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CN111518877B - 用于微量样本分型检测多房棘球蚴和细粒棘球蚴的一管法巢式实时定量pcr检测试剂盒 - Google Patents

用于微量样本分型检测多房棘球蚴和细粒棘球蚴的一管法巢式实时定量pcr检测试剂盒 Download PDF

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CN111518877B CN202010397064.5A CN202010397064A CN111518877B CN 111518877 B CN111518877 B CN 111518877B CN 202010397064 A CN202010397064 A CN 202010397064A CN 111518877 B CN111518877 B CN 111518877B
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Abstract

本发明公开了一种用于微量样本分型检测多房棘球蚴和细粒棘球蚴的一管法巢式实时定量PCR检测试剂盒，设计内外引物、探针和PCR扩增条件的选择达到巢式PCR一管法完成，操作过程中避免开盖产生气溶胶污染，提高检测结果准确性。检测试剂盒内含有PCR内、外引物对序列、MGB分型检测探针序列、用于内质控的人源内参比基因引物对序列及探针序列。本发明可针对患者血清循环DNA等微量样本分型检测出含有多房棘球蚴和/或细粒棘球蚴的样品，准确度高，可准确地分型检测出多房棘球蚴与细粒棘球蚴源特异DNA序列；可以大批量快速分型鉴定多房棘球蚴与细粒棘球蚴；操作简便，可以对样本中微量虫源DNA进行扩增并达到分型检出的水平。

Description

用于微量样本分型检测多房棘球蚴和细粒棘球蚴的一管法巢 式实时定量PCR检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种分型检测多房棘球蚴和细粒棘球蚴的实时定量PCR检测试剂盒。
背景技术
包虫病(Echinococcosis)是一种人兽共患型寄生虫疾病，又称棘球蚴病，在我国主要由细粒棘球绦虫引起的幼虫病：单房/细粒棘球蚴病(Cystic Echinococcosis,CE)和多房棘球绦虫引起的幼虫病：多房棘球蚴病(Alveolar Echinocococosis,AE)。包虫病感染灶在人体内生长缓慢，临床表现复杂，较长时间内无明显的症状和体征。目前针对包虫病的诊断及分型鉴别还缺乏有效的、灵敏的方法，主要依靠影像学诊断(B超、核磁、CT)，往往经影像学确诊的病人已经产生肝脏等器官的实质性病变，使得病人已丧失最佳的治愈时间窗甚至错过手术治疗的机会。目前虽然有基于血清抗体的分子生物学诊断方法，但是由于多房棘球蚴和细粒棘球蚴蛋白质相似度高且与其他病原微生物存在交叉抗原等因素导致其诊断结果不准确。
随着分子生物学的发展，目前基于病原体核酸检测的准确度已被大家所公认。实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。荧光标记探针可以提高实时定量PCR结果的效率、灵敏度和特异性，而且定量PCR可以在一个反应里同时检测多个目标基因。目前线粒体基因ND5、COX2、12SrRNA等基因已被用于细粒棘球蚴与多房棘球蚴分型的检测，并提出了在先发明专利申请“基于MGB探针分型检测多房棘球蚴与细粒棘球蚴样品的PCR诊断方法”，申请号为201611198588.1。
