CN103911365A

CN103911365A - 提取结核杆菌dna的方法及检测其多重耐药性的试剂盒

Info

Publication number: CN103911365A
Application number: CN201410093113.0A
Authority: CN
Inventors: 李沛祥
Original assignee: NANJING AIBIMENG BIOLOGICAL MATERIAL Co Ltd
Current assignee: NANJING AIBIMENG BIOLOGICAL MATERIAL Co Ltd
Priority date: 2014-03-13
Filing date: 2014-03-13
Publication date: 2014-07-09

Abstract

本发明公开了一种提取结核杆菌DNA的方法以及快速准确检测结核分枝杆菌多重耐药性（multiple drug resistence，MDR）的试剂盒。该方法包括从由临床样本提取待检DNA，应用荧光实时定量PCR确定结核分枝杆菌感染、鉴别是否为耐药性及何种耐药性菌株感染，最终确定病原体感染数量。本发明方法可以检测目前已确定可引起结核菌耐药（包括利福平、异烟肼和乙胺丁醇）的全部耐药基因共29个位点，是迄今为止囊括结核耐药基因最全面的快速分子诊断系统。另外通过独特的引物、探针和选择荧光染料标记设计，实现应用多重qPCR检测上述全部耐药基因位点，得到应用简便快速、结果准确可靠，对于快速诊断结核菌感染、确定耐药性从而进行有针对性的治疗具有巨大的实用价值和广阔的应用前景。

Description

提取结核杆菌DNA的方法及检测其多重耐药性的试剂盒

技术领域

本发明涉及生物医学检测技术领域，尤其是涉及一种提取结核杆菌DNA的方法及快速准确检测结核分枝杆菌多重耐药性的试剂盒。

背景技术

结核病仍是一个全球性的问题。目前全球约有20亿人被感染，每年新出现结核病患者约800万～1000万，每年因结核病死亡人数约200万～300万,结核病已成为21世纪严重危及人类健康的疾病之一。中国也是结核病发生比较严重的国家之一，有接近一半的人口已经感染了结核病病菌，目前有结核病人500万，每年新增患者150万。

虽然结核病已经不是过去那种能够让人“十痨九死”的瘟神了，但近20年来结核病在世界范围内出现暴发流行，出现“复燃“，其主要原因是耐药结核病的产生。WHO2008年报道显示，全球结核病总耐药率为20.0%，耐多药率为5.3%每年新出现耐多药结核病患者约50万人，广泛耐药结核病（XDR-TB）患者5万人。随着世界范围内的旅行和人口流动的增加，耐药性肺结核病例过去20年来一直呈上升态势，严重地威胁着结核病控制工作已取得的进展。

耐药的发生与结核杆菌的基因突变有关。药物靶基因一个或几个核苷酸突变（增加、缺失、替代），造成核苷酸编码错误致氨基酸错位排列，影响药物与靶位酶结合而产生耐药。因一个基因突变而产生的耐药为单基因型耐药，因多基因型突变而产生的耐药为多基因耐药；对多种药物发生耐药是结核分枝杆菌的不同靶位基因相继发生突变造成的。

与病毒性传染病如艾滋和肝炎病不同，目前已有多种有效抗结核药物。因此，有效控制结核病的关键在于研发出快速、可靠的耐药结核病检测技术。因为只有快速、准确地检测出病人是否为耐药结核病及对何种药物耐药，病人才能得以及时而且合理的治疗，从而有效地控制住结核病传播。而目前因临床所使用的药敏试验耗时长（6-8周）、费力，病人的病情得不到及时的合理化治疗，根本无法满足目前结核病防治的需要。

结核病致病原是结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，TB）。它是一类单细胞，需氧，革兰氏阳性菌。典型的分枝杆菌通常有一个较厚的、疏水性的细胞壁，缺乏细胞外膜。结核分枝杆菌感染的特殊性给结核病的诊断和有效治疗带来很大的困难，主要表现在：（1）结核菌感染后可能表现出症状，如慢性咳嗽（典型的会痰中带血），发热，夜间盗汗，疲劳乏力，脸色苍白，消瘦等，但也可能是潜在的和完全无症状。这时应用传统的检测方法常无法诊断或造成假阴性（漏诊）；（2）结核病感染的常规诊断通常依赖于身体检查和实验室检查。身体检查往往仅在结核活动期或感染后期才能发现症状。结核菌素皮试和抗酸性染色方法的特异性不强。肺组织活检，胸腔穿刺术等创伤性检测方法对机体损害较大。最广泛采用的痰液涂片、显微镜下检查确诊结核病检出率很低。而细胞培养的方式由于结核分枝杆菌的特殊结构、生长特性以及在感染个体体内的滴度通常较低等特点，需要较长的细菌培养周期，从临床标本培养结核菌通常需要四到八周之间。在此期间，病人可能病情加重或传染给他人。这使作为传统意义上结核诊断金标准的细胞培养方法在实际操作上存在巨大的局限性，难以有效控制病情发展和传播；（3）更重要的是耐药及多重耐药菌的出现使对结核病的治疗雪上加霜。结核杆菌耐药菌株的出现是基因突变和自然选择的结果。但在实际操作中其根本原因就是由于对耐药性检验不力，对患者感染结核菌耐药性不了解，造成无法选择正确有效的治疗药物。而这基本相当于一个人工选择耐药性结核菌感染的过程，其结果是造成更严重、更难治的耐药菌感染，同时促进了新的耐药菌种的出现和传播。因此可以说，在没有结核菌耐药监测前提下的抗生素治疗，适得其反，弊大于利。

针对上述问题，对结核病及耐药与多重耐药菌株的快速分子诊断方法是目前结核病防治的关键。分子诊断方法快速，灵敏度高、特异性好、结果准确，非常适于对结核病及耐药与多重耐药病的诊断。荧光定量PCR是目前临床最重要的分子诊断技术。由于其快速，灵敏度高、结果准确，已被广泛地应用到艾滋病，肝炎，和HPV等传染病诊断与普查。但在结核病及耐药与多重耐药分子诊断尚未广泛开展起来。这主要存在以下几个问题：

