CN108323764B - 一种提取禽蛋壳膜多肽并制备骨关节保健品的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提取禽蛋壳膜多肽并制备骨关节保健品的方法，包含以下步骤：蛋壳原料的制备、酸处理、过滤、制备多肽粉和有机钙粉，多肽粉和有机钙粉经混合可制备关节保健组合物，再经配料、混合、制粒、压片后可得到骨关节保健品。本发明通过建立酸‑还原‑酶法相耦合的蛋壳膜处理技术，无需复杂的壳膜分离操作，可高效制备蛋壳膜多肽和蛋壳有机酸钙，通过本发明方法制备的关节保健产品富含透明质酸、硫酸软骨素、氨糖、有机酸钙、有机酸镁等骨关节关键保健营养成分，具有修复骨质疏松、骨关节炎、抗氧化功效，因此本技术特别适用于制备天然来源的改善骨关节炎的医药、食品、保健品，实现蛋壳与壳膜同时高效资源化利用，变废为宝。
Description
技术领域
本发明涉及农副产品禽蛋壳加工领域，具体涉及一种提取禽蛋壳膜多肽并制备骨关节保健品的方法。
背景技术
我国骨关节炎发病率高，现有关节保健药物及产品价格昂贵，亟需开发一种价格低廉、功效良好、来源广泛、易于生产的骨关节保健产品。骨关节炎是一种严重危害人类健康的慢性进行性骨关节综合症。流行病学调查结果显示：我国关节炎患病率60岁以上者达78.5％。并且随着我国人口老龄化的日益加剧，越来越多的老年人受到骨关节炎病痛的折磨，增加了医疗负担的同时也严重降低了患者的劳动能力和生活质量。因此有效防治关节炎己成为重大的公共卫生学问题。但目前治疗和改善骨关节炎症的药物和产品价格昂贵，关节保健所需营养成分：氨基葡萄糖、透明质酸、硫酸软骨素、胶原蛋白价格较高，来源受限，长期使用经济负担大，极大的影响了我国数千万关节炎患者的康复。因此开发一种价格低廉、功效良好、来源广泛、易于生产的骨关节保健产品，对我国骨关节炎患者的健康和国家大健康产业发展意义重大。
鸡蛋壳和壳膜营养价值高，蛋壳含有丰富的生物活性钙、壳膜含有与膝关节软骨基质及关节液中相同或者相近的组成成分，如氨基葡萄糖、透明质酸、硫酸软骨素、胶原蛋白等。已有国外临床实验证实口服鸡蛋壳膜可以改善关节炎患者的膝关节疼痛和僵硬症状，具有治疗改善关节炎的开发潜力。但由于现有技术问题制约，包括：壳膜分离困难、蛋壳钙直接吸收效果差、蛋壳膜不溶解难以消化利用等问题，使得蛋壳与壳膜直接用于骨关节保健存在技术难题，国内尚未见废弃蛋壳与壳膜直接联合用于骨关节保健的高效生产技术和产品报道。
将壳膜提取壳膜多肽可解决蛋膜不溶解消化性差的问题、蛋壳提取有机酸钙可解决蛋壳碳酸钙不利于中老年肠胃吸收的问题，可以提高蛋壳与壳膜的应用功效。蛋膜多肽——富含溶解性良好的氨基葡萄糖、透明质酸、硫酸软骨素、胶原蛋白的水溶性多肽，可提高蛋壳膜的应用功效，有效应用于医药、保健食品、化妆品、生物材料领域，尤其在关节保健食品方面应用前景广阔。蛋壳有机酸钙——将蛋壳无机钙转化为易于被人体消化吸收的有机酸钙，人体吸收不消耗胃酸，不会引起肾与尿道结石，更利于骨关节炎高发人群——肠胃功能较弱的中老年使用。
我国每年废弃蛋壳和壳膜的产量巨大，废弃蛋壳年产量高达360万吨以上，废弃蛋壳膜年产量高达40万吨以上。是一种来源广泛、成本低廉的天然宝贵资源。目前我国蛋壳与壳膜除少部分用于饲料，大多数直接丢弃。随着国内企业生产蛋粉、蛋液的加工产业发展，我国各大加工厂每天集中批量产生大量蛋壳与壳膜并丢弃，废弃蛋壳携带蛋清易腐败产生恶臭污染环境，造成严重的资源浪费和环境污染问题。将蛋壳与壳膜开发骨关节炎保健产品，既可以提供天然来源、价格低廉的原料，取代昂贵的化学合成骨关节保健成分，又可促进废弃蛋壳与壳膜资源化利用，实现变废为宝。