“液体活检”作为体外诊断的一个分支，是指一种非侵入式的血液测试。目前针对于血液、尿液、唾液等样本的细胞外游离DNA的检测已经在疾病监控、胎儿产检及肿瘤分期分型等相关领域应用。但循环游离DNA的检测能否用于包虫病分型诊断则是一个问题，2018年法国科学家检测了多房棘球蚴感染沙鼠动物模型及泡型包虫病患者体内游离DNA的中虫源的ND5和U1的表达情况，结果显示在沙鼠模型中ND5和U1广泛存在(8/9)而在人体的研究中仅22.58％(7/31)的患者体内能够检出上述基因。因此发明人也在患者游离血浆中考察了在先申请的发明专利(申请号：201611198588.1)引物及探针用于虫源循环DNA的检测，但是效果不理想。分析原因，可能有两点因素导致上述方法不理想：1)目前对于虫源DNA进去宿主的机制尚不明确，棘球蚴在人体和动物中的生长方式存在差异，导致虫源DNA进入机体的基因数和种类存在差异；2)虫源DNA在患者体内的表达量非常低，由于循环DNA的种类繁多对PCR反应造成竞争性的影响，从而导致常规的PCR的方法无法检出微量的DNA。
针对于问题一，发明人通过对10位泡型包虫病患者循环DNA进行了测序发现，存在虫源的DNA信息，然而是以片段的形式存在，并非完整的基因组DNA。并且发现EM18、EMY162、ELP、AgB及线粒体编码ND5、COX1等用于棘球蚴分型检测的基因并非广泛存在，而一段长度为1260bp的线粒体DNA序列(CBLO020001206,18820 to 10080)在90％(9/10)的患者体内均检出，表明CBLO020001206该序列可以用于游离DNA的诊断。通过序列比对发现在先申请的发明专利(申请号：201611198588.1)引物及探针恰好位于这段序列内。
针对于问题二，虽然在先申请的发明专利(申请号：201611198588.1)引物及探针恰好位于这段序列内，然而由于拷贝数低等原因导致在先专利的引物和探针无法从患者体内检出棘球蚴核酸信息，针对此，发明人进一步考虑通过设计外引物进行巢式PCR来提升原有方法的检测限，以外引物先进行预扩增以提升模板中目的序列的量后以第一步预扩增产物为模板进行第二轮扩增。然而巢式PCR分两步进行操作过程中需要开盖加样，会产生气溶胶污染的风险，这也是巢式PCR很难用于临床诊断的原因。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种可用于分型检测血浆游离DNA多房棘球蚴和细粒棘球蚴的"一管法"巢式实时定量PCR检测方法及试剂盒，通过对患者血浆游离DNA测序发现一段可用于检测棘球蚴感染的基因片段；通过设计外引物对、内引物对达到通过控制退火温度进行巢式PCR扩增，避免反应中途开盖造成气溶胶污染；通过设计针对棘球蚴特异DNA的引物及分型检测探针，采用实时定量PCR检测技术分型检测出多房棘球蚴与细粒棘球蚴，通过设计添加人源内参比基因引物对及探针已达到对提取DNA质量的评估。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种可用于微量样本分型检测多房棘球蚴和细粒棘球蚴的一管法巢式实时定量PCR检测试剂盒，其特征在于：含有用于分型检测多房棘球蚴和细粒棘球蚴的外引物、内引物、探针及人源内质控基因的引物、探针，其中，
引物序列如下：
上游外引物WF：5’–GGWCACAGTGCCAGCATCTGCGGTTARTCT–3’(SEQ ID NO：1)；
下游外引物WR：5’–GAGGGTGACGGGCGGTGTGTACCTGAG–3’(SEQ ID NO：2)；
上游内引物NF：5’–GACAGGGATTAGATACCCCATT–3’(SEQ ID NO：3)；
下游内引物NR：5’–GTGGACCATCCTTYACTATGC–3’(SEQ ID NO：4)；上游内质控引物CF：5’–CTCTGAAGCTGACCACACCA–3’(SEQ ID NO：5)；
下游内质控引物CR：5’–GCCAGGCATAAAGAAATGGA–3’(SEQ ID NO：6)；
探针序列如下：
AE probe：5’–FAM-CAGTGAGTGATTCTTGT-MGB–3’(SEQ ID NO：7)；
CE probe：5’–HEX-CAGTGAGCGATTCTTAT-MGB–3’(SEQ ID NO：8)；
C probe：5’–TAMRA-CTACGGGGATCTGAACCACCTTGTCTC-BHQ2-3’(SEQ ID NO：9)。(见序列表)
该检测试剂盒还包括dNTPs、Taq酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的一种、两种或多种。
