CN102834509A - 生成哺乳动物样复合n-聚糖的酵母菌株 - Google Patents

Abstract

本文中描述了可用于生成含有哺乳动物样复合N-聚糖或含有哺乳动物糖基化途径中的中间体的靶分子的方法和经工程化改造的真菌细胞。

Description

生成哺乳动物样复合N-聚糖的酵母菌株

对相关申请的交叉引用

本申请要求2009年11月19日提交的美国申请流水号61/262,828的优先权。在先申请的公开内容通过提及而完整收录。

发明领域

本发明涉及用于在真菌细胞中生成糖蛋白的方法和材料，且更具体而言，涉及生成含有哺乳动物样复合N-聚糖的蛋白质或含有哺乳动物糖基化途径内的中间体的蛋白质的遗传工程真菌细胞。

发明背景

需要高效表达系统来生产目前开发下的大多数生物药物(例如，重组蛋白)。许多这些生物药物的生物学活性依赖于其翻译后修饰(例如，磷酸化或糖基化)。基于酵母的表达系统组合易于遗传操作与具有分泌并修饰蛋白质的能力的微生物生物体的发酵。然而，酵母细胞中生成的重组糖蛋白主要展现出异源高甘露糖和高甘露糖聚糖结构，其对于蛋白质功能、下游加工、及随后的治疗性用途，特别地在糖基化发挥生物学重要作用的情况中可以是不利的。

发明概述

可以使用本文中所描述的方法和遗传工程真菌细胞来生产靶分子(例如，靶蛋白)，其含有哺乳动物样N-聚糖或含有哺乳动物(例如人)糖基化途径内的中间体。自此类工程化改造细胞分离的靶分子可以用于生物药物应用，包括抗体生产、细胞因子生产，及用于治疗代谢病症诸如溶酶体贮积病。

在一方面，本文件的特征在于一种生成能够生成包含GlcNAcMan₅GlcNAc₂N-聚糖的蛋白质的真菌细胞(例如，解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)或陆地酵母(Arxula adeninivorans))的方法。该方法包括提供遗传工程化改造为生成包含Man₅GlcNAc₂ N-聚糖的蛋白质的真菌细胞；并将编码GlcNAc转移酶I的核酸导入细胞中，其中所述核酸包含编码将编码的GlcNAc转移酶I靶向至胞内区室(例如，高尔基体)的靶向序列的核苷酸序列，其中GlcNAc转移酶I在真菌细胞中的表达生成包含GlcNAcMan₅GlcNAc₂ N-聚糖的蛋白质。该方法可以进一步包括将编码靶蛋白的核酸导入细胞中，其中所述细胞生成修饰为包含GlcNAcMan₅GlcNAc₂ N-聚糖的靶蛋白。靶蛋白可以结合Fc受体。靶蛋白可以是抗体或其片段。靶蛋白可以是治疗性糖蛋白。靶蛋白可以是干扰素-β、GM-CSF、干扰素γ、或促红细胞生成素。

遗传工程化改造为生成含有Man₅GlcNAc₂ N-聚糖的蛋白质的真菌细胞可以是OCH1活性缺陷的，并且包括编码α-1，2-甘露糖苷酶的核酸，其中编码α-1，2-甘露糖苷酶的核酸包括编码将编码的α-1，2-甘露糖苷酶靶向至内质网的靶向序列的核苷酸序列。靶向序列可以是HDEL序列。

所述方法可以进一步包括将编码甘露糖苷酶II的核酸导入细胞中，其中编码甘露糖苷酶II的核酸包括编码将编码的甘露糖苷酶II靶向至高尔基体的靶向序列的核苷酸序列，其中甘露糖苷酶II在真菌细胞中的表达生成含有GlcNAcMan₃GlcNAc₂ N-聚糖的蛋白质。

所述方法可以进一步包括将编码半乳糖基转移酶的核酸导入细胞中，其中编码半乳糖基转移酶的核酸包含编码将编码的半乳糖基转移酶靶向至高尔基体的靶向序列的核苷酸序列，其中所述半乳糖基转移酶在真菌细胞中的表达生成含有GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂或GalGlcNAcMan₃GlcNAc₂ N-聚糖的蛋白质。半乳糖基转移酶可以是UDP-Glc-4-差向异构酶和β-1，4-半乳糖基转移酶I的催化域的融合物。此方法可以进一步包括将编码靶蛋白的核酸导入细胞中，其中所述细胞生成修饰为含有GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂或GalGlcNAcMan₃GlcNAc₂ N-聚糖的靶蛋白。该方法可以包括分离修饰为含有GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂或GalGlcNAcMan₃GlcNAc₂ N-聚糖的靶蛋白。

在另一方面，本文件的特征在于一种生成含有GlcNAcMan₃GlcNAc₂ N-聚糖的靶蛋白的方法。该方法包括提供遗传工程化改造为包含编码GlcNAc转移酶I、α-1，2-甘露糖苷酶、和甘露糖苷酶II的核酸的真菌细胞(例如，解脂耶氏酵母或陆地酵母)，其中所述核酸编码靶向序列的核苷酸序列，或编码多种靶向序列的多种核苷酸序列，所述靶向序列将每种编码的蛋白质靶向至胞内区室，其中所述真菌细胞是OCH1活性缺陷的；并将编码靶蛋白的核酸导入细胞中，其中所述细胞生成含有GlcNAcMan₃GlcNAc₂ N-聚糖的靶蛋白。编码α-1，2-甘露糖苷酶的核酸可以包含将编码的α-1，2-甘露糖苷酶靶向至内质网的内质网靶向序列。例如，靶向序列可以是HDEL序列。编码GlcNAc转移酶I和甘露糖苷酶II的核酸可以包含高尔基靶向序列、或多种高尔基靶向序列，其将编码的GlcNAc转移酶I和甘露糖苷酶II靶向至高尔基体。靶蛋白可以结合Fc受体。靶蛋白可以是抗体或其片段。靶蛋白可以是治疗性糖蛋白。靶蛋白可以是干扰素-β、GM-CSF、干扰素γ、或促红细胞生成素。

在一些实施方案中，所述方法可以进一步包括将编码半乳糖基转移酶的核酸导入细胞中，其中编码半乳糖基转移酶的核酸包含编码将编码的半乳糖基转移酶靶向至高尔基体的靶向序列的核苷酸序列，其中半乳糖基转移酶在真菌细胞中的表达生成修饰为含有GalGlcNAcMan₃GlcNAc₂ N-聚糖的靶蛋白。可以自真菌细胞分离修饰为含有GalGlcNAcMan₃GlcNAc₂ N-聚糖的靶蛋白。

本文件的特征还在于一种生成能够生成含有GlcNAcMan₃GlcNAc₂ N-聚糖的蛋白质的真菌细胞(例如，解脂耶氏酵母或陆地酵母)的方法。该方法包括提供遗传工程化改造为生成含有Man₃GlcNAc₂ N-聚糖的蛋白质的真菌细胞；并将编码GlcNAc转移酶I的核酸导入细胞中，其中所述核酸包含编码将编码的GlcNAc转移酶I靶向至胞内区室(例如，高尔基体)的靶向序列的核苷酸，其中GlcNAc转移酶I在真菌细胞中的表达生成含有GlcNAcMan₃GlcNAc₂N-聚糖的蛋白质。该方法可以进一步包括将编码靶蛋白的核酸导入细胞中，其中所述细胞生成修饰为含有GlcNAcMan₃GlcNAc₂ N-聚糖的靶蛋白。靶蛋白可以结合Fc受体。靶蛋白可以是抗体或其片段。靶蛋白可以是治疗性糖蛋白。靶蛋白可以是干扰素-β、GM-CSF、干扰素γ、或促红细胞生成素。

遗传工程化改造为生成含有Man₃GlcNAc₂ N-聚糖的蛋白质的真菌细胞可以是ALG3活性缺陷的，并且包含编码α-1，2-甘露糖苷酶的核酸，其中所述核酸包含编码将编码的α-1，2-甘露糖苷酶靶向至内质网的靶向序列的核苷酸序列。此类真菌细胞可以进一步是OCH1活性缺陷的和/或进一步包括编码α-1，3-葡萄糖基转移酶(例如，ALG6)的核酸。

所述方法可以进一步包括将编码GlcNAc转移酶II的核酸导入细胞中，其中编码GlcNAc转移酶II的核酸包含编码将编码的GlcNAc转移酶II靶向至胞内区室的靶向序列的核苷酸序列，其中GlcNAc转移酶II在真菌细胞中的表达生成含有GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ N-聚糖的蛋白质。

所述方法可以进一步包括将编码半乳糖基转移酶的核酸导入细胞中，其中编码半乳糖基转移酶的核酸包含编码将编码的半乳糖基转移酶靶向至高尔基体的靶向序列的核苷酸序列，其中半乳糖基转移酶在真菌细胞中的表达生成含有GalGlcNAcMan₃GlcNAc₂或Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ N-聚糖的蛋白质。半乳糖基转移酶可以是UDP-Glc-4-差向异构酶和β-1，4-半乳糖基转移酶I的催化域的融合物。所述方法可以进一步包括将编码靶蛋白的核酸导入细胞中，其中所述细胞生成修饰为含有GalGlcNAcMan₃GlcNAc₂或Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ N-聚糖的靶蛋白。

所述方法可以进一步包括将编码葡萄糖苷酶II的α和β亚基的核酸导入细胞中，其中葡萄糖苷酶II的α和β亚基在真菌细胞中的表达生成包含GalGlcNAcMan₃GlcNAc₂或Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ N-聚糖的蛋白质。

本文件的特征还在于一种生成含有Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ N-聚糖的靶蛋白的方法。该方法包括提供遗传工程化改造为ALG3活性缺陷并包含编码GlcNAc转移酶I、GlcNAc转移酶II、和半乳糖基转移酶的核酸的真菌细胞，其中编码GlcNAc转移酶I、GlcNAc转移酶II、和半乳糖基转移酶的核酸包含编码靶向序列的核苷酸序列，或编码多种靶向序列的多种核苷酸序列，所述靶向序列将每种编码的蛋白质靶向至胞内区室(例如，高尔基体)；并将编码靶蛋白的核酸导入细胞中，其中所述细胞生成含有Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂N-聚糖的靶蛋白。真菌细胞可以进一步是OCH1活性缺陷的和/或进一步包含编码α-1，3-葡萄糖基转移酶诸如ALG6的核酸。真菌细胞可以进一步包含编码葡萄糖苷酶II的α和β亚基的核酸，其中葡萄糖苷酶II的α和β亚基在真菌细胞中的表达生成含有Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ N-聚糖的靶蛋白。

在另一方面，本文件的特征在于遗传工程化改造为生成含有GlcNAcMan₃GlcNAc₂ N-聚糖的蛋白质的分离的真菌细胞。真菌细胞可以是OCH1活性缺陷的，并且包含编码α-1，2-甘露糖苷酶、GlcNAc转移酶I、和甘露糖苷酶II的核酸，其中编码α-1，2-甘露糖苷酶、GlcNAc转移酶I、和甘露糖苷酶II的核酸包含编码靶向序列的核苷酸序列，或编码多种靶向序列的多种核苷酸序列，所述靶向序列将每种编码的蛋白质靶向至胞内区室，其中α-1，2-甘露糖苷酶、GlcNAc转移酶I、和甘露糖苷酶II在真菌细胞中的表达生成含有GlcNAcMan₃GlcNAc₂ N-聚糖的蛋白质。真菌细胞可以进一步包含编码靶蛋白的核酸，其中所述细胞生成修饰为含有GlcNAcMan₃GlcNAc₂ N-聚糖的靶蛋白。

在一些实施方案中，此类真菌细胞进一步包含编码GlcNAc转移酶II的核酸，其中编码GlcNAc转移酶II的核酸包含编码将编码的GlcNAc转移酶II靶向至胞内区室的靶向序列的核苷酸序列，其中GlcNAc转移酶II在真菌细胞中的表达生成含有GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ N-聚糖的蛋白质。

在一些实施方案中，此类真菌细胞进一步包含编码半乳糖基转移酶的核酸，其中编码半乳糖基转移酶的核酸包含编码将编码的半乳糖基转移酶靶向至高尔基体的靶向序列的核苷酸序列，其中半乳糖基转移酶在真菌细胞中的表达生成含有Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ N-聚糖的蛋白质。

在又一方面，本文件的特征在遗传工程化改造为生成含有GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ N-聚糖的蛋白质的分离的真菌细胞。将真菌细胞遗传工程化改造为ALG3活性缺陷的，并且包含编码GlcNAc转移酶I和GlcNAc转移酶II的核酸，其中编码GlcNAc转移酶I和GlcNAc转移酶II的核酸包含编码靶向序列的核苷酸序列，或编码多种靶向序列的多种核苷酸序列，所述靶向序列将每种编码的蛋白质靶向至胞内区室，其中GlcNAc转移酶I和GlcNAc转移酶II在真菌细胞中的表达生成含有GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ N-聚糖的蛋白质。遗传工程真菌细胞进一步可以是OCH1活性缺陷的和/或进一步包含编码α-1，3-葡萄糖基转移酶的核酸。遗传工程真菌细胞还可以包含编码靶蛋白的核酸，其中所述细胞生成修饰为含有GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ N-聚糖的靶蛋白。真菌细胞进一步可以包含编码葡萄糖苷酶II的α和β亚基的核酸，其中葡萄糖苷酶II的α和β亚基在真菌细胞中的表达生成含有GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ N-聚糖的蛋白质。真菌细胞进一步可以包含编码半乳糖基转移酶的核酸，其中编码半乳糖基转移酶的核酸包含编码将编码的半乳糖基转移酶靶向至高尔基体的靶向序列的核苷酸序列，其中半乳糖基转移酶在真菌细胞中的表达生成含有Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ N-聚糖的蛋白质。

本文件的特征在于解脂耶氏酵母细胞的基本上纯的培养物，大量的所述解脂耶氏酵母细胞被遗传工程化改造为生成含有Gal₂GlcNac₂Man₃GlcNAc₂N-聚糖的糖蛋白。将细胞工程化改造为ALG3活性缺陷的，并且包含编码GlcNAc转移酶I、GlcNAc转移酶II、和半乳糖基转移酶的核酸，其中编码GlcNAc转移酶I、GlcNAc转移酶II、和半乳糖基转移酶的核酸包含编码靶向序列的核苷酸序列，或编码多种靶向序列的多种核苷酸序列，所述靶向序列将每种编码的蛋白质靶向至胞内区室，其中GlcNAc转移酶I、GlcNAc转移酶II、和半乳糖基转移酶在细胞中的表达生成含有Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ N-聚糖的蛋白质。遗传工程真菌细胞进一步可以是OCH1活性缺陷的和/或进一步包含编码α-1，3-葡萄糖基转移酶(例如，ALG6)的核酸。细胞进一步可以包含编码葡萄糖苷酶II的α和β亚基的核酸，其中葡萄糖苷酶II的α和β亚基在细胞中的表达生成含有Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ N-聚糖的靶蛋白。

在另一方面，本文件的特征在于解脂耶氏酵母细胞的基本上纯的培养物，大量所述解脂耶氏酵母细胞被工程化改造为生成含有Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ N-聚糖的糖蛋白，其中将细胞工程化改造为OCH1活性缺陷的，并且包含α-1，2-甘露糖苷酶、GlcNAc转移酶I、甘露糖苷酶II、GlcNAc转移酶II、和半乳糖基转移酶的核酸，其中编码α-1，2-甘露糖苷酶、GlcNAc转移酶I、甘露糖苷酶II、GlcNAc转移酶II、和半乳糖基转移酶的核酸包括编码靶向序列的核苷酸序列，或编码多种靶向序列的多种核苷酸序列，所述靶向序列将每种编码的蛋白质靶向至胞内区室，其中α-1，2-甘露糖苷酶、GlcNAc转移酶I、甘露糖苷酶II、GlcNAc转移酶II、和半乳糖基转移酶在细胞中的核苷酸序列生成包含Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ N-聚糖的蛋白质。

本文件的特征还在于包含糖蛋白的组合物，其中糖蛋白上的至少50％(例如，至少70％或至少85％的N-聚糖是GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ N-聚糖。

除非另有定义，本文中所使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中所描述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料可以在本发明的实施或测试中使用，但是下文描述了例示性的方法和材料。通过提及而完整收录本文中提及的所有出版物、专利申请、专利、

登录号、和其它参考文献。在矛盾的情况中，应当以本申，包括定义为准。所述材料、方法和例子仅是例示性的，而并不意图为限制性的。

本发明的其它特征和优点从以下发明详述及权利要求书看会是显而易见的。

附图简述

图1A是Man₅GLcNAc₂和Man₃GlcNAc₂结构的示意图。

图1B是质粒pYlOCH1 PUT TOPO的示意图。

图2是一系列电泳图(electroferogram)，其描绘了对自pold lnuga解脂耶氏酵母野生型细胞或Δochl pold lnuga解脂耶氏酵母细胞获得的分泌性蛋白质的N-聚糖分析。在OCH1灭活后的主要N-聚糖变为Man₈GlcNAc₂。使用DNA测序仪辅助的、荧光团辅助的碳水化合物电泳(DSA-FACE)来实施分析。“M5，”“M6，”“M8，”和“M9，”指与基础N-乙酰葡糖胺结构缀合的甘露糖残基的数目。Y轴代表作为每个N-聚糖结构的量的指标的相对荧光单位。X轴代表每个N-聚糖结构通过毛细管的相对迁移率。顶部电泳图是作为迁移率标准品使用的右旋糖苷的分析。

图3是质粒pYLHUXdL2preManHDEL和pYLTUXdL2preManHDEL的示意图。

图4是一系列电泳图，其描绘了在将ManHDEL(＝加有HDEL标签的α-1，2-甘露糖苷酶)表达盒(在TEF1或Hp4d启动子控制下)导入菌株G014中后的N-聚糖概况。“Rd”代表经由图3中显示的载体上存在的zeta序列的“随机整合”。甘露糖苷酶表达后的主要N-聚糖是Man₅GlcNAc₂。自这些菌株之一(G018，见表2)消除URA3标志物不改变N-聚糖概况。