（1）检验内容有限：目前的方法常仅限于测试是否有结核菌感染，或集中于测试是否为耐利福平耐药，结果非常局限而不够全面。比如美国食品药品管理局(FDA)近年批准的首个用来检测结核菌耐药性的分子诊断试剂盒就是用于检测利福平耐药性的，称为XpertMTB/RIF。诚然，利福平是很重要的结核一线抗生素，但对其它药物耐药和多重结核耐药菌根本无法检测。而常规结核病抗生素治疗一个公认的基本原则就是复合用药。而且单一抗生素用药是造成结核菌产生耐药的重要原因之一。如果仅知道利福平的耐药信息对指导治疗的实用价值是有限的。近年来耐药与多重耐药结核菌感染甚至爆发的出现要求有更先进的方法，全面检测结核感染的耐药信息。

（2）目前市场上基于荧光定量PCR检测的方法多数每个反应仅作单突变点检测。这样或者限制了可以检测突变点的数量，或者试剂过多、操作复杂费时，在实际临床实践中受到制约。多重荧光定量PCR的应用不仅能够检测所有结核菌耐药与多重耐药，而且，大大简化了实验方法。

（3）对于样本的DNA提取缺乏规范有效的方法。结核杆菌DNA的提取一直是困扰结核病分子诊断发展的一个技术难题。

因此，开发一项崭新的，适合临床结核病防治的荧光定量PCR检测方法是当前急待解决的问题。该方法应该不仅提供从结核菌DNA提取到最终获得结核菌感染与否，耐药与多重耐药与否全部信息，而且要能准确可靠，快速、简便地应用于临床实验室。

发明内容

本发明提供一种提取结核杆菌DNA的方法，以解决现有技术中的DNA提取困难，费时费力等问题。

本发明提供一种快速准确检测结核分枝杆菌多重耐药性的试剂盒，以准确可靠，快速、简便地检测结核杆菌耐药性及多重耐药性。

本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：

从痰液中提取结核杆菌DNA的方法，包括以下步骤：

a)、碱处理，将生物样本（痰液）加入NaOH溶液内液化处理；

b）、一次离心，将上述液化后的生物样本置入离心机内离心，弃上清液；

c）、Tris缓冲液洗涤沉淀，弃去上清液；

d）、加入DNA提取液，沸水浴5-15分钟；

e）、二次离心，将上步所得液体置于离心机内离心，收集上清液，即得结核杆菌DNA。

作为优选的技术方案，所述碱处理中的NaOH溶液的浓度为4%，碱处理的温度为37℃，碱处理的时间为30分钟。

作为优选的技术方案，所述一次离心和二次离心的转速均为12000转，时长为10分钟。

作为优选的技术方案，所述DNA提取液包括以下浓度的组分：

组分	浓度
		异硫氰酸胍（Guanidine thiocyanate GITC）	3M
二硫苏糖醇（Dithiothreitol DTT）	1mM
		柠檬酸钠（Sodium Citrate）	10mM
十二烷基磺酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate SDS）	0.5%
		消泡剂（Antifoam）	0.002%

三羟甲基氨基甲烷（Tris(hydroxymethyl)aminomethane Tris）	100mM
		乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid EDTA)	0.1mM
乙醇（Ethanol）	20%

本发明还提出了一种快速准确检测结核分枝杆菌多重耐药性的试剂盒，包括：痰液样本液化剂、DNA提取液、qPCR反应液、多重耐药基因检测引物、核苷酸探针、各耐药基因野生型及各耐药基因变异型序列检测标准品；

所述痰液样本液化剂为浓度为4%的NaOH溶液；

所述DNA提取液包括以下浓度的组分：

组分	浓度
		异硫氰酸胍（Guanidine thiocyanate GITC）	3M
二硫苏糖醇（Dithiothreitol DTT）	1mM
		柠檬酸钠（Sodium Citrate）	10mM
十二烷基磺酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate SDS）	0.5%
		消泡剂（Antifoam）	0.002%
三羟甲基氨基甲烷（Tris(hydroxymethyl)aminomethane Tris）	100mM
		乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid EDTA)	0.1mM
乙醇（Ethanol）	20%