该检测试剂盒还包括有标准阳性模板。
利用检测试剂盒的外引物对序列、内引物对序列、分型检测探针序列对血浆循环游离DNA中多房棘球蚴及细粒棘球蚴源DNA进行分型PCR检测，同时，内质控引物对序列及探针序列对人源样品的提取质量进行评价。
该检测方法包括以下步骤，
1)提取体液样品中的总DNA；
2)以步骤1)中的总DNA为模板，WR、WF为引物对进行巢式PCR预扩增，NR、NF、为内引物对，CF、CR为内质控引物对，以AE-probe、CE-probe、C-probe为探针进行实时定量PCR扩增反应；
3)荧光定量PCR分析DNA产物。
优选地，对于以WR、WF为外引物对，NR、NF为内引物对，CF、CR为内质控引物对，以AE-probe、CE-probe、C-probe为探针进行实时定量PCR扩增反应体系以20μL计为：
2×Taq PCR MasterMix，10μL；10μM外引物WF，0.2μL；10μM外引物WR，0.2μL；10μM内引物NF，0.40μL；10μM内引物NR，0.4μL；10μM内质控引物CF，0.4μL；10μM内质控引物CR，0.4μL；AE-probe，0.4μL；CE-probe，0.4μL；C-probe，0.4μL；DNF buffer 2μL
DNA模板，2μL；ddH2O，2.8μL；总反应体系为20μL。
优选地，对于以WR、WF为外引物对，NR、NF为内引物对，CF、CR为内质控引物对，以AE-probe、CE-probe、C-probe为探针进行实时定量PCR扩增反应条件为：94℃酶激活3min；94℃变性15s，70℃退火15s，72℃延伸30s，20个循环预扩增(不采集荧光信号)；94℃变性15s，50℃退火15s，72℃延伸30s，共40个循环(采集荧光信号)；FAM通道实时检测AE probe，VIC通道实时检测CE probe扩增曲线，TAMRA通道检测C probe扩增曲线。
本发明与传统检测工具相比具有以下优点，第一，准确度高，本发明根据多房棘球蚴与细粒棘球蚴病原体DNA在患者血浆中特异分布设计引物与探针，可以准确的分型检测出多房棘球蚴与细粒棘球蚴特异性DNA；
第二，操作简便，本发明将区分多房棘球蚴、细粒棘球蚴及人源内质控基因的探针标记不同荧光染料(AE probe-FAM；CE probe-HEX；C probe-TAMRA)，并同时将上述三种探针加入一个反应体系，可以在一个反应中完成对细粒棘球蚴、多房棘球蚴的分型检测，同时可对人源样本进行DNA提取质量评价，可以大批量快速分型鉴定多房棘球蚴与细粒棘球蚴；
第三，敏感度高，本发明从样品中提取DNA作为模板，以WR、WF为外引物对，NR、NF为内引物对，CF、CR为内质控引物对，以AE-probe、CE-probe、C-probe为探针进行“一管法”巢式多重实时定量PCR扩增较传统PCR检测限提高，可以对样本中微量虫源线粒体DNA进行扩增并达到分型检出的水平。
附图说明
图1为包虫病患者血浆游离DNA测序结果图；
图2A为血浆游离DNA内参比基因探针C probe-TAMRA信号扩增阳性；图2B为细粒探针CE probe-VIC、多房探针AE-probe-FAM信号均为阴性；图2C为多房棘球蚴探针AE-probe-FAM信号均为阳性，细粒棘球蚴探针CE probe-VIC为阴性；图2D为多房棘球蚴探针AE-probe-FAM信号均为阴性，细粒棘球蚴探针CE probe-VIC为阳性；
图3A为“一管法”巢式实时定量PCR与不含外引物的实时定量PCR针对多房棘球蚴阳性质控品对照质粒进行扩增差异图；图3B为“一管法”巢式实时定量PCR与不含外引物的实时定量PCR针对细粒棘球蚴阳性质控品对照质粒进行扩增差异图；
