所示：NNNNNNTTGATTNNNNNNNNNNNNNNNTANNATNNNNNN，其中，N选自A，T，C或G。
优选地，丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体与SEQ ID NO.21所示序列的丙酮酸羧化酶基因启动子相比，具有1-17倍以上增强的启动子活性。示例性的，突变后的启动子活性增强至少1.8倍，优选3倍，5倍，8倍，优选10倍，11倍，12倍，13倍，更优选14倍，15倍，16倍以上。
在一些实施方式中，根据本公开所述的突变体的启动子核心区的核苷酸序列为如下序列之一：
1)CTAATTTTGATTCGTACTGATTTCTGCTACGATGAGTCA；
2)GGATTGTTGATTTGAGCTTGATGAGCGTACAATCAACTT；
3)TTCTCCTTGATTGCGCCTTAACCGTGGTATGATTCGATA；
4)ATTGATTTGATTGGAACCTTACTGTGCTATGATTTGGTA；
5)TCGAGTTTGATTTCACAACGTGTGTGATAGGATATAATA；
6)TTGCGTTTGATTAAAGTATGCAAGGGCTAGTATGGTGAT；
7)ATCATTTTGATTCCGGCGCACATGTGGTAATATGGTATT；
8)TCGCCATTGATTGCCCGCCATCCATGCTATAATCGGAAG；
9)TTCCGCTTGATTGTGGCCATAGTATGATATTATTAATTA；
10)CGGATCTTGATTTTATGATGGGTATTGTATAATCTTGGT；
11)CGGATATTGATTTGGCCGGTGTTGTGGTAGTATCGTGTT；
12)AGGGGTTTGATTGGCCGCTCGGTGTGTTATCATGGAGAG；
13)GAGTTGTTGATTTCGTTGGTGCACGTATACAATGGTTTT；
14)CTTGGCTTGATTTTTGTTTGAGGGTTGTATAATGTTATT；
15)GACTAGTTGATTTCCGCCCTTGGTTGATATTATGCTTGA；
16)ATCCGCTTGATTTAGGCGTACGTTTAATAGTATATTGAA；
17)CGGGGCTTGATTTCCTTGTCGTGGCGTTATTATAATGGA；
18)ATGGAGTTGATTATACGATACTACAGATACTATACTGGT；
19)CCGTAGTTGATTGACTTGGGCAGTATATAGTATAATGAA；或
20)CGGGCCTTGATTGTAAGATAAGACATTTAGTATAATTAG。
在一些实施方式中，根据本公开所述的丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：20任一项所示。
其中丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体是具有启动子活性的核苷酸分子，并相对于野生型的启动子具有增强的活性。所述“启动子”是指一种核酸分子，通常位于目的基因编码序列的上游，为RNA聚合酶提供识别位点，并位于mRNA转录起始位点的5’方向的上游。它是不被翻译的核酸序列，RNA聚合酶与这一核酸序列结合后启动目的基因的转录。
所述编码丙酮酸羧化酶的基因为pyc基因，被认为是棒杆菌回补途径中发挥重要作用的酶，该酶能够催化丙酮酸和二氧化碳生成草酰乙酸，这是三羧酸循环的一个重要回补途径。已有大量的文献报道，过表达丙酮酸羧化酶Pyc可以增加菌株的氨基酸(如赖氨酸、谷氨酸、苏氨酸等)产量。
所述“启动子核心区”是指原核生物中位于启动子上的一段核酸序列，是发挥启动子功能的核心序列区，主要包括-35区、-10区、-35区和-10区之间的区域以及转录起始位点， -35区是RNA聚合酶的识别位点，-10区是RNA聚合酶的结合位点。
本公开的启动子的突变体是改进的谷氨酸棒杆菌丙酮酸羧化酶基因的启动子，它比野生型启动子具有更高的启动子活性，如提高至少1.8倍，3倍，5倍，8倍，优选10倍，11倍，12倍，13倍，更优选14倍，15倍，16倍以上。
本公开的启动子核酸分子可以使用标准的分子生物学技术分离或制备。例如，可以使用合适的引物序列通过PCR来分离本公开的启动子核酸分子。此外，也可以使用自动DNA合成仪通过标准合成技术来制备本公开的启动子核酸分子。
本公开的具有启动子活性的核酸分子可以被用作棒杆菌或肠杆菌中其他基因的表达，包括但不限于氨基酸合成相关的基因，如丙酮酸羧化酶Pyc、谷氨酸脱氢酶Gdh、天冬氨酸激酶LysC、苏氨酸操纵子ThrABC、天冬氨酸半醛脱氢酶Asd、天冬氨酸氨裂合酶AspB、高丝氨酸脱氢酶Hom、高丝氨酸O-乙酰基转移酶MetX、二氢吡啶二羧酸合成酶DapA、二氢吡啶甲酸还原酶DapB、内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶Ddh、谷氨酸激酶ProB、谷氨酸-5-半醛脱氢酶ProA、吡咯-5-羧酸脱氢酶ProC、脯氨酸脱氢酶/吡咯-5-羧酸脱氢酶PutA、5-氨基乙酰丙酸合成酶HemA、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶Ppc、氨基酸运输蛋白、ptsG系统相关蛋白、丙酮酸脱氢酶AceE、甘油醛-3-磷酸脱氢酶GapN、赖氨酸脱羧酶CadA或LdcC等等。
本公开的所述的系列强度启动子元件，可用于适度调控目标基因的表达，实现目标产物的高效生产。
本公开所使用的术语“棒杆菌”是指棒杆菌属的微生物，包括但不限于谷氨酸棒杆菌ATCC13032、谷氨酸棒杆菌ATCC 13869、谷氨酸棒杆菌B253、谷氨酸棒杆菌ATCC 14067，以及由上述菌株制备的产生氨基酸的衍生菌株。
第二方面，本公开提供了包含所述丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体的表达盒、重组载体。
所述“表达盒”具有本领域技术人员普遍理解的意思，即含有启动子、目的基因并且能够将目的基因进行表达的元件。