目前壳膜多肽提取方法已有较多报道，包括碱法、酸法、酶法等。但已报道的方法中存在着提取时间长、提取效率低、使用高浓度强酸强碱、壳膜分离前处理操作复杂、使用安全性差的化学试剂等问题。碱法主要采用高浓度碱加热处理壳膜，易导致蛋膜氨基酸变性生成有害成分，并产生异臭，产品不适用于医药及保健食品应用领域；酸法采用提取时间长，提取率低不足10％；酶法提取时间长，多在10小时以上，提取效率低。因此现有方法难以实现规模化生产。CN 103275205 A公开了一种水溶性禽蛋膜活性肽生产方法，其利用强碱(pH＝12-14)和超声处理下对包括蛋壳膜的禽蛋壳进行水解的步骤，该方法虽然时间短，但反应条件碱性强，已有研究表明蛋白质在强碱条件下水解易产生有毒产物，存在安全隐患，同时不利于工业化推广。反应后需要对水解液进行浓缩和脱盐处理，工艺复杂。CN104292364 A公开了一种从蛋壳膜中提取生物活性物质的方法，需要壳膜分离处理，其利用离子液体为1—轻乙基—3—甲基咪哩四氟硼酸盐处理蛋壳膜处理3小时后，采用碱性蛋白酶和胰蛋白酶两种酶水解14个小时，处理过程复杂，时间长，同时由于调节酸度加入了大量的酸和碱，产品需要脱盐处理。工艺复杂。CN103069000A公布了一种蛋壳膜溶解方法，该专利提供了一种蛋白酶与还原剂联用的方法溶解蛋壳膜，该法仅将酶法与还原法相结合，尽管该法对蛋膜多肽的提取效果优于单一酶法，但该法未达到最佳的蛋膜多肽提取效果，且无法实现蛋壳的同时利用，造成蛋膜使用时蛋壳的浪费。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提取禽蛋壳膜多肽并制备骨关节保健品的方法，以解决现有蛋壳与壳膜高效应用于关节保健的技术问题，高效制备蛋膜多肽和蛋壳有机钙粉用于生产关节保健组合物，应用于保健食品和药品中，如咀嚼片、固体饮料、胶囊等，本技术工艺简单、不使用强酸强碱和有机试剂、安全性高，可有效降低关节保健产品成本，为我国关节炎患者带来福音。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种提取禽蛋壳膜多肽的方法，包括以下步骤：
a、蛋壳原料的制备：将新鲜禽蛋打破，蛋液留待他用，得到带蛋膜的蛋壳经清洗、消毒、烘干后粉碎，过40-200目筛得到蛋壳粉；
b、酸处理：将上述步骤a中得到的蛋壳粉按1-50wt％添加至1-10mol/L的有机酸溶液中，在40-60℃条件下，搅拌充分反应至无气泡产生；
c、过滤：将上述步骤b中反应后的溶液过滤，得到滤液A和滤渣B，用水或稀碱溶液将滤渣B洗至中性；
d、制备多肽粉：取上述步骤c中洗至中性的滤渣B，依次加入滤渣B质量5-30倍的纯水或缓冲液、相对滤渣B为0.1-30wt％的还原剂以及相对滤渣B为0.1-30wt％的蛋白酶，充分搅拌之后反应1-5h，然后干燥，即可得到产物蛋膜多肽粉。
优选的，对于所述的提取禽蛋壳膜多肽的方法，上述步骤b中的有机酸为醋酸、乳酸或柠檬酸中的一种或多种，其浓度为6mol/L。
优选的，对于所述的提取禽蛋壳膜多肽的方法，上述步骤d中所用的还原剂为亚硫酸钠、赖氨酸、L-半胱氨酸、谷胱甘肽和半胱氨酸中一种或多种，其浓度为相对滤渣B质量的15wt％。
