CN103173510A - 一种高含量羟脯氨酸的鹿胶原肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种高含量羟脯氨酸的鹿胶原肽的制备方法，以新鲜的鹿皮和/或鹿筋为原料，破碎为2～3平方厘米的碎片，将鹿皮和/或鹿筋碎片按其与缓冲液质量比为1∶1～100加入0.01-0.1M醋酸缓冲液中，再按单酶与鹿皮和/或鹿筋质量比为1∶10～500加入单酶，于20～50℃搅拌反应1～10小时；将反应液的pH用0.1-1M NaOH溶液调至6～8，加入复合酶进行酶解，加复合酶量为反应物鹿皮和/或鹿筋质量的0.1～1％，于20～70℃搅拌反应1～10小时，灭活；反应液离心，收集上清，冷冻干燥得到鹿胶原肽。以含高含量羟脯氨酸鹿胶原肽为活性成份，在医药及保健品领域具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及鹿胶原肽的制备方法，本发明制备所得胶原蛋白得率高、羟脯氨酸的含量高、分子量小，可应用于食品、化妆品、保健品、药品等领域。
背景技术
胶原蛋白是地球上最丰富的蛋白质，存在于皮肤、骨头、软骨、肌腱等组织中，起着支撑、保护、连结等作用，脊椎生物中胶原蛋白的含量可达25-30％。胶原蛋白是由三条螺旋结构的肽链组成，分子量30万道尔顿，不溶于水。胶原蛋白的三螺旋结构中有高度重复的Gly-X-Y(甘氨酸-X-Y，XY是不同的氨基酸)序列，特异性存在Gly-Pro-Hpy(甘氨酸-脯氨酸-羟脯氨酸)序列。胶原蛋白经水解后使原本包含在蛋白质中的肽段释放出来而表现促进骨细胞分化、血管紧张素转化酶抑制、抗氧化等生物活性，因此胶原蛋白水解所得的胶原肽广泛应用于保健食品、化妆品等领域。胶原肽分子量小、在水中溶解性好，可穿过肠障碍进入血液系统，从而达到皮肤组织，临床前及临床研究已经证明胶原蛋白水解物可改善皮肤状况(ITE Lett.2006，7，386-390)。羟脯氨酸是胶原蛋白的特征氨基酸，在其他蛋白质中很少见。文献证明胶原肽中主要成分Pro-Hyp可促进皮肤纤维细胞生长(Agric.Food Chem.2009，57，444-449)和改善关节炎症状(Osteoarthri tis and Cartilage，17(12)，1620-1627)，食用胶原肽中的Pro-Hyp对身体具有积极的作用(Food Chemistry 129(2011)1019-1024)。因此胶原肽制备过程中最大限度地提取、保留羟脯氨酸对胶原肽的活性具有至关重要。
胶原蛋白中羟脯氨酸的含量主要与原料来源相关，但是同一来源的胶原肽中羟脯氨酸的含量主要取决于制备方法(吉林大学学报自然科学学报，2001，106-108)。胶原肽的提取方法有：酸法、碱法和酶法，酸法和碱法会破坏胶原肽中氨基酸而很少应用，酶法是目前研究和应用较多的方法。酶法分为一步法和两步法，一步法所采用的酶可以是单酶也可以是复合酶，二步法是不同单酶分次酶解。目前文献报道的各种来源的胶原肽中羟脯氨酸的含量均不超过12％，文献报道的鹿皮胶原肽中羟脯氨酸的含量仅为8.6％(吉林大学学报自然科学学报，2001，106-108)，鹿茸胶原蛋白水解物中羟脯氨酸仅为6.7％(李银清，长春中医药大学博士论文，2010)。本发明提供一种简单易行的单酶、复合酶相结合的二步法鹿胶原肽制备方法，可显著提高胶原蛋白提取率和羟脯氨酸含量。
发明内容
本发明的目的是提供一种高含量羟脯氨酸鹿胶原肽的制备方法，其以鹿皮、鹿筋为原料，所制备的胶原肽羟脯氨酸大于16％，分子量小于3000道尔顿，在医药领域和功能性食品领域具有良好的应用前景
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
以新鲜的鹿皮、鹿筋等为原料，鹿皮或鹿筋用纯水清洗干净，剪为2～3平方厘米的碎片，鹿皮或鹿筋碎片按照1∶1～100质量比加入0.01M醋酸缓冲液，再按1∶10～500加入胃蛋白酶，于20～50℃搅拌反应1～10小时。将上述反应液的pH用1M NaOH调至6～8，加入复合酶进行酶解，加酶量为反应物质量的0.1～1％，于20～70℃搅拌反应1～10小时，反应结束后90℃灭活20min。将上述反应液5000rpm离心5min，收集上清，冷冻干燥得到鹿胶原肽。
酶解过程为两步法，第一步用单酶酶解，第二步用复合酶酶解。单酶酶解所用酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶其中一种，复合酶为胰蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶或中性蛋白酶其中两种、三种、四种或五种酶组合使用。
按照所述的制备方法制备的胶原肽具有以下特征：胶原肽得率＞90％，羟脯氨酸的含量＞16％，分子量＜3000道尔顿。