所述多重耐药基因检测引物的DNA序列为SEQ ID Nos：1-79，引物序列如下：

扩增结核杆菌特异性IS6110通用序列正向引物：

SEQ ID No.1CTGCGCGATGGCGAACTCAAGG

扩增结核杆菌特异性IS6110通用序列反向引物：

SEQ ID No.2GGTTCAGGGTTAGCCACACTTTGCG

扩增KatG基因通用反向引物：

SEQ ID No.3GTCCTTACCGGTTCCGGTGCC

SEQ ID No.4TGTATTGCCAAGCGCCAGCAGG

扩增KatG基因S315T变异型正向引物：

SEQ ID No.5CCGGTAAGGACGCGATCACCTC

SEQ ID No.6CCGGTAAGGACGCGATCACAAC

扩增KatG基因T275P变异型正向引物：

SEQ ID No.7CGGCGGTCACACTTTCGGTAATC

SEQ ID No.8GGCGGTCACACTTTCGGTACGC

扩增KatG基因W300G变异型正向引物：

SEQ ID No.9CTGGAGCAGATGGGCTTGGGAG

SEQ ID No.10CTGGAGCAGATGGGCTTGGTCG

扩增KatG基因S315N变异型正向引物：

SEQ ID No.11CCGGTAAGGACGCGATCACCCA

SEQ ID No.12GAACCGGTAAGGACGCGATCACAAA

扩增FurA-KatG基因间隔序列通用反向引物：

SEQ ID No.13TACTGGGGTCTATGTCCTGATTGTTCG

扩增FurA-KatG基因间隔序列G7A变异型正向引物：

SEQ ID No.14GTGTTGCTCGGGCACAGCATGT

SEQ ID No.15GTGTTGCTCGGGCACAGCAGTT

扩增FurA-KatG基因间隔序列A10C变异型正向引物：

SEQ ID No.16GCTCGGGCACAGCATTCCGG

SEQ ID No.17GTTGCTCGGGCACAGCATTCATG

扩增FurA-KatG基因间隔序列G12A变异型正向引物：

SEQ ID No.18GTTGCTCGGGCACAGCATTCCTTAT

SEQ ID No.19GCTCGGGCACAGCATTCCTGCT

扩增inhA基因通用反向引物：

SEQ ID No.20GAATACGCCGAGATGTGGATGCC

扩增inhA基因S94A变异型正向引物：

SEQ ID No.21CTCGACGGGGTGGTGCAGG

SEQ ID No.22CTCGACGGGGTGGTGCCTG

扩增embB基因通用反向引物

SEQ ID No.23CAGCCGAAGGGATCCTCCGG

SEQ ID No.24TGTGAATGCGGCGGTAACGACG

SEQ ID No.25AGGTAGTAGTAACGCAGGTTCTCGG

扩增embB基因G406S变异型正向引物

SEQ ID No.26CAACGGCCTGCGGCCGGATA

SEQ ID No.27CGGCCTGCGGCCGGTGA

扩增embB基因G406A变异型正向引物

SEQ ID No.28GGCCTGCGGCCGGAGTC

SEQ ID No.29GGCCTGCGGCCGGATGC

扩增embB基因G406D变异型正向引物

SEQ ID No.30CGGCCTGCGGCCGGAGTA

SEQ ID No.31CGGCCTGCGGCCGGATGA

扩增embB基因G406C变异型正向引物

SEQ ID No.32CAACGGCCTGCGGCCGGATT

SEQ ID No.33CGGCCTGCGGCCGGTGT

扩增embB基因Q497R变异型正向引物

SEQ ID No.34GACCGTGGTGTTCGCCGACAC

SEQ ID No.35GACCGTGGTGTTCGCCGAACC

SEQ ID No.36GACCGTGGTGTTCGCCGACAG

SEQ ID No.37GACCGTGGTGTTCGCCGAACG

扩增embB基因M306I变异型正向引物

SEQ ID No.38CGACGGCTACATCCTGGGCAGT

SEQ ID No.39CGACGGCTACATCCTGGGCCTT

SEQ ID No.40GACGGCTACATCCTGGGCAGC

SEQ ID No.41GACGGCTACATCCTGGGCCTC

扩增embB基因M306L变异型正向引物

SEQ ID No.42GACGACGGCTACATCCTGGGAC

SEQ ID No.43GACGACGGCTACATCCTGGTCC

SEQ ID No.44GACGACGGCTACATCCTGGGAT

SEQ ID No.45GACGACGGCTACATCCTGGTCT

扩增embB基因M306V变异型正向引物

SEQ ID No.46GACGACGGCTACATCCTGGGAG

SEQ ID No.47GACGACGGCTACATCCTGGTCG

扩增embC基因通用反向引物

SEQ ID No.48CCGTCGTCGGAGGTGTTGGC

扩增embC基因T270I变异型正向引物

SEQ ID No.49CCGCGCGCTGGTGGTCGTT

SEQ ID No.50CCCGCGCGCTGGTGGTCTAT

扩增rpoB基因通用反向引物

SEQ ID No.51TAGCGCTTCTCCTTGAAGAACAAGTTTTCC

SEQ ID No.52GGTCAGGTACACGATCTCGTCG

SEQ ID No.53GAGCCGATCAGACCGATGTTGG

扩增rpoB基因D516V变异型正向引物

SEQ ID No.54ACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGTT

SEQ ID No.55CCAGCCAGCTGAGCCAATTCATTGT

扩增rpoB基因H526Y变异型正向引物

SEQ ID No.56AACCCGCTGTCGGGGTTGAACT

SEQ ID No.57CCCGCTGTCGGGGTTGACGT

扩增rpoB基因S531L变异型正向引物

SEQ ID No.58ACCCACAAGCGCCGACTGGC

SEQ ID No.59TTGACCCACAAGCGCCGACTTTC

扩增rpoB基因S531W变异型正向引物

SEQ ID No.60GACCCACAAGCGCCGACTGGG

SEQ ID No.61TTGACCCACAAGCGCCGACTTTG

扩增rpoB基因Q513L变异型正向引物

SEQ ID No.62CGGCACCAGCCAGCTGAGCAT

SEQ ID No.63CGGCACCAGCCAGCTGAGACT

扩增rpoB基因D516Y变异型正向引物

SEQ ID No.64CACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATTT

SEQ ID No.65CAGCCAGCTGAGCCAATTCAGGT

扩增rpoB基因H526D变异型正向引物

SEQ ID No.66CCCGCTGTCGGGGTTGACAG

SEQ ID No.67CCCGCTGTCGGGGTTGAACG

扩增rpoB基因V146F变异型正向引物

SEQ ID No.68GGCTGGACCAGCGAGCAGATGT

SEQ ID No.69GGCTGGACCAGCGAGCAGAGTT

扩增rpoB基因H526R变异型正向引物

SEQ ID No.70CCGCTGTCGGGGTTGACCAG

SEQ ID No.71CCGCTGTCGGGGTTGACACG

扩增rpoB基因H526L变异型正向引物

SEQ ID No.72CCCGCTGTCGGGGTTGACCAT

SEQ ID No.73CCCGCTGTCGGGGTTGACACT

扩增rpoB基因I572F变异型正向引物

SEQ ID No.74TGAGGGGCCCAACATCGGTCTTT

SEQ ID No.75AGGGGCCCAACATCGGTCGGT

扩增rpoB基因D516G变异型正向引物

