CN103059043A - 伸筋草碱a-c、其制法和其药物组合物与用途 - Google Patents

Abstract

伸筋草碱A-C、其制法和其药物组合物与用途。本发明涉及从伸筋草(Lycopodium japonicum Thunb.)中分离得到的3个生物碱(伸筋草碱A-C)，其药效学上可接受的盐，及其制备方法，含有这类化合物的药物组合物，以及这类化合物在制备乙酰胆碱酯酶抑制剂药物中、在制备治疗早老性痴呆症药物中和制备抗中老年记忆和认知能力减退疾病药物中的应用。

Description

伸筋草碱A-C、其制法和其药物组合物与用途

技术领域

本发明属于药物技术领域，具体而言，本发明涉及一类石松生物碱化合物：伸筋草碱A-C(1-3)，其药效学上可接受的盐，其制备方法，含有这类化合物的药物组合物，以及这类化合物在制备乙酰胆碱酯酶抑制剂药物中、在制备治疗早老性痴呆症药物中和制备抗中老年记忆和认知能力减退疾病药物中的应用。 

背景技术

随着世界人口平均寿命的逐年增加，老年性痴呆症的发病率也随着迅速上升，老年痴呆症中有50％-70％为阿尔兹海默氏病(AD)，又称早老性痴呆症，患者的脑功能逐渐衰退，出现记忆力、抽象思维能力和语言表达能力减退、行动不便和其他功能性障碍，影响神经系统功能，不仅给患者带来痛苦，而且也给家庭和社会带来许多问题。AD是一种以进行性认知和记忆力损伤为主的中枢神经系统退行性疾病，在发达国家成为继心血管病和肿瘤之后引起死亡的主要疾病。治疗AD的药物主要有胆碱能类药物、神经细胞代谢增强剂、抗氧化剂、钙离子拮抗剂、神经生长因子、雌激素、抗炎药、抗β淀粉样蛋白药物等。目前临床上治疗该病最成功的方法就是通过提高中枢神经系统内胆碱能神经递质-乙酰胆碱的水平，改善AD病人的症状。乙酰胆碱酯酶抑制剂(AChEI)通过针对性地抑制乙酰胆碱酯酶(AChE) 对乙酰胆碱的水解作用而提高脑内的乙酰胆碱水平，成为治疗AD的一线药物。临床上有效的药物如他克林、安理申、艾斯能、加兰他敏和石杉碱甲均为乙酰胆碱酯酶抑制剂。而著名的天然产物石杉碱甲是从中国特有蕨类植物千层塔(蛇足石杉，Huperzia serrata(Thunb)Trev.，石杉科(Huperziaceae))中提取的一种生物碱，为可逆性胆碱酯酶专一性抑制剂，对乙酰胆碱酯酶具有选择性抑制作用，而且毒性低，作用时间长，目前已被开发成治疗良性记忆障碍和早老性痴呆最为安全有效的药物之一，也是中国首创的一种世界级新药，其成功开发也使我们看到了从天然产物中寻找新型活性成分并进行新药研制的希望。 

伸筋草(石松，Lycopodium japonicum Thunb.)为石松科(Lycopodiaceae)石松属植物，为我国常用传统中药，主要功效为祛风除湿、舒筋活络，用于关节酸痛，屈伸不利。民间及临床使用发现伴有增强心肌收缩力、兴奋平滑肌、引起肌肉收缩抽搐等胆碱能副反应，暗示其中可能含有对胆碱能系统有作用的化学成分。本发明技术方案试图对伸筋草中的微量生物碱类成分进行深入研究，期望发现结构新颖，具有乙酰胆碱酯酶抑制作用的天然活性成分。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一类新结构类型的化合物：伸筋草碱A-C(1-3)及其药效学上可接受的盐。 

本发明的另一个方面涉及化合物伸筋草碱A-C(1-3)的制备方法。 

本发明又一个方面又涉及一种药物组合物，其包括药物有效剂量的、作为活性成分的化合物伸筋草碱A-C(1-3)及制药领域中常用的载体。 

本发明再一个方面涉及化合物伸筋草碱A-C(1-3)及其组合物在制备乙酰胆碱酯酶抑制剂药物中、在制备治疗早老性痴呆症药物中、和制备抗中老年记忆和认知能力减退疾病药物中的应用。 

本发明化合物的药物组合物可根据本领域公知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将本发明化合物与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为药物使用的适当的施用形式或剂量形式。 

本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、腹腔注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等，优选口服给药。 

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等。固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、 含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。 

本发明化合物可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。 

为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二丙醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。 

还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。 

为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀 粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、月桂酸聚乙二醇甘油酯、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄耆胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。 

为了将给药单元制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。 

为了将给药单元制成胶囊，将有效成分本发明化合物伸筋草碱A-C(1-3)与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。 

例如，将本发明化合物伸筋草碱A-C(1-3)制成注射用制剂，如溶液剂、混悬剂溶液剂、乳剂、冻干粉针剂，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂。如稀释剂可选自水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。这些辅料是本领域常用的。 