图5是质粒JME926 pPTLeu2-ADE2ex-Hp4dManHDEL(Yl)和OXYP289pPTAxp1-LEU2ex-Hp4dManHDEL(Yl)的构建策略的示意图。见关于载体pYLTmAXrGnTII构建的图23。

图6是一系列电泳图，其描绘了在通过LEU2或AXP1基因座中的靶向性整合(Tg)将ManHDEL(＝加有HDEL标签的α-1，2-甘露糖苷酶)表达盒(在Hp4d启动子控制下)导入菌株G014中后的N-聚糖概况。Man₅GlcNAc₂变为主要N-聚糖。

图7是在Kre2p的100个N端氨基酸与人GlcNAc转移酶I的催化域间的融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)和经耶氏酵母密码子优化的核苷酸序列(SEQ ID NO：4)的描绘。粗体：融合蛋白的Kre2p部分；普通字体：融合蛋白的GnT I部分；下划线：起始和终止密码子。

图8是用于质粒pYLTmAXhGnTI和pYLHp4mAXhGnTI的构建策略的示意图。

图9是一系列电泳图，其描绘了在通过用表达GnT I的载体转化将GnT I活性导入菌株G036中后的N-聚糖概况。“Rd”代表经由图8中显示的载体上存在的zeta序列的“随机整合”。表达GnT I活性后的主要N-聚糖是GlcNAcMan₅GlcNAc₂。用α-1，2-甘露糖苷酶的体外处理不显著改变该概况，指示仅存在少量与Man₅GlcNAc₂不同的高甘露糖N-聚糖。体外己糖胺酶处理导致从GlcNAcMan₅GlcNAc₂向Man₅GlcNAc₂的转变。

图10是在Mnn2p的36个N端氨基酸与黑腹果蝇甘露糖苷酶II的催化域间的融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)和经耶氏酵母密码子优化的核苷酸序列(SEQ ID NO：8)的描绘。粗体：融合蛋白的Mnn2p部分；普通字体：融合蛋白的Man II部分；加下划线：起始和终止密码子。

图11是质粒pYLTmAXDmManII和pYLTmAXDmManII(LEU2ex)的构建策略的示意图。

图12是一系列电泳图，其描绘了在通过用Man II表达载体转化将Man II活性导入菌株G040中后的N-聚糖概况。“Rd”代表经由图11中显示的载体上存在的zeta序列的“随机整合”。在表达Man II活性后，出现具有较高电泳迁移率的新峰，以及在与Man₅GlcNAc₂几乎相同位置运行的“肩部”峰。体外己糖胺酶处理导致这些峰向上转变(紧靠观察到的从GlcNAcMan₅GlcNAc₂向Man₅GlcNAc₂的转变)，指示末端GlcNAc的存在，并且如此鉴定该峰为GlcNAcMan₃GlcNAc₂和GlcNAcMan₄GlcNAc₂。用α-1，2-甘露糖苷酶的体外处理没有显著改变概况，指示仅存在少量与Man₅GlcNAc₂不同的高甘露糖N-聚糖。

图13是在Mnn2p的46个N端氨基酸、粟酒裂殖酵母UDP-Glc-4-差向异构酶样蛋白与人β-1，4-半乳糖基转移酶I的催化域间的融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：9)和经耶氏酵母密码子优化的核苷酸序列(SEQ ID NO：10)。融合蛋白的Mnn2p部分是SEQ ID NO：9的1-46，接头序列是47-49和405-408，融合蛋白的差向异构酶序列是50-404，而融合蛋白的Man II部分是409-763。Mnn2p部分是SEQ ID NO：10的核苷酸1-138，接头序列是核苷酸139-147和1213-1224，差向异构酶序列是核苷酸148-1212，而Man II部分是1225-2289。起始和终止密码子是加下划线的。

图14是质粒pYLTmAXSpGal10hGalTI和pYLTmAXSpGal10hGalTI(ADE2ex)的构建策略的示意性描绘。

图15是一系列电泳图，其描绘了在将Gal10-GalTI活性导入菌株G040中后的N-聚糖概况。将所得的转化体G044在2种不同的培养基中培养。“Rd”代表经由图14中显示的载体上存在的zeta序列的“随机整合”。在表达Gal10-GalTI活性后，出现新峰，其在Man₇GlcNAc₂和Man₈GlcNAc₂间的某个位置处运行。体外半乳糖苷酶处理导致此峰向上转变和GlcNAcMan₅GlcNAc₂的相等增加(通过半乳糖苷酶和己糖胺酶的双重处理，后一种确认为代表此N-聚糖)。这指示末端半乳糖的存在，并且如此鉴定G044概况的新峰为GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂。用α-1，2-甘露糖苷酶的体外处理指示大量尚未修剪为Man₅GlcNAc₂的高甘露糖N-聚糖(特别是Man₈GlcNAc₂)的存在。

图16是质粒pYLalg3PUT-ALG6的示意性描绘。

图17是一系列电泳图，其描绘了在将pYLalg3PUT-ALG6导入菌株G036中后的N-聚糖概况。ALG6的过表达导致大量葡萄糖基化的峰(GlcMan_5’GlcNAc₂和Glc₂Man_5’GlcNAc₂)，指示葡萄糖苷酶II将转移至新生蛋白质的Glc₃Man_5’GlcNAc₂结构不完全修剪为Man_5’GlcNAc₂。根据生长培养基，通过ER定位的加有HDEL标签的里氏木霉α-1，2-甘露糖苷酶的作用将生成的Man_5’GlcNAc₂部分(仍然是一些Man_5’GlcNAc₂和Man_4’GlcNAc₂)或几乎完全修剪成Man₃GlcNAc₂。因此，将Man_5’GlcNAc₂和Man_4’GlcNAc₂峰根据其对α-1，2-甘露糖苷酶的敏感性来鉴定。由于加帽葡萄糖，GlcMan_5’GlcNAc₂和Glc₂Man_5’GlcNAc₂对此处理不敏感。刀豆甘露糖苷酶部分能够除去游离的α-1，6-连接的甘露糖，而且它还将Man_3-5’GlcNAc₂转化成Man₁GlcNAc₂。

图18是质粒pYLTmAXhGnTI(Hygr ex)的构建策略的示意性描绘。

图19是一系列电泳图，其描绘了在通过用GnT I表达载体转化将GnT I活性导入Δalg3-Hp4dALG6菌株的非消除(G039)或消除(G045)型式中后的N-聚糖概况。经由己糖胺酶消化证明GlcNAcMan₃GlcNAc₂的生成。新峰完全向后转变成Man₃GlcNAc₂。在菌株G048中，向GlcNAcMan₃GlcNAc₂的转化不是完全的，因为仍可以观察到一些Man₃GlcNAc₂。此菌株还具有一些残留的Man_5’GlcNAc₂，如通过α-1，2-甘露糖苷酶消化显示的。

图20是质粒JME925 pPTAde2-URA3ex-Hp4dhGnTI的构建策略的示意性描绘。

图21是一系列电泳图，其描绘了在将GnT I活性导入Δalg3-Hp4dALG6菌株(＝G045)的消除型式中；将Hp4d驱动的表达构建体整合入ADE2基因座(Tg-ade2)中后的N-聚糖概况。在此培养中，葡萄糖基化的N-聚糖的量较高，并且Man_4’-5’GlcNAc₂至Man₃GlcNAc₂的转化是不完全的。在转化体G057中观察到紧靠Man_4’GlcNAc₂运行的新峰，并且可以基于己糖胺酶消化的结果称为GlcNAcMan₃GlcNAc₂：新峰完全向后转变成Man₃GlcNAc₂。

图22是在Mnn2p的36个N端氨基酸和大鼠GlcNAc转移酶II的催化域间的融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：17)和经耶氏酵母密码子优化的核苷酸序列(SEQ ID NO：18)。粗体：融合蛋白的Mnn2p部分；普通字体：融合蛋白的Man II部分；加下划线：起始和终止密码子。

图23是质粒pYLTmAXrGnTII和pYLTmAXrGnTII(ADE2ex)的构建策略的示意性描述。

图24是一系列电泳图，其描绘了在将GnT II活性导入合成GlcNAcMan₃GlcNAc₂的菌株后的N-聚糖概况。经由用GnTI和GnT II表达构建体双重转化G045或经由用GnTII表达构建体转化G047来获得所得的菌株。在这两种情况中，代表GlcNAcMan₃GlcNAc₂的峰几乎完全消失，并且出现大大约1个葡萄糖单元的新峰。己糖胺酶处理指示新的N-聚糖上的两个末端GlcNAc残基的存在；峰向左转变约两个葡萄糖单元，并且如此代表GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂。α-1，2-甘露糖苷酶处理没有导致主要差异，指示仅有存在的有限量的Man_4’-5’GlcNAc₂。

图25是用于表达葡萄糖苷酶II活性的质粒pYLTUXdL2preAnGlcII和pYLeu2ExTEFpreLip2AnGlucIIβ的示意图。

图26是质粒JME923 pPTura3-LEU2ex-TefL2preAnGlcIIa+b[alt1]的构建策略的示意图。

图27是质粒JME923 pPTura3-LEU2ex-Hp4dL2preAnGlcIIa+b[alt1]和Zeta-LEU2ex-Hp4dL2preAnGlcIIa+b[alt]的构建策略的示意图。

图28是一系列电泳图，其描绘了将葡萄糖苷酶II活性导入合成GlcNAcMan3GlcNAc2的菌株中后的N-聚糖概况。经由用于gls2α和gls2β亚基的双重表达构建体的随机(G060)或靶向性(G061)整合获得所得的菌株。在这两种情况中，观察到葡萄糖基化峰的降低。α-1，2-甘露糖苷酶处理指示不是所有生成的Man_5’GlcNAc₂被异源的加有HDEL标签的α-1，2-甘露糖苷酶转化成Man₃GlcNAc₂。由于加帽葡萄糖，GlcMan_5’GlcNAc₂和Glc₂Man_5’GlcNAc₂对此处理不敏感。刀豆甘露糖苷酶部分能够除去剩余的葡萄糖基化N-聚糖和GlcNAcMan₃GlcNAc₂两者上的游离的α-1，6-连接的甘露糖。此外，此处理将Man_3-5’GlcNAc₂转化成Man₁GlcNAc₂。“Rd”代表经由图27中显示的载体上存在的zeta序列的“随机整合”。“Tg-ade2”和“Tg-ura3”分别代表ADE2和URA3基因座上的靶向性整合。

图29是一系列电泳图，其描绘了经由将GlcNAc转移酶II导入菌株G061中生成的菌株G070和G071的分泌物组的N-聚糖概况。用α-1，2-甘露糖苷酶(除去所有末端α-1，2-连接的甘露糖残基)或己糖胺酶(其除去末端β-1，2-连接的GlcNAc残基)处理N-聚糖以容许鉴定G070和G071天然概况中的峰。含有葡萄糖的N-聚糖不对两种酶之任一种敏感。α-1，2-甘露糖苷酶处理导致Man5’GlcNAc2和Man4GlcNAc2向Man3GlcNAc2的修剪。己糖胺酶处理除去β-1，2-连接的末端GlcNAc残基，其已经通过GlcNAc转移酶I和II添加以生成Man3GlcNAc2。

图30A是合成的preproLip2-轻链(LC)的核苷酸序列(SEQ ID NO：32)。

图30B是合成的preproLip2-LC的氨基酸序列(SEQ ID NO：33)。

图31A是合成的preproLip2-重链(HC)的核苷酸序列(SEQ ID NO：34)。

图31B是合成的preproLip2-HC的氨基酸序列(SEQ ID NO：35)。

图32是一系列电泳图，其描绘了对用pYLHp4L2preproHerHC/LC(GUT2ex)-ori2转化的经糖工程化改造的菌株G045，G057，G061和G071的SuperT/甘油摇瓶培养的N-聚糖概况分析。关于菌株G045，G057，G061和G071的描述，见表2。

图33是G096补料-分批发酵中在不同时间点时来自功能性ELISA的结果的图。

图34A和B是一系列电泳图，其描绘了G096补料-分批发酵内在不同时间点时对分泌物组的N-聚糖概况分析。

发明详述

如本文中所描述的，酵母分泌性糖蛋白上的哺乳动物样复合N-聚糖的体内合成可以基于Man₅GlcNAc₂或Man₃GlcNAc₂基本结构(见图1A，“Man”指甘露糖，而“GlcNAc”指N-葡糖胺)。为了生成Man₅GlcNAc₂基本结构，将酵母细胞工程化改造，使得α-1，2-甘露糖苷酶活性在胞内区室中升高，并且外部链延伸(Outer CHain elongation，OCH1)活性降低。为了生成Man₃GlcNAc₂基本结构，天冬酰胺连接的糖蛋白3(ALG3)和在一些实施方案中，OCH1的活性降低，α-1，2-甘露糖苷酶的活性和在一些实施方案中，α-1，3-葡萄糖基转移酶的活性升高。可以通过将酵母细胞进一步工程化改造为含有下列一项或多项活性来改变此类酵母细胞中生成的蛋白质的N-聚糖概况(profile)：GlcNAc转移酶I(GnT I)活性、甘露糖苷酶II活性、GlcNAc转移酶II(GnT II)活性、葡萄糖苷酶II活性、和半乳糖基转移酶(Gal T)活性。例如，在生成Man₅GlcNAc₂或Man₃GlcNAc₂ N-聚糖的酵母细胞中表达GnT I导致将GlcNAc模块转移至Man₅GlcNAc₂或Man₃GlcNAc₂ N-聚糖，使得分别生成GlcNAcMan₅GlcNAc₂ orGlcNAcMan₃GlcNAc₂ N-聚糖。在生成GlcNAcMan₅GlcNAc₂ N-聚糖的细胞中，表达甘露糖苷酶II导致两个甘露糖自GlcNAcMan₅GlcNAc₂ N-聚糖除去以生成GlcNAcMan₃GlcNAc₂ N-聚糖。在生成GlcNAcMan₃GlcNAc₂ N-聚糖的细胞中，表达GnT II导致另一个GlcNAc模块转移至GlcNAcMan₃GlcNAc₂ N-聚糖以生成GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ N-聚糖。在生成GlcNAcMan₃GlcNAc₂或GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ N-聚糖的细胞中表达Gal T导致将半乳糖转移至GlcNAcMan₃GlcNAc₂或GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ N-聚糖以生成GalGlcNAcMan₃GlcNAc₂或Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ N-聚糖。在一些实施方案中，可以表达葡萄糖苷酶II(例如，通过表达α和β亚基)以提高Man₃GlcNAc₂基本结构的生成。

靶分子

如本文中所使用的，靶分子指在遗传工程细胞(例如，真菌细胞诸如解脂耶氏酵母、陆地酵母、或其它相关物种二形(dimorphic)酵母细胞；植物细胞，或动物细胞)中经历N-糖基化的任何分子。在一些实施方案中，靶分子能够经由解脂耶氏酵母或陆地酵母(或其它相关物种二形酵母)分泌途径的一个或多个步骤运输，导致其通过宿主细胞机器的N-糖基化。靶分子可以是内源的或外源的。

合适的靶蛋白包括病原体蛋白质(例如，破伤风类毒素；白喉类毒素；病毒表面蛋白(例如，巨细胞病毒(CMV)糖蛋白B、H和gCIII；人免疫缺陷病毒1(HIV-1)包膜糖蛋白；劳斯肉瘤病毒(RSV)包膜糖蛋白；单纯疱疹病毒(HSV)包膜糖蛋白；埃巴病毒(EBV)包膜糖蛋白；水痘-带状疱疹病毒(VZV)包膜糖蛋白；人乳头瘤病毒(HPV)包膜糖蛋白((e.g.，tetanus toxoid；diptheriatoxoid；viral surface proteins(e.g.，cytomegalovirus(CMV)glycoproteins B，Hand gCIII；human immunodeficiency virus 1(HIV-1)envelope glycoproteins；Rous sarcoma virus(RSV)envelope glycoproteins；herpes simplex virus(HSV)envelope glycoproteins；Epstein Barr virus(EBV)envelope glycoproteins；varicella-zoster virus(VZV)envelope glycoproteins；human papilloma virus(HPV)envelope glycoproteins)；流感病毒糖蛋白；和肝炎家族表面抗原)、溶酶体蛋白质(例如，葡糖脑苷脂酶、脑苷酯酶、或半乳糖脑苷脂酶)(e.g.，glucocerebrosidase，cerebrosidase，or galactocerebrosidase)，、胰岛素、胰高血糖素、生长因子、细胞因子、趋化因子、结合Fc受体的蛋白质、抗体或其片段、或任何蛋白质域抗体或抗体片段的融合物(例如，蛋白质-Fc)。生长因子包括例如，血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、神经生长因子(NGF)；神经营养因子、血小板衍生的生长因子(PDGF)、促红细胞生长素(EPO)、促血小板生成素(TPO)、筒箭毒碱(Myostatin)(GDF-8)、生长分化因子-9(GDF9)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF或FGF2)、表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)。细胞因子包括例如，白介素(例如，IL-1至IL-33诸如IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-12，IL-13或IL-15)和干扰素(例如，干扰素β或干扰素γ)。趋化因子包括例如I-309，TCA-3，MCP-1，MIP-1α，MIP-1β，RANTES，C10，MRP-2，MARC，MCP-3，MCP-2，MRP-2，CCF18，MIP-1γ，嗜酸细胞活化趋化因子(Eotaxin)，MCP-5，MCP-4，NCC-1，Ckβ10，HCC-1，白细胞诱素-1，LEC，NCC-4，TARC，PARC或嗜酸细胞活化趋化因子-2。还包括肿瘤糖蛋白(例如，肿瘤相关抗原)，例如，癌胚抗原(CEA)、人粘蛋白、HER-2/neu、和前列腺特异性抗原(PSA)[Henderson和Finn，Advances in Immunology，62，pp.217-56(1996)]。在一个实施方案中，靶蛋白是抗HER2/neu抗体。在一些实施方案中，靶蛋白可以是与溶酶体贮积病症有关的靶蛋白，该靶蛋白包括例如，alpha-L-艾杜糖苷酸酶、beta-D-半乳糖苷酶、beta-葡萄糖苷酶、beta-己糖胺酶、beta-D-甘露糖苷酶、alpha-L-岩藻糖苷酶、芳基硫酸酯酶B、芳基硫酸酯酶A、alpha-N-乙酰基半乳糖苷酶、天冬氨酰氨基葡糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、alpha-氨基葡萄糖苷-N-乙酰转移酶、beta-D-葡糖醛酸糖苷酶(glucoronidase)、透明质酸酶、alpha-L-甘露糖苷酶、alpha-神经氨酸酶、磷酸转移酶、酸性脂肪酶、酸性神经酰胺酶、鞘磷脂酶、硫酯酶、组织蛋白酶K、和脂蛋白脂肪酶。