图4A为不含外引物的实施定量PCR法对囊型包虫病患者血浆游离DNA检测结果；图4B为“一管法”巢式实时定量PCR对囊型包虫病患者血浆游离DNA检测结果；图4C为内质控引物探针对囊型包虫病患者血浆游离DNA提取质量评价；图4D为不含外引物的实施定量PCR法对泡型包虫病患者血浆游离DNA检测结果；图4E为“一管法”巢式实时定量PCR对泡型包虫病患者血浆游离DNA检测结果；图4F为内质控引物探针对泡型包虫病患者血浆游离DNA提取质量评价。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，当然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，并不意味着对本发明的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本实施例中，本发明基于对包虫病患者血浆中游离DNA测序发现CBLO020001206可用于体外诊断多房棘球蚴与细粒棘球蚴感染，设计筛选出针对多房棘球蚴与细粒棘球蚴特异DNA序列设计外引物对、内引物对、内质控基因引物对及探针，并通过设计调节退火温度建立了“一管法”巢式实时定量PCR技术进行扩增，对扩增产物进行实时定量荧光分析，使其能够达到准确判断多房棘球蚴与细粒棘球蚴DNA的水平的同时可考察人源样本游离DNA的提取质量。
材料
1、样本：多房棘球蚴及细粒棘球蚴感染患者血浆
2、DNA提取：使用QIAamp Circulating NucleicAcid kit(50次)试剂盒提取；
3、2×Taq PCR MasterMix(低ROX)；
4、PCR仪：ABI 7500。
一、血浆DNA的提取
15mL离心管中加60μLProtease K，加4mL的血浆样本，加4mL的Buffer AL，涡旋15s；
56℃温育10min，直到裂解完全，快速离心；
加4mL乙醇(100％)，涡旋15s，快速离心；
转移混合液到Spin column(2mL收集管)至抽真空装置上，加500μL CC至柱子(活化柱子)，打开循环水式真空泵，调节至0.3Mpa左右；
加1mL BufferVW1，直至将液体抽滤干，再加入500μL WB至柱子中后抽滤30s。
将离心后的柱子底部转移至1.5mL EP管中(EP管需要编号)，12000rmp离心3min。
加30μL预热的Elutionbuffer至EP管的柱心上，室温静置3min后，12000rmp离心3min。
将EP管底部液体吸出重新加至柱心上，室温静置3min后，12000rmp离心3min，弃去柱心，将离心得到的溶液收集到离心管。短时间保存于4℃，长时间保存于-20℃。
二、包虫病患者血浆DNA测序分析
对包虫病患者血浆游离DNA进行500X测序后比对结果发现虫源DNA序列CBLO020001206.1可在90％患者中检出(图1)。
三、引物与探针的设计
根据CBLO020001206.1序列设计内外引物对及探针：
上游外引物WF：5’–GGWCACAGTGCCAGCATCTGCGGTTARTCT–3’(SEQ ID NO：1)；
下游外引物WR：5’–GAGGGTGACGGGCGGTGTGTACCTGAG–3’(SEQ ID NO：2)；
上游内引物NF：5’–GACAGGGATTAGATACCCCATT–3’(SEQ ID NO：3)；
下游内引物NR：5’–GTGGACCATCCTTYACTATGC–3’(SEQ ID NO：4)；
设计用于区分检测多房/细粒棘球蚴的探针AE probe和CE probe：
AE probe：5’–FAM-CAGTGAGTGATTCTTGT-MGB–3’(SEQ ID NO：7)；
CE probe：5’–HEX-CAGTGAGCGATTCTTAT-MGB–3’(SEQ ID NO：8)；
根据人源内质控基金β-tublin设计特异性引物及探针：
上游内质控引物CF：5’–CTCTGAAGCTGACCACACCA–3’(SEQ ID NO：5)；
下游内质控引物CR：5’–GCCAGGCATAAAGAAATGGA–3’(SEQ ID NO：6)；
设计检测内质控基因的探针C probe：
C probe：5’–TAMRA-CTACGGGGATCTGAACCACCTTGTCTC-BHQ2-3’(SEQ ID NO：9)；
引物与探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