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。 

为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可 用任何公知的给药方法给药。 

本发明化合物药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重、性格及个体反应，给药途径、给药次数、治疗目的，因此本发明的治疗剂量可以有大范围的变化。一般来讲，本发明中药学成分的使用剂量是本领域技术人员公知的。可以根据本发明化合物组合物中最后的制剂中所含有的实际药物数量，加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求，完成本发明的预防或治疗目的。本发明化合物的每天的合适剂量范围为0.001～10mg/Kg体重，分2-4次服用。本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用并调整剂量。 

术语与简称 

AChE     乙酰胆碱酯酶 

ESI-MS   电喷雾质谱 

HMBC     异核多键相关(一种测定分子中远程氢碳连接关系的二维核磁共振谱) 

HPLC     高效液相色谱 

HRESI-MS 高分辨电喷雾质谱 

HSQC     异核单量子相关(一种测定分子中氢碳直接相连关系的二维核磁共振谱) 

IC₅₀     半数抑制剂量 

IR       红外光谱 

NMR      核磁共振 

ROESY    旋转坐标系欧沃豪斯增益谱(一种测定分子中氢原子空间位置临近关系的二维核磁共振谱) 

UV       紫外光谱 

附图说明

图1伸筋草的提取分离及伸筋草碱A-C(1-3)的制备流程图 

图2伸筋草碱A-C(1-3)的X-ray单晶衍射结果(分子椭球图) 

具体实施方式

据文献报道，石松科植物主要含有石松生物碱、萜类、有机酸、黄酮和蒽醌等成分，而伸筋草作为一种常见的石松科植物，其生物碱类成分由于含量较低而没有进行深入彻底的研究。本发明人通过加大药材用量，针对该药材提取物的生物碱部位，通过正、反相色谱等分离手段得到具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的三个活性化合物，并经多种波谱数据及X-ray单晶衍射确证其化学结构为前人未报道过的具有新颖骨架的三个石松生物碱类化合物。下面的实施例及药物活性实验用来进一步说明本发明，但这并不意味着对本发明的任何限制。 

实施例1伸筋草碱A-C(1-3)的分离及结构表征 

伸筋草全草约100Kg，切成小段，用95％EtOH(乙醇，1200L)回流提取3次，第一次3小时，后两次每次2小时。提取液减压浓缩得到浸膏18Kg(记作A)，将浸膏溶于3％酒石酸水溶液(pH＝2，150L)，滤去不溶物(记作E，5Kg)后再用乙酸乙酯(3次，每次150L)萃取。萃取后的酸水用饱和碳酸氢钠溶液(18L)调pH至10，氯仿萃取至氯仿层无生物碱反应为止(4次，每次150L)，氯仿层浓缩得总生物碱135g(记作B)。总生物碱经碱性硅胶柱(200-300目，pH 8-9)色谱，用石油醚∶丙酮＝20∶1，10∶1，5∶1，1∶1，0∶1，丙酮∶甲醇＝20∶1，5∶1， 0∶1洗脱，每个梯度洗脱18000ml，每1000ml接收1个流份，各流份减压回收溶剂后经TLC(石油醚∶丙酮∶二乙胺＝1∶1∶0.1)检识，根据主斑点予以合并，得到B1～B9九个组分。组分B3(8.7g)经硅胶柱(200-300目，pH 6-7)色谱，采用石油醚∶乙酸乙酯∶二乙胺＝10∶1∶0.1，8∶1∶0.1，6∶1∶0.1，4∶1∶0.1，2∶1∶0.1，1∶1∶0.1梯度洗脱，每个梯度洗脱1500ml，每100ml接收1个流份，各流份回收溶剂后经TLC(石油醚∶乙酸乙酯∶二乙胺＝1∶1∶0.1)检识合并得到B3-1～B3-9九个组分，B3-3组分(2.65g)再经凝胶Sephadex LH-20(二氯甲烷∶甲醇＝1∶1)纯化及制备型HPLC(Shimadzu LC-6AD型制备液相仪，YMC-packODS-A色谱柱(250×20mm，5μm)，洗脱条件：乙腈/醋酸铵缓冲液(0.04mol/L醋酸铵+0.1％醋酸)＝15/85，5ml/min，t_R＝27min)分离得到化合物3(33mg)；组分B7(34.0g)经硅胶柱(200-300目，pH 6-7)色谱，采用石油醚∶乙酸乙酯∶二乙胺＝8∶1∶0.1，5∶1∶0.1，3∶1∶0.1，1∶1∶0.1，1∶2∶0.2梯度洗脱，每个梯度洗脱6000ml，每500ml接收1个流份，各流份回收溶剂后经TLC(石油醚∶乙酸乙酯∶二乙胺＝1∶2∶0.1)检识合并得到B7-1～B7-13十三个组分，B7-9(2.10g)组分再经硅胶柱(200-300目，pH 6-7)色谱，采用二氯甲烷∶甲醇＝60∶1，40∶1，20∶1，10∶1，5∶1梯度洗脱，经TLC(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)检识合并得到B7-9a～B7-9g七个组分，B7-9c(0.21g)由制备型TLC(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)得到化合物2(30mg)；B7-10(1.34g)组分经硅胶柱(200-300目，pH 6-7)色谱，采用二氯甲烷∶甲醇＝1∶0，40∶1，30∶1，20∶1梯度洗脱，经TLC(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)检识合并得到B7-10a～B7-10e 五个组分，B7-10a组分放置过程中有针状结晶析出，用丙酮洗涤得白色结晶即化合物1(40mg)。提取分离的流程图如附图1所示。 