术语“载体”指的是DNA构建体，其含有与合适的控制序列可操作地连接的DNA序列，从而在合适的宿主中表达目的基因。本公开所使用的载体并没有特别的限制，可为本领域中已知的任何载体，只要它能够在宿主中进行复制即可。即所述载体包括但不限于质粒，噬菌体，例如本公开具体实施例中使用的pEC-XK99E质粒。一旦转化入合适的宿主之后，所述载体可以复制并独立于宿主基因组发挥功能，或者在某些情况下整合入基因组本身。
第三方面，本公开提供了含有所述丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体、表达盒或重组载体的重组宿主细胞。
重组宿主细胞具体例如通过转化来实现。此处“转化”具有本领域技术人员普遍理解的意思，即将外源性的DNA导入宿主的过程。所述转化的方法包括任何将核酸导入细胞的方法，这些方法包括但不限于电穿孔法、磷酸钙(CaPO 4)沉淀法、氯化钙(CaCl 2)沉淀法、微注射法、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法以及乙酸锂-DMSO法。
本公开所述“宿主细胞”具有本领域普通技术人员通常理解的含义，即，能够导入本公开的具有启动子活性的核酸的细胞，导入之后称为重组宿主细胞。换言之，本公开可以利用任何宿主细胞，只要其细胞中含有本公开的具有启动子活性的核酸，并且与某一基因可操作性地连接介导该基因的转录。本公开的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，在一些实施方式中，本公开中的宿主细胞可以是具有目标产物的生产能力的任意类型的菌株，其包括野生型菌株和重组菌株。示例性的，宿主细胞来源于适合发酵生产氨基酸及其衍生物等目标产物的微生物，例如肠杆菌、棒杆菌、短杆菌、节杆菌、微杆菌等。
在一些优选地实施方式中，宿主细胞为肠杆菌或棒杆菌，更优选谷氨酸棒杆菌，包括但不限于谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌ATCC 13869、谷氨酸棒杆菌B253、谷氨酸棒杆菌ATCC 14067，以及由上述菌株制备的产生L-氨基酸的衍生菌株。
在一个具体实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌经过下述改良，所述谷氨酸棒杆菌中的天冬氨酸激酶编码基因引入了T311I突变编码序列，并且导入与上述的丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体可操作连接的编码丙酮酸羧化酶的基因，获得赖氨酸生产菌株；或导入与本公开所述的丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体可操作连接地引入有G149K突变的谷氨酸激酶、谷氨酸-5-半醛脱氢酶，和/或吡咯-5-羧酸脱氢酶的表达盒整合至脯氨酸脱氢酶/吡咯-5-羧酸脱氢酶基因上，获得脯氨酸生产菌株；优选地，所述的丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体的核心区序列为CGGGCCTTGATTGTAAGATAAGACATTTAGTATAATTAG，更优选地，其全长启动子的序列如SEQ ID NO：20所示。
在另外一些实施方式中，宿主细胞还可以是其他种类的氨基酸生产菌株。本公开所说的“氨基酸生产菌株”是指，当细菌在培养基中培养时可以生产氨基酸并且能够积累氨基酸，或者能够将氨基酸分泌到培养基中，也就是能够得到胞外的游离氨基酸的菌株。例如，可以是天然存在的氨基酸生产菌株，也可以是经过遗传改造获得的氨基酸生产工程菌株。
示例性地，宿主细胞为生产赖氨酸的宿主细胞。在一些实施方式中，所述生产赖氨酸的宿主细胞中还可以包括但不限于选自以下的一个或多个基因被弱化或表达降低：
a.编码乙醇脱氢酶的adhE基因；
b.编码乙酸激酶的ackA基因；
c.编码磷酸乙酰转移酶的pta基因；
d.编码乳酸脱氢酶的ldhA基因；
e.编码甲酸转运蛋白的focA基因；
f.编码丙酮酸甲酸裂解酶的pflB基因；
g.编码丙酮酸氧化酶的poxB基因；
h.编码天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱氢酶I双功能酶的thrA基因；
i.编码高丝氨酸激酶的thrB基因；
j.编码赖氨酸脱羧酶的ldcC基因；和
h.编码赖氨酸脱羧酶的cadA基因。
在一些实施方式中，所述生产赖氨酸宿主细胞中还可以包括但不限于选自以下的一个或多个基因被增强或过表达：
a.编码解除赖氨酸反馈抑制的二氢二吡啶合成酶的dapA基因；
b.编码二氢二吡啶二羧酸还原酶的dapB基因；
c.编码二氨基庚二酸脱氢酶的ddh基因；
d.编码四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶的dapD和编码琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶的dapE；
e.编码天冬氨酸-半醛脱氢酶的asd基因；
f.编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因；
g.编码烟酸胺腺嘌呤二核苷酸转氢酶的pntAB基因；
i.编码赖氨酸的运输蛋白lysE基因。
示例性地，宿主细胞为生产苏氨酸的宿主细胞。在一些实施方式中，生产苏氨酸的宿主细胞为在谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基础上表达解除反馈抑制的天冬氨酸激酶LysC的菌株。在另外一些实施方式中，生产苏氨酸的宿主细胞也可以是具有苏氨酸生产能力的其他种类的菌株。
在一些实施方式中，所述生产苏氨酸的宿主细胞中选自以下的一个或多个基因被增强或过表达：
a.编码苏氨酸操纵子的thrABC基因；
b.编码解除反馈抑制的高丝氨酸脱氢酶的hom基因；
c.编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因；
d.编码丙酮酸羧化酶的pyc基因；