优选的，对于所述的提取禽蛋壳膜多肽的方法，上述步骤d中所用的蛋白酶为木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶或中性蛋白酶中的一种或多种，其添加量为相对滤渣B质量的15wt％。
优选的，对于所述的提取禽蛋壳膜多肽的方法，上述步骤d中的干燥方式为喷雾干燥、真空干燥或冷冻干燥。
优选的，对于所述的提取禽蛋壳膜多肽的方法，上述步骤a中使用的新鲜禽蛋为鸡蛋。
一种制备骨关节保健品的方法，包括如下步骤：
1)制备有机钙粉：向上述步骤c中得到的滤液A中加入氢氧化钙溶液中和，然后烘干、粉碎，得到蛋壳有机钙粉；
2)制备关节保健组合物：将上述步骤1)中得到的蛋壳有机钙粉和上述步骤d中得到的蛋膜多肽粉按照质量比为1:1-1:20的比例混合，即可得到关节保健组合物；
3)骨关节保健品的制备：取上述步骤2)中得到的关节保健组合物10-80质量份，再依次加入壳寡糖1-15质量份、维生素D 0.001-0.01质量份、果蔬粉1-10质量份、吡咯烷酮1-10质量份、微晶纤维素5-10质量份、麦芽糊精5-20质量份和甜味剂0.1-0.3质量份，充分混合，然后经制粒、干燥和压片工艺，得到骨关节保健品。
优选的，对于所述的制备骨关节保健品的方法，在上述步骤2)中，蛋壳有机钙粉和蛋膜多肽粉按照质量比为1:6的比例混合。
优选的，对于所述的制备骨关节保健品的方法，在上述步骤3)中，取关节保健组合物80质量份，再依次加入壳寡糖15质量份、维生素D 0.01质量份、果蔬粉10质量份、吡咯烷酮10质量份、微晶纤维素10质量份、麦芽糊精20质量份和甜味剂0.3质量份，充分混合，然后经制粒、干燥和压片工艺，得到骨关节保健品。
一种蛋壳膜多肽粉及其关节保健组合物的应用，本发明的蛋膜多肽粉或骨关节保健组合物可应用于药品、保健食品、化妆品、纺织品、化工原料、人工皮肤中。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本技术方法打破了传统蛋壳与壳膜应用中，需要壳膜分离后，分别再对蛋壳和壳膜提取利用的现状。独创性的将蛋壳与壳膜不分离同时反应处理，大大简化了蛋膜多肽提取工艺，并可直接同时制备有机酸钙。
2、本方法可高效、简单的同时制备关节保健所需的功效成分蛋壳有机钙和蛋膜多肽复合物。
3、本发明方法建立了酸-还原-酶法相耦合的蛋壳膜处理技术，提取效果比现有报道技术显著提高：比单独使用酶法提取时间缩短85％以上，比酶法和还原法同时使用提取进间缩短达75％以上(见表2)。通过酸-还原剂-酶法相耦合的蛋膜处理技术，壳膜不溶纤维在酸性处理下充分溶胀展开，利于还原剂打开蛋膜纤维二硫键，加速蛋白酶对蛋膜不溶性蛋白的水解，从而实现高效、快速的提取壳膜多肽，效果优于现有文献报道的技术方法。
4、本发明方法不使用强酸强碱和有机有毒试剂，无需复杂的有机试剂脱除工艺，安全性高，无异味无有毒物质产生，特别适合于开发医药、保健食品、营养强化食品。
5、本技术方法制备的关节保健组合物及其食品，富含多种骨关节修复保护的功效营养成分：生物源有机酸钙、有机酸镁、磷、氨糖、胶原蛋白、胶原多肽、透明质酸、硫酸软骨素等(产品成分表见表2和表3)对骨关节修复效果好(修复效果实验见具体实施例)：可有效促进体内蛋白多糖及胶原蛋白的合成，补充关节滑液、提供受伤后关节恢复健康的软骨组织所必须的材料，预防骨关节炎、促进骨关节健康。