SEQ ID No.76CAGCCAGCTGAGCCAATTCATCGA

SEQ ID No.77CCAGCCAGCTGAGCCAATTCATAGA

人类GAPDH基因qPCR正向引物：

SEQ ID No.78GAAGGTGAAGGTCGGAGT

人类GAPDH基因qPCR反向引物：

SEQ ID No.79GAAGATGGTGATGGGATTTC

所述核苷酸探针的序列为SEQ ID Nos：80-92，核苷酸探针序列如下：

结核杆菌IS6110通用序列探针：

SEQ ID No.80CATCAGCCGCGTCCACGCCGCCAACTAC

KatG基因qPCR探针：

SEQ ID No.81CCGAGGCTGCTCCGCTGGAGCAGATG

SEQ ID No.82AGATCCTGTACGGCTACGAGTGGGAGCTGACGAA

FurA-KatG基因间隔序列qPCR探针：

SEQ ID No.83CGGGCTGTGATCACGGATGTGATCGCGAAGTGT

inhA基因qPCR探针：

SEQ ID No.84TCATGCCGCAGACCGGGATGGGCATCAACC

embB基因qPCR探针

SEQ ID No.85CGACCACGCCGGCTACATGTCCAACTATTTCCG

SEQ ID No.86CGCTCGGCTCGCTGGTCACCTATGTGCTGAT

SEQ ID No.87TGTTGGAAGCCACCAGGGTTCGCGCCAAAATCG

embC基因qPCR探针

SEQ ID No.88CTGGTTATCGCCGTGCTGGTGTGGTGGCATTTC

rpoB基因qPCR探针

SEQ ID No.89TTCTCCGAGATCATGCGATCGACGCTGGAGAAG

SEQ ID No.90TTCATCGAAACGCCGTACCGCAAGGTGGTCGA

SEQ ID No.91TCCGCGACGTGCACCCGTCGCACTAC

人类GAPDH基因qPCR探针：

SEQ ID No.92CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC

所述各耐药基因野生型及耐药变异型序列检测标准品的序列为SEQIDNos：93-138，序列如下：

结核杆菌特异性插入片段IS6110序列：

SEQ ID No.93：

CTGCGCGATGGCGAACTCAAGGAGCACATCAGCCGCGTCCACGCCGCCAACTACGGTGTTTACGGTGCCCGCAAAGTGTGGCTAACCCTGAACC

KatG基因S315T/S315N野生型：

SEQ ID No.94：

ATGGCACCGGAACCGGTAAGGACGCGATCACCAGCGGCATCGAGGTCGTATGGACGAACACCCCGACGAAATGGGACAACAGTTTCCTCGAGATCCTGTACGGCTACGAGTGGGAGCTGACGAAGAGCCCTGCTGGCGCTTGGCAATACA

KatG基因S315T变异型：

SEQ ID No.95：

CCGGTAAGGACGCGATCACCTCCGGCATCGAGGTCGTATGGACGAACACCCCGACGAAATGGGACAACAGTTTCCTCGAGATCCTGTACGGCTACGAGTGGGAGCTGACGAAGAGCCCTGCTGGCGCTTGGCAATACA

KatG基因T275P野生型：

SEQ ID No.96：

CGCTGATCGTCGGCGGTCACACTTTCGGTAAGACCCATGGCGCCGGCCCGGCCGATCTGGTCGGCCCCGAACCCGAGGCTGCTCCGCTGGAGCAGATGGGCTTGGGCTGGAAGAGCTCGTATGGCACCGGAACCGGTAAGGAC

KatG基因T275P变异型：

SEQ ID No.97：

CGGCGGTCACACTTTCGGTAATCCCCATGGCGCCGGCCCGGCCGATCTGGTCGGCCCCGAACCCGAGGCTGCTCCGCTGGAGCAGATGGGCTTGGGCTGGAAGAGCTCGTATGGCACCGGAACCGGTAAGGAC

KatG基因W300G野生型：

SEQ ID No.98：

AGGCTGCTCCGCTGGAGCAGATGGGCTTGGGCTGGAAGAGCTCGTATGGCACCGGAACCGGTAAGGACGCGATCACCAGCGGCATCGAGGTCGTATGGACGAACACCCCGACGAAATGGGACAACAGTTTCCTCGAGATCCTGTACGGCTACGAGTGGGAGCTGACGAAGAGCCCTGCTGGCGCTTGGCAATACA

KatG基因W300G变异型：

SEQ ID No.99：

CTGGAGCAGATGGGCTTGGGAGGGAAGAGCTCGTATGGCACCGGAACCGGTAAGGACGCGATCACCAGCGGCATCGAGGTCGTATGGACGAACACCCCGACGAAATGGGACAACAGTTTCCTCGAGATCCTGTACGGCTACGAGTGGGAGCTGACGAAGAGCCCTGCTGGCGCTTGGCAATACA

KatG基因S315N变异型：

SEQ ID No.100：

CCGGTAAGGACGCGATCACCCACGGCATCGAGGTCGTATGGACGAACACCCCGACGAAATGGGACAACAGTTTCCTCGAGATCCTGTACGGCTACGAGTGGGAGCTGACGAAGAGCCCTGCTGGCGCTTGGCAATACA

FurA-KatG基因间隔野生型：

SEQ ID No.101：

CTGTAATGGGTGGGTGTTGCTCGGGCACAGCATTCCTTCCAGGAGTTGGTGTTATCGGGCTGTGATCACGGATGTGATCGCGAAGTGTCGGATATCGAACAATCAGGACATAGACCCCAGTA

FurA-KatG基因间隔G7A变异型：

SEQ ID No.102：

GGTGTTGCTCGGGCACAGCATGTCTTCCAGGAGTTGGTGTTATCGGGCTGTGATCACGGATGTGATCGCGAAGTGTCGGATATCGAACAATCAGGACATAGACCCCAGTA

FurA-KatG基因间隔A10C变异型：

SEQ ID No.103：

TTGCTCGGGCACAGCATTCCGGCCAGGAGTTGGTGTTATCGGGCTGTGATCACGGATGTGATCGCGAAGTGTCGGATATCGAACAATCAGGACATAGACCCCAGTA

FurA-KatG基因间隔G12A变异型：

SEQ ID No.104：

GTTGCTCGGGCACAGCATTCCTTATAGGAGTTGGTGTTATCGGGCTGTGATCACGGATGTGATCGCGAAGTGTCGGATATCGAACAATCAGGACATAGACCCCAGTA

inhA基因野生型：

SEQ ID No.105：

GGGCGGGCAACAAGCTCGACGGGGTGGTGCATTCGATTGGGTTCATGCCGCAGACCGGGATGGGCATCAACCCGTTCTTCGACGCGCCCTACGCGGATGTGTCCAAGGGCATCCACATCTCGGCGTATTCGTATGCTTC

inhA基因S94A变异型：

SEQ ID No.106：

CTCGACGGGGTGGTGCAGGCGATTGGGTTCATGCCGCAGACCGGGATGGGCATCAACCCGTTCTTCGACGCGCCCTACGCGGATGTGTCCAAGGGCATCCACATCTCGGCGTATTCGTATGCTTC

embB基因G406S/G406A/G406D/G406C野生型

SEQ ID No.107：

GGATGCCGTTCAACAACGGCCTGCGGCCGGAGGGCATCATCGCGCTCGGCTCGCTGGTCACCTATGTGCTGATCGAGCGGTCCATGCGGTACAGCCGGCTCACACCGGCGGCGCTGGCCGTCGTTACCGCCGCATTCACA