靶蛋白还可以是融合蛋白。融合蛋白包括例如，(i)本文中所描述的任何蛋白质或其片段与(ii)抗体或其片段的融合物。如本文中所使用的，术语“抗体片段”指(a)抗原结合片段或(b)可以与Fc受体相互作用的抗体Fc部分。抗原结合片段可以是例如，Fab、F(ab’)₂、Fv、和单链Fv(scFv)片段。scFv片段是包含scFv来源的抗体的重和轻链可变区的单一多肽链。另外，可以在本发明的方法中使用双抗体[Poljak(1994)Structure 2(12)：1121-1123；Hudson等(1999)J.Immunol.Methods 23(1-2)：177-189]和胞内抗体[Huston等(2001)Hum.Antibodies 10(3-4)：127-142；Wheeler等(2003)Mol.Ther.8(3)：355-366；Stocks(2004)Drug Discov.Today 9(22)：960-966]。

也可以将靶蛋白与一种或多种聚合物、载体、赋形剂、免疫毒素、或可检测(例如，荧光、发光、或放射性)模块连接。例如，可以将靶蛋白与聚乙二醇连接，所述聚乙二醇可以用于提高小蛋白质的分子量和/或延长循环残留时间。

在一些实施方案中，靶分子可以是或者含有多萜醇。

遗传工程细胞

可以使用本文中所描述的遗传工程细胞来生成含有哺乳动物样N-聚糖的靶分子或含有哺乳动物糖基化途径内的中间体的靶分子。例如，如本文中所描述的，可以将编码一种或多种酶的核酸导入真菌细胞中，使得细胞生成期望的N-聚糖(例如，GlcNAcMan₅GlcNAc₂、GlcNAcMan₃GlcNAc₂、GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、GalGlcNAcMan₃GlcNAc₂或Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂N-聚糖)。如此，在本文中所描述的任何实施方案中，真菌细胞可以含有编码一种酶的核酸，或者核酸可以编码多种酶。每种此类核酸还可以含有如下文所描述的靶向序列。另外，也可以将编码靶分子的核酸导入真菌细胞中，使得将靶分子生成并修饰为含有期望的N-聚糖(例如，GlcNAcMan₅GlcNAc₂、GlcNAcMan₃GlcNAc₂、GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、GalGlcNAcMan₃GlcNAc₂或Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂N-聚糖)。

术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用，指RNA和DNA两者，包括cDNA、基因组DNA、合成的DNA、和含有核酸类似物的DNA(或RNA)。核酸可以具有任何三维结构。核酸可以是双链或单链(即，有义链或反义链)。核酸的非限制性例子包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、siRNA、微小RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针、和引物，以及核酸类似物。“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，意指氨基酸的任何肽连接的链，而不管长度或翻译后修饰。

“分离的核酸”指与存在于天然存在的基因组的其它核酸分子分开的核酸，包括通常在天然存在的基因组(例如，酵母基因组)中的核酸的一侧或两侧侧翼的核酸。如本文中所使用的，术语“分离的”就核酸而言还包括任何非天然存在的核酸序列，因为此类非天然存在的序列不存在于自然界，并且在天然存在的基因组中没有刚好连续的序列。

分离的核酸可以是例如，DNA分子，只要通常刚刚在天然存在的基因组中的DNA分子侧翼找到的核酸序列之一被除去或缺乏。如此，分离的核酸包括但不限于作为不依赖于其它序列的不同分子(例如，化学合成的核酸、或通过PCR或限制性内切核酸酶处理生成的cDNA或基因组DNA片段)存在的DNA分子以及掺入载体、自主复制型质粒、病毒(例如，任何副粘液病毒、逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、或疱疹病毒)中，或掺入原核生物或真核生物的基因组DNA中的DNA。另外，分离的核酸可以包括经工程化改造的核酸诸如作为杂合或融合核酸的一部分的DNA分子。认为存在于例如cDNA文库或基因组文库，或含有基因组DNA限制性消化物的凝胶切片内的数百至数百万个其它核酸间的核酸不是分离的核酸。

如本文中所使用的，术语“外源的”就核酸和特定宿主细胞而言意指不存在于(并且不能获自)如自然界中找到的所述特定细胞的任何核酸。如此，认为一旦导入宿主细胞中，非天然存在的核酸对于宿主细胞而言是外源的。重要的是，注意到非天然存在的核酸可以含有自然界中找到的核酸亚序列或核酸序列片段，只要整个核酸不存在于自然界中。例如，在表达载体内含有基因组DNA序列的核酸分子是非天然存在的核酸，并且如此一旦导入宿主细胞中，对于宿主细胞而言是外源的，因为整个核酸分子(基因组DNA加载体DNA)不存在于自然界中。如此，认为作为整体不存在于自然界中的任何载体、自主复制型质粒、或病毒(例如，逆转录病毒、腺病毒、或疱疹病毒)是非天然存在的核酸。由此可见，认为通过PCR或限制性内切核酸酶处理及eDNA的基因组DNA片段是非天然存在的核酸，因为它们以自然界中找不到的分开的分子存在。由此还可见，以自然界中找不到的排列含有启动子序列和多肽编码序列(例如，cDNA或基因组DNA)的任何核酸是非天然存在的核酸。天然存在的核酸可以是特定细胞外源的。例如，一旦自酵母x细胞分离的整个染色体被导入酵母细胞中，所述染色体对于酵母y细胞而言是外源核酸。

适合于遗传工程的细胞包括例如真菌细胞(例如，解脂耶氏酵母或本文中所描述的任何其它相关二形酵母细胞)、植物细胞、或动物细胞。细胞可以是原代细胞、永生化细胞、或经转化的细胞。细胞可以是那些在动物，例如，非人哺乳动物中的细胞。在如本文中规定的遗传工程前，此类细胞可以获自多种商业来源和研究资源机构，诸如例如，美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)。

细胞的遗传工程可以包括遗传修饰，诸如：(i)删除编码具有N-糖基化活性的蛋白质的内源基因；(ii)导入编码具有N-糖基化活性的蛋白质(例如，内源或外源蛋白质)的突变体形式的重组核酸(即，表达具有N-糖基化活性的突变体蛋白质)；(iii)导入或表达干扰具有N-糖基化活性的蛋白质的功能性表达的RNA分子；(iv)导入编码具有N-糖基化活性的野生型(例如，内源的或外源的)蛋白质的重组核酸(即，表达具有N-糖基化活性的蛋白质)；或者(v)改变编码具有N-糖基化活性的蛋白质的一种或多种内源基因的启动子或增强子元件，如此以改变其编码蛋白质的表达。RNA分子包括例如小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、反义RNA、或微小RNA(miRNA)。应当理解，项(ii)包括例如，用相对于如此替换的内源基因编码具有更大N-糖基化活性的蛋白质的基因替换内源基因。遗传工程还包括改变编码具有N-糖基化活性的蛋白质的内源基因以生成具有添加(例如，异源序列)、删除、或取代(例如，突变诸如点突变；保守或非保守突变)的蛋白质。可以将突变特异性引入(例如，定点诱变或同源重组)或者可以随机引入(例如，可以将细胞化学诱变，如记载于例如Newman和Ferro-Novick(1987)J.Cell Biol.105(4)：1587的。

本文中所描述的遗传修饰可以导致下列一项或多项：(i)经遗传修饰的细胞中的一种或多种N-糖基化活性的升高，(ii)经遗传修饰的细胞中的一种或多种N-糖基化活性的降低，(iii)经遗传修饰的细胞中的一种或多种N-糖基化活性的定位或胞内分布的变化，或(iv)经遗传修饰的细胞中的一种或多种N-糖基化活性的比率变化。应当理解，N-糖基化活性量增加可以由具有N-糖基化活性的一种或多种蛋白质的过表达、内源基因的拷贝数目增加(例如，基因复制)、或刺激由基因编码的蛋白质表达升高的内源基因的启动子或增强子的变化所致。一种或多种N-糖基化活性的降低可以是由于具有N-糖基化改变活性的一种或多种蛋白质的突变体形式(例如，显性负性形式)的过表达、导入或表达降低具有N-糖基化活性的一种或多种蛋白质的表达的一种或多种干扰RNA分子，或删除编码具有N-糖基化活性的蛋白质的一种或多种内源基因。

删除或破坏一种或多种内源基因的方法记载于伴随的实施例中。例如，为了通过同源重组破坏基因，可以以如下的方式构建“基因替换”载体，使得包括选择标志基因。选择标志基因可以与5’和3’两端与足以介导同源重组的长度的基因的一部分可操作连接。选择标志可以是许多基因之一，所述基因互补宿主细胞营养缺陷型或者提供抗生素抗性，包括URA3、LEU2和HIS3基因。其它合适的选择标志包括CAT基因，其对酵母细胞赋予氯霉素抗性，或lacZ基因，其导致由于表达β-半乳糖苷酶所致的蓝色菌落。然后，使用本领域中公知的方法(见下文)来将基因替换载体的线性化DNA片段导入细胞中。可以基于选择标志来确定线性片段对基因组的整合和对基因的破坏，并且可以通过例如，Southern印迹分析来确认。

如伴随的实施例中详述的，在其选择中使用后，可以通过例如Cre-loxP系统(见下文)自宿主细胞的基因组除去选择标志。此标志物除去方法遍及整个实施例中称为“消除”。

或者，可以以如下的方式构建基因替换载体，使得包括要破坏的基因的一部分，其中该部分缺乏任何内源基因启动子序列，并且编码无一基因编码序列或编码基因编码序列的无活性片段。“无活性片段”指编码具有例如自基因的全长编码序列生成的蛋白质的活性的小于约10％(例如，小于约9％、小于约8％、小于约7％、小于约6％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、或0％)的蛋白质的基因的片段。以如下的方式将基因的所述一部分插入载体中，使得无已知的启动子序列与基因序列可操作连接，但是终止密码子和转录终止序列与基因序列的一部分可操作连接。随后，可以将此载体在基因序列的一部分中线性化，并转化入细胞中。作为单一同源重组，然后将此线性化载体在基因的内源对应物中整合。

表达载体可以是自主的或整合的。

可以将重组核酸以表达载体形式诸如质粒、噬菌体、转座子、粘粒或病毒颗粒导入细胞中。可以将重组核酸在染色体外维持或者可以将其整合入酵母细胞染色体DNA中。表达载体可以含有编码在选定的条件下对于细胞存活力需要的蛋白质的选择标志基因(例如，URA3，其编码尿嘧啶生物合成必需的酶，或TRP1，其编码色氨酸生物合成需要的酶)以容许检测和/或选择用期望的核酸转化的那些细胞(见例如美国专利No.4,704,362)。表达载体还可以包含自主复制序列(ARS)。例如，美国专利No.4,837,148描述了提供适合于维持毕赤酵母中的质粒的手段的自主复制序列。

整合性载体记载于例如美国专利No.4,882,279。整合性载体一般包含至少第一可插入DNA片段、选择标志基因、和第二可插入DNA片段的连续排列序列。第一和第二可插入DNA片段各为约200(例如，约250、约300、约350、约400、约450、约500、或约1000或更多)个核苷酸的长度，并且具有与要转化的物种的基因组DNA的一部分同源的核苷酸序列。含有表达的感兴趣基因(例如，编码具有N-糖基化活性的蛋白质的基因)的核苷酸序列在此载体中在第一和第二可插入DNA片段间插入，无论在标志物基因之前还是之后。可以将整合性载体线性化，之后进行酵母转化以便于感兴趣的核苷酸序列对宿主细胞基因组的整合。

表达载体的特征可以是在酵母(例如，解脂耶氏酵母、陆地酵母、或其它相关二形酵母物种)启动子(其使它们能够在酵母中表达)的控制下的重组核酸。合适的酵母启动子包括TEF1，HP4D，GAP，POX2，ADC1，TPI1，ADH2，POX和Gal10启动子。见例如，Madzak等，(2000)J.Mol.Microbiol.Biotechnol.2：207-216；Guarente等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79(23)：7410。其它合适的启动子记载于例如Zhu和Zhang(1999)Bioinformatics 15(7-8)：608-611及美国专利No.6,265,185。在要将表达载体导入动物细胞诸如哺乳动物细胞中的情况中，表达载体的特征可以是在适合于在感兴趣的宿主细胞中表达的动物细胞启动子控制下的重组核酸。哺乳动物启动子的例子包括SV40和巨细胞病毒(CMV)启动子。

启动子可以是组成性或诱导型(条件性的)。组成性启动子理解为其表达在标准的培养条件下恒定的启动子。诱导型启动子是响应一种或多种诱导信号的启动子。例如，可以将诱导型启动子化学调节(例如，其转录活性受到化学诱导剂诸如醇、四环素、类固醇、金属、或其它小分子的存在或缺乏调节的启动子)或物理调节(例如，其转录活性受到物理诱导物诸如光或高或低温的存在或缺乏调节的启动子)。也可以通过自身受到化学或物理信号直接调节的一种或多种转录因子间接调节诱导型启动子。

细胞的遗传工程还包括激活如下的内源基因(例如，编码具有N-糖基化活性的蛋白质的基因)，其存在于宿主细胞中，但是在细胞中通常不表达或者在细胞中不以显著的水平表达。例如，可以将内源基因的调节序列(例如，基因启动子或增强子)修饰为使得可操作连接的编码序列展现出升高的表达。可以使用同源重组或靶向来用调节序列将通常与基因联合的调节区替换或使其丧失能力，所述调节序列引起基因以比相应的非遗传工程细胞中明显的水平高的水平表达，或者引起基因展现出与相应的非遗传工程细胞中明显的调节或诱导样式不同的调节或诱导样式。适合于引入基因的调节序列(例如，启动子或增强子)的变化的方法记载于例如美国专利公开文本No.20030147868。

应当理解，其它遗传工程修饰也可以是条件性的。例如，可以使用例如，位点特异性DNA重组酶诸如Cre-loxP系统(见例如，Gossen等(2002)Ann.Rev.Genetics 36：153-173及美国申请公开文本No.20060014264)来条件性删除基因。

可以使用多种方法诸如原生质球技术或全细胞氯化锂酵母转化方法来将重组核酸导入本文中所描述的细胞中。其它可用于将质粒或线性核酸载体转化入细胞中的方法记载于例如，美国专利No.4,929,555；Hinnen等(1978)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 75：1929；Ito等(1983)J.Bacteriol.153：163；美国专利No.4,879,231；及Sreekrishna等(1987)Gene 59：115。也可以使用电穿孔和PEG1000全细胞转化规程，如由Cregg和Russel，Methods in Molecular Biology：Pichia Protocols，第3章，Humana Press，Totowa，N.J.，第27-39页(1998)所描述的。动物细胞的转染的特征可以在于例如，使用磷酸钙、电穿孔、热休克、脂质体、或转染剂诸如或

或者通过接触裸核酸载体与溶液中的细胞(见例如，Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual第二版第1、2和3卷.Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor，New York，USA，Nov.1989)来将载体导入细胞。

可以通过使用合适的技术，包括但不限于在转化后在缺乏需要的生物化学产物(由于细胞的营养缺陷型所致)的情况中培养营养缺陷型细胞，选择并检测新表型，或在存在抗生素的情况中培养来选择经转化的酵母细胞，所述抗生素在缺乏转化体中含有的抗性基因的情况中对于酵母是毒性。也可以通过将表达盒整合入基因组中来选择和/或确认转化体，其可以通过例如Southern印迹或PCR分析来评估。

在将载体导入感兴趣的靶细胞中后，可以将载体在细菌细胞诸如大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)中生长(例如，扩增)。可以通过导致载体DNA自细菌环境(milieu)纯化的本领域中已知的任何方法来自细菌细胞分离载体DNA。可以用酚、氯仿、和乙醚来广泛提取纯化的载体DNA，以确保质粒DNA制备物中不存在大肠杆菌蛋白质，因为这些蛋白质对于哺乳动物细胞可以是毒性的。