四、试剂盒对血浆游离DNA的检测
以患者血浆游离DNA为模板，以外引物对WF、WR，内引物对NF、NR，内质控引物对CF、CR及AE probe、CE probe、C probe为探针进行实时定量PCR扩增。“一管法”巢式实时定量PCR反应体系为：2×Taq PCR MasterMix，10μL；10μM外引物WF，0.2μL；10μM外引物WR，0.2μL；10μM内引物NF，0.40μL；10μM内引物NR，0.4μL；10μM内质控引物CF，0.4μL；10μM内质控引物CR，0.4μL；AE-probe，0.4μL；CE-probe，0.4μL；C-probe，0.4μL；DNF buffer 2μL；DNA模板，2μL；ddH2O，2.8μL；总反应体系为20μL。反应条件为：94℃酶激活3min；94℃变性15s，70℃退火15s，72℃延伸30s，20个循环预扩增(不采集荧光信号)；94℃变性15s，50℃退火15s，72℃延伸30s，共40个循环(采集荧光信号)；FAM通道实时检测AE probe，VIC通道实时检测CE probe扩增曲线，TAMRA通道检测C probe扩增曲线。结果如图2所示，C probeTAMRA信号阳性表示所提取游离DNA中人源内质控基因阳性，表明血浆游离DNA提取成功(图2A)；FAM、VIC荧光信号为阴性表明待测DNA样品中不含有虫源基因(图2B)；AE probe FAM荧光信号阳性、CE probe VIC荧光信号阴性表明待测DNA中含有多房棘球蚴特异DNA(图2C)；AE probeFAM荧光信号阴性、CE probe VIC荧光信号阳性表明待测DNA中含有细粒棘球蚴特异DNA(图2C)；
五、“一管法”巢式实时定量PCR与不含外引物的实时定量PCR针对阳性质控品进行对比
“一管法”巢式实时定量PCR扩增程序:
以104copy/uL多房/细粒对照质粒DNA为模板，以外引物对WF、WR，内引物对NF、NR，内质控引物对CF、CR及AE probe、CE probe、C probe为探针进行实时定量PCR扩增。“一管法”巢式实时定量PCR反应体系为：2×Taq PCR MasterMix，10μL；10μM外引物WF，0.2μL；10μM外引物WR，0.2μL；10μM内引物NF，0.40μL；10μM内引物NR，0.4μL；10μM内质控引物CF，0.4μL；10μM内质控引物CR，0.4μL；AE-probe，0.4μL；CE-probe，0.4μL；C-probe，0.4μL；DNFbuffer 2μL；DNA模板，2μL；ddH2O，2.8μL；总反应体系为20μL。反应条件为：94℃酶激活3min；94℃变性15s，70℃退火15s，72℃延伸30s，20个循环预扩增(不采集荧光信号)；94℃变性15s，50℃退火15s，72℃延伸30s，共40个循环(采集荧光信号)；FAM通道实时检测AEprobe，VIC通道实时检测CE probe扩增曲线，TAMRA通道检测C probe扩增曲线。
不含外引物的实时定量PCR扩增程序(参见在先专利申请：201611198588.1)
以104copy/uL多房/细粒对照质粒DNA为模板，以EF、ER为引物，以AE probe、CEprobe为探针，进行实时定量PCR扩增。实时定量PCR反应体系为：2×Taq PCR MasterMix，10μL；10μM引物EF，0.40μL；10μM引物ER，0.4μL；AE-probe，0.3μL；CE-probe，0.3μL；DNFbuffer 2μL；DNA模板，2μL；ddH2O，4.6μL；总反应体系为20μL。以AE probe和CE probe为探针的实时定量PCR的反应条件为：94℃酶激活3min，94℃变性5s，60℃退火/延伸/荧光数据收集5s，共40个循环；FAM通道实时检测AE probe,VIC通道实时检测CE probe扩增曲线。