embB基因G406S变异型

SEQ ID No.108：

CAACGGCCTGCGGCCGGATAGCATCATCGCGCTCGGCTCGCTGGTCACCTATGTGCTGATCGAGCGGTCCATGCGGTACAGCCGGCTCACACCGGCGGCGCTGGCCGTCGTTACCGCCGCATTCACA

embB基因G406A变异型

SEQ ID No.109：

GGCCTGCGGCCGGAGTCCATCATCGCGCTCGGCTCGCTGGTCACCTATGTGCTGATCGAGCGGTCCATGCGGTACAGCCGGCTCACACCGGCGGCGCTGGCCGTCGTTACCGCCGCATTCACA

embB基因G406D变异型

SEQ ID No.110：

CGGCCTGCGGCCGGAGTACATCATCGCGCTCGGCTCGCTGGTCACCTATGTGCTGATCGAGCGGTCCATGCGGTACAGCCGGCTCACACCGGCGGCGCTGGCCGTCGTTACCGCCGCATTCACA

embB基因G406C变异型

SEQ ID No.111：

CAACGGCCTGCGGCCGGATTGCATCATCGCGCTCGGCTCGCTGGTCACCTATGTGCTGATCGAGCGGTCCATGCGGTACAGCCGGCTCACACCGGCGGCGCTGGCCGTCGTTACCGCCGCATTCACA

embB基因Q497R野生型

SEQ ID No.112：

GCACCGTCATCCTGACCGTGGTGTTCGCCGACCAGACCCTGTCAACGGTGTTGGAAGCCACCAGGGTTCGCGCCAAAATCGGGCCGAGCCAGGCGTGGTATACCGAGAACCTGCGTTACTACTACCT

embB基因Q497R变异型

SEQ ID No.113：

GACCGTGGTGTTCGCCGACACGACCCTGTCAACGGTGTTGGAAGCCACCAGGGTTCGCGCCAAAATCGGGCCGAGCCAGGCGTGGTATACCGAGAACCTGCGTTACTACTACCT

embB基因M306I/M306L/M306V野生型

SEQ ID No.114：

CGAATTCGTCGGACGACGGCTACATCCTGGGCATGGCCCGAGTCGCCGACCACGCCGGCTACATGTCCAACTATTTCCGCTGGTTCGGCAGCCCGGAGGATCCCTTCGGCTG

embB基因M306I变异型

SEQ ID No.115：

CGACGGCTACATCCTGGGCAGTGCCCGAGTCGCCGACCACGCCGGCTACATGTCCAACTATTTCCGCTGGTTCGGCAGCCCGGAGGATCCCTTCGGCTG

embB基因M306L变异型

SEQ ID No.116：

GACGACGGCTACATCCTGGGACTGGCCCGAGTCGCCGACCACGCCGGCTACATGTCCAACTATTTCCGCTGGTTCGGCAGCCCGGAGGATCCCTTCGGCTG

embB基因M306V变异型

SEQ ID No.117：

GACGACGGCTACATCCTGGGAGTGGCCCGAGTCGCCGACCACGCCGGCTACATGTCCAACTATTTCCGCTGGTTCGGCAGCCCGGAGGATCCCTTCGGCTG

embC基因野生型

SEQ ID No.118：

ACCGGCGGTTCCTGCCCGCGCGCTGGTGGTCGACCGGCGGTCTGGACACCCTGGTTATCGCCGTGCTGGTGTGGTGGCATTTCGTCGGGGCCAACACCTCCGACGACGG

embC基因T270I变异型

SEQ ID No.119：

CCGCGCGCTGGTGGTCGTTCGGCGGTCTGGACACCCTGGTTATCGCCGTGCTGGTGTGGTGGCATTTCGTCGGGGCCAACACCTCCGACGACGG

rpoB基因D516V/D516Y/D516G野生型

SEQ ID No.120：

CTTCGGCACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCGGGCTGGAGGTCCGCGACGTGCACCCGTCGCACTACGGCCGGATGTGCCCGATCGAAACCCCTGAGGGGCCCAACATCGGTCTGATCGGCTC

rpoB基因D516V变异型

SEQ ID No.121：

ACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGTTCCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCGGGCTGGAGGTCCGCGACGTGCACCCGTCGCACTACGGCCGGATGTGCCCGATCGAAACCCCTGAGGGGCCCAACATCGGTCTGATCGGCTC

rpoB基因H526Y/H526D/H526R/H526L野生型

SEQ ID No.122：

GACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCGGGCTGGAGGTCCGCGACGTGCACCCGTCGCACTACGGCCGGATGTGCCCGATCGAAACCCCTGAGGGGCCCAACATCGGTCTGATCGGCTC

rpoB基因H526Y变异型

SEQ ID No.123：

AACCCGCTGTCGGGGTTGAACTACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCGGGCTGGAGGTCCGCGACGTGCACCCGTCGCACTACGGCCGGATGTGCCCGATCGAAACCCCTGAGGGGCCCAACATCGGTCTGATCGGCTC

rpoB基因S531L/S531W野生型

SEQ ID No.124：

CGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCGGGCTGGAGGTCCGCGACGTGCACCCGTCGCACTACGGCCGGATGTGCCCGATCGAAACCCCTGAGGGGCCCAACATCGGTCTGATCGGCTC

rpoB基因S531L变异型

SEQ ID No.125：

ACCCACAAGCGCCGACTGGCGGCGCTGGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCGGGCTGGAGGTCCGCGACGTGCACCCGTCGCACTACGGCCGGATGTGCCCGATCGAAACCCCTGAGGGGCCCAACATCGGTCTGATCGGCTC

rpoB基因S531W变异型

SEQ ID No.126：

GACCCACAAGCGCCGACTGGGGGCGCTGGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCGGGCTGGAGGTCCGCGACGTGCACCCGTCGCACTACGGCCGGATGTGCCCGATCGAAACCCCTGAGGGGCCCAACATCGGTCTGATCGGCTC

rpoB基因Q513L野生型

SEQ ID No.127：

TCAAGGAGTTCTTCGGCACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCGGGCTGGAGGTCCGCGACGTGCACCCGTCGCACTACGGCCGGATGTGCCCGATCGAAACCCCTGAGGGGCCCAACATCGGTCTGATCGGCTC