可以使用如本文中所描述的遗传工程来表达(例如，过表达)、将修饰引入、或删除许多编码具有N-糖基化活性的蛋白质的基因。此类蛋白质包括例如，OCH1、ALG3、α-1，3-葡萄糖基转移酶、GnT I、甘露糖苷酶II、GnT II、葡萄糖苷酶II、或Gal T。编码具有N-糖基化活性的蛋白质的基因可以来自任何含有此类基因的物种。可以获得编码具有N-糖基化活性的蛋白质的基因的例示性真菌物种包括但不限于异常毕赤酵母(Pichia anomala)、牛毕赤酵母(Pichia bovis)、加拿大毕赤酵母(Pichia canadensis)、卡氏毕赤酵母(Pichiacarsonii)、粉状毕赤酵母(Pichia farinose)、发酵毕赤酵母(Pichia fermentans)、Pichia fluxuum、膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)、膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)、粗状假丝酵母(Candida valida)、白念珠菌(Candidaalbicans)、Candida ascalaphidarum、Candida amphixiae、南极假丝酵母(Candida Antarctica)、大西洋假丝酵母(Candida atlantica)、Candidaatmosphaerica、蟑螂假丝酵母(Candida blattae)、果生假丝酵母(Candidacarpophila)、Candida cerambycidarum、Candida chauliodes、延胡索假丝酵母(Candida corydalis)、Candida dosseyi、杜氏假丝酵母(Candida dubliniensis)、Candida ergatensis、Candida fructus、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、发酵假丝酵母(Candida fermentati)、吉利蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)、黑马朗假丝酵母(Candida haemulonii)、Candida insectamens、Candidainsectorum、中型假丝酵母(Candida intermedia)、Candida jeffresii、乳酒假丝酵母(Candida kefyr)、克鲁斯氏念珠菌(Candida krusei)、葡萄牙假丝酵母(Candida lusitaniae)、Candida lyxosophila、麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)、膜醭假丝酵母(Candida membranifaciens)、梅林假丝酵母(Candida milleri)、橄榄假丝酵母(Candida oleophila)、俄勒冈假丝酵母(Candida oregonensis)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)、桔假丝酵母(Candida quercitrusa)、休哈塔假丝酵母(Candida shehatea)、Candida temnochilae、纤维假丝酵母(Candidatenuis)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、Candida tsuchiyae、Candidasinolaborantiu、大豆假丝酵母(Candida sojae)、维斯假丝酵母(Candidaviswanathii)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、膜醭毕赤酵母(Pichiamembranaefaciens)、Pichia silvestris、膜醭毕赤酵母、Pichia chodati、膜醭毕赤酵母、膜醭毕赤酵母、Pichia minuscule、毕赤酵母、Pichiapseudopolymorpha、Pichia quercuum、Pichia robertsii、Pichia saitoi、Pichiasilvestrisi、Pichia strasburgensis、陆生毕赤酵母(Pichia terricola)、Pichiavanriji、Pseudozyma Antarctica、圆红冬孢酵母菌(Rhodosporidium toruloides)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、Saccharomyces momdshuricus、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)、贝酵母、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、二孢酵母(Saccharomyces bisporus)、谢瓦利埃酵母(Saccharomyces chevalieri)、德尔布酵母(Saccharomyces delbrueckii)、少孢酵母(Saccharomyces exiguous)、发酵性酵母(Saccharomyces fermentati)、脆壁酵母(Saccharomyces fragilis)、Saccharomyces marxianus、蜂蜜酵母(Saccharomyces mellis)、罗斯酵母(Saccharomyces roseii)、鲁酵母(Saccharomyces rouxii)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)、魏氏酵母(Saccharomyces willianus)、路氏类酵母(Saccharomycodes ludwigii)、荚复膜孢酵母(Saccharomycopsis capsularis)、扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)、扣囊复膜酵母、Endomyces hordei、Endomycopsis fobuligera.Saturnispora saitoi、八孢裂殖酵母(Schizosaccharomyces octosporus)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)、德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)、德尔布有孢圆酵母、Saccharomyces dairensis、德尔布有孢圆酵母、Torulaspora fermentati、发酵性酵母(Saccharomycesfermentati)、德尔布有孢圆酵母、罗斯有孢圆酵母(Torulaspora rosei)、罗斯有孢圆酵母、德尔布有孢圆酵母、罗斯酵母、德尔布有孢圆酵母、德尔布酵母、德尔布有孢圆酵母、德尔布酵母、Zygosaccharomyces mongolicus、Dorulasporaglobosa、球形德巴利酵母(Debatyomyces globosus)、球拟圆酵母(Torulopsisglobosa)、皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)、三角酵母(Trigonopsisvariabilis)、Williopsis californica、土星拟威尔酵母(Williopsis saturnus)、二孢接合酵母(Zygosaccharomyces bisporus)、二孢接合酵母、Debaryomycesdisporua、二孢酵母(Saccharomyces bisporas)、二孢接合酵母、二孢酵母、Zygosaccharomyces mellis、Zygosaccharomyces priorianus、Zygosaccharomycesrouxiim、鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、巴格式结合酵母(Zygosaccharomyces barkeri)、鲁酵母、鲁氏接合酵母、酱醪接合酵母(Zygosaccharomyces majori)、Saccharomyces rousii、异常毕赤酵母(Pichiaanomala)、Pichia bovis、加拿大毕赤酵母(Pichia Canadensis)、卡氏毕赤酵母(Pichia carsonii)、粉末毕赤酵母(Pichia farinose)、发酵毕赤酵母(Pichiafermentans)、Pichia fluxuum、膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)、Pichiapseudopolymorpha、Pichia quercuum、Pichia robertsii、Pseudozyma Antarctica、圆红冬孢酵母菌(Rhodosporidium toruloides)、圆红冬孢酵母菌、胶红类酵母菌(Rhodotorula glutinis)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、贝酵母、二孢酵母、酿酒酵母、谢瓦利埃酵母、德尔布酵母、发酵性酵母、脆壁酵母、路氏类酵母、粟酒裂殖酵母、西方许旺酵母、德尔布有孢圆酵母、球有孢圆酵母(Torulaspora globosa)、变异三角酵母(Trigonopsis variabilis)、Williopsiscalifornica、土星拟威尔酵母、二孢接合酵母、Zygosaccharomyces mellis、鲁氏接合酵母、或本领域中已知的或本文中所描述的任何其它真菌(例如，酵母)。例示性的低等真核生物还包括曲霉属(Aspergillus)的多种物种，包括但不限于浅蓝灰曲霉(Aspergillus caesiellus)、亮白曲霉(Aspergillus candidus)、肉色曲霉(Aspergillus carneus)、棒曲霉(Aspergillus clavatus)、弯头曲霉(Aspergillus deflectus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、灰绿曲霉(Aspergillus glaucus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(黑曲霉素)、赭曲霉(Aspergillus ochraceus)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)、帚状曲霉(Aspergilluspenicilloides)、局限曲霉(Aspergillus restrictus)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、聚多曲霉(Aspergillus sydowi)、溜曲霉(Aspergillus tamari)、土曲霉(Aspergillusterreus)、焦曲霉(Aspergillus ustus)、或花斑曲霉(Aspergillus versicolor)。可以获得编码具有N-糖基化活性的蛋白质的基因的例示性原生动物属包括但不限于动体目(Blastocrithidia)、短膜虫属(Crithidia)、肠锥虫属(Endotrypanum)、匐滴虫属(Herpetomonas)、利什曼原虫属(Leishmania)、细滴虫属(Leptomonas)、植物单胞菌属(Phytomonas)、锥体虫属(Trypanosoma)(例如，布氏锥虫(T.bruceii)、冈比亚锥虫(T.gambiense)、罗德西亚锥虫(T.rhodesiense)、和克氏锥虫(T.cruzi))、和Wallaceina。例如，编码GnT I的基因可以获自人(Swiss蛋白质登录号P26572)、大鼠、拟南芥属(Arabidopsis)、小鼠、或果蝇属(Drosophila)；编码GntII的基因可以获自人、大鼠(Swiss蛋白质登录号Q09326)、拟南芥属、或小鼠；编码Man II的基因可以获自人、大鼠、拟南芥属、小鼠、果蝇属(Swiss蛋白质登录号Q24451)；而编码GalT的基因可以获自人(Swiss蛋白质登录号P15291)、大鼠、小鼠、或牛。

在一些实施方案中，遗传工程细胞缺乏OCH1(GenBank登录号：AJ563920)基因或其基因产物(mRNA或蛋白质)。在一些实施方案中，遗传工程细胞缺乏ALG3(

登录号：XM 503488，Genolevures参照：YALI0E03190g)基因或其基因产物(mRNA或蛋白质)。在一些实施方案中，遗传工程细胞表达(例如，过表达)α-1，3-葡萄糖基转移酶(例如，ALG6，登录号：XM 502922，Genolevures参照：YALI0D17028g)蛋白。在一些实施方案中，遗传工程细胞表达α-1，2-甘露糖苷酶(例如，Genbank登录号：AF212153)蛋白。在一些实施方案中，遗传工程细胞表达GlcNAc转移酶I(例如，Swiss Prot.登录号P26572)蛋白。在一些实施方案中，遗传工程细胞表达甘露糖苷酶II蛋白或其催化域(例如，Swiss Prot.登录号Q24451)。在一些实施方案中，遗传工程细胞表达半乳糖基转移酶I蛋白或其催化域(例如，SwissProt.登录号P15291)。在一些实施方案中，遗传工程细胞表达GlcNAc转移酶II蛋白或其催化域(例如，Swiss Prot.登录号Q09326)。在一些实施方案中，遗传工程细胞表达葡萄糖苷酶II诸如解脂耶氏酵母、布氏锥虫(Trypanosomabrucei)或黑曲霉素(Aspergillus niger)的葡萄糖苷酶II的alpha或beta亚基(或alpha和beta亚基两者)。遗传工程细胞可以具有这些修饰的任何组合。

例如，在一些实施方案中，遗传工程细胞可以缺乏OCH1基因，并且表达α-1，2-甘露糖苷酶、GlcNAc转移酶I、甘露糖苷酶II、和半乳糖基转移酶I。在一些实施方案中，遗传工程细胞可以缺乏ALG3基因，并且表达α-1，2-甘露糖苷酶、GlcNAc转移酶I、GlcNAc转移酶I、和半乳糖基转移酶I。此类遗传工程细胞进一步可以表达α-1，3-葡萄糖基转移酶和/或表达葡萄糖苷酶II的alpha和beta亚基和/或缺乏OCH1基因。

多种此类蛋白质之一可以是含有异源靶向序列的融合蛋白。例如，α-1，2-甘露糖苷酶可以具有HDEL内质网(ER)-保留氨基酸序列(见实施例)。应当理解，可以将具有N-糖基化活性的任何蛋白质工程化改造成包含HDEL序列的融合蛋白。其它蛋白质可以具有将蛋白质靶向至高尔基体的异源序列。例如，可以使用由酵母Kre2p基因编码的前100个N端氨基酸、由酿酒酵母Mnn2基因编码的前36个N端氨基酸(Swiss Prot.登录号P38069)、或由酿酒酵母Mnn2p基因编码的前46个N端氨基酸来将蛋白质靶向至高尔基。因此，编码要在真菌细胞中表达的蛋白质的核酸可以包含编码将编码的蛋白质靶向至胞内区室的靶向序列的核苷酸序列。例如，可以将α-1，2-甘露糖苷酶靶向至ER，而可以将GnT I、GnTII、甘露糖苷酶、和Gal T靶向至高尔基。

在具有N-糖基化活性的蛋白质源自与要表达蛋白质的细胞不同类型(例如，不同物种)的细胞的实施方案中，可以将编码蛋白质的核酸进行密码子优化以在感兴趣的特定细胞中表达。例如，可以将编码来自布氏锥虫(Trypanosoma brucei)的具有N-糖基化的蛋白质的核酸进行密码子优化以在酵母细胞诸如解脂耶氏酵母中表达。此类密码子优化可以用于提高蛋白质在感兴趣细胞中的表达。用于将编码蛋白质的核酸进行密码子优化的方法是本领域中已知的，并且记载于例如Gao等(Biotechnol.Prog.(2004)20(2)：443-448)，Kotula等(Nat.Biotechn.(1991)9，1386-1389)及Bennetzen等(J.Biol.Chem.(1982)257(6)：2036-3031)。表1显示了解脂耶氏酵母的密码子选择。数据源自存在于5,967种编码序列的2,945,919个密码子。表1的内容获自密码子选择数据库，其可以见万维网于kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi？species＝284591。

表1

解脂耶氏酵母密码子选择表

表栏(Tablefield)以[三联体][频率：每千]([数目])显示。

在一些实施方案中，可以将人蛋白质导入细胞中，并且可以抑制(例如，删除或突变)具有N-糖基化活性的一种或多种内源酵母蛋白质。用于“人源化”真菌糖基化途径的技术记载于例如Choi等(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100(9)：5022-5027；Vervecken等(2004)Appl.Environ.Microb.70(5)：2639-2646；及Gerngross(2004)Nature Biotech.22(11)：1410-1414。

在遗传工程牵涉例如蛋白质表达或外源蛋白质(包括内源蛋白质的突变体形式)表达变化的情况中，可以使用多种技术来测定遗传工程细胞是否表达蛋白质。例如，可以分别使用例如Northern印迹或RT-PCR分析或Western印迹分析来检测编码蛋白质的mRNA或蛋白质自身的存在。可以通过使用多种技术，包括亚细胞分级和免疫荧光来分析具有N-糖基化活性的蛋白质的胞内定位。

用于检测靶分子的糖基化的方法包括DNA测序仪辅助(DSA)、荧光团辅助碳水化合物电泳(FACE)或表面增强的激光解吸/离子化飞行时间质谱术(SELDI-TOF MS)。例如，分析可以利用DSA-FACE，其中例如，将糖蛋白变性，接着在例如膜上固定化。然后，可以用合适的还原剂诸如二硫苏糖醇(DTT)或β-巯基乙醇来还原糖蛋白。可以使用酸诸如碘乙酸来将蛋白质的硫氢基基团羧化。接着，可以使用酶诸如N-糖苷酶F来自蛋白质释放N-聚糖。任选地，可以将N-聚糖重建，并通过还原性胺化来衍生化。然后，可以将衍生化的N-聚糖浓缩。适合于N-聚糖分析的设备包括例如，

377DNA测序仪(Applied Biosystems)。可以使用例如

3.1软件(AppliedBiosystems)来实施数据分析。任选地，可以用一种或多种酶进一步处理分离的甘露糖蛋白(mannoprotein)以确认其N-聚糖状态。N-聚糖分析的其它方法包括例如质谱术(例如MALDI-TOF-MS)、正常相的高压液相层析(HPLC)、反相和离子交换层析(例如，在未标记聚糖时通过脉冲安培计检测，且若将聚糖适当标记，则通过UV吸光度或荧光)。还可见Callewaert等(2001)Glycobiology 11(4)：275-281及Freire等(2006)Bioconjug.Chem.17(2)：559-564。

在遗传工程细胞的任何遗传修饰在诱导信号(例如，化学或物理信号)存在上是诱导的或条件性的情况中，任选地，可以将遗传工程细胞在将核酸导入之前、期间、或之后在存在诱导剂的情况中培养。例如，在导入编码靶蛋白的核酸后，可以将细胞暴露于能够促进具有N-糖基化活性的一种或多种蛋白质表达的化学诱导剂。在多种诱导信号诱导具有N-糖基化活性的一种或多种蛋白质的条件性表达的情况中，可以使细胞与多种诱导剂接触。

可以自遗传工程细胞分离修饰为包含期望的N-聚糖的靶分子。可以将经修饰的靶分子在酵母细胞内维持，并且在细胞裂解后释放，或者可以经由由指导分子自细胞分泌的编码序列(对于外源核酸而言天然的或者工程化改造入表达载体中)提供的机制将经修饰的靶分子分泌入培养液中。可以通过多种用于检测分子存在的标准方案来确认细胞裂解物或培养液中的经修饰的靶分子的存在。例如，在改变的靶分子是蛋白质的情况中，此类方案可以包括但不限于用对改变的靶蛋白(或靶蛋白自身)特异性的抗体的免疫印迹或放射性免疫沉淀、对改变的靶蛋白(或靶蛋白自身)特异性的配体的结合、或测试经修饰的靶蛋白(或靶蛋白自身)的酶比活。

在一些实施方案中，自遗传工程细胞分离的至少约25％的靶分子含有期望的N-聚糖。例如，自遗传工程细胞分离的至少约27％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、或至少约95％、或至少约99％的靶分子可以含有期望的N-聚糖。

在一些实施方案中，在使用本文中所描述的方法生成的靶分子中，糖蛋白上的至少50％(例如，至少55，60，65，70，75，80或85％)的N-聚糖可以是GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ N-聚糖。自DSA-FACE电泳图中的峰面积评估GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ N-聚糖的百分比。见实施例13。

在一些实施方案中，可以将分离的经修饰的靶分子冷冻、冻干、或固定化并在合适的条件(例如，其容许改变的靶分子保留生物学活性)下贮存。

经工程化改造的细胞的培养物

本文件还提供了本文中所描述的任何遗传工程细胞的基本上纯的培养物。如本文中所使用的，遗传工程细胞的“基本上纯的培养物”是所述细胞的如下培养物，其中培养物中活细胞总数的小于约40％(即，小于约：35％；30％；25％；20％；15％；10％；5％；2％；1％；0.5％；0.25％；0.1％；0.01％；0.001％；0.0001％；或甚至更少)是与遗传工程细胞不同的活细胞，例如，细菌、真菌(包括酵母)、支原体、或原生动物细胞。在本上下文中的术语“约”意味着相关百分比可以是在规定的百分比之上或之下的规定百分比的15％百分比。如此，例如，约20％可以是17％至23％。遗传工程细胞的此类培养物包括细胞和生长、贮存、或转运培养基。培养子可以是液体、半固体(例如，凝胶状培养基)、或冷冻的。培养基包括在液体中或在半固体培养基中/上生长或在贮存或转运培养基，包括冷冻贮存或转运培养基中贮存或转运的细胞。培养物在培养容器或贮存容器或基片(例如，培养皿、烧瓶、或管或贮存小瓶或管)中。

可以将本文中所描述的遗传工程细胞例如，以冷冻的细胞悬浮液在例如含有冻干保护剂诸如甘油或蔗糖的缓冲液中以冻干细胞贮存。或者，可以将它们例如以例如通过流化床干燥或喷雾干燥，或任何其它合适的干燥方法获得的干燥细胞群贮存。