6、本技术方法制备的关节保健功效成分，仅以蛋壳与壳膜为原料生产，取代了现有技术的关节保健产品生产配方普遍采用：昂贵原料如氨基葡萄糖、透明质酸、胶原蛋白等单一原料进行复配制备的方法，本方法产品来源天然、安全有效、成本低廉，可显著降低骨关节产品生产成本，减少骨关节患者的经济负担，为我国庞大的骨关节炎患者群体在治疗与保健方面带来福音。
7、本技术产品中的钙元素来源于蛋壳源有机酸钙，相比于无机钙更易于被骨关节炎高发人群--肠胃功能较弱的中老年群体吸收。同时蛋壳中富含的镁、磷元素与钙离子、蛋膜胶原蛋白互作发生协同效益，更有利于促进钙在骨骼的沉积，提高骨密度和韧性，从而预防和改善骨质疏松症。
8、本技术方法生产工艺简单、易于推广，可有效实现蛋壳与壳膜的高效利用，变废为宝，提高我国禽蛋产业附加值，减少蛋壳与壳膜废弃造成的环境污染问题，具有保护环境、减少资源浪费的有益效果。
附图说明
图1为本发明的蛋膜多肽粉产品的分子量测定结果；
图2为本发明的不同壳膜多肽浓度的羟基自由基清除率测定结果。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明，以便于本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所列举的实施例不作为本发明的限定。
1.对比例与产品成分分析
本发明公开了一种酸-还原剂-酶法耦合提取蛋壳膜多肽提取技术，将本技术专利方法与现有报道较多的两种壳膜处理方法(还原剂-酶法和酶法)作对比，其中还原剂-酶法按专利CN103069000 A中报道方法，以蛋膜的溶解反应时间和提取物中粘多糖含量为对比指标，粘多糖为关节保健重要营养成分。经对比实验表明，本专利技术效果更优。
实验如下：
酶法：试验酶制剂为文献报道最多的蛋膜处理膜——碱性蛋白酶，酶量为0.5％(w/v)，蛋壳膜量为1％，反应温度为60℃，搅拌反应，测定蛋膜完全溶解所需的时间。
还原剂-酶法：方法摘自CN103069000 A，试验酶制剂为BIOSORK，酶量为0.5％(w/v)，L-半胱氨酸试验浓度为50mM，蛋壳膜量为1％，反应温度为60℃，搅拌反应，测定蛋膜完全溶解所需的时间。
酸-还原剂-酶法：6mol/L醋酸60℃处理含壳膜的蛋壳2h，试验酶制剂为木瓜蛋白酶，酶量为0.3％(w/v)，蛋壳膜量为1％，L-半胱氨酸试验浓度为50mM，反应温度为60℃，搅拌反应，测定蛋膜完全溶解所需的时间。
表1上述三种蛋膜多肽提取方法的实验结果对比
如表1所示，单独采用酶法时，蛋壳膜反应10小时仍有50％的壳膜呈固态未溶解，粘多糖的提取率低；采用还原剂-酶法处理需6小时完全溶解，采用本发明技术的酸-还原剂-酶法耦合处理90分钟即可实现壳膜的完全溶解，比单纯的酶法反应时间减少85％以上，比CN103069000 A方法(还原剂-酶法)反应时间减少75％。酸-还原剂-酶法的蛋膜多肽中的关节营养素--粘多糖含量最高，分别为还原剂-酶法多糖的2.2倍和CN103069000 A方法(还原剂-酶法)的7.3倍。因此酸-还原剂-酶耦合法可以有效降低蛋膜提取反应时间、提高反应效率、且反应产物在关节保护效果上更优。因此本发明的酸-还原剂-酶法耦合法优于现有报导的蛋壳膜处理方法。
2.通过本发明制备的壳膜多肽粉及蛋壳醋酸钙粉成分检测分析
采用酸-还原剂-酶法：6mol/L醋酸60℃处理2h，试验酶制剂为木瓜蛋白酶，酶量为0.3％(w/v)，蛋壳膜量为1％，L-半胱氨酸试验浓度为50mM，反应温度为60℃，搅拌反应，测定本专利方法同时制备的蛋膜多肽粉和蛋壳有机钙粉的各组分含量，测定结果见表2和表3。