e.编码苹果酸：醌氧化还原酶的mqo基因；
f.编码转酮酶的tkt基因；
g.编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的gnd基因；
h.编码苏氨酸输出的thrE基因；
i.编码烯醇酶的eno基因。
示例性地，宿主细胞为生产异亮氨酸的宿主细胞。在一些实施方式中，生产异亮氨酸的宿主细胞是通过用丙氨酸取代L-苏氨酸脱水酶ilvA基因第323位的氨基酸而产生L-异亮氨酸的菌株。在另外一些实施方式中，生产异亮氨酸的宿主细胞也可以是具有异亮氨酸生产能力的其他种类的菌株。
示例性地，宿主细胞为生产O-乙酰高丝氨酸的宿主细胞。在一些实施方式中，生产O-乙酰高丝氨酸的宿主细胞是通过使O-乙酰高丝氨酸(硫醇)-裂解酶失活而产生O-乙酰高丝氨酸的菌株。在另外一些实施方式中，生产O-乙酰高丝氨酸的宿主细胞也可以是具有O-乙酰高丝氨酸生产能力的其他种类的菌株。
示例性地，宿主细胞为生产蛋氨酸的宿主细胞。在一些实施方式中，生产蛋氨酸的宿主细胞是通过使甲硫氨酸和半胱氨酸的转录调节因子失活而产生蛋氨酸的菌株。在另外一些实施方式中，生产蛋氨酸的宿主细胞也可以是具有蛋氨酸生产能力的其他种类的菌株。
在本公开中，所述宿主细胞的培养可以根据本领域的常规方法进行，包括但不限于孔板培养、摇瓶培养、批次培养、连续培养和分批补料培养等，并可以根据实际情况适当地调整各种培养条件如温度、时间和培养基的pH值等。
第四方面，本公开提供了第一方面所述的丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体，第二方面所述的表达盒或表达载体，第三方面所述的重组宿主细胞在如下(a)-(c)至少一种中的用途：
(a)增强基因的转录水平，或制备用于增强基因的转录水平的试剂或试剂盒；
(b)制备蛋白，或制备用于制备蛋白的试剂或试剂盒；
(c)生产目标产物，或制备用于生产目标产物的试剂或试剂盒。
在一些实施方式中，蛋白为与目标产物合成相关的蛋白、与膜转运相关的蛋白或基因表达调控蛋白。
在一些实施方式中，目标产物可以选自氨基酸及其衍生物中至少一种，也可以选自本领域中可能通过生物合成得到的其他种类的化合物。
示例性地，所述氨基酸及其衍生物包括但不限于如下的一种或两种以上的组合：脯氨酸、羟脯氨酸、赖氨酸、谷氨酸、精氨酸、鸟氨酸、谷氨酸酰胺、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、5-氨基乙酰丙酸、5-氨基酸戊酸或上述任一种的氨基酸的衍生 物。
第五方面，本公开提供了一种增强目的基因表达的方法，所述方法包括将所述丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体与目的基因可操作地链接，优选地增强以草酰乙酸为前体的目标产物合成相关基因的表达。
本公开中的术语“可操作地连接”是指本公开的丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体与编码基因功能性连接，以启动和介导所述基因的转录，表明本公开的丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体与编码基因可操作地连接以控制操纵子基因的转录活性。所述可操作地连接的方式可以采用本领域技术人员所述的任何方式。本公开所述的增强目的基因表达的方法中，利用本公开的所述丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体的基础上，采用包括本领域技术人员通常使用的方法实现。
示例性的，编码基因包括但不限于与目标产物合成相关的蛋白的编码基因，与膜转运相关的蛋白的编码基因，或基因表达调控蛋白的编码基因。
在一些实施方式中，丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体被用作与氨基酸合成相关的基因的表达。示例性的，丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体可以被用作棒杆菌或肠杆菌中其他基因的表达，包括但不限于氨基酸合成相关的基因，如谷氨酸脱氢酶Gdh、丙酮酸羧化酶Pyc、天冬氨酸激酶LysC、苏氨酸操纵子ThrABC、天冬氨酸半醛脱氢酶Asd、天冬氨酸氨裂合酶AspB、高丝氨酸脱氢酶Hom、高丝氨酸O-乙酰基转移酶MetX、二氢吡啶二羧酸合成酶DapA、二氢吡啶甲酸还原酶DapB、内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶Ddh、谷氨酸激酶ProB、谷氨酸-5-半醛脱氢酶ProA、吡咯-5-羧酸脱氢酶ProC、脯氨酸脱氢酶/吡咯-5-羧酸脱氢酶PutA、谷氨酰t-RNA还原酶HemA、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶Ppc、氨基酸运输蛋白、ptsG系统相关蛋白、丙酮酸脱氢酶AceE、甘油醛-3-磷酸脱氢酶GapN、赖氨酸脱羧酶CadA或LdcC等等。
在另外一些实施方式中，丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体被用作与有机酸合成相关的基因的表达。示例性的，与合成柠檬酸有关的蛋白，或用于编码与合成琥珀酸有关的蛋白等等。
第六方面，本公开提供了一种制备蛋白的方法，其中，所述方法包括利用第二方面所述的表达盒或表达载体，或第三方面所述的重组宿主细胞表达所述蛋白的步骤；可选地，所述蛋白为与目标产物合成相关的蛋白、与膜转运相关的蛋白或基因表达调控蛋白；
任选地，所述方法还包括分离或纯化所述蛋白的步骤。
第七方面，本公开提供了一种生产目标产物的方法，所述方法包括培养含有第一方面所述的丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体与目标产物合成相关的基因可操作地连接的宿主细 胞，并收集产生的目标产物。