通过改变的N-糖基化分子可治疗的病症

可以使用修饰为含有期望的N-聚糖的分离的靶分子来治疗多种病症，包括代谢病症、癌症和炎性病症。

(i)代谢病症

代谢病症是一种影响个体人(或动物)细胞内的能量生成的病症。大多数代谢病症是遗传的，尽管一些可以由于饮食、毒性、感染等而为“获得性的”。遗传性代谢病症又称为先天性代谢错误。一般地，遗传性代谢病症是由导致细胞的代谢过程中的一些步骤必需的缺少或不适当构建的酶的遗传缺陷引起的。最大类别的代谢病症是碳水化合物代谢的病症、氨基酸代谢的病症、有机酸代谢的病症(有机酸尿症)、脂肪酸氧化的病症和线粒体代谢、卟啉代谢的病症、嘌呤或嘧啶代谢的病症、类固醇代谢的病症、线粒体功能的病症、过氧化物酶体功能的病症、和溶酶体贮积病(LSD)。

可以经由施用本文中所描述的一种或多种糖基化分子(或其药物组合物)治疗的代谢紊乱的例子可以包括遗传性血色病(hereditary hemochromatosis)、眼皮肤白化病(oculocutaneous albinism)、蛋白C缺乏(protein C deficiency)、I型遗传性血管性水肿(type I hereditary angioedema)、先天性蔗糖酶异麦芽糖酶缺乏(congenital sucrase-isomaltase deficiency)、克里格勒-纳贾尔II型(Crigler-Najjar type II)、Laron综合征、遗传性髓过氧化酶(hereditaryMyeloperoxidase)、原发性甲状腺功能减退症(primary hypothyroidism)、先天性长QT综合征(congenital long QT syndrome)、甲状腺素-结合球蛋白缺乏(tyroxine binding globulin deficiency)、家族性高胆固醇血症(familialhypercholesterolemia)、家族性乳糜微粒血症(familial chylomicronemia)、无β脂蛋白血症(abeta-lipoproteinema)、低血浆脂蛋白A水平(low plasmalipoprotein A levels)、伴有肝损伤的遗传性肺气肿(hereditary emphysema withliver injury)、先天性甲状腺功能减退症(congenital hypothyroidism)、成骨不全(osteogenesis imperfecta)、遗传性低纤维蛋白原血症(hereditaryhypofibrinogenemia)、alpha-1抗胰凝乳蛋白酶缺乏(antichymotrypsindeficiency)、肾性尿崩症(nephrogenic diabetes insipidus)、垂体神经部尿崩症(neurohypophyseal diabetes insipidus)、腺苷脱胺酶缺陷(adenosine deaminasedeficiency)、佩利措伊斯-梅茨巴赫病(Pelizaeus Merzbacher disease)、血管性血友病(von Willebrand disease)IIA型、组合的因子V和VIII缺乏、脊椎骨骺迟缓性发育不良(spondylo-epiphyseal dysplasia tarda)、无脉络膜(choroideremia)、I细胞病(cell disease)、巴藤病(Batten disease)、共济失调毛细血管扩张症(ataxiatelangiectasias)、ADPKD-常染色体显性多囊肾病(autosomal dominantpolycystic kidney disease)、微绒毛包含病(icrovillus inclusion disease)、结节性硬化症(tuberous sclerosis)、Lowe眼脑肾综合征(oculocerebro-renal syndrome ofLowe)、肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis)、骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome)、少淋巴细胞综合征(Bare lymphocyte syndrome)、丹吉尔病(Tangier disease)、家族性肝内胆汁郁积(familial intrahepaticcholestasis)、X连锁肾上腺脑白质营养不良(X-linked adreno-leukodystrophy)、Scott综合征、Hermansky-Pudlak综合征1和2型、Zellweger综合征、肢根性点状软骨发育不良(rhizomelic chondrodysplasia puncta)、常染色体隐性原发性高草酸尿(autosomal recessive primary hyperoxaluria)、Mohr Tranebjaerg综合征、脊髓延髓肌肉萎缩症(spinal and bullar muscular atrophy)、原发性纤毛运动障碍(primary ciliary diskenesia)(Kartagener氏综合征)、巨大症(giantism)和肢端肥大症(acromegaly)、乳溢(galactorrhea)、阿狄森氏综合征(Addison’s disease)、肾上腺性男性化(adrenal virilism)、Cushing氏综合征、酮酸中毒(ketoacidosis)、原发性或继发性醛甾酮增多症(aldosteronism)、Miller Dieker综合征、无脑回(lissencephaly)、运动神经元病(motor neuron disease)、Usher氏综合征、Wiskott-Aldrich综合征、Optiz综合征、享廷顿氏病(Huntington’s disease)、遗传性胰腺炎(hereditary pancreatitis)、抗磷脂综合征(anti-phospholipidsyndrome)、重叠结缔组织病(overlap connective tissue disease)、舍格伦氏综合征(

syndrome)、僵体综合征(stiff-man syndrome)、Brugada综合征、芬兰型先天性肾炎综合征(congenital nephritic syndrome of the Finnish type)、杜宾-约翰逊综合征(Dubin-Johnson syndrome)、X-连锁低磷血症(X-linkedhypophosphosphatemia)、彭德莱综合征(Pendred syndrome)、持续性幼儿型胰岛素过度分泌低血糖症(persistent hyperinsulinemic hypoglycemia of infancy)、遗传性球形红细胞增多症(hereditary spherocytosis)、无血浆铜蓝蛋白(aceruloplasminemia)、婴儿神经元蜡样质脂褐质沉积症(infantile neuronalceroid lipofuscinosis)、假性软骨发育不全(pseudoachondroplasia)和多发性骨骺、Stargardt样黄斑营养不良(multiple epiphyseal，Stargardt-like maculardystrophy)、X-连锁夏科-马里-图思病(X-linked Charcot-Marie-Tooth disease)、常染色体显性色素性视网膜炎(autosomal dominant retinitis pigmentosa)、Wolcott-Rallison综合征、库兴氏病(Cushing’s disease)、角膜缘带肌营养不良(limb-girdle muscular dystrophy)、粘多糖病(mucoploy-saccharidosis)IV型、芬兰型遗传性家族型淀粉样变(hereditary familial amyloidosis of Finish)、安徒生病(Anderson disease)、肉瘤(sarcoma)、慢性骨髓单核细胞性白血病(chronicmyelomonocytic leukemia)、心肌病(cardiomyopathy)、面生殖发育异常(faciogenital dysplasia)、Torsion病、亨廷顿(Huntington)和脊髓小脑共济失调(spinocerebellar ataxias)、遗传性高同种半胱氨酸血症(hereditaryhyperhomosyteinemia)、多神经病(polyneuropathy)、下位运动神经元病(lowermotor neuron disease)、色素性视网膜炎(pigmented retinitis)、血清阴性多关节炎(seronegative polyarthritis)、间质性肺纤维化(interstitial pulmonary fibrosis)、雷诺氏现象(Raynaud’s phenomenon)、韦格纳氏肉芽肿病(Wegner’sgranulomatosis)、蛋白尿(preoteinuria)、CDG-Ia、CDG-Ib、CDG-Ic、CDG-Id、CDG-Ie、CDG-If、CDG-IIa、CDG-IIb、CDG-IIc、CDG-IId、Ehlers-Danlos综合征、多发性外生骨疣(multiple exostoses)、格里塞利综合征(Griscellisyndrome)(1型或2型)、或X-连锁非特异性智力低下(X-linked non-specificmental retardation)。另外，代谢紊乱还可以包括溶酶体贮积病症，诸如但不限于法布里病(Fabry disease)、法韦尔病(Farber disease)、戈谢病(Gaucherdisease)、GM1-神经节苷脂贮积病(gangliosidosis)、泰-萨克斯(Tay-Sachs)病、桑德霍夫病(Sandhoff disease)、GM2激活物病(activator disease)、克拉伯病(Krabbe disease)、异染性脑白质营养不良(metachromatic leukodystrophy)、尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease)(A、B、和C型)、胡尔勒病(Hurler disease)、谢伊病(Scheie disease)、亨特病(Hunter disease)、桑菲列普病(Sanfilippodisease)、莫尔丘病(Morquio disease)、马-拉病(Maroteaux-Lamy disease)、透明质酸酶缺乏(hyaluronidase deficiency)、天冬氨酰基葡萄糖胺尿(aspartylglucosaminuria)、岩藻糖苷贮积症(fucosidosis)、甘露糖苷贮积症(mannosidosis)、欣德勒病(Schindler disease)、涎酸贮积症(sialidosis)1型、蓬佩病(Pompe disease)、致密性成骨不全症(Pycnodysostosis)、蜡样脂褐质沉积症(ceroid lipofuscinosis)、胆固醇脂贮积病(cholesterol ester storage disease)、沃尔曼病(Wolman disease)、多种硫酸酯酶缺乏症(Multiple sulfatasedeficiency)、半乳糖唾液酸沉积症(galactosialidosis)、粘脂糖症(mucolipidosis)(II、III、和IV型)、胱氨酸贮积症(cystinosis)、唾液酸贮积病(sialic acid storagedisorder)、乳糜微粒驻留病(chylomicron retention disease)伴Marinesco-

综合征、Hermansky-Pudlak综合征、Chediak-Higashi综合征、Danon病、或Geleophysic发育异常。

代谢紊乱的症状是许多的且多种多样的，并且可以包括下列一项或多项：例如，贫血(anemia)、疲劳(fatigue)、容易瘀伤(bruising easily)、低血小板(low blood platelet)、肝增大(liver enlargement)、脾增大(spleen enlargement)、骨骼衰减(skeletal weakening)、肺损伤(lung impairment)、感染(例如，胸感染(chest infections)或肺炎(pneumonias))、肾损伤(kidney impairment)、进行性脑损伤(progressive brain damage)、癫痫发作(seizures)、额外厚的胎粪(extra thickmeconium)、咳嗽(coughing)、哮鸣(wheezing)、过多唾液或粘液生成、呼吸急促(shortness of breath)、腹痛(abdominal pain)、肠闭塞(occluded bowel orgut)、生育力问题(fertility problems)、鼻中的息肉(polyps in the nose)、指/趾甲和皮肤的杵状肥大(clubbing)、手或脚疼痛(pain in the hands or feet)、毛细管扩张性疣(angiokeratoma)、出汗减少(decreased perspiration)、角膜和晶状体混浊(opacities)、白内障(cataracts)、二尖瓣脱垂(mitral valve prolapse)和/或反胃(regurgitation)、心肥大(cardiomegaly)、温度不耐性胃(temperatureintolerance)、步行困难(difficulty walking)、吞咽困难(difficulty swallowing)、进行性视觉丧失(progressive vision loss)、进行性听觉丧失(progressive hearingloss)、张力过低(hypotonia)、巨舌(macroglossia)、反射消失(areflexia)、下腰痛(lower back pain)、睡眠性呼吸暂停(sleep apnea)、端坐呼吸(orthopnea)、瞌睡(somnolence)、脊柱前凸(lordosis)、或脊柱侧弯(scoliosis)。应当理解，由于缺陷的或缺乏的蛋白质的多种多样的性质和所得疾病表型(例如，代谢紊乱的症状表现)，给定病症一般会仅呈现所述特定病症特征性的症状。例如，法布里病患者可以呈现上文提及的症状的特定亚组，诸如但不限于温度不耐性、角膜涡转(corneal whirling)、疼痛、皮疹(skin rashes)、恶心(nausea)、或腹泻(dirarrhea)。具有Gaucher综合征的患者可以呈现为伴有脾大(splenomegaly)、硬化(cirrhosis)、抽搐(convulsions)、张力过高(hypertonia)、呼吸暂停(apnea)、骨质疏松症(osteoporosis)、或皮肤变色(skin discoloration)。

在施用本文中所描述的一种或多种分子外，也可以通过合适的营养和维生素(例如，辅因子疗法)、物理疗法、和疼痛药物治疗代谢病症。

根据给定的代谢病症的特定性质，患者可以在任何年龄时呈现这些症状。在许多病例中，症状可以存在于儿童或成人早期中。例如，法勃雷病(Fabrydisease)的病症可以存在于早期年龄，例如年龄为10或11岁。

如本文中所使用的，“有风险形成代谢病症”的受试者是具有形成病症的素因，即形成由于酶中的突变所致的代谢病症的遗传素因的受试者，所述酶诸如alpha-L-艾杜糖苷酸酶、beta-D-半乳糖苷酶、beta-葡萄糖苷酶、beta-己糖胺酶(己糖胺酶)、beta-D-甘露糖苷酶、alpha-L-岩藻糖苷酶(fucosidase)、芳基硫酸酯酶B、芳基硫酸酯酶A、alpha-N-乙酰基半乳糖苷酶、天冬氨酰氨基葡糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、alpha-氨基葡萄糖苷-N-乙酰转移酶、beta-D-葡糖醛酸糖苷酶(glucoronidase)、透明质酸酶、alpha-L-甘露糖苷酶、alpha-神经氨酸酶、磷酸转移酶、酸性脂肪酶、酸性神经酰胺酶、鞘磷脂酶、硫酯酶、组织蛋白酶K、或脂蛋白脂肪酶。明显地，“有风险形成代谢病症”的受试者不是感兴趣物种内的所有受试者。

“怀疑患有病症”的受试者是具有病症诸如本文中所描述的那些病症之任一的一种或多种症状的受试者。

(ii)癌症

癌症是一类以不受控制的细胞分裂和这些通过经由侵入直接生长入相邻组织中，或者通过转移植入远距离部位(其中癌细胞经由血流或淋巴系统转运)扩散的能力为特征的疾病或病症。癌症可以影响所有年龄的人，但是风险随年龄而趋于升高。癌症的类型可以包括例如，肺癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、肝癌、骨癌、血液学癌症、神经组织癌、黑素瘤、甲状腺癌、卵巢癌、睾丸癌、前列腺癌、宫颈癌、阴道癌、或膀胱癌。

如本文中所使用的，“有风险形成癌症”的受试者是具有形成癌症的素因，即有形成癌症的遗传素因，诸如肿瘤抑制物基因中的突变(例如，BRCA1、p53、RB、或APC中的突变)或者已经暴露于可导致癌症的环境的受试者。如此，受试者也可以是在受试者已经暴露于致突变或致癌水平的某些化合物(例如，香烟烟中的致癌性化合物诸如丙烯醛、砷、苯、苯并蒽、苯并芘、钋-210(氡)、乌拉坦(Urethane)、或氯化乙烯)时“有风险形成癌症”的受试者。此外，受试者可以是在受试者已经暴露于例如大剂量的紫外光或X-照射，或者暴露于(感染)引起肿瘤/肿瘤相关病毒诸如乳头瘤病毒、埃巴病毒、乙肝病毒、或人T细胞白血病-淋巴瘤病毒时“有风险形成癌症”。从上文看，会清楚的是，“有风险形成癌症”的受试者不是感兴趣物种内的所有受试者。

“怀疑具有癌症”的受试者是具有癌症的一种或多种症状的受试者。癌症的症状是本领域技术人员公知的，并且包括但不限于乳房肿块(breastlumps)、乳头变化(nipple change)、乳房囊肿(breast cyst)、乳房疼痛(breastpain)、体重减轻(weight loss)、虚弱(weakness)、过度疲劳(excessive fatigue)、进食困难(difficulty eating)、食欲不振(loss of appetite)、久嗽(chronic cough)、气喘恶化(worsening breathlessness)、咳血(coughing up blood)、尿血(blood inthe urine)、血便(blood in stool)、恶心(nausea)、呕吐(vomiting)、肝转移(livermetastases)、肺转移(lung metastases)、骨转移(bone metastases)、肚胀(abdominalfullness)、胃气胀(bloating)、腹膜腔中的流体(fluid in peritoneal cavity)、阴道出血(vaginal bleeding)、便秘(constipation)、腹胀(abdominal distension)、结肠穿孔(perforation of colon)、急性腹膜炎(acute peritonitis)(感染、发热、疼痛)、疼痛、呕血(vomiting blood)、重度出汗(heavy sweating)、发热、高血压、贫血、腹泻、黄疸、头晕、寒战、肌肉痉挛、结肠转移、肺转移、膀胱转移、肝转移、骨转移、肾转移、和胰腺转移、吞咽困难等。从上文上，会清楚的是，“怀疑具有癌症”的受试者不是感兴趣物种内的所有受试者。

在施用本文中所描述的一种或多种改变的N-糖基化分子外，也可以通过化学治疗剂、电离辐射、免疫治疗剂、或超高温治疗(hyperthermotherapy)剂来治疗癌症。化学治疗剂包括例如，顺铂、卡铂(carboplatin)、丙卡巴肼(procarbazine)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、喜树碱(camptothecin)、阿霉素(adriamycin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、美法仑(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、白消安(bisulfan)、硝基脲(nitrosurea)、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、博来霉素(bleomycin)、普卡霉素(plicomycin)、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、Verampil、鬼臼毒素(podophyllotoxin)、他莫昔芬(tamoxifen)、泰素(taxol)、反铂(transplatinum)、5-氟尿嘧啶、长春花新碱(vincristin)、长春碱(vinblastin)、和甲氨蝶呤。