表2蛋膜多肽粉成分分析
表3蛋壳有机钙粉成分分析
| 物质 | 含量 | 检测方法 |
| 醋酸钙 | 97.13％ | GB 1903.15-2016 |
| 醋酸镁 | 0.13％ | 火焰原子吸收法 |
| 钙元素 | 37.2％ | 火焰原子吸收法 |
| 镁元素 | 0.52％ | 火焰原子吸收法 |
| 磷元素 | 0.15％ | 钼酸铵分光光度法 |
| 钠元素 | 0.18％ | 火焰原子吸收法 |
| 钾元素 | 0.13％ | 火焰原子吸收法 |
| 铁元素 | 0.063％ | 火焰原子吸收法 |
| 蛋白质 | 2.64％ | 凯氏定氮法 |
对本专利方法制备的壳膜多肽粉和蛋壳有机钙粉的成分分析可知，蛋膜多肽粉和蛋壳有机钙粉富含骨关节营养所需的蛋白质、胶原蛋白、氨基葡萄糖、硫酸软骨素、钙、镁、磷等元素，可以作为骨关节保健营养丰富的功能性原料。
3.蛋膜多肽粉产品的分子量测定
采用高效凝胶过滤色谱法测定蛋膜多肽粉的相对分子质量分布。此方法以多孔性填料为固定相，依据样品组分相对分子量大小的差别进行分离，在肽键的紫外吸收波长220nm条件下检测，使用凝胶色谱法测定相对分子质量分布。实验采用Waters 600高效液相色谱仪(配有紫外检测器和GPC数据处理软件)测量蛋膜蛋白肽分子量分布，色谱柱为TSKgel 2000SWXL 300mm×7.8nm。吸取样品10mg于10mL容量瓶中，用流动相乙腈/水/三氟乙酸(20/80/0.1)定容，然后用微孔过滤膜过滤后进样，其中柱温为室温，流速选择0.5m L/min，在220nm下检测，检测结果见图1。
经过酸-还原剂-酶法耦合处理得到的壳膜多肽产品，采用GPC检测分子量分布范围，结果见图1，可知蛋膜多肽分子量主要集中在10kd以内，产品易吸收，富含水溶性弹性蛋白、胶原蛋白、水溶性角蛋白、小分子多肽等关节营养物质。
4.通过本发明得到的多肽提取物的抗氧化性检测
现有研究表明，自由基可抑制软骨基质蛋白多糖的合成，促进基质中蛋白多糖和胶原的降解，有损伤关节软骨细胞作用。因此产品如果具有清除自由基的抗氧化性，就可以消除自由基对软骨细胞损伤，从源头治理自由基对骨关节的伤害。
采用本专利技术制备的鸡蛋壳膜多肽粉对羟基自由基的清除率进行了测定，图2显示了不同壳膜多肽浓度的羟基自由基清除率测定结果。由图2可知，随着蛋膜多肽浓度不断增大，对羟基自由基的清除率逐渐增加。浓度仅为0.01g/mL时本技术方法生产的蛋膜多肽粉的清除率即达到74.19％。因此，鸡蛋壳膜多肽提取物可有效清除机体内的自由基，降低自由基对软骨细胞损伤，从而具有良好的关节保健效果。
5.结合本发明的以蛋膜多肽粉和蛋壳有机钙粉为原料制备的关节保健产品，对改善骨骼与关节健康的机理进行说明
蛋壳有机钙粉：钙是人体骨质形成的必需元素，对骨质健康有重要作用。补充钙剂是改善骨骼健康的基础治疗途径。蛋壳含90％以上的碳酸钙，是一种天然生物活性钙来源，重金属含量低，富含镁、磷、蛋白质等营养成分。由于碳酸钙不溶于水、吸收消耗胃酸、直接吸收效果差、吸收率仅为38％、不适合长期补钙服用，通过本技术方法可有效将蛋壳中无机钙转化为易吸收的有机钙——醋酸钙或乳酸钙，吸收不受胃酸影响，人体吸收率高达78％以上，作为长期使用的钙增补剂不会引起肾与尿道结石，更利于肠胃功能较弱的中老年骨关节炎患者使用。本技术方法制备的蛋壳有机钙粉，除醋酸钙外，还含有镁、磷、氨基酸等营养元素(见表3)，对人体钙元素吸收起到协同增效作用，强壮骨密度，提高骨关节健康。