进一步的，本公开提供了一种以草酰乙酸为前体的目标产物的生产方法，所述方法包括培养含有所述丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体与以草酰乙酸为前体的目标产物合成相关的基因可操作地连接的宿主细胞，并收集产生的目标产物。其中，以草酰乙酸为前体的目标产物包括但不限于氨基酸及其衍生物，所述氨基酸包括天冬氨酸家族氨基酸(赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸)，谷氨酸家族氨基酸(谷氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、精氨酸、谷氨酸酰胺)，以及5-氨基乙酰丙酸等，所述衍生物包括但不限于戊二胺、戊二酸等。通过本公开的方法，可以提高菌株的以草酰乙酸为前体的目标产物的产量。更具体的，以草酰乙酸为前体的目标产物合成相关的基因选自pyc基因，gdh基因，lysC基因、thrABC基因、asd基因、aspB基因、hom基因、metX基因、dapA基因、dapB基因、ddh基因、proB基因、proA基因、proC基因、putA基因、hemA基因、ppc基因、lysE基因、ptsG基因、ptsI基因、aceE基因、gapN基因、cadA基因、ldcC基因等。
本公开所述的生产以草酰乙酸为前体的目标产物的方法中，利用本公开的所述丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体的基础上，采用包括本领域技术人员通常使用的方法，同时也包括从细胞或培养液中回收目标产物的步骤。从细胞或培养基中回收目标产物的方法是本领域公知的，包括但不限于：过滤、阴离子交换色谱、结晶和HPLC。
本公开的有益效果：本公开提供的具有增强的启动子活性的核酸分子表现出比野生型更高的启动子活性，可以用于目标基因的表达，尤其是与氨基酸生产相关基因的表达，例如与pyc基因等与目标产物合成相关的基因可操作地连接，可以增强丙酮酸羧化酶等与目标产物合成相关的蛋白的表达强度，由此提高了重组菌株的氨基酸及其衍生物等的生产效率，具有较高的应用价值。
附图说明
图1：pEC-XK99E-Ppyc-rfp质粒的质粒图谱。
图2：pyc启动子突变体的荧光筛选平板。
具体实施方式
术语定义
当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”联用时，词语“一(a)”或“一(an)”可以指“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内 的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
在整个申请文件中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。
虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
当用于权利要求书或说明书时，选择/可选/优选的“数值范围”既包括范围两端的数值端点，也包括相对于前述数值端点而言，所述数值端点中间所覆盖的所有自然数。
如本公开所使用的，术语“核酸分子”、“多核苷酸”指由核苷酸组成的聚合物。核酸分子、多核苷酸可以是单独片段的形式，也可以是更大的核苷酸序列结构的一个组成部分，其是从至少在数量或浓度上分离一次的核苷酸序列衍生而来的，能够通过标准分子生物学方法(例如，使用克隆载体)识别、操纵以及恢复序列及其组分核苷酸序列。当一个核苷酸序列通过一个DNA序列(即A、T、G、C)表示时，这也包括一个RNA序列(即A、U、G、C)，其中“U”取代“T”。换句话说，“多核苷酸”指从其他核苷酸(单独的片段或整个片段)中去除的核苷酸聚合物，或者可以是一个较大核苷酸结构的组成部分或成分，如表达载体或多顺反子序列。多核苷酸包括DNA、RNA和cDNA序列。
如本公开所使用的，术语“目标基因”、“目的基因”可以互换的使用。
如本公开所使用的，术语“野生型的”指在自然界中可以找到的对象。例如，一种存在于生物体中，可以从自然界的一个来源中分离出来并且在实验室中没有被人类有意修改的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。如本公开所用的，“天然存在的”和“野生型的”是同义词。
如本公开所使用的，术语“序列同一性”和“同一性百分比”指两个或更多个多核苷酸或多肽之间相同(即同一)的核苷酸或氨基酸的百分比。两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列同一性可通过以下方法测定：将多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列对准且对经对准的多核苷酸或多肽中含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行评分，且将其与经对准的多核苷酸或多肽中含有不同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行比较。多核苷酸可例如通过含有不同核苷酸(即取代或突变)或缺失核苷酸(即一个或两个多核苷酸中的核苷酸插入或核苷酸缺失)而在一个位置处不同。多肽可例如通过含有不同氨基酸(即取代或突变)或缺失氨基酸(即一个或两个多肽中的氨基酸插入或氨基酸缺失)而在一个位置处不同。序列同一性可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中氨基酸残基的总数来计算。举例而言，可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中核苷酸或氨基酸残基的总数且乘以100来计算同一性百分比。
在一些实施方式中，当使用序列比较算法或通过目视检查测量以最大的对应性进行比较 和比对时，两个或多个序列或子序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％核苷酸的“序列同一性”或“同一性百分比”。在某些实施方式中，所述序列在任一或两个相比较的生物聚合物(例如，多核苷酸)的整个长度上基本相同。