结果见图3所示：针对于多房棘球蚴样本，“一管法”巢式实时定量PCR有外引物进行巢式预扩增相比于不含外引物的实时定量PCR方法，FAM通道CT值提前了16.28(图3A)；针对于细粒棘球蚴样本，“一管法”巢式实时定量PCR有外引物进行巢式预扩增相比于不含外引物的实时定量PCR方法，VIC通道CT值提前了16.31(图3B)。以上结果表明该试剂盒通过加入外引物对进行“一管法”巢式PCR可显著提升扩增产物产量，使扩增反应尽早到达平台期有利于微量样品的检测。
六、“一管法”巢式实时定量PCR与不含外引物的实时定量PCR临床患者血浆游离DNA检测对比
“一管法”巢式实时定量PCR扩增程序:
以患者血浆游离DNA为模板，，以外引物对WF、WR，内引物对NF、NR，内质控引物对CF、CR及AE probe、CE probe、C probe为探针进行实时定量PCR扩增。“一管法”巢式实时定量PCR反应体系为：2×Taq PCR MasterMix，10μL；10μM外引物WF，0.2μL；10μM外引物WR，0.2μL；10μM内引物NF，0.40μL；10μM内引物NR，0.4μL；10μM内质控引物CF，0.4μL；10μM内质控引物CR，0.4μL；AE-probe，0.4μL；CE-probe，0.4μL；C-probe，0.4μL；DNF buffer 2μL；DNA模板，2μL；ddH2O，2.8μL；总反应体系为20μL。反应条件为：94℃酶激活3min；94℃变性15s，70℃退火15s，72℃延伸30s，20个循环预扩增(不采集荧光信号)；94℃变性15s，50℃退火15s，72℃延伸30s，共40个循环(采集荧光信号)；FAM通道实时检测AE probe，VIC通道实时检测CE probe扩增曲线，TAMRA通道检测C probe扩增曲线。
不含外引物的实时定量PCR扩增程序(参见在先专利申请：201611198588.1)
以以患者血浆游离DNA为模板，以EF、ER为引物，以AE probe、CE probe为探针，进行实时定量PCR扩增。实时定量PCR反应体系为：2×Taq PCR MasterMix，10μL；10μM引物EF，0.40μL；10μM引物ER，0.4μL；AE-probe，0.3μL；CE-probe，0.3μL；DNF buffer 2μL；DNA模板，2μL；ddH2O，4.6μL；总反应体系为20μL。以AE probe和CE probe为探针的实时定量PCR的反应条件为：94℃酶激活3min，94℃变性5s，60℃退火/延伸/荧光数据收集5s，共40个循环；FAM通道实时检测AE probe,VIC通道实时检测CE probe扩增曲线。
结果如图4所示，针对囊型包虫病患者不含外引物的实时定量PCR扩增结果显示其阳性扩增很弱，CT值为31.00(图4A)，介于荧光定量PCR针断的临界值很难判断是否为阳性扩增，而一管法”巢式实时定量PCR反应结果显示其CT值为16.47为阳性结果与CT诊断结果一致(图4B)，内质控扩增结果显示其人员内质控基因扩增为阳性(图4C)样品血浆游离DNA提取质量合格。针对多房棘球蚴感染泡型包虫病患者不含外引物的实时定量PCR扩增结果显示其阳性扩增很弱，CT值为31.56(图4D)，很难判断是否为阳性扩增，而一管法”巢式实时定量PCR反应结果同样可诊断为阳性扩增CT值为17.19(图4E)，内质控基因扩增结果显示该样品血浆游离DNA提取质量合格(图4F)。
七、该试剂盒对包虫病患者血浆游离DNA的应用
收集经影像学方法(CT)确诊感染包虫病患者的血浆样本73例，其中，囊型包虫病患者为41例，泡型包虫病患者为32例；另收集阴性对照临床样本74例。经该试剂盒诊断结果结果与CT诊断结果对比如下：
表一本试剂盒与影像学结果对比
Figure GDA0002997484280000121
灵敏度(真阳性率)：囊型(CE)为92.68％，泡型(AE)为87.50％。
特异度(真阴性率)：100％。
准确度：95.24％。
试剂盒和影像学对比采用Kappa一致性检验，经计算Kappa值为：0.90，Kappa值>0.75，本试剂盒与影像学诊断一致性较高。
以上已将本发明做一详细说明，以上所述，仅为本发明之较佳实施例而已，当不能限定本发明实施范围，即凡依本申请范围所作均等变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖范围内。