胶原蛋白：胶原蛋白具有提高骨韧性、帮助钙沉积在骨骼、粘合氨糖健康关节的作用。
粘多糖：蛋壳膜粘多糖包含葡萄糖醛酸、透明质酸、硫酸软骨素等成分，是骨关节的重要营养成分。
氨糖：是形成软骨细胞的重要营养素，是健康关节软骨的天然组织成份。合成胶原蛋白和透明质酸，修复磨损关节软骨，生成新关节软骨和滑膜，恢复关节部位的正常生理功能。氨糖是医学界唯一认可的对骨关节疾病具有改善作用的营养保健品，是唯一可以恢复骨关节中已破坏的蛋白多糖生物合成的药物，并能阻止骨关节炎的发作。
硫酸软骨素：主要是医学上用于治疗关节炎、防治动脉粥样硬化、构建生物膜等。
透明质酸：是软骨基质的成分之一，是一种安全有效的治疗骨关节疾病的药物，具有覆盖、润滑、缓冲关节软骨应力；减轻炎症关节内反应；促进内源性透明质酸分泌的作用。
因此以本技术方法生产的蛋膜多肽粉和蛋壳有机钙粉复配制备的组合物具有骨关节保健和修复效果。
实施例1：蛋壳膜处理制备蛋膜多肽粉和蛋壳有机钙粉
a、蛋壳原料的制备：将带有壳膜的新鲜禽蛋打破，蛋液留待他用，得到的蛋壳经清洗、消毒、烘干后粉碎，过40目筛得到蛋壳粉；
b、酸处理：将上述步骤a中得到的蛋壳粉50kg，按10wt％的比例添加至6mol/L的醋酸溶液中，在60℃条件下，搅拌充分反应至无气泡产生；
c、过滤：将上述步骤b中反应后的溶液过滤，得到滤液A和滤渣B，用水或稀碱溶液将滤渣B洗至中性；
d、制备多肽粉：取上述步骤c中洗至中性的滤渣B，依次加入滤渣B质量20倍的纯水或缓冲液、相对滤渣B为15wt％的半胱氨酸以及相对滤渣B为15wt％的木瓜蛋白酶，充分搅拌之后反应3h，然后干燥，即可得到产物蛋膜多肽粉；
e、制备蛋壳有机钙粉：向上述步骤c中得到的滤液A中加入氢氧化钙溶液，充分反应后，喷雾干燥，得到蛋壳有机钙粉。
实施例2：关节保健咀嚼片的制备
1)制备关节保健组合物：将分别制备的蛋壳有机钙粉和蛋膜多肽粉按1:4比例称量后混合均匀后，即可得到关节保健组合物。关节保健组合物1kg的成分如表4所示：
表4关节保健组合物的成分
| 产品成分 | 蛋壳醋酸钙 | 蛋白多肽 | 粘多糖 | 胶原蛋白 | 透明质酸 |
| 含量(g) | 194 | 321 | 49 | 31 | 1.04 |
2)关节保健咀嚼片的制备：取步骤1)中制备的关节保健组合物75份，添加壳寡糖5份、水果粉5份、维生素D 0.01份、吡咯烷酮5份，微晶纤维素5份，麦芽糊精5份、低聚麦芽糖5份，经混合、制粒、干燥、整粒、压片工艺制备，每片2g。该片剂每片含钙元素68.5mg、480mg蛋白多肽、46.5mg胶原蛋白、73.5mg粘多糖，骨关节健康所需的营养元素全面，建议需要骨关节保健中老年人群食用量为每次2片，每日3次。食用者无需再食用钙片，可同时保护骨骼与关节健康，具有防止、延缓骨质疏松、防止关节炎、修复关节保护膜、改善关节灵活性、抗氧化、减少自由基产生的功效。
安全性毒理实验如下：
检测样品：蛋膜水解粉(本发明专利具体实施例1的蛋膜多肽粉)
生产方法：酸-还原-酶解耦合方法
检测依据：15193.3-2014
检测项目：急性经口毒性试验
检测环境：屏障环境动物房，使用许可证号：SYXK(浙)2016-0012，室温21.4℃～23.3℃，相对湿度45.7％～59.8％