如本公开所使用的，术语“互补的”是指在核苷酸或核苷酸之间的杂交或碱基配对，例如双链DNA分子的两条链之间或者寡核苷酸引物与被测序或扩增的单链核苷酸上的引物结合位点之间等。
如本公开所使用的，术语“高严格条件”是指，对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃处在5X SSPE(saline sodium phosphate EDTA)、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃处使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
如本公开所使用的，术语“非常高严格条件”是指，对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃处在5X SSPE(saline sodium phosphate EDTA)、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃处使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语与本公开所属领域普通技术人员通常理解的意义相同。虽然可利用与本文所述相似或等价的任何方法和材料来实施或检验本公开，但优选本文所述的方法和材料。
下面结合具体实施例，进一步阐述本公开。应理解，这些实施例仅用于说明本公开而不用于限制本公开的范围。本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法，例如下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。
实施例1.谷氨酸棒杆菌pyc基因启动子强度表征质粒的构建
为了表征谷氨酸棒杆菌pyc基因启动子的强度，本公开首先构建一个表征载体，在pEC-XK99E质粒骨架基础上，由pyc基因启动子表达pyc基因N端60个氨基酸、一个连接肽和红色荧光蛋白基因。根据已公开的谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列及pyc基因注释信息，设计引物pyc-F/R，以ATCC13032基因组为模板，通过PCR扩增获得pyc基因启动子和N端180bp的DNA片段。以文献报道的pEC-XK99E-rfp [3]质粒为模板，以pEC-F/R引物， 扩增pEC-XK99E质粒骨架、连接肽和红色荧光蛋白基因的DNA片段。以上两个片段通过诺唯赞的一步重组试剂盒克隆连接，获得pEC-XK99E-Ppyc-rfp表征载体，质粒图谱如图1所示。以上所用引物序列如表1所示。
表1
Figure PCTCN2021105989-appb-000001
实施例2.谷氨酸棒杆菌pyc基因启动子突变体筛选及强度表征
(1)谷氨酸棒杆菌pyc基因启动子突变体文库的构建
本公开对谷氨酸棒杆菌pyc基因启动子的核心区：
“CGATGT TTGATTGGGGGAATCGGGGGT TACGATACTAGG”进行突变，其中下划线处分别为该启动子的-35区和-10区主要序列。本公开在以上核心区对应位置进行突变“NNNNNN TTGATTNNNNNNNNNNNNNNN TANNATNNNNNN”，分别采用pyc-M1/M2和pyc-M3/M4引物扩增质粒的两个片段，通过诺唯赞的一步重组试剂盒克隆连接，对获得的所有克隆菌进行收集并提取质粒，获得pyc基因启动子突变体文库。将以上文库和实施例1中获得野生型对照pEC-XK99E-Ppyc-rfp转化分别转化谷氨酸棒杆菌ATCC13032，涂布TSB平板，通过荧光成像系统对长有数百个克隆的平板进行荧光拍照，根据克隆的荧光亮度初步筛选表达强度提高的突变体。TSB平板培养基成份为(g/L)：葡萄糖，5g/L；酵母粉，5g/L；大豆蛋白胨，9g/L；尿素，3g/L；丁二酸，0.5g/L；K 2HPO 4·3H 2O，1g/L；MgSO 4·7H 2O，0.1g/L；生物素，0.01mg/L；维生素B1，0.1mg/L；MOPS，20g/L；琼脂粉，15g/L。本公开对大于1万个克隆进行初步平板筛选，如图2所示，获得约30个荧光强度增强的突变体。以上所用引物序列如表2所示。
表2
Figure PCTCN2021105989-appb-000002
(2)谷氨酸棒杆菌pyc基因启动子突变体文库筛选
对以上平板观察荧光强度增强的所有突变体进行96孔板培养表征启动子的强度，TSB液体培养基成份为(g/L)：葡萄糖，5g/L；酵母粉，5g/L；大豆蛋白胨，9g/L；尿素，3g/L；丁二酸，0.5g/L；K 2HPO 4·3H 2O，1g/L；MgSO 4·7H 2O，0.1g/L；生物素，0.01mg/L；维生素B1，0.1mg/L；MOPS，20g/L。将平板获得的菌株用牙签接种至每孔含有200μl TSB液体培养基的96孔板中，每个菌株3个平行，孔板摇床转速为800rpm，30℃培养24h后检测菌株的荧光强度，并对荧光强度较野生型对照提高的菌株进行测序。结果如表3所示，部分启动子突变体序列相同，最终本公开成功获得20个表达强度较野生型启动子提高的不同启动子突变体(对应的突变启动子的核苷酸序列编为SEQ ID NO：1至20)，提高倍数范围为1.8-16.1倍，可为改造pyc等基因的表达提供丰富的元件。
表3
Figure PCTCN2021105989-appb-000003
实施例3.谷氨酸棒杆菌pyc基因启动子突变体应用于目标产物生产
(1)谷氨酸棒杆菌pyc基因启动子突变体的重组载体构建
根据已报道的谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列，分别以ATCC13032基因组为模板，以pyc-UF/pyc-UR1和pyc-DF1/pyc-DR，pyc-UF/pyc-UR9和pyc-DF9/pyc-DR，pyc-UF/pyc-UR16和pyc-DF16/pyc-DR，pyc-UF/pyc-UR20和pyc-DF20/pyc-DR为引物，PCR扩增P pyc-1、P pyc-9、P pyc-16和P pyc-20启动子突变的上下游同源臂；同时以pK18-1/2引物扩增pK18mobsacB的骨架。上述PCR片段回收后，通过诺唯赞的一步重组试剂盒克隆连接，分别获得启动子突变的重组载体pK18-P pyc-1、pK18-P pyc-9、pK18-P pyc-16和pK18-P pyc-20。以上所用引物序列如表4所示。