(iii)炎性病症

如本文中所使用的，“炎性病症”指一种或多种物质(例如，不天然存在于受试者中的物质)经由白血病(例如，B细胞、T细胞、巨噬细胞、单核细胞、或树突细胞)的作用不适当地触发病理学应答，例如，病理学免疫应答的过程。因而，炎性应答中牵涉的此类细胞称为“炎性细胞”。不适当触发的炎性应答可以是如下的炎性应答，其中受试者之中或之上不存在外来物质(例如，抗原、病毒、细菌、真菌)。不适当触发的应答可以是如下的应答，其中炎性细胞靶向自身组分(例如，自身抗原)(例如，自身免疫性病症诸如多发性硬化)。不适当触发的应答还可以是如下的应答，其在幅度(magnitude)或持续时间上是不适当的，例如过敏反应。如此，不适当靶向的应答可以是由于微生物感染(例如，病毒性、细菌性、或真菌性)的存在所致。炎性病症(例如，自身免疫性疾病)的类型可以包括但不限于骨性关节炎(osteoarthritis)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)、脊椎关节病(spondyloarthropathies)、POEMS综合征、克罗恩氏病(Crohn’s disease)、多中心性卡斯尔曼氏病(multicentric Castleman’s disease)、系统性红斑狼疮(systemic lupuserythematosus，SLE)、多发性硬化(multiple sclerosis，MS)、肌营养不良(muscular dystrophy，MD)、胰岛素依赖性糖尿病(insulin-dependent diabetesmellitus，IDDM)、皮肌炎(dermatomyositis)、多肌炎(polymyositis)、炎性神经病(inflammatory neuropathies)诸如Guillain Barre综合征、血管炎(vasculitis)诸如韦格纳氏肉芽肿病(Wegener’s granulomatosus)、结节性多动脉炎(polyarteritis nodosa)、风湿性多肌痛(polymyalgia rheumatica)、颞动脉炎(temporal arteritis)、斯耶格伦氏综合征(Sjogren’s syndrome)、Bechet氏综合征、丘-施二氏综合征(Churg-Strauss syndrome)、或高安氏动脉炎(Takayasu’sarteritis)。炎性病症中还包括某些类型的变态反应诸如鼻炎(rhinitis)、鼻窦炎(sinusitis)、荨麻疹(urticaria)、荨麻疹(hives)、血管性水肿(angioedema)、特应性皮炎(atopic dermatitis)、食物变态反应(food allergies)(例如，坚果变态反应)、药物变态反应(例如，青霉素)、昆虫变态反应(例如，对蜂螯伤的变态反应)、或肥大细胞增多症(mastocytosis)。炎性病症还可以包括溃疡性结肠炎和哮喘。

“有风险形成炎性病症”的受试者指具有一种或多种炎性病症的家族史(例如，一种或多种炎性病症的遗传素因)的受试者或暴露于一种或多种炎症诱导条件的受试者。例如，受试者可以已经暴露于病毒或细菌超抗原诸如但不限于葡萄球菌肠毒素(SE)、链球菌生脓外毒素(SPE)、金黄色葡萄球菌毒性休克综合征毒素(TSST-1)、链球菌有丝分裂外毒素(SME)和链球菌超抗原(SSA)。从上文看，会清楚的是，“有风险形成炎性病症”的受试者不是感兴趣物种内的所有受试者。

“怀疑具有炎性病症”的受试者是呈现为炎性病症的一种或多种症状的受试者。炎性病症的症状是本领域中公知的，并且包括但不限于发红、肿胀(例如，肿胀的关节)、触感温暖的关节、关节疼痛、僵硬、关节功能丧失、发热、寒战、疲劳、能量损失、头痛、食欲不振、肌肉僵硬、失眠、发痒(itchiness)、不通气的鼻(stuffy nose)、喷嚏(sneezing)、咳嗽(coughing)、一种或多种神经学症状诸如头晕(dizziness)、癫痫发作、或疼痛。从上文看，会清楚的是，“怀疑具有炎性病症”的受试者不是感兴趣物种内的所有受试者。

在施用本文中所描述的一种或多种分子外，也可以通过非类固醇消炎药(NSAID)、疾病缓解抗风湿药(disease-modifying anti-rheumatic drug，DMARD)、生物反应修饰剂、或皮质类固醇来治疗炎性病症。生物反应修饰剂包括例如，抗TNF剂。抗TNF剂的非限制性例子包括可溶性TNF受体或对TNF特异性的抗体，诸如阿达木单抗(adulimumab)、英夫利昔单抗(infliximab)、或依那西普(etanercept)。

以下部分中列出了适合于使用任何经改变的N-糖基化分子(或其药物组合物)来治疗本文中所描述的任何病症(例如，预防或改善其一种或多种症状)的方法。

药物组合物和治疗方法

可以将修饰为具有期望的N-聚糖的靶分子掺入药物组合物中，所述药物组合物含有治疗有效量的分子和一种或多种佐剂、赋形剂、载体、和/或稀释剂。可接受的稀释剂、载体和赋形剂通常没有不利地影响接受体的稳态(例如，电解质平衡)。可接受载体包括生物相容性、惰性或生物可吸收盐、缓冲剂、寡或多糖、聚合物、粘性改善剂、防腐剂等。一种例示性的载体是生理盐水(0.15M NaCl，pH 7.0至7.4)。另一种例示性的载体是50mM磷酸钠、100mM氯化钠。关于配制和施用药物组合物的技术的更多详情可参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences(Maack Publishing Co.，Easton，Pa.)。补充性活性化合物也可以掺入组合物中。

含有具有N-聚糖的分子的药物组合物的施用可以是系统的或局部的。可以如下配制药物组合物，使得它们适合于胃肠外和/或非胃肠外施用。具体的施用模式包括皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、经皮、鞘内、口服、直肠、含服、表面、鼻、眼、关节内、动脉内、蛛网膜下、支气管、淋巴系统、阴道、和子宫内施用。

施用可以是通过周期性注射药物组合物的推注或者可以通过自外部(例如，IV袋)或内部(例如，生物可蚀性植入物、生物人工器官、或植入的经改变的N-糖基化分子生成细胞的集落)的储库的静脉内或腹膜内施用而是不中断的或连续的。见例如美国专利No.4,407,957，5,798,113和5,800,828。可以使用合适的投递手段来实现药物组合物的施用，诸如：泵(见例如Annals ofPharmacotherapy，27：912(1993)；Cancer，41：1270(1993)；Cancer Research，44：1698(1984)；微囊化(见例如美国专利No.4,352,883；4,353,888；和5,084,350)；连续释放聚合物植入物(见例如Sabel，美国专利No.4,883,666)；macroencapsulation(见例如美国专利No.5,284,761，5,158,881，4,976,859和4,968,733及公布的PCT专利申请WO92/19195，WO 95/05452)；注射(皮下、静脉内、动脉内、肌肉内、或对其它合适的部位)；或口服施用(在胶囊、液体、片剂、丸剂、或延长释放的配制剂中)。

胃肠外投递系统的例子包括乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入输注系统、泵投递、包囊细胞投递、脂质体投递、针投递注射、无针注射、喷雾器、气雾器、电穿孔、和经皮贴片。

适合于胃肠外施用的配制剂通常含有经改变的N-糖基化分子的无菌水性制备物，其优选地是与接受体的血液等张的(例如，生理盐水溶液)。配制剂可以以单位剂量或多剂形式呈现。

适合于口服施用的配制剂可以以离散单元呈现，诸如胶囊、扁囊剂、片剂、或锭剂，它们各自含有预定量的经改变的N-糖基化分子；或水性液体或非水性液体中的悬浮液，诸如糖浆剂、酏剂、乳剂、或顿服水剂(draught)。

可以对哺乳动物(例如，人患者)以例如膏剂、喷雾剂、泡沫、凝胶、油膏、软膏、或干擦施用适合于表面施用的具有N-聚糖的分子。干擦在施用部位可以是再水合的。此类分子也可以直接输注入(例如，浸入并干燥)绷带、纱布、或贴片，其然后可以直接表面应用。此类分子也可以以半液体、胶化、或完全液体状态在供表面施用的绷带、纱布或贴片中维持(见例如美国专利No.4,307,717)。

可以以本领域技术人员可确定的剂量方案对有此需要的受试者施用治疗有效量的药物组合物。例如，可以对受试者以每剂0.01μg/kg至10,000μg/kg受试者体重的剂量系统性施用组合物。在另一个例子中，剂量是每剂1μg/kg至100μg/kg受试者体重。在另一个例子中，剂量是每剂1μg/kg至30μg/kg受试者体重，例如，每剂3μg/kg至10μg/kg受试者体重。

为了有效治疗效力，首先可以以不同给药方案施用含有N-聚糖的分子。单位剂量和方案取决于如下因素，其包括例如，哺乳动物物种、其免疫状态、哺乳动物的体重。通常，可以使用合适的筛选测定法作为临床测试规程的一部分来监测此类分子在组织中的水平，例如以测定给定治疗方案的功效。

分子的给药频率在医学从业人员(例如医生或护士)的技术和临床判断内。通常，通过可以建立最佳施用参数的临床试验来建立施用方案。然而，从业人员可以依照受试者的年龄、健康、重量、性别和医学状态来改变此类施用方案。可以根据治疗是预防性还是治疗性来改变给药频率。

可以通过例如细胞培养物或实验动物中的已知药学规程来确定此类分子或其药物组合物的毒性和治疗效力。例如，可以使用这些规程来测定LD50(对50％的群体致死的剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)。毒性与治疗效果之间的剂量比率是治疗系数，并且其可以表示为比率LD50/ED50。优选展现出大的治疗系数的药物组合物。虽然可以使用展现出毒性副作用的药物组合物，但是要注意设计如下的投递系统，其将此类化合物靶向受累组织位置以使对正常细胞(例如，非靶定细胞)的潜在损害最小化，由此降低副作用。

可以在配制合适受试者(例如，人患者)用剂量范围中使用自细胞培养测定法和动物研究获得的数据。此类药物组合物的剂量一般位于包括具有少许毒性或没有毒性的ED50的循环浓度范围内。剂量可以在此范围内变化，这取决于所采用的剂量形式和所利用的施用路径。对于如本文中所描述的那样使用的药物组合物(例如，用于治疗受试者中的代谢紊乱)，最初可以自细胞培养测定法评估治疗有效剂量。可以在动物模型中配制剂量以达到包括IC50(即，实现对症状的半最大抑制的药物组合物的浓度)的循环血浆浓度范围，如在细胞培养中所测定的。可以使用此类信息来更精确地确定人中有用的剂量。可以例如通过高效液相层析来测量血浆中的水平。

如本文中所定义的，含有N-聚糖的分子的“治疗有效量”是能够在经治疗的受试者中产生医学上期望的结果(例如，改善代谢紊乱的一种或多种症状)的分子的量。治疗有效量(即，有效剂量)可以包括每千克受试者或样品重量毫克或微克量的化合物(例如，每千克约1微克至每千克约500毫克、每千克约100微克至每千克约5毫克、或每千克约1微克至每千克约50微克)。

受试者可以是任何哺乳动物，例如，人(例如，人患者)或非人灵长类(例如，黑猩猩、狒狒、或猴)、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、沙鼠、仓鼠、马、一类牲畜(例如，母牛、猪、绵羊、或山羊)、犬、猫、或鲸。

可以对受试者以与另一种治疗，例如用于代谢紊乱(例如，溶酶体贮积病症)的治疗的联合疗法施用本文中所描述的分子或其药物组合物。例如，联合疗法可以包括对受试者(例如，人患者)施用一种或多种别的药剂，其对具有，或有风险形成，(或怀疑具有)代谢紊乱(例如，溶酶体贮积病症)的受试者提供治疗益处。如此，可以同时施用化合物或药物组合物和一种或多种别的药剂。或者，可以第一次施用所述分子，而第二次施用一种或多种别的药剂，或者反之亦然。

应当领会，在先前的疗法是特别有毒性(例如，具有显著副作用概况的用于代谢紊乱的治疗)的情况中，可以使用本文中所描述的分子的施用来以如下的水平抵消和/或减少先前疗法的量，从而足以给出相同或改善的治疗益处，而没有毒性。

本文中所描述的任何药物组合物可以与施用用法说明书一起包含在容器、包装、或分配器中。

以下是本发明实施的实施例。它们不应解释为以任何方式限制本发明的范围。

实施例

表2含有用于下文所描述的实验的所有菌株的列表。在表2中，MH＝加有HDEL标签的α-1，2-甘露糖苷酶；ζ＝经由zeta序列的随机整合；停靠(docking)Δ＝对特定基因座的整合；且(H)＝潮霉素抗性的。

实施例1：解脂耶氏酵母OCH1破坏

在解脂耶氏酵母菌株pold lnuga(一种具有营养缺陷型leu2-，ura3-，gut2-和ade2-的菌株)中完整糖工程化改造的蛋白质表达菌株的生成。建立敲除解脂耶氏酵母中的OCH1(GenBank登录号：AJ563920)基因的策略，如对LIP2基因所描述的(Fickers等，2003J Microbiol Methods.55(3)：727-37)。OCH1基因遵循的基因构建策略记载于美国专利公开文本No.20090069232-A1。所得的载体称作pYlOCH1 PUT TOPO(图1B)。

通过SpeI/Bst1107I限制性消化来自质粒分离OCH1KO片段，并将其转化至解脂耶氏酵母菌株pold lnuga。获得几种尿嘧啶原养型菌株，并使用引物Yloch1 prom fw(5’-TCGCTATCACGTCTCTAGC-3’，SEQ ID NO：1)和Yloch1term rev(5’-ACTCTGTATACTTGTATGTACTGTGAGAC-3’，SEQ ID NO：2)通过对基因组DNA(gDNA)的PCR来筛选以分析质粒的基因组整合。对测试的几个克隆扩增正确大小(即，2328bp对野生型中的1894bp)的片段。还通过对分泌入生长培养基中的总糖蛋白集合(＝分泌物组)的N-聚糖分析来确定OCH1基因的敲除：Man₈GlcNAc₂结构已经变为糖概况内的主要N-聚糖(图2)。此概况与野生型菌株的概况不同，所述野生型菌株的概况含有较高的Man₉GlcNAc₂量(由于Ochlp活性，后一种最有可能含有额外的甘露糖)以及一些具有甚至更高甘露糖残基数目的结构。

为了除去URA3基因，用含有Cre重组酶的表达盒的附加体质粒pUB4-Cre(Fickers等，2003，见上文)转化阳性Δoch1克隆(称作G013，见表2)。使用引物Yloch1 prom fw和Yloch1 term rev(见上文)通过对gDNA的PCR来筛选URA3基因的除去。切除URA3标志物的克隆不再导致2328bp条带的扩增；取而代之，获得1075bp(excl.URA3)的PCR片段。在分泌物组的N-聚糖水平上检查阳性克隆，并且显示了与非消除的菌株的概况非常相似的概况(图2)。选择消除菌株之一(称作G014，见表2)以进一步N-聚糖工程化改造。

实施例2：通过随机整合或靶向性/停靠性整合来过表达ER保留的α-1，2-甘露糖苷酶

为了实现附接于由Δoch1菌株表达的糖蛋白的Man₅GlcNAc₂的生成，表达α-1，2-甘露糖苷酶以将Man₈GlcNAc₂切割为Man₅GlcNAc₂(即，高尔基型α-1，2-甘露糖苷酶活性)。应当将此类甘露糖苷酶靶向至分泌系统。与酿酒酵母前交配因子原融合且用HDEL序列(SEQ ID NO：21)加标签以将其定位于ER中的里氏木霉(Trichoderma reesei)α-1，2-甘露糖苷酶(Genbank登录号AF212153)能够在毕赤酵母及里氏木霉和黑曲霉素中在体内将Man₈GlcNAc₂修剪成Man₅GlcNAc₂。生成表达构建体，其中将加有HDEL标签的里氏木霉α-1，2-甘露糖苷酶的经密码子优化的型式与解脂耶氏酵母LIP2前信号序列融合，并且在TEF1、Hp4d(Madzak等，2000，J.Mol.Microbiol.Biotechnol.2：207-216)、GAP或POX2启动子的转录控制下放置。这些质粒的构建策略记载于美国专利公开文本No.20090069232-A1。

使用这些中的两种载体pYLHUXdL2preManHDEL和pYLTUXdL2preManHDEL(图3)(具有在Hp4d resp.TEF1启动子的转录控制下甘露糖苷酶)来转化菌株G014(源自实施例1)。用NotI消化载体以容许经由zeta序列对基因组的随机整合。选择URA3原养型转化体以进行N-聚糖分析。几种转化体显示Man₈GlcNAc₂向Man₅GlcNAc₂的清楚转化(图4)。因为在TEF1启动子控制下表达甘露糖苷酶的克隆显示缓慢的且成块的生长表型(这些克隆之一称作G016)，所以在其中的基因在Hp4d转录控制下的菌株背景中完成糖工程中的进一步步骤。

选出在hp4d启动子控制下表达ManHDEL的一个阳性克隆(G018)，经由表达Cre-重组酶的质粒pRRQ2的瞬时转化自所述阳性克隆消除URA3标志物(Richard等，2001 J.Bacteriol.183：3098-3107)。在该规程后选出几个ura3-克隆，并且使用一个克隆(G036)(其在分泌物组上显示清楚的Man₅GlcNAc₂概况)来进行进一步的工程化改造工作(图4)。对此克隆的Southern分析揭示了一个随机整合的甘露糖苷酶表达盒的存在。使用经DIG标记的甘露糖苷酶特异性PCR片段对经Hind III消化的基因组DNA实施此Southern分析，所述PCR片段是使用引物Man(5’-GCCTTCCAGACCTCTTGGAACGCCTACCACC-3’，SEQ ID NO：22)和Man rev(5’-GCCAGGTGGCCGCCTCGTCGAGAAGAAGATCG-3’，SEQ ID NO：23)来生成的。