试验动物：ICR小鼠，清洁级，由浙江省实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(浙)2014-0001
动物数/性别：20只，雌雄各半
样品制备：称取12.5012g样品置于烧杯中，加入玉米油混匀，倒入50mL容量瓶内，加入玉米油定容至刻度线，充分摇匀后倒入试剂瓶标识备用，样品现配现用。
试验方法：采用最大限量法，灌胃剂量为10000.96mg/kg(一日染毒两次，两次剂量合并作为一次剂量计算)；染毒前动物禁食4小时。试验开始后，对动物用经口灌胃法一次染毒，染毒后继续禁食1h，观察并记录染毒过程和观察期内动物的中毒和死亡情况，观察周期14d，观察期结束后，处死存活动物并进行大体解剖。
结果：实验动物在染毒14天内未见任何中毒症状和中毒死亡，雌性动物的体重未见异常，实验观察结束后，对受试动物进行大体解剖检查也未见异常变化。
结论：蛋膜多肽粉对ICR小鼠经口LD50＞10000.96mg/kg，根据急性毒性分级，蛋膜水解粉为实际无毒级。
表5急性经口毒性试验结果
增加骨质密度实验如下：
检测样品：骨关节保健组合物(蛋壳有机钙粉和蛋膜多肽粉按1：4混匀)、蛋壳有机钙粉(醋酸钙)、市售食品级碳酸钙
试验动物：雌性SD大鼠46只，5周龄，90±10g清洁级，由湖北省武汉市疾病控制中心提供
饲养环境：温度20±2℃，湿度为60±5％，12h昼夜交替
动物基础饲料：动物基础饲料配方为10.0％酪蛋白，15.0％黄豆粉，54.0％小麦面粉，4.0％花生油，2.0％纤维素，2.6％混合矿物盐，1.0％混合维生素，0.2％氯化胆碱，0.2％DL-蛋氨酸，11.0％淀粉，调整钙含量为150mg/100g饲料(基础饲料钙水平为0.15％)。用此低钙饲料配方配制各受试物组。
试验分组：低钙组作为对照组；第一组，骨关节保健组合物(100g含钙4.9g)；第二组，蛋壳有机钙粉(100g含钙25.3g)；第三组，市售食品级碳酸钙(100g含钙40g)。比较其在大鼠体内吸收利用度，补钙剂量以正常大鼠饲料钙水平0.8％～1.8％为依据，本试验选择大鼠饲料钙水平为1.0％，由于基础饲料钙水平为0.15％，那么补钙剂钙水平为0.85％。设定三类钙剂在基础配料中的添加量分别为：17.3g、3.36g、2.13g。测定结果见表6。
表6大鼠股骨密度测定
试验结果：采取X射线法测定骨密度，结果表明第一组骨关节保健组合物摄入组大鼠骨密度显著高于其他组别，第二组蛋壳有机钙摄入组别大鼠略高于第三组市售碳酸钙组别，低钙组大鼠的骨密度显著低于其他所有组别。检测数据见下表。
结论：采用蛋壳有机钙与蛋壳膜多肽复配制备的骨关节保健组合物，可显著增加大鼠的骨密度。
病例如下：
病例一：陈XX，女，65岁，2015年8月就诊，主述反复左膝关节疼痛，活动受限5年，自述5年前开始出现左膝关节反复疼痛，劳累时加重，休息后可缓解，由于病情较轻没特殊治疗，1年前出现左下肢放射痛，伴左下肢乏力、活动受限，晨起出现左膝关节僵硬，休息不能缓解，进行X光提示“左膝骨关节炎”。服用本发明专利实施例2中的骨关节保健产品两个月后，疼痛明显减轻，至今未复发。