表4
Figure PCTCN2021105989-appb-000004
(2)谷氨酸棒杆菌赖氨酸生产菌的pyc基因启动子突变体构建
将上述构建的重组载体pK18-P pyc-1、pK18-P pyc-9、pK18-P pyc-16和pK18-P pyc-20分别转化谷氨酸棒杆菌赖氨酸生产菌SCgL30(该菌株中谷氨酸棒杆菌ATCC13032中的天冬氨酸激酶的第311位Thr突变为Ile的菌株 [4])，涂布含有5g/L葡萄糖和25μg/mL卡那霉素的LBHIS固体培养基上，30℃培养获得第一次重组的转化子。正确的一次重组转化子分别接种含有5g/L葡萄糖的LB培养基，过夜培养，然后1％转接含有100g/L蔗糖的LB培养基，30℃培养过夜后分别涂布添加100g/L蔗糖的LB固体培养基平板进行筛选，并通过测序确认，分别获得的pyc启动子突变的菌株SCgL33、SCgL34、SCgL35和SCgL36。
(3)谷氨酸棒杆菌赖氨酸生产菌pyc基因启动子突变体的赖氨酸生产能力评价
为了测试谷氨酸棒杆菌中pyc启动子突变对菌株产赖氨酸的影响，分别对SCgL30、SCgL33、SCgL34、SCgL35和SCgL36进行发酵测试，发酵培养基成份为：葡萄糖，80g/L；酵母粉，1g/L；大豆蛋白胨，1g/L；NaCl，1g/L；硫酸铵，1g/L；尿素，8g/L；K 2HPO 4·3H 2O，1g/L；MgSO 4·7H 2O，0.45g/L；FeSO4·7H 2O，0.05g/L；生物素，0.4mg/L；维生素B1，0.1 mg/L；MOPS，40g/L；初始pH7.2。首先将菌株接种到TSB液体培养基中培养8h，培养物作为种子接种到每孔含有800μl发酵培养基的24孔板中，初始OD 600控制为0.1，30℃培养20h，孔板摇床转速为800rpm，每个菌株3个平行，发酵结束后检测赖氨酸产量。结果如表5所示，pyc启动子突变后菌株的赖氨酸产量均有提高，而且随着启动子强度的增强而提高的更加显著。
表5
菌株 赖氨酸产量(g/L)
SCgL30 1.67±0.03
SCgL33 1.77±0.04
SCgL34 2.07±0.06
SCgL35 2.37±0.15
SCgL36 3.27±0.15
实施例4.谷氨酸棒杆菌pyc基因启动子突变体应用于脯氨酸生产
(1)P pyc-20应用于脯氨酸生产的菌株构建
本公开将谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株引入G149K突变，密码子从GGT突变为AAG，获得SLCgP1菌株。本公开进一步应用将P pyc-20启动子过表达解除反馈抑制的谷氨酸激酶proB G149K、谷氨酸-5-半醛脱氢酶proA和吡咯-5-羧酸脱氢酶proC的表达盒整合至脯氨酸脱氢酶/吡咯-5-羧酸脱氢酶putA基因上，获得脯氨酸生产菌SLCgP2菌株。
SLCgP2菌株具体构建如下：1)首先在pEC-XK99E质粒上构建P pyc-20启动子表达proB G149K、proA和proC的表达盒。以SCgL36菌株基因组为模板，以pyc-a/b为引物，扩增P pyc-20启动子片段；以SLCgP1菌株基因组为模板，分别以proB-1/2、proA-1/2和proC-1/2为引物扩增proB G149K、proA和proC的片段；同时以pEC-1/2引物扩增pEC-XK99E的骨架。以上5个片段通过诺唯赞的一步重组试剂盒克隆连接，获得pEC-proB G149KproAproC质粒。2)构建将以上表达框在putA基因上插入染色体的重组载体。以SCgL36菌株基因组为模板，分别以putA-1/2和putA-3/4引物扩增putA基因上插入的上下游同源臂；以pEC-proB G149KproAproC质粒为模板，以ABC-F/R为引物扩增表达框片段；同时以pK18-1/2引物扩增pK18mobsacB的骨架。上述PCR片段通过诺唯赞的一步重组试剂盒克隆连接，获得pK18-proB G149KproAproC重组载体。3)pK18-proB G149KproAproC重组载体转化SLCgP1菌株，涂布含有5g/L葡萄糖和25μg/mL卡那霉素的LBHIS固体培养基上，30℃培养获得第一次重组的转化子。正确的一次重组转化子分别接种含有5g/L葡萄糖的LB培养基，过夜培养，然后1％转接含有100g/L蔗糖的LB培养基，30℃培养过夜后分别涂布添加100g/L蔗糖的LB 固体培养基平板进行筛选，通用特异引物PCR及测序确认正确突变体，获得SLCgP2菌株。以上所用引物序列如表6所示。
表6
Figure PCTCN2021105989-appb-000005
(2)P pyc-20启动子突变体改造菌株的脯氨酸生产能力评价
为了测试谷氨酸棒杆菌中应用P pyc-20启动子突变对菌株产脯氨酸的影响，分别对SLCgP1和SLCgP2进行发酵测试，发酵培养基成份为：葡萄糖，72g/L；酵母粉，1g/L；大豆蛋白胨，1g/L；NaCl，1g/L；硫酸铵，1g/L；尿素，10g/L；K 2HPO 4·3H 2O，1g/L；MgSO 4·7H 2O，0.45g/L；FeSO4·7H 2O，0.05g/L；生物素，0.4mg/L；维生素B1，0.1mg/L；MOPS，40g/L；初始pH7.2。首先将菌株接种到TSB液体培养基中培养8h，培养物作为种子接种到每孔含有800μl发酵培养基的24孔板中，接种量为12μl，30℃培养18h，孔板摇床转速为800rpm，每个菌株3个平行，发酵结束后检测脯氨酸产量。结果如表7所示，在染色体插入P pyc-20启动子表达proB G149K、proA和proC的表达盒后菌株的脯氨酸产量提高显著，其中SLCgP2比SLCgP1提高了77％。
表7