在一种备选的策略中，生成两种构建体，其容许Hp4d驱动的甘露糖苷酶表达盒对耶氏酵母基因组的LEU2或AXP1基因座的靶向整合。图5中描绘了这些质粒JME926 pPTLeu2-ADE2ex-Hp4dManHDEL(Yl)和OXYP289 pPTAxp1-LEU2ex-Hp4dManHDEL(Yl)的构建。在转化至菌株G014前，用NotI消化这两种构建体，并分离相应的表达盒。选定的ADE2原养型克隆已经潜在地将甘露糖苷酶表达盒整合入LEU2基因座中，而LEU2原养型已经潜在地将该盒整合入AXP1基因座中。通过Southern分析来检查转化体以评估对基因组的正确靶向。这使用经DIG标记的甘露糖苷酶特异性PCR片段对经BamHI消化的(在LEU2基因座中整合)或经HindIII消化的(在AXP1基因座中整合)基因组DNA实施，所述PCR片段使用引物Man(5’-GCCTTCCAGACCTCTTGGAACGCCTACCACC-3’，SEQ ID NO：22)和Man rev(5’-GCCAGGTGGCCGCCTCGTCGAGAAGAAGATCG-3’，SEQ IDNO：23)来生成。还对选定的克隆检查合成到分泌性糖蛋白上的N-聚糖的性质。在大多数情况中，正确靶向的Hp4d驱动的α-1，2-甘露糖苷酶表达导致主要地Man₅GlcNAc₂寡糖的合成(图6)。对于每个靶定的基因座，选出一个甘露糖苷酶表达克隆(在LEU2停靠的情况中为G046；在AXP1停靠的情况中为G053)以使用质粒pRRQ2(对于菌株G046)和pUB4-Cre(对于菌株G053)经由Cre重组酶的瞬时表达来消除。经由Southern印迹来再次检查所得的消除菌株(分别为G055和G054)，并使用DSA-FACE经由N-聚糖分析来确认其Man₅GlcNAc₂概况。

实施例3：GlcNAc转移酶I的表达

生成经耶氏酵母密码子优化的序列以表达融合蛋白，该融合蛋白由酿酒酵母Kre2蛋白(SwissProt AccNo P27809)的前100个N端氨基酸和后面的人GlcNAc转移酶I(SwissProt AccNo P26572)的催化域(图7，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)组成。酵母Kre2p 100个N端氨基酸充当GnT I催化域的高尔基定位信号。这样，确保GnT I融合蛋白比ER保留的加有HDEL标签的α-1，2-甘露糖苷酶更晚地定位于分泌途径中以使酶能够将蛋白质连接的N-聚糖自Man₅GlcNAc₂转化成GlcNAcMan₅GlcNAc₂。将用于表达融合蛋白质的经密码子优化的合成基因在TEF1或Hp4d启动子的转录控制下放置，生成质粒pYLTmAXhGnTI和pYLHp4mAXhGnTI。图8中显示了构建策略。Kre2-GnT I融合蛋白的功能性表达应当导致β-1，2连接的GlcNAc残基添加至可用的Man₅GlcNAc₂聚糖上，导致GlcNAcMan₅GlcNAc₂的合成。

将质粒pYLTmAXhGnTI and pYLHp4mAXGnTI用NotI消化，之后转化至菌株G036(参见实施例2)，已知在其分泌性蛋白质上生成Man₅GlcNAc₂N-聚糖。对转化体选择尿嘧啶原养型。对这些中的几个克隆的分泌物组上的N-糖基化概况的分析显示了N-聚糖样式的清楚变化：Man₅GlcNAc₂显著减少，并且出现新峰，其代表具有更高分子量的N-聚糖(额外的约一个葡萄糖单元)。用刀豆β-N-乙酰基己糖胺酶(即，一种能够除去末端β-连接的GlcNAc残基的酶)处理分离的N-聚糖指示新的N-聚糖是GlcNAcMan₅GlcNAc₂：新峰消失，并且完全转化成Man₅GlcNAc₂(图9)。根据所使用的培养方法，证明了约70％的总N-聚糖集合是GlcNAcMan₅GlcNAc₂(其中约77％的可用Man₅GlcNAc₂被转化)。

将一种在TEF1启动子控制下表达Kre2-GnT I融合蛋白的转化体命名为菌株G040，并选出以进一步使用。经由Southern印迹对此菌株的基因组分析指示一个表达盒的存在。使用经DIG标记的GnT I特异性PCR片段对经BamHI消化的基因组DNA完成Southern分析，所述PCR片段使用引物5’-GGATGATCACACAATGGCCCTGTTTCTG-3’(SEQ ID NO：5)和5’-TGCTCTAGACTAGTTCCAAGAGGGGTC-3’(SEQ ID NO：6)来生成。对菌株G040对携带1至3个拷贝(通过同一Southern印迹确认)的Hp4d驱动的Kre2-GnT I表达盒的菌株的分泌物组上的糖基化概况的分析没有显示GlcNAc转移性能的显著差异。

实施例4：甘露糖苷酶II的表达

生成经耶氏酵母密码子优化的序列以表达融合蛋白，该融合蛋白由酿酒酵母Mnn2蛋白(SwissProt AccNo P38069)的前36个N端氨基酸和其后的黑腹果蝇甘露糖苷酶II(SwissProt AccNo Q24451)的催化域(图10，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8)组成。酵母Mnn236个N端氨基酸充当Man II催化域的高尔基定位信号。这样，确保Mnn2-Man II融合蛋白与/比Kre2-GnT I融合蛋白同时或甚至更晚的位置定位于分泌途径中，并且因此能够将GlcNAcMan₅GlcNAc₂转化为GlcNAcMan₃GlcNAc₂。将用于表达融合蛋白的经耶氏酵母密码子优化的合成基因在TEF1启动子的转录控制下放置，生成质粒pYLTmAXDmManII和pYLTmAXDmManII(LEU2ex)。图11中显示了构建策略。

将质粒pYLTmAXDmManII(LEU2ex)用NotI消化，之后转化至菌株G040(见实施例3)，已知这在其分泌性蛋白质上生成GlcNAcMan₅GlcNAc₂N-聚糖。对转化体选择尿嘧啶原养型。对这些中的几个克隆的分泌物组上的N-糖基化概况的分析显示了N-聚糖样式的变化：出现代表具有约2个葡萄糖单元的更低分子量的N-聚糖的新峰，这可以指示GlcNAcMan₃GlcNAc₂及如此部分甘露糖苷酶II活性的形成。还出现另一个峰，在与Man₅GlcNAc₂几乎相同的位置(即，峰的肩部)运行，潜在地代表GlcNAcMan₄GlcNAc₂。后一种结构可以是部分修剪事件的结果，其中甘露糖苷酶II活性仅除去一个甘露糖残基，而不是2个。用刀豆β-N-乙酰基己糖胺酶处理分离的N-聚糖由于末端GlcNAc残基的丧失而导致具有约1个葡萄糖单元的聚糖样式的向左移动以及如此更高的电泳迁移率(图12)。这进一步确认由于功能性甘露糖苷酶II活性的表达自GlcNAcMan₅GlcNAc₂生成GlcNAcMan₄GlcNAc₂和GlcNAcMan₃GlcNAc₂。根据所使用的培养方法，证明了约15％的总N-聚糖集合是GlcNAcMan₃GlcNAc₂：约35％的可用GlcNAcMan₅GlcNAc₂损失1或2个甘露糖残基，其中20％被完全修剪成GlcNAcMan₃GlcNAc₂。

实施例5：半乳糖基转移酶I的表达

具有末端半乳糖残基的N-聚糖的合成不仅取决于分泌途径内功能性且定位良好的半乳糖基转移酶的存在，而且还取决于UDP-Gal，即酶使用的供体底物的利用度。虽然一般认为UDP-Glc和UDP-GlcNAc在酵母生物体的高尔基体中足够可用，但是这对于UDP-Gal已知较少。为了克服糖工程化改造期间的潜在UDP-Gal缺乏，先前已经在毕赤酵母中尝试将粟酒裂殖酵母UDP-Glc-4-差向异构酶(由GAL10样基因SPBC365.14c-SwissProt AccNoQ9Y7X5编码)和人β-1，4-半乳糖基转移酶I(GalT I)(SwissProt AccNo P15291)的催化域的融合蛋白靶向入酵母高尔基体中(Bobrowicz等，Glycobiology14(9)：757-766，2004)。通过使用酿酒酵母Mnn2p的前46个N端氨基酸作为N端靶向信号来实现Gal10p-GalT I融合蛋白在分泌途径内的定位，优选地在GlcNAc转移和甘露糖苷酶II活性已经对注定分泌的蛋白质的N-聚糖起作用的位置。

因此，生成经耶氏酵母密码子优化的序列以表达融合蛋白，该融合蛋白由酿酒酵母Mnn2蛋白的前46个N端氨基酸、接着的粟酒裂殖酵母Gal10样蛋白和人GalT I的催化域组成(图13)。将所得的合成基因在TEF1启动子的转录控制下放置，生成质粒pYLTmAXSpGal10hGalTI和pYLTmAXSpGal10hGalTI(ADE2ex)。图14中显示了构建策略。

将质粒pYLTmAXSpGal10hGalTI(ADE2ex)用NotI消化，之后转化至菌株G040(见实施例3)，已知这在其分泌性蛋白质上生成GlcNAcMan₅GlcNAc₂ N-聚糖。对转化体选择其腺嘌呤原养型。对这些中的几个克隆的分泌物组上的N-糖基化概况的分析显示了N-聚糖样式的变化：出现新峰，在Man₇GlcNAc₂与Man₈GlcNAc₂间的位置处运行(图15)。用肺炎链球菌(Streptococcuspneumonia)β-1，4-半乳糖苷酶处理N-聚糖指示峰代表GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂，因此此体外消化导致此新峰的消失和GlcNAcMan₅GlcNAc₂的高得相等的增加。

使用此设置并且根据生长条件，将约75％的GlcNAcMan₅GlcNAc₂转化成GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂。半乳糖基化结构的总量占总N-聚糖集合的约25％。然而，从体外α-1，2-甘露糖苷酶消化看，清楚的是大量的高甘露糖N-聚糖被转化成Man₅GlcNAc₂(图15)。根据所使用的培养基，Man₅GlcNAc₂向GlcNAcMan₅GlcNAc₂的转化率也低于在G040亲本菌株中观察到的。这最有可能与对此Mnn2-Gal10-GalT I融合蛋白的转化体观察到的生长率较慢相关。

实施例6：YlALG3的敲除和YlALG6的同时过表达

为了容许生成Man₃GlcNAc₂平台，需要将菌株G036(pold lnuga Δoch1+Hp4d驱动的α-1，2-甘露糖苷酶)的ALG3基因灭活。这导致ER定位的Alg3pα-1，6-甘露糖基转移酶活性的丧失，并且改变脂质连接的N-聚糖前体结构的组成。此结构转移至初生多肽链的N-糖基化位点使得有可能将酵母糖基化概况转化成哺乳动物样N-聚糖结构，而不需要表达甘露糖苷酶II。然而，因为此新的脂质连接的结构不如初生多肽一样有效地转移，所以需要同时过表达耶氏酵母ALG6基因(编码ER定位的Alg6p α-1，3-葡萄糖基转移酶)以尽可能减少糖基化下的潜在蛋白质。

先前构建称作pYLalg3PUT-ALG6的载体(图16)以容许同时的YlALG3敲除和Hp4d驱动的YlALG6过表达。见美国专利公开文本No.20090069232-A1。将此载体的NotI/PacI片段(其含有此敲除/敲入(knock-in)盒)转化入解脂耶氏酵母G036中，并将转化体基于其尿嘧啶原养型进行选择。经由对分泌物组的N-聚糖分析来直接筛选已经正确整合所述构建体的克隆。在80个筛选的克隆中，2个克隆显示如下的N-糖基化概况，其可以与表达ER定位的α-1，2-甘露糖苷酶的菌株中的YlALG3灭活一致。除了一定分数的Man₃GlcNAc₂聚糖外，仍有一些Man_4’GlcNAc₂和Man_5’GlcNAc₂以及大量的葡萄糖基化的N-聚糖(GlcMan_5’GlcNAc₂和Glc₂Man_5’GlcNAc₂)。后一种是葡萄糖苷酶II的无效修剪的结果(Grinna和Robbins，J.Biol.Chem.255，2255-2258，1980)。通过用α-1，2-甘露糖苷酶在体外处理N-聚糖来确认Man₄GlcNAc₂和Man₅GlcNAc₂结构的性质(图17)。根据所使用的生长条件，Man₃GlcNAc₂的水平可以升高至占总N-聚糖集合的多至60％，其中葡萄糖基化峰对α-1，2-甘露糖苷酶是不敏感的，而对刀豆α-甘露糖苷酶处理(可以对α-1，2-、α-1，3-和α-1，6连接的甘露糖残基起作用的非特异性α-甘露糖苷酶)仅略敏感。相反，后一种酶将生成的Man₃GlcNAc₂转化成Man₁GlcNAc₂(图17)。

两种阳性转化体之一称作G039，并且用于进一步糖工程工作。用表达Cre-重组酶的pRRQ2瞬时转化该菌株以容许消除URA3标志物，该URA3标志物在用载体pYLalg3PUT-ALG6转化G036后引入。分析显示了糖基化概况在消除后保持相同。选择一种消除菌株以进一步使用，并称作G045。

实施例7：GlcNAc转移酶I在Man₃GlcNAc₂生成菌株中的表达

与实施例3中完成的事情相似，经由表达Kre2-GnT I融合蛋白来实现GnTI活性的引入。以三种方式实现GnT I的此类表达构建体的随机整合：1)用经NotI消化的载体pYLTmAXhGnTI(Hygr ex)转化非消除菌株G039(见实施例6)，并且最初将GnT I表达克隆基于其幸免于对选择板添加的300μg/ml潮霉素的能力来选择，2)用经NotI消化的载体pYLTmAXhGnTI(也可见实施例3)转化消除菌株G045(见实施例6)，并且最初将GnT I表达克隆基于其尿嘧啶原养型来选择或者3)用经NotI消化的载体pYLHp4mAXhGnTI转化消除菌株G045(见实施例6)，并且最初将GnT I表达克隆基于其尿嘧啶原养型选择。图18中显示了pYLTmAXhGnTI(Hygr ex)的构建策略。在使用质粒pYLTmAXhGnTI(Hygr ex)和pYLTmAXhGnTI时，GnT I的表达在TEF1启动子的转录控制下；在使用质粒pYLHp4mAXhGnTI时，GnT I表达在Hp4d启动子的控制下。

用pYLTmAXhGnTI(Hygr ex)转化G039生成三个如下的克隆，其仅在比预期更长的温育期后出现在培养板上。然而，对这些克隆的分泌物组的N-糖基化概况的分析显示了N-聚糖样式的清楚变化：存在于非转化的G039菌株中的Man₃GlcNAc₂显著降低或几乎完全缺乏，而出现新峰，其代表具有更高分子量的N-聚糖(额外的约1个葡萄糖单元)。用刀豆β-N-乙酰基己糖胺酶(即，一种能够除去末端β-连接的GlcNAc残基的酶)处理分离的N-聚糖指示新的N-聚糖确实是GlcNAcMan₃GlcNAc₂。新峰消失，并且完全转化成Man₃GlcNAc₂(图19)。使用所评估的转化体之一来进行进一步的糖工程工作，并且命名为G047。在用pYLTmAXhGnTI(G048)或用pYLHp4mAXhGnTI(G056)转化消除菌株G045时也获得类似的结果。选出菌株G056以使用质粒pRRQ2经由Cre重组酶的瞬时表达来消除。所得的菌株称作G058。

根据所使用的培养方法，证明菌株G047的约70％的总N-聚糖集合是GlcNAcMan₃GlcNAc₂，其中一些保留Glc_1-2Man_5’GlcNAc₂，并且几乎不存在Man₃GlcNAc₂(转化率＞＞90％)(图19)。不管高转化率，经由Southern印迹在此菌株中仅可以鉴定出一个拷贝的GnT I表达盒。使用经DIG标记的GnT I特异性PCR片段对经BamHI消化的基因组DNA完成Southern分析，所述PCR片段使用引物5’-GGATGATCACACAATGGCCCTGTTTCTG-3’(SEQ ID NO：11)和5’-TGCTCTAGACTAGTTCCAAGAGGGGTC-3’(SEQ ID NO：12)来生成。

在一个备选的策略中，生成构建体JME925pPTAde2-URA3ex-Hp4dhGnTI以容许Hp4d驱动的GnT I表达盒靶向整合入耶氏酵母基因组的ADE2基因座中。图20中描绘了该构建策略。在转化至菌株G045前，将质粒用NotI消化，并分离靶向/表达盒。将转化体基于其腺嘌呤原养型来选择。使用正向引物Ver1Ade2(5’-CGACGATAGAGCAGGTCTCACTGTTGGGAATGCTG-3’，SEQ IDNO：13)反向引物Ver2Ade2(5’-CTACACTGACGAAGTGGACATCCCGGCTTGGACTG-3’，SEQ IDNO：14)经由PCR来检查表达盒对ADE2基因座的正确整合，并且经由Southern印迹来进一步确认。这使用经DIG标记的GnT I特异性PCR片段对经BamHI/SpeI消化的基因组DNA完成，所述PCR片段使用引物5’-GGATGATCACACAATGGCCCTGTTTCTG-3’(SEQ ID NO：15)和5’-TGCTCTAGACTAGTTCCAAGAGGGGTC-3’(SEQ ID NO：16)来生成。经由N-聚糖分析和体外刀豆β-N-乙酰基己糖胺酶处理来确认将GlcNAcMan₃GlcNAc₂合成至分泌物组上(图21)。选出一个GnT I表达转化体(称作G057)以使用质粒pRRQ2经由Cre转化酶的瞬时表达来消除。所得的菌株称作G059。

实施例8：GlcNAc转移酶II的表达

生成经耶氏酵母密码子优化的序列以表达融合蛋白，该融合蛋白由酿酒酵母Mnn2蛋白(SwissProt AccNo P38069)的前36个N端氨基酸和其后的大鼠GlcNAc转移酶II(GnT II)(SwissProt AccNo Q09326)的催化域(图22，SEQ IDNO：17和SEQ ID NO：18)组成。酵母Mnn236个N端氨基酸充当GnT II催化域的高尔基体定位信号。这样，确保Mnn2-GnT II融合蛋白与/比Kre2-GnT I(和Mnn2-Man II)融合蛋白相同或甚至更晚的位置定位于分泌途径中，并且因此能够将GlcNAcMan₃GlcNAc₂转化成GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂。将用于表达融合蛋白的合成基因在TEF1启动子的转录控制下放置，生成质粒pYLTmAXrGnTII和pYLTmAXrGnTII(ADE2ex)。图23中显示了构建策略。