病例二：张XX，男，67岁，患有退化性软骨和骨刺疾病，膝盖关节严重疼痛，以致无法行动，服用本发明实施例2的骨关节保健组合物连续一年，服用量为每日2次，每次3片。服用3个月后，疼痛明显减轻，继续巩固服用两个月后，软骨组织逐渐增生、无明显的骨刺，疼痛感逐渐消失，至今未复发。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明所举的较佳实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明的基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (6)
1.一种提取禽蛋壳膜多肽并制备骨关节保健品的方法，其特征在于，所述提取禽蛋壳膜多肽的方法包括以下步骤：
a、蛋壳原料的制备：将新鲜禽蛋打破，蛋液留待他用，得到带蛋膜的蛋壳经清洗、消毒、烘干后粉碎，过40-200目筛得到蛋壳粉；
b、酸处理：将上述步骤a中得到的蛋壳粉按1-50wt％添加至6mol/L的有机酸溶液中，在40-60℃条件下，搅拌充分反应至无气泡产生；
c、过滤：将上述步骤b中反应后的溶液过滤，得到滤液A和滤渣B，用水或稀碱溶液将滤渣B洗至中性；
d、制备多肽粉：取上述步骤c中洗至中性的滤渣B，依次加入滤渣B质量5-30倍的纯水或缓冲液、相对滤渣B为15wt％的还原剂以及相对滤渣B为0.1-30wt％的蛋白酶，充分搅拌之后反应1-5h，然后干燥，即可得到产物蛋膜多肽粉；
所述制备骨关节保健品的方法包括如下步骤：
1)制备有机钙粉：向上述步骤c中得到的滤液A中加入氢氧化钙溶液中和，然后烘干、粉碎，得到蛋壳有机钙粉；
2)制备关节保健组合物：将上述步骤1)中得到的蛋壳有机钙粉和上述步骤d中得到的蛋膜多肽粉按照质量比为1:1-1:20的比例混合，即可得到关节保健组合物；
3)骨关节保健品的制备：取上述步骤2)中得到的关节保健组合物10-80质量份，再依次加入壳寡糖1-15质量份、维生素D 0.001-0.01质量份、果蔬粉1-10质量份、吡咯烷酮1-10质量份、微晶纤维素5-10质量份、麦芽糊精5-20质量份和甜味剂0.1-0.3质量份，充分混合，然后经制粒、干燥和压片工艺，得到骨关节保健品；
上述步骤b中的有机酸为醋酸、乳酸或柠檬酸中的一种或多种；
上述步骤d中所用的还原剂为亚硫酸钠、赖氨酸、L-半胱氨酸、谷胱甘肽和半胱氨酸中一种或多种。
2.如权利要求1所述的提取禽蛋壳膜多肽并制备骨关节保健品的方法，其特征在于，上述步骤d中所用的蛋白酶为木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶或中性蛋白酶中的一种或多种，其添加量为相对滤渣B质量的15wt％。
3.如权利要求1所述的提取禽蛋壳膜多肽并制备骨关节保健品的方法，其特征在于，上述步骤d中的干燥方式为喷雾干燥、真空干燥或冷冻干燥。
4.如权利要求1所述的提取禽蛋壳膜多肽并制备骨关节保健品的方法，其特征在于，上述步骤a中使用的新鲜禽蛋为鸡蛋。
5.如权利要求1所述的提取禽蛋壳膜多肽并制备骨关节保健品的方法，其特征在于，在上述步骤2)中，蛋壳有机钙粉和蛋膜多肽粉按照质量比为1:6的比例混合。
6.如权利要求1所述的提取禽蛋壳膜多肽并制备骨关节保健品的方法，其特征在于，在上述步骤3)中，取关节保健组合物80质量份，再依次加入壳寡糖15质量份、维生素D 0.01质量份、果蔬粉10质量份、吡咯烷酮10质量份、微晶纤维素10质量份、麦芽糊精20质量份和甜味剂0.3质量份，充分混合，然后经制粒、干燥和压片工艺，得到骨关节保健品。
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