菌株 脯氨酸产量(g/L)
SLCgP1 3.10±0.15
SLCgP2 5.48±0.23
以上结果表明增强的pyc基因启动子突变体可用于在谷氨酸棒杆菌中表达不同的目标基因并应用于各种产品的生产。首先，增强的pyc基因启动子突变体可用于谷氨酸棒杆菌中pyc基因自身的表达增强，从而增强Pyc的活性，进而强化从丙酮酸到草酰乙酸的合成，其可应用至依赖于草酰乙酸前体供应的目标产物的生产，包括天冬氨酸家族氨基酸(赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸)，谷氨酸家族氨基酸(谷氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、精氨酸、谷氨酸酰胺)，以及5-氨基乙酰丙酸等以草酰乙酸为重要代谢前体的氨基酸的生物法生产。本公开实施例已经证实增强的pyc基因启动子突变体可以用于天冬氨酸家族氨基酸赖氨酸和谷氨酸家族氨基酸脯氨酸的生产。已证实增强Pyc的表达和活性可以用于以上产品的生产，例如：1)Peters-Wendisch PG等报道过表达Pyc可以提高谷氨酸、赖氨酸和苏氨酸产量 [5]。2)Pyc是谷氨酸棒杆菌中催化从C3(PEP或丙酮酸)生成C4草酰乙酸的主要酶，Pyc过表达及活性增强是提高以草酰乙酸为前体的氨基酸生产的重要靶点 [6]。3)专利文献 [7]公布了促进草酰乙酸合成的相关酶(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或丙酮酸羧化酶)的活性增强可以提高5-氨基乙酰丙酸产量，本公开的谷氨酸棒杆菌丙酮酸羧化酶pyc基因启动子突变都可以用于增强Pyc的表达和活性，因此本公开pyc基因启动子突变体也可以用于5-氨基乙酰丙酸生产。其次，本公开的实施例也证实增强的pyc基因启动子突变体还可以用于proB、proA、proC等基因的表达，说明本公开的pyc基因启动子突变体具有很好的通用性，其可以用于更多基因的表达，进而用于更多产品的生产。
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Claims (14)

  1. 一种谷氨酸棒杆菌丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体，其中，所述突变体选自如下(i)-(iv)组成的组中的任一项：
    (i)所述突变体在对应于SEQ ID NO:21所示核苷酸序列的启动子的第279位至第317位的核心区存在一个或多个突变的核苷酸；
    (ii)包含与(i)所示核苷酸序列的反向互补序列；
    (iii)包含在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，能够与(i)或(ii)所示的核苷酸序列杂交的序列的反向互补序列；
    (iv)与(i)或(ii)所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列；
    其中，(i)-(iv)任一项所示的突变体在对应SEQ ID NO:21所示序列的第279-第317位的核苷酸序列不为CGATGTTTGATTGGGGGAATCGGGGGTTACGATACTAGG；优选地，与SEQ ID NO:21所示序列的丙酮酸羧化酶基因启动子相比，(i)-(iv)任一项所示的突变体具有增强的启动子活性。
  2. 根据权利要求1所述的丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体，其中，所述突变体在对应于SEQ ID NO:21所示核苷酸序列的第279位至第317位的核苷酸序列如下所示：
    NNNNNN TTGATTNNNNNNNNNNNNNNN TANNATNNNNNN，其中，N选自A，T，C或G；优选地，所述突变体与SEQ ID NO:21所示序列的丙酮酸羧化酶基因启动子相比，具有1-17倍以上增强的启动子活性。
  3. 根据权利要求1或2所述丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体，其中，所述突变体第279位至第317位的核心区的核苷酸序列为如下序列之一：
    1)CTAATTTTGATTCGTACTGATTTCTGCTACGATGAGTCA；
    2)GGATTGTTGATTTGAGCTTGATGAGCGTACAATCAACTT；
    3)TTCTCCTTGATTGCGCCTTAACCGTGGTATGATTCGATA；
    4)ATTGATTTGATTGGAACCTTACTGTGCTATGATTTGGTA；
    5)TCGAGTTTGATTTCACAACGTGTGTGATAGGATATAATA；
    6)TTGCGTTTGATTAAAGTATGCAAGGGCTAGTATGGTGAT；
    7)ATCATTTTGATTCCGGCGCACATGTGGTAATATGGTATT；
    8)TCGCCATTGATTGCCCGCCATCCATGCTATAATCGGAAG；
    9)TTCCGCTTGATTGTGGCCATAGTATGATATTATTAATTA；
    10)CGGATCTTGATTTTATGATGGGTATTGTATAATCTTGGT；
    11)CGGATATTGATTTGGCCGGTGTTGTGGTAGTATCGTGTT；
    12)AGGGGTTTGATTGGCCGCTCGGTGTGTTATCATGGAGAG；
    13)GAGTTGTTGATTTCGTTGGTGCACGTATACAATGGTTTT；
    14)CTTGGCTTGATTTTTGTTTGAGGGTTGTATAATGTTATT；
    15)GACTAGTTGATTTCCGCCCTTGGTTGATATTATGCTTGA；
    16)ATCCGCTTGATTTAGGCGTACGTTTAATAGTATATTGAA；
    17)CGGGGCTTGATTTCCTTGTCGTGGCGTTATTATAATGGA；