本发明所制备的鹿胶原肽应用时，以常规的制剂工艺，单独使用或与其他药物配合制备成不同的剂型，如散剂、丸剂、胶囊剂、片剂、栓剂、膏剂、酊剂、冲剂、口服液等；还可用于化妆品添加剂等。
本发明的特点如下：
1.本发明制备工艺的特点是单酶-复合酶两步法，首先用单一酶切断胶原蛋白三螺旋结构中肽的空间区域，使胶原蛋白与其他蛋白分离出来；再用复合酶切断每条肽链内的连接使分子量减小，同时使羟脯氨酸充分暴露。单酶-复合酶两步法保护了胶原蛋白中原有的羟脯氨酸不被破坏，又使肽链中羟脯氨酸暴露，因此得到高羟脯氨酸的胶原肽。
2、采用本发明制备工艺所制备的胶原肽得率＞90％，羟脯氨酸含量＞16％，分子量＜3000道尔顿，易于被人体吸收，高含量羟脯氨酸可显著提高胶原肽的生物活性和对皮肤的保湿性能。
3.本发明的制备工艺简单，对环境无污染，绿色环保。
4.通过本发明制备的鹿胶原肽活性肽可用于化妆品和保健食品，因此具有良好的应用前景。
附图说明
图1采用本发明的制备工艺所制备的鹿胶原肽的分子量分布的MALD-TOF质谱图。
具体实施方式
实施例1
以新鲜鹿皮为原料，按照以下工艺制备鹿胶原肽：
以新鲜的鹿皮为原料，鹿皮用纯水清洗干净，剪为2～3平方厘米的碎片，鹿皮碎片按照1∶1质量比加入0.01M醋酸缓冲液中，再按胃蛋白酶与鹿皮的质量比1∶10、加入胃蛋白酶，于20℃搅拌反应1小时。将上述反应液的pH用1M NaOH调至7，加入复合酶(按质量比，胰蛋白酶：碱性蛋白酶为1∶1)进行酶解，加酶量为反应物鹿皮质量的0.1％，于20℃搅拌反应1小时，反应结束后90℃灭活20min。将上述反应液5000rpm离心5min，收集上清，上清冷冻干燥得到鹿胶原肽。胶原肽得率为92％。
胶原肽中羟脯氨酸含量采用氯氨T氧化，对甲胺基苯甲醛显色，分光光度法测定，质量含量为17.9％(按照中华人民共和国国家标准：肉与肉制品L-羟脯氨酸含量测定GB9695.23-90操作)。
分子量分布采用MALD-TOF-MS测定，分子量分布如图1所示，分子量均＜3000道尔顿。
实施例2
以新鲜的鹿筋为原料，鹿筋用纯水清洗干净，剪为2～3平方厘米的碎片，按照鹿筋碎片∶醋酸缓冲液的质量比为1∶100、鹿筋碎片加入0.01M醋酸缓冲液中，再按胃蛋白酶与鹿皮的质量比1∶500、加入酸性蛋白酶，于50℃搅拌反应10小时。将上述反应液的pH用1MNaOH调至8，加入复合酶(按质量比，木瓜蛋白∶菠萝蛋白酶，中性蛋白酶为1∶1)进行酶解，加酶量为反应物鹿筋质量的1％，于70℃搅拌反应10小时，反应结束后90℃灭活20min。将上述反应液5000rpm离心5min，收集上清，冷冻干燥得到鹿胶原肽。胶原肽得率95％。
胶原肽中羟脯氨酸含量采用氯氨T氧化，对甲胺基苯甲醛显色，分光光度法测定，含量为16.9％。分子量分布采用MALD-TOF-MS测定，分子量均分布如图1所示，分子量均＜3000道尔顿。
Claims (5)
1.一种高含量羟脯氨酸的鹿胶原肽的制备方法，其特征在于：
所述鹿胶原肽的制备过程如下，以新鲜的鹿皮和/或鹿筋为原料，鹿皮和/或鹿筋用纯水清洗干净，破碎为2～3平方厘米的碎片，按照鹿皮和/或鹿筋与醋酸缓冲液质量比为1∶1～100，将鹿皮和/或鹿筋碎片加入0.01-0.1M醋酸缓冲液中，再按单酶与鹿皮和/或鹿筋质量比为1∶10～500、加入胃蛋白酶，于20～50℃搅拌反应1～10小时；
将上述反应液的pH用0.1-1M NaOH溶液调至6～8，加入复合酶进行酶解，加复合酶量为反应物鹿皮和/或鹿筋质量的0.1～1％，于20～70℃搅拌反应1～10小时，反应结束后灭活；将上述反应液离心，收集上清，上清冷冻干燥得到鹿胶原肽。
2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
酶解过程为两步法，第一步用单酶酶解，第二步用复合酶酶解；
单酶酶解所用酶为胃蛋白酶、酸性蛋白酶其中一种；
复合酶为胰蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶或中性蛋白酶其中两种、三种、四种或五种酶组合使用；每种酶于复合酶中的质量含量为20-80％。
3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
灭活是指，反应结束后60-100℃灭活10-60min。
4.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
离心是指，将反应液3000-8000rpm离心5-60min。
5.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
制备的胶原肽具有以下特征：胶原肽得率＞90％，羟脯氨酸的含量＞16％，分子量＜3000道尔顿。
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