rpoB基因Q513L变异型

SEQ ID No.128：

CGGCACCAGCCAGCTGAGCATATTCATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCGGGCTGGAGGTCCGCGACGTGCACCCGTCGCACTAC

rpoB基因D516Y变异型

SEQ ID No.129：

CACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATTTACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCGGGCTGGAGGTCCGCGACGTGCACCCGTCGCACTACGGCCGGATGTGCCCGATCGAAACCCCTGAGGGGCCCAACATCGGTCTGATCGGCTC

rpoB基因H526D变异型

SEQ ID No.130：

CCCGCTGTCGGGGTTGACAGACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCGGGCTGGAGGTCCGCGACGTGCACCCGTCGCACTACGGCCGGATGTGCCCGATCGAAACCCCTGAGGGGCCCAACATCGGTCTGATCGGCTC

rpoB基因V146F野生型

SEQ ID No.131：

TCAAGGCGCTGGGCTGGACCAGCGAGCAGATTGTCGAGCGGTTCGGGTTCTCCGAGATCATGCGATCGACGCTGGAGAAGGACAACACCGTCGGCACCGACGAGGCGCTGTTGGACATCTACCGCAAGCTGCGTCCGGGCGAGCCCCCGACCAAAGAGTCAGCGCAGACGCTGTTGGAAAACTTGTTCTTCAAGGAGAAGCGCTA

rpoB基因V146F变异型

SEQ ID No.132：

GGCTGGACCAGCGAGCAGATGTTCGAGCGGTTCGGGTTCTCCGAGATCATGCGATCGACGCTGGAGAAGGACAACACCGTCGGCACCGACGAGGCGCTGTTGGACATCTACCGCAAGCTGCGTCCGGGCGAGCCCCCGACCAAAGAGTCAGCGCAGACGCTGTTGGAAAACTTGTTCTTCAAGGAGAAGCGCTA

rpoB基因H526R变异型

SEQ ID No.133：

CCGCTGTCGGGGTTGACCAGCAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCGGGCTGGAGGTCCGCGACGTGCACCCGTCGCACTACGGCCGGATGTGCCCGATCGAAACCCCTGAGGGGCCCAACATCGGTCTGATCGGCTC

rpoB基因H526L变异型

SEQ ID No.134：

CCCGCTGTCGGGGTTGACCATCAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCGGGCTGGAGGTCCGCGACGTGCACCCGTCGCACTACGGCCGGATGTGCCCGATCGAAACCCCTGAGGGGCCCAACATCGGTCTGATCGGCTC

rpoB基因I572F野生型

SEQ ID No.135：

TCGAAACCCCTGAGGGGCCCAACATCGGTCTGATCGGCTCGCTGTCGGTGTACGCGCGGGTCAACCCGTTCGGGTTCATCGAAACGCCGTACCGCAAGGTGGTCGACGGCGTGGTTAGCGACGAGATCGTGTACCTGACC

rpoB基因I572F变异型

SEQ ID No.136：

TGAGGGGCCCAACATCGGTCTTTTCGGCTCGCTGTCGGTGTACGCGCGGGTCAACCCGTTCGGGTTCATCGAAACGCCGTACCGCAAGGTGGTCGACGGCGTGGTTAGCGACGAGATCGTGTACCTGACC

rpoB基因D516G变异型

SEQ ID No.137：

CCAGCCAGCTGAGCCAATTCATCGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCGGGCTGGAGGTCCGCGACGTGCACCCGTCGCACTACGGCCGGATGTGCCCGATCGAAACCCCTGAGGGGCCCAACATCGGTCTGATCGGCTC

人类GAPDH基因部分序列

SEQ ID No.138：

GAAGGTGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGTCGTATTGGGCGCCTGGTCACCAGGGCTGCTTTTAACTCTGGTAAAGTGGATATTGTTGCCATCAATGACCCCTTCATTGACCTCAACTACATGGTTTACATGTTCCAATATGATTCCACCCATGGCAAATTCCATGGCACCGTCAAGGCTGAGAACGGGAAGCTTGTCATCAATGGAAATCCCATCACCATCTTC

进一步的，将用于检测所有突变型基因变异序列的引物与探针组合成四组复合qPCR扩增体系，分别用于检测三种耐药性基因型，其组合为：

1）对照组：包括人类GAPDH基因及结核杆菌特异性插入片段IS6110序列，序列分别为SEQ ID No.138和SEQIDNo.93；

2）实验组1rpoB变异型；

3）实验组2embB/embC变异型；

4)实验组3KatG、FurA-KatG和inhA变异型。

作为优选的技术方案，除去所述结核杆菌特异性插入片段IS6110序列的探针采用SYBR/FAM标记外，其余探针均采用采用SYBR/FAM标记。通过采用上述组合，可以保证结果的确实可靠，SYBR/FAM是灵敏度最高、应用最广泛的荧光染料，因此这里用该染料标记变异性探针保证足够的检测灵敏度。

本发明快速准确检测结核分枝杆菌多重耐药性的试剂盒的操作方法，包括如下步骤：

a、由临床最常用的痰液样本提取高质量DNA。对生物样本（痰液）首先采用碱处理液化，其中，碱处理中采用的NaOH溶液的浓度为4%，碱处理的温度为37℃，碱处理的时间为30分钟，12000转离心10分钟后弃上清，然后使用Tris缓冲液洗涤沉淀两次，弃去上清；加入DNA提取液50μl，沸水浴10分钟，离心12000转10分钟，收集上清即可用于后续qPCR检验；

b、将全部待检的29个变异型和一个结核杆菌特异性IS6110插入片段基因保守序列及人类GAPDH基因的qPCR反应分作四组，其中在对照组检测包括人类GAPDH基因和结核杆菌特异性IS6110基因片段，分别采用SYBR/FAM和VIC/JOE标记，人类GAPDH基因检测可用作DNA提取的阳性对照，结核杆菌特异性IS6110插入片段基因保守序列则用来判定结核杆菌特异性感染，但不包含任何耐药与多重耐药性信息，其余三组实验组每组专门检测特定类的结核杆菌抗生素耐药性信息；

c、根据各抗生素在结核杆菌基因组上的作用位置及相关基因变异信息，设计结核杆菌IS6110部分保守序列及针对各基因野生型及变异型的标准序列，在序列的5’和3’端分别添加NheI（GCTAGC）和XhoI（CTCGAG）限制性内切酶识别序列，基因合成这些序列后应用NheI和XhoI将其克隆至pShuttle克隆载体，应用转化态细胞DH5a扩增质粒，采用小提获得含有各对照序列的质粒DNA用作阳性对照样本，应用Nanodrop^TM1000spectrophotometer测定浓度均为1～100ng/μl。换算成拷贝数为1.8X10¹⁰拷贝/μl。

d、使用阳性对照样本建立qPCR反应条件，其中，

qPCR反应体系设置如下：

反应组分20μl反应体系	终浓度
		qPCR反应液10μl	1X
正向引物(6μM)1.0μl	300nM
		反向引物(6μM)1.0μl	300nM
20X探针1.0μl	1X
		模板DNA1μl	100ng
无核酸酶的水6.0μl