Claims (6)

1.一种用于微量样本分型检测多房棘球蚴和细粒棘球蚴的一管法巢式实时定量PCR检测试剂盒，其特征在于：含有用于分型检测多房棘球蚴和细粒棘球蚴的外引物、内引物、探针及人源内质控基因的引物、探针，其中，
引物序列如下：
上游外引物WF：5’–GGWCACAGTGCCAGCATCTGCGGTTARTCT–3’；
下游外引物WR：5’–GAGGGTGACGGGCGGTGTGTACCTGAG–3’；
上游内引物NF：5’–GACAGGGATTAGATACCCCATT–3’；
下游内引物NR：5’–GTGGACCATCCTTYACTATGC–3’；
上游内质控引物CF：5’–CTCTGAAGCTGACCACACCA–3’；
下游内质控引物CR：5’–GCCAGGCATAAAGAAATGGA–3’；
探针序列如下：
AE probe：5’–FAM-CAGTGAGTGATTCTTGT-MGB–3’；
CE probe：5’–HEX-CAGTGAGCGATTCTTAT-MGB–3’；
C probe：5’–TAMRA-CTACGGGGATCTGAACCACCTTGTCTC-BHQ2-3’；
所述微量样本为血浆游离DNA。
2.根据权利要求1所述的用于微量样本分型检测多房棘球蚴和细粒棘球蚴的一管法巢式实时定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒还包括有标准阳性模板。
3.根据权利要求1所述的用于微量样本分型检测多房棘球蚴和细粒棘球蚴的一管法巢式实时定量PCR检测试剂盒，其特征在于：利用检测试剂盒的外引物对序列、内引物对序列、分型检测探针序列对血浆循环游离DNA中多房棘球蚴及细粒棘球蚴源DNA进行分型PCR检测，同时，内质控引物对序列及探针序列对人源样品的提取质量进行评价。
4.根据权利要求3所述的用于微量样本分型检测多房棘球蚴和细粒棘球蚴的一管法巢式实时定量PCR检测试剂盒，其特征在于：包括以下步骤，
1)提取血浆样品中的游离DNA；
2)以步骤1)中的总DNA为模板，WR、WF为引物对进行巢式PCR预扩增，NR、NF为内引物对，CF、CR为内质控引物对，以AE probe、CE probe、C probe为探针进行实时定量PCR扩增反应；
3)荧光定量PCR分析步骤2)的扩增产物。
5.根据权利要求4所述的用于微量样本分型检测多房棘球蚴和细粒棘球蚴的一管法巢式实时定量PCR检测试剂盒，其特征在于：对于以WR、WF为外引物对，NR、NF为内引物对，CF、CR为内质控引物对，以AE probe、CE probe、C probe为探针进行实时定量PCR扩增反应体系以20μL计为：
2×Taq PCR MasterMix，10μL；10μM外引物WF，0.2μL；10μM外引物WR，0.2μL；10μM内引物NF，0.40μL；10μM内引物NR，0.4μL；10μM内质控引物CF，0.4μL；10μM内质控引物CR，0.4μL；AE probe，0.4μL；CE probe，0.4μL；C probe，0.4μL；DNF buffer，2μL；
DNA模板，2μL；ddH2O，2.8μL。
6.根据权利要求4所述的用于微量样本分型检测多房棘球蚴和细粒棘球蚴的一管法巢式实时定量PCR检测试剂盒，其特征在于：对于以WR、WF为外引物对，NR、NF为内引物对，CF、CR为内质控引物对，以AE probe、CE probe、C probe为探针进行实时定量PCR扩增反应条件为：94℃酶激活3min；94℃变性15s，70℃退火15s，72℃延伸30s，20个不采集荧光信号的循环预扩增；94℃变性15s，50℃退火15s，72℃延伸30s，共40个采集荧光信号的循环；FAM通道实时检测AE probe，VIC通道实时检测CE probe扩增曲线，TAMRA通道检测C probe扩增曲线。
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