伸筋草碱A-C(1-3)的结构式及鉴定方法 

伸筋草碱A-C(1-3)的波谱数据和理化性质 

1.伸筋草碱A(1) 

无色透明结晶，mp.223-225℃； 

UV(MeOH)：λ _max＝203，300nm；IR：v_max＝3371，2967，2928，1736，1697，1488，1454，1415，1378，1257，1138，910，856，612，587，544cm^-1；(+)ESI-MS：m/z＝292.1[M+H]⁺；HR-ESI-MS：m/z＝292.1545[M+H]⁺(计算为C₁₆H₂₁NO₄)；¹H NMR和¹³C NMR数据见表1。 

2.伸筋草碱B(2) 

无色透明结晶，mp.175-177℃； UV(MeOH)：λ _max＝202，259，300nm；IR：v_max＝3460，3319，2921，2850，1700，1646，1465，1416，1279，1095，1080，848，787，581，547cm^-1；(+)ESI-MS：m/z＝294.2[M+H]⁺；HR-ESI-MS：m/z＝294.1703[M+H]⁺(计算为C₁₆H₂₃NO₄)；¹H NMR和¹³C NMR数据见表1。 

3.伸筋草碱C(3) 

无色透明结晶，mp.147-149℃； 

UV(CHCl₃)：λ _max＝241nm；IR：v_max＝2981，2956，2938，2773，1726，1657，1442，1384，1262，1203，1159，1121，1069，885cm^-1；(+)ESI-MS：m/z＝274.2[M+H]⁺；HR-ESI-MS：m/z＝274.1809[M+H]⁺(计算为C₁₇H₂₃NO₂)；¹H NMR和¹³C NMR数据见表1。 

表1.化合物1-3的¹HNMR(500MHz)和¹³CNMR(125MHz)数据(δin ppm，J in Hz) 

a氘代吡啶    b氘代氯仿 

药理实验 

试验例1伸筋草碱A-C(1-3)的AChE抑制活性测定 

实验原理： 

乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AChE)水解乙酰胆碱生成胆碱及乙酸，胆碱可以与巯基显色剂反应生成TNB(对称三硝基苯，Sym-Trinitrobenzene)黄色化合物，根据颜色深浅进行比色定量，水解产物胆碱的数量可以反映胆碱酯酶的活力。 

实验材料及所需仪器： 

酶标仪，水浴箱，微量移液器，乙酰胆碱酯酶测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)，试剂组成包括：试剂一：1μmol/L标准应用液；试剂二：底物；试剂三：显色剂储备液；试剂四：抑制剂；试剂五：透明剂；试剂六：稳定剂；试剂七：生理盐水。 

操作步骤： 

混匀，放置15分钟，412nm下酶标仪测定吸光度。 

抑制率＝[1-(测定管OD值-对照管OD值)/(标准管OD值-空白管OD值)]×100％ 

选用石杉碱甲为阳性对照，其浓度为其IC₅₀浓度8.2×10^-8mol/L，在化合物与标准应用液的混合液中化合物的终浓度分别为10^-5，10^-6，10^-7mol/L。 

测定结果： 

从上述药理活性研究结果来看，伸筋草A-C(1-3)均具有显著的乙酰胆碱酯酶抑制活性，其活性与阳性对照药石杉碱甲(HupA)相当或更强，是很有价值的新颖结构化合物。 

Claims (7)

1.如下式式2和式3所示的伸筋草碱(A-C)及其药效学上可接受的盐

2.一种药物组合物，其特征在于，含有有效剂量的伸筋草碱A-C(1-3)或其药效学上可接受的盐，以及药效学上可以接受的载体。

3.根据权利要求2的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物可以是片剂、胶囊、丸剂、注射剂、缓释制剂、控释制剂或微粒给药系统。

4.权利要求1化合物伸筋草碱A-C的制备方法，其主要来源于蕨类植物伸筋草(Lycopodium japonicum Thunb.)的全草。

5.权利要求1化合物伸筋草碱A-C及其药效学上可接受的盐在制备乙酰胆碱酯酶抑制剂药物中的应用。

6.权利要求1化合物伸筋草碱A-C及其药效学上可接受的盐在制备治疗早老性痴呆症药物中的应用。

7.权利要求1化合物伸筋草碱A-C及其药效学上可接受的盐在制备抗中老年记忆和认知能力减退疾病药物中的应用。

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