注：qPCR反应液使用EverGreen qPCR 2X masterMix（cat.No.MasterMix-R，Appliedbiological Materials.Inc,Richmond,BC,CANADA）。

qPCR反应条件如下：

e、系列稀释阳性对照样本到每μl含10⁸、10⁶、10⁴、100、10和1个拷贝/μl进行qPCR检测获得标准曲线，测定该方法的最低检出限为10拷贝/反应，以实现在低到10拷贝/反应的情况下检测到结核杆菌特异性DNA，检出阳性代表感染量在10拷贝/μl以上，检测阴性代表或者没有感染，或感染量低于该检出限。

f、检验特异性定量，PCR检验应用实验测定的CT值代表感染病菌的多少，CT值越高，感染量越低。耐药性的判定通过比较同一样本IS6110基因CT值与该样本其余三个实验组的CT值获得。如果IS6110的CT值在23-28之间，同时实验组的CT值与IS6110的CT之差小于7，则判定该实验组结果阳性。实验组1结果阳性代表rpoB基因变异致利福平耐药，实验组2结果阳性代表embB或embC基因变异致乙胺丁醇耐药，实验组3结果阳性代表KatG基因或inhA基因或FurA-KatG间隔序列变异致异烟肼耐药。如果三个实验组结果均为阴性则代表感染的结核菌对上述三种一线结核抗生素均不耐药。如果IS6110基因的CT值大于28表明没有结核病菌感染，如果IS6110基因的CT值小于23，请将提取的DNA样本稀释10倍后重新测试。

其中，步骤a中，所述DNA提取液包括以下浓度的组分：

组分	浓度
		异硫氰酸胍（Guanidine thiocyanate GITC）	3M
二硫苏糖醇（Dithiothreitol DTT）	1mM

柠檬酸钠（Sodium Citrate）	10mM
		十二烷基磺酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate SDS）	0.5%
消泡剂（Antifoam）	0.002%
		三羟甲基氨基甲烷（Tris(hydroxymethyl)aminomethane Tris）	100mM
乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid EDTA)	0.1mM
		乙醇（Ethanol）	20%

本发明具有的有益效果是：（1）通过碱处理，离心，DNA提取液等方式提取痰液中的DNA，操作方便，可以实现批量样本自动化处理，适合筛选要求；

（2）通过检测全部6个基因的29种变异型，提供样本感染抗利福平、异烟肼和乙胺丁醇一线抗生素的全面基因突变信息，一次性检验提供完整地抗药信息，更快速、更准确为临床用药提供指导；

（3）通过复合qPCR反应的建立，减少了实验设置步骤，降低了运行成本，使应用qPCR方法全面检测结核杆菌耐药成为可能。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方案或现有技术中的技术方案，下面将对实施方案或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方案，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明：qPCR检测特异性测试；

图2为本发明：10例测试样本IS6110qPCR结果；

图3为本发明：10例测试样本rpoB基因变异型测试。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。

本发明提供了一种结核杆菌感染及耐药性测定试剂盒，试剂盒中包括：痰液样本液化剂、DNA提取液、qPCR反应液、针对结核耐利福平、异烟肼和乙胺丁醇抗生素基因的全部序列特异性引物、探针、各耐药基因野生型及耐药变异型序列检测标准品。该方法由痰液中提取DNA，经qPCR检验测定其结核分枝杆菌感染及耐药性基因变异，为临床诊治提供依据。

其中，通过大规模生物信息学分析结合以往文献报道，确定用于鉴别结核菌多重耐药性的各基因及相应变异位点。通过查询Genebank获得结核杆菌野生型基因组全序列，结合以往文献报道确定用于结核治疗的一线抗生素（包括利福平、异烟肼和乙胺丁醇）在结核杆菌基因组上的作用部位。据此查阅文献获知在这些特定位置上已被确证的基因变异，如下，共计6个基因，涉及29个基因变异。

结核杆菌耐利福平、异烟肼和乙胺丁醇基因信息：

试剂盒的制备：

1）制备痰液样本液化剂：稀释100%NaOH至终浓度4%。

2）制备DNA提取液：制备500mlDNA提取液，具体方法请参照如下

DNA提取液的制备（500ml）

组分名称	高浓度储备溶液	加入量	终浓度
				异硫氰酸胍（GITC）		177.5克	3M
二硫苏糖醇（DTT）	1M	500μl	1mM
				柠檬酸钠（Sodium Citrate）		1.47克	10mM
十二烷基磺酸钠（SDS）	10%	25ml	0.5%
				消泡剂（Antifoam）	10%	1ml	0.002%
三羟甲基氨基甲烷（Tris）	1M	50ml	100mM
				乙二胺四乙酸(EDTA)	0.5M	100μl	0.1mM
乙醇（Ethanol）	100%	100ml	20%
				无核酸酶的水		补足到500ml

3）各基因野生型及耐药变异型的qPCR检测引物序列为SEQ ID Nos：1-79；引物由Integrated DNA Technology(Coraville,Iowa,USA)公司合成。

4）各基因野生型及耐药变异型的qPCR探针序列为SEQ ID Nos：80-92；探针由Integrated DNA Technology公司合成。除人类GAPDH基因探针采用VIC/JOE标记外，其他探针均采用SYBR/FAM荧光染料标记。

基因型标准序列的建立：

1）根据各结核耐药基因野生型与耐药型的基因变异，结合本发明中所使用的qPCR引物及探针的设计，确定各基因野生型与耐药变异型标准序列，序列为SEQ ID Nos：93-138。