    18)ATGGAGTTGATTATACGATACTACAGATACTATACTGGT；
    19)CCGTAGTTGATTGACTTGGGCAGTATATAGTATAATGAA；或
    20)CGGGCCTTGATTGTAAGATAAGACATTTAGTATAATTAG。
  4. 根据权利要求1-3任一项所述的丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：20任一项所示。
  5. 一种表达盒，其包含如权利要求1-4任一项所述的丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体。
  6. 一种表达载体，其包含如权利要求1-4任一项所述的丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体、或如权利要求5所述的表达盒。
  7. 一种重组宿主细胞，其包含如权利要求1-4任一项所述的丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体，如权利要求5所述的表达盒，或者如权利要求6所述的表达载体。
  8. 根据权利要求7所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是肠杆菌属或棒杆菌属，优选棒杆菌属，进一步优选为谷氨酸棒杆菌，更具体的是谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌ATCC 13869、谷氨酸棒杆菌B253、谷氨酸棒杆菌ATCC 14067及其衍生菌株。
  9. 根据权利要求1-4任一项所述的丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体，根据权利要求5所述的表达盒，根据权利要求6所述的表达载体，根据权利要求7或8所述的重组宿主细胞在如下(a)-(c)至少一种中的用途：
    (a)增强基因的转录水平，或制备用于增强基因的转录水平的试剂或试剂盒；
    (b)制备蛋白，或制备用于制备蛋白的试剂或试剂盒；
    (c)生产目标产物，或制备用于生产目标产物的试剂或试剂盒；
    可选地，所述蛋白为与目标产物合成相关的蛋白、与膜转运相关的蛋白或基因表达调控蛋白。
  10. 根据权利要求9所述的用途，其中，所述目标产物选自氨基酸及其衍生物中的至少一种；可选地，所述氨基酸及其衍生物选自如下的一种或两种以上的组合：脯氨酸、羟脯氨酸、赖氨酸、谷氨酸、精氨酸、鸟氨酸、谷氨酸酰胺、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、 异亮氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、5-氨基乙酰丙酸或上述任一种的氨基酸的衍生物。
  11. 一种增强目标基因表达的方法，其中，所述方法包括将如权利要求1-4任一项所述的丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体与目标基因或目标RNA可操作地连接；可选地，所述目标RNA包括tRNA、sRNA中的至少一种，所述目标基因包括与目标化合物合成相关的蛋白的编码基因、基因表达调控蛋白的编码基因、与膜转运相关的蛋白的编码基因中的至少一种；可选地，所述目标基因包括如下的至少一种酶的编码基因：丙酮酸羧化酶pyc基因、谷氨酸脱氢酶gdh基因、天冬氨酸激酶lysC基因、苏氨酸操纵子thrABC基因、天冬氨酸半醛脱氢酶asd基因、天冬氨酸氨裂合酶aspB基因、高丝氨酸脱氢酶hom基因、高丝氨酸O-乙酰基转移酶metX基因、二氢吡啶二羧酸合成酶dapA基因、二氢吡啶甲酸还原酶dapB基因、内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶ddh基因、谷氨酸激酶proB基因、谷氨酸-5-半醛脱氢酶proA基因、吡咯-5-羧酸脱氢酶proC基因、脯氨酸脱氢酶/吡咯-5-羧酸脱氢酶putA基因、谷氨酰t-RNA还原酶hemA基因、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc基因、氨基酸运输蛋白lysE基因、ptsG系统相关编码基因、丙酮酸脱氢酶aceE基因、甘油醛-3-磷酸脱氢酶gapN基因、赖氨酸脱羧酶cadA/ldcC基因。
  12. 一种制备蛋白的方法，其中，所述方法包括利用权利要求5所述的表达盒，权利要求6所述的表达载体，或权利要求7-8任一项所述的重组宿主细胞表达所述蛋白的步骤；可选地，所述蛋白为与目标产物合成相关的蛋白、与膜转运相关的蛋白或基因表达调控蛋白；
    任选地，所述方法还包括分离或纯化所述蛋白的步骤。
  13. 一种生产目标产物的方法，其中，所述方法包括培养含有权利要求1-4任一项的丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体与目标产物合成相关的基因可操作地连接的宿主细胞，并收集产生的目标产物；优选地，所述目标产物为氨基酸；优选地，所述与目标产物合成相关的基因为与氨基酸及其衍生物合成相关的基因；
    可选地，所述氨基酸及其衍生物选自如下的一种或两种以上的组合：脯氨酸、羟脯氨酸、赖氨酸、谷氨酸、精氨酸、鸟氨酸、谷氨酸酰胺、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、5-氨基乙酰丙酸或上述任一种的氨基酸的衍生物。
  14. 如权利要求13所述的目标化合物，其特征在于，所述目标化合物以草酰乙酸作为前体。优选地，所述以草酰乙酸为前体的目标产物包括如下的一种或多种：赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、精氨酸、谷氨酸酰胺、5-氨基乙酰丙酸、戊二胺、5-氨基酸戊酸或上述任一种的衍生物。
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