2）基因合成这些标准序列。合成序列时，在序列的5’端和3’端分别加上附加序列NheI和XhoI序列。

3）采用限制性内切酶NheI和XhoI线性化pShuttle克隆载体和基因合成片段。然后胶回收纯化特异性片段（Column-Pure DNA Gel RecoveryKit，Applied biological materials.Inc.Richmond,BC,CANADA）。应用T4DNA连接酶（T4DNALigase，Applied biologicalmaterials.Inc.Richmond,BC,CANADA）连接线性化克隆载体和标准序列。

4）转化DH5a转化态细胞。扩增后应用质粒DNA小提试剂盒（Column-PurePlasmidMini-PrepKit，Applied biological materials.Inc.Richmond,BC,CANADA）提取质粒DNA。应用Nanodrop^TM1000spectrophotometer(Thermo fisher Scientific,Madison,WI,USA)测定DNA浓度均为～100ng/μl。换算为1.8X10¹⁰拷贝/μl。

5）应用阳性对照样本测试本方法的检验特异性。将只有rpoB野生型或将rpoB基因的D516V变异性阳性对照样本与rpoB野生型阳性对照样本按照1：1，1：2和1：4的比例混合后，采用测试组1检验混合样本的基因型如图1所示。可以看出，对于rpoB野生型样本，qPCR为阴性结果。而随着变异性在与野生型混合样本中的比例不断增加，qPCR曲线左移，证明该方法特异性好，且qPCR结果与样本中变异性的相对含量相关。

下面为具体的实施例：

应用该试剂盒检测10例临床采集痰液样本，实验步骤如下：

1）痰液样本预处理：从每份痰液样本中取50μl移入1.5ml离心管中。在每个样本中加入200μl本试剂盒中的痰液液化剂，37℃水浴孵育30分钟，检查样本变得完全澄清无旋浊，无痰丝。

2）预处理过的样本离心12000转，10分钟后弃上清。然后使用100mM的Tris-HCl缓冲液洗涤沉淀，离心12000转，10分钟。重复洗涤步骤一次，弃去上清。

3）在沉淀中加入DNA提取液50μl，沸水浴煮10分钟，离心12000转10分钟，收集上清即为待检DNA溶液。应用Nanodrop1000Spectrophotometer测定DNA溶液浓度。所得DNA溶液的浓度为59-117ng/μl。分装出10μlDNA溶液直接进行后续qPCR检测，将剩余DNA溶液保存在-20℃冻存。

4）设置qPCR反应体系：设置qPCR反应总体系为20μl。首先按下表配置PCR反应预混合液，每个样本13μl，包括10μlEverGreen qPCR2X masterMix，加入正向、反向引物（储存液浓度6μM，人类GAPDH基因引物储存液浓度为60nM）各1.0μl（终浓度每个引物0.3μM，人类GAPDH基因引物终浓度为3nM,为其他引物浓度的1%），及20X探针1μl。最后根据提取DNA的浓度，稀释每个样品到7μl（约300ng），加到13μlPCR反应预混合液中。

PCR反应预混合液的配置

反应组分	20μl反应体系
		qPCR反应液	10μl
正向引物（6μM）	1.0μl
		反向引物（6μM）	1.0μl
探针（20X）	1μl
		总量	13μl

5）运行qPCR反应：按照下表条件运行qPCR反应。

临床样本检验qPCR反应条件

6）结果分析：

A.样本DNA浓度及质量：依据人类GAPDH基因的qPCR测试结果判断原始DNA的提取和相对浓度。结果为各样本GAPDH基因量相近，CT值为20-22之间。

B.结核杆菌感染：IS6110基因测定阳性。本实验中获得各样本的IS6110基因qPCR测试CT值在24-25之间，见图2。

C.耐药变异型检出：10例样本的实验组1qPCR反应结果见图3。各样本rpoB基因表达不同，CT值最小为24。

D.总结10个测试样本的各组qPCR检测结果见下表。

10个测试样本的检测结果

编号	GAPDH	IS6110	CT阳性值=CT(IS6110)+7	实验组1	结论
						1	20.2	24.3	31.3	24.5	RIF耐药
2	21.1	25.1	32.1	39.3	RIF不耐药
						3	21.6	25.1	32.1	38.8	RIF不耐药
4	20.3	24.7	31.7	25.8	RIF耐药
						5	21.5	25.2	32.2	37.1	RIF不耐药
6	20.8	25.2	32.2	26.1	RIF耐药
						7	21.4	25.5	32.5	37.5	RIF不耐药
8	21.2	25.4	32.4	29.3	RIF耐药
						9	20.9	24.9	31.9	31.9	RIF耐药
10	20.5	24.8	31.8	30.7	RIF耐药

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims

1.提取结核杆菌DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)、碱处理，将生物样本（痰液）加入NaOH溶液内液化处理；

b)、一次离心，将上述液化后的生物样本置入离心机内离心，弃上清液；

c)、Tris缓冲液洗涤沉淀，弃去上清液；

d)、加入DNA提取液，沸水浴5-15分钟；

e)、二次离心，将上步所得液体置于离心机内离心，收集上清液，即得结核杆菌DNA。

2.根据权利要求1所述的提取结核杆菌DNA的方法，其特征在于，所述碱处理中的NaOH溶液的浓度为4%，碱处理的温度为37℃，碱处理的时间为30分钟。

3.根据权利要求1所述的提取结核杆菌DNA的方法，其特征在于，所述一次离心和二次离心的转速均为12000转，时长为10分钟。

4.根据权利要求1所述的提取结核杆菌DNA的方法，其特征在于，所述DNA提取液包括以下浓度的组分：

5.一种检测结核分枝杆菌多重耐药性的试剂盒，其特征在于，包括：痰液样本液化剂、DNA提取液、qPCR反应液、多重耐药基因检测引物、核苷酸探针、各耐药基因野生型及各耐药基因变异型序列检测标准品；

所述多重耐药基因检测引物的DNA序列为SEQ ID Nos：1-79；

所述核苷酸探针的序列为SEQ ID Nos：80-92；

所述各耐药基因野生型及各耐药基因变异型序列检测标准品的序列为SEQ ID Nos：93-138。

6.根据权利要求5所述的一种检测结核分枝杆菌多重耐药性的试剂盒，其特征在于，所述痰液样本液化剂为浓度为4%的NaOH溶液。

7.根据权利要求5所述的一种检测结核分枝杆菌多重耐药性的试剂盒，其特征在于，所述DNA提取液包括以下浓度的组分：