以两种不同的方式生成表达GnT II活性的菌株：1)用经NotI消化的pYLTmAXhGnTI和经NotI消化的pYLTmAXrGnTII(ADE2 ex)同时转化菌株G045(见实施例6)，并将转化体基于其尿嘧啶和腺嘌呤原养型来选择或者2)用经NotI消化的pYLTmAXrGnTII(ADE2ex)转化菌株G047(实施例7)，并将转化体基于其腺嘌呤原养型来选择。使用正向引物TefPromFW5’-GTCCCCGAATTACCTTTCC-3’(SEQ ID NO：19)和反向引物Lip2TermRV5’-AGGTAGAAGTTGTAAAGAGTG-3’(SEQ ID NO：20)来检查表达盒的整合。与用刀豆β-N-乙酰基己糖胺酶在体外处理分离的糖组合的对分泌物组的N-聚糖分析指示几种转化体能够生成GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂，并且如此能够表达功能性GnT II活性(图24)。在一种选定的条件中，占总N-聚糖集合的约40％由GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂组成。底物GlcNAcMan₃GlcNAc₂至GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂的转化率是90％。最终选定的菌株称作G050(G045的双重转化)和G051(G047中的GnT II表达)。

实施例9：葡萄糖苷酶II alpha和beta亚基(Gls2α和Gls2β)的表达

基于实施例6至8中所描述的实验，牵涉YlALG3的敲除和YlALG6的同时过表达的策略导致携带一个或两个末端葡萄糖残基的N-聚糖(Glc_1-2Man_5’GlcNAc₂)的生成。这些葡萄糖残基的存在阻碍ER定位的加有HDEL标签的α-1，2-甘露糖苷酶实现的向Man₃GlcNAc₂的转化。为了除去葡萄糖残基，需要提高ER内的葡萄糖苷酶II活性。在没有α-1，2-甘露糖苷酶表达的背景中，黑曲霉素葡萄糖苷酶II alpha和beta亚基的过表达导致最高的Glc_1-2Man_5’GlcNAc₂至Man_5’GlcNAc₂转化(美国专利公开文本No.20090069232-A1)。如下生成用于过表达黑曲霉gls2亚基的构建体：1)生成经耶氏酵母密码子优化的cDNA以表达成熟的(缺乏信号肽)黑曲霉gls2α和gls2β亚基；2)将cDNA以符合读码框的方式克隆至解脂耶氏酵母LIP2前序列；3)将所得的LIP2前-gls2α和LIP2前-gls2β序列在组成性TEF1启动子的转录控制下克隆。所得的质粒称作pYLTUXdL2preAnGlcIIα和pYLeu2ExTEFpreLip2AnGlucIIβ(图25)。

基于这些质粒，生成新构建体以在TEF1启动子控制(用于靶向整合的载体JME923 pPTura3-LEU2ex-TefL2preAnGlcIIa+b[altl]-图26)或Hp4d启动子控制(用于靶向整合的载体JME923pPTura3-LEU2ex-Hp4dL2preAnGlcIIa+b[alt 1]和用于随机整合的载体Zeta-LEU2ex-Hp4dL2preAnGlcIIa+b[alt]-图27)下同时过表达黑曲霉gls2α和gls2β亚基。

用经NotI消化的质粒JME923pPTura3-LEU2ex-Hp4dL2preAnGlcIIa+b[alt1]和Zeta-LEU2ex-Hp4dL2preAnGlcIIa+b[alt]转化菌株G057(见实施例7)，并将转化体基于其亮氨酸原养型来选择。经由PCR和Southern分析在基因组上分析几个克隆以评估gls2α和gls2β表达盒的整合。使用引物AnGls2α-FW(5’-GCTGGACTCTTCTTCTATCC-3’)(SEQ ID NO：24)和AnGls2α-RV(5’-GGTCTCCTTCAGAGACAGG-3’)(SEQ ID NO：25)来完成对于gls2α亚基的PCR分析和DIG探针生成；对于gls2β亚基，我们利用引物AnGls2β-FW(5’-CCAAGTTCTACAAGGACACC-3’)(SEQ ID NO：26)和AnGlc2β-RV(5’-CCCTTGACGACCTTAGAGG-3’)(SEQ ID NO：27)。在使用gls2α探针时对经Eco47III消化的DNA，及在使用gls2β探针时对经SpeI/SfiI消化的gDNA完成用于检查双重Hp4dGls2α/β表达盒的靶向整合的Southern分析。大多数选定的克隆显示双重表达盒对URA3基因座的正确整合。用这两种探针对经PvuI消化的gDNA检查对双重Hp4dGls2α/β表达盒的随机整合的Southern分析。在所有情况中，仅整合一个拷贝的双重表达盒。

接着，对几个确认为已经(正确)整合双重Hp4dGls2α/β表达盒的克隆实施N-聚糖分析。在三天的Falcon培养后对总的分泌性蛋白质检查N-糖基化。几个克隆显示葡萄糖基化糖的显著减少和Man₃GlcNAc₂和GlcNAcMan₃GlcNAc₂的增加。图28中显示了在一方面已经随机(＝菌株G060)和在另一方面以靶向性方式(＝菌株G061)整合双重表达盒的克隆的概况。两个较小的峰代表Man_4’GlcNAc₂和Man_5’GlcNAc₂，因为它们在用α-1，2-甘露糖苷酶和刀豆甘露糖苷酶处理后分别移向Man₃GlcNAc₂和Man₁GlcNAc₂。后一种处理还导致剩余的Glc_1-2Man_5’GlcNAc₂部分转化成Glc_1-2Man_4’GlcNAc₂和GlcNAcMan₃GlcNAc₂部分转化成GlcNAcMan₂GlcNAc₂。然而，Man_4’GlcNAc₂和Man_5’GlcNAc₂的存在指示由异源共表达的加有HDEL标签的α-1，2-甘露糖苷酶实现的对Man₃GlcNAc₂的不完全转化。类似地，Man₃GlcNAc₂的存在指示重组人GnT I不完全转移GlcNAc残基，从而获得GlcNAcMan₃GlcNAc₂。然而，基于上文所描述的结果(例如在实施例7中的G047培养，图19)，清楚的是，培养条件的差异可以显著提高转化率，并且如此改善最终结果。

实施例10：GlcNAc转移酶II在GlcNAcMan₃GlcNAc₂生成菌株G061中的表达

如实施例8中所描述的，生成经耶氏酵母密码子优化的序列以表达融合蛋白，其由酿酒酵母Mnn2蛋白(SwissProt AccNo P38069)的前36个N端氨基酸和接着的大鼠GlcNAc转移酶II(GnT II)(SwissProt AccNo Q09326)的催化域(图22，分别为SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18)组成。酵母Mnn236个N-端氨基酸充当GnT II催化域的高尔基定位信号。这样，确保Mnn2-GnT II融合蛋白与/比Kre2-GnT I融合蛋白相同或甚至更晚的位置定位于分泌途径中，并且因此能够将GlcNAcMan₃GlcNAc₂转化成GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂。将用于表达融合蛋白的合成基因在Hp4d启动子的转录控制下放置，生成质粒pYLHp4mAXrGnTII，其用于将Hp4d驱动的GnT II表达盒随机整合入耶氏酵母基因组中。在一个备选的策略中，生成构建体OXYP289pPTAxp1-ADE2ex-Hp4dhGnTII以容许将Hp4d驱动的GnT II表达盒靶向整合入耶氏酵母基因组的AXP1基因座中。

在转化菌株G061(见实施例9)前，将质粒用NotI消化，并分离靶向/表达盒。将转化体基于其腺嘌呤原养型来选择。在用XmnI消化基因组DNA后通过Southern印迹分析来确认表达盒对ADE2基因座的正确整合。使用正向引物rGnTII-FW(5’-GACCAGATGCTGCGAAACG-3’)(SEQ ID NO：28)和反向引物rGnTII-RV(5’-CTTGACGTCCACCTTGTCG-3’)(SEQ ID NO：29)来生成对GnT II编码序列具有特异性的经DIG标记的探针。此策略在基因成功整合入Axp1基因座中时生成3172bp的条带。

在一个备选的策略中，可以使用正向引物AXPVer1b(5’-GCCTGAACGGCACGATGCGATCGTGGCAATCC-3’)(SEQ ID NO：30)和反向引物AXPVer2b(5’-CAAGAAGCCTCAGGCTCGGCGAATCTCCATC-3’)(SEQ ID NO：31)经由对基因组DNA的PCR反应来检查对Axp1基因座的正确整合。在对Axp1基因座正确靶向的情况中，预期6489bp的PCR片段。

与用刀豆β-N-乙酰基己糖胺酶或里氏木霉α-1，2-甘露糖苷酶在体外处理分离的糖组合的对分泌物组的N-聚糖分析指示几个转化体能够生成GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂，并且如此能够表达功能性GnT II活性(图29)。分析指示占总N-聚糖集合的约25至30％由GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂组成，GlcNAcMan₃GlcNAc₂至GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂转化率为约90％。最终选定的菌株称作G070(pYLHp4mAXrGnTII对G061的整合)和G071(OXYP289pPTAxp1-ADE2ex-Hp4dhGnTII对G061的整合)。

实施例11：用于对解脂耶氏酵母同时Hp4d驱动表达抗HER2重链(HC)和轻链(LC)的串联质粒的构建

抗HER2抗体重和轻链的氨基酸序列获自Carter等，Proc Natl Acad SciUSA.，89(10)：4285-4289(1992)；及Ward等，Appl Environ Microbiol.，70(5)：2567-2576(2004)。将相关的氨基酸序列逆向翻译，针对解脂耶氏酵母进行密码子优化，并且由GenArt，Regensburg Germany合成。在有可能的情况中，避免非常高(＞80％)或非常低(＜30％)GC含量的区域。在优化过程期间，避免下列顺式作用序列基序：内部TATA-框、chi-位点和核糖体进入位点、富含AT或富含GC的序列段、重复序列和RNA二级结构及(隐藏的)剪接供体和接受体位点。为了容许分泌异位蛋白质，将Lip2蛋白质“前原”信号的编码序列(其后面有肽接头“GGG”的编码序列)添加至编码序列的5’区。添加“GGG”以为正确Kex2加工增强变化。图30A含有合成的preproLip2-LC(＝750bp)的核苷酸序列(SEQ ID NO：32)。图30B含有preproLip2-LC(＝250Aa；MW＝27.011 Da；pI＝8.46)的氨基酸序列(SEQ ID NO：33)。图31A含有合成的preproLip2-HC(＝1458bp)的核苷酸序列(SEQ ID NO：34)。图31B含有preproLip2-HC(＝486Aa；MW＝52.853Da；pI＝8.65)的氨基酸序列(SEQ IDNO：35)。将preproLip2-HC和-LC的编码序列导入同一载体(称作pYLHp4L2preproHerHC/LC(GUT2ex)-ori2)中。

实施例12：对具有不同程度的糖工程化改造的解脂耶氏酵母菌株表达抗HER2抗体HC和LC

将质粒pYLHp4L2preproHerHC&LC(GUT2ex)-ori2用NotI消化，并分离HC-/LC-串联表达盒，之后转化解脂耶氏酵母菌株G045，G057，G061和G071(见表2)。将含有随机整合的HC-/LC-表达盒的转化体基于其在甘油作为唯一碳源上生长的能力来选择。在含有甘油作为唯一碳源的丰富培养基(SuperT/甘油培养基：0.5％酵母提取物；2％麦芽提取物；1％胰蛋白胨；1.5％甘油；200mM磷酸盐缓冲液pH 6.8)中摇瓶培养选定的转化体4天后经由Western印迹来完成对HC和LC的表达分析。使用针对无Kappa轻链的小鼠单克隆(4C11)(Abcam)来实施LC检测，而使用小鼠单克隆抗人IgG(γ-链特异性)(Sigma)来完成HC检测。

抗HER2抗体生成菌株的分泌物组的N-聚糖显示与相应的不表达任何HC和LC的经糖工程化改造的菌株类似的概况(图32)。在SuperT/甘油培养基中摇瓶培养6天后测定具有G045，G057，G061和G071背景的菌株中的N-聚糖的百分比。在G045背景中，54.6％的N-聚糖是Man₃GlcNAc₂。在G057背景中，47.5％的N-聚糖是GlcNAc₁Man₃GlcNAc₂。在G061背景中，58.9％的N-聚糖是GlcNAc₁Man₃GlcNAc₂。在G071背景中，37.6％的N-聚糖是GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂。

实施例13：耶氏酵母菌株G096，即一种表达抗HER2抗体HC和LC的GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂合成菌株的发酵

对解脂耶氏酵母G071(一种能够合成GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂的菌株)的几种pYLHp4L2preproHerHC&LC(GUT2ex)-ori2转化体分析HC和LC表达水平。选择这些克隆之一G096以进一步分析。

在装备有过程控制和管理系统(Lucillus PIMS)的14升搅拌罐式生物反应器(MAVAG AG)中完成发酵。培养基中的相对部分氧压力、排气中的CO₂和O₂浓度、pH值、温度、反应器超压、反应器重量、补料重量和基准重(baseweight)均在线监测。通过添加消泡剂聚丙二醇(PPG)来消除泡沫生成。通过添加25％氨水溶液或8.5％磷酸溶液来完成pH的调节。

将G096的种子培养物于28℃在含有丰富培养基的摇瓶中培养。将种子培养物接种入含有矿物培养基的发酵罐中以开始于28℃在无限生长情况中的分批阶段(batch phase)，其使用甘油作为唯一碳源进行。使用此阶段来快速达到高生物量浓度。从该点向前，将该过程以0.02的恒定生长速率转换至指数甘油补料分批(具有甘油作为唯一碳和能量来源；pH 6)。举例而言，下文描述了于28℃的补料分批发酵的结果。

补料分批阶段持续148小时。在发酵的不同时间点时，采集样品以追踪下列参数：1)经由Western印迹，LC和HC蛋白主链的表达；2)经由ELISA，功能性抗HER2抗体的表达；和3)分泌物组的N-糖基化概况的进化。全长HC表达水平在时间点7(39小时)左右达到最大值，并且此后保持大致相等。LC表达在时间点7(39小时)和10(73小时)间达到最大值，但是在后来的时间稍微降低。在时间点5(25小时)和9(62小时)间生成一些LC二聚体，但是此后再次消失。

开发出功能性ELISA以测量具有至少一个功能性抗原结合域的抗HER2抗体的生成。用天然HER2抗原的重组变体，即重组人ErbB2/Fc嵌合物(R&Dsystems)包被平板。然后，将不同时间点时收获的培养基的稀释液添加至经包被的平板。使用经HRP缀合的抗人kappa LC抗体(Sigma)来完成评估抗原结合蛋白的量。图33中显示了补料-分批发酵内的ErbB2/Fc嵌合物结合蛋白量的进化(测量分泌性功能性抗HER2抗体的量)。数据显示了抗HER2抗体水平的逐渐升高，在生成阶段结束时最大值为10至12mg/L。

对在补料-分批发酵期间的几个时间点时采集的样品完成N-聚糖分析。图34A和34B中显示了结果。在补料-分批阶段开始时，有存在的大量含有葡萄糖的N-聚糖。从时间点6向前(指数补料开始后34小时)，葡萄糖基化N-聚糖水平显著降低，在收获时(时间18，148小时)几乎没有留下。这指示最初携带含有葡萄糖的N-聚糖的蛋白质到发酵结束时被稀释掉。在该点时，自分泌物组分离的约86％的N-聚糖具有结构GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂。

其它实施方案

虽然本发明已经结合其详细描述进行了描述，但是前述说明书意图例示而并不限制本发明的范围，其由所附权利要求的范围限定。其它方面、优点、和修饰在所附权利要求的范围内。

Claims (66)

1.一种生成能够生成包含GlcNAcMan₅GlcNAc₂N-聚糖的蛋白质的真菌细胞的方法，所述方法包括：

a)提供遗传工程化改造为生成包含Man₅GlcNAc₂N-聚糖的蛋白质的真菌细胞；

b)将编码GlcNAc转移酶I的核酸导入所述细胞中，其中所述核酸包含编码将所述编码的GlcNAc转移酶I靶向至胞内区室的靶向序列的核苷酸序列，其中所述GlcNAc转移酶I在所述真菌细胞中的表达生成包含GlcNAcMan₅GlcNAc₂N-聚糖的蛋白质。

2.权利要求1的方法，所述方法进一步包括将编码靶蛋白的核酸导入所述细胞中，其中所述细胞生成修饰为包含所述GlcNAcMan₅GlcNAc₂N-聚糖的所述靶蛋白。

3.权利要求2的方法，其中所述靶蛋白结合Fc受体。

4.权利要求3的方法，其中所述靶蛋白是抗体或其片段。

5.权利要求2的方法，其中所述靶蛋白是治疗性糖蛋白。

6.权利要求2的方法，其中所述靶蛋白是干扰素-β、GM-CSF、干扰素γ、或促红细胞生成素。

7.权利要求1的方法，其中所述胞内区室是高尔基体。

8.权利要求1的方法，其中遗传工程化改造为生成含有Man₅GlcNAc₂N-聚糖的蛋白质的所述真菌细胞是OCH1活性缺陷的，并且包括编码α-1,2-甘露糖苷酶的核酸，其中编码所述α-1,2-甘露糖苷酶的所述核酸包括编码将所述编码的α-1,2-甘露糖苷酶靶向至内质网的靶向序列的核苷酸序列。

9.权利要求8的方法，其中所述靶向序列是HDEL序列。

10.权利要求1的方法，其中所述真菌细胞是解脂耶氏酵母或陆地酵母。

11.权利要求1的方法，所述方法进一步包括将编码甘露糖苷酶II的核酸导入所述细胞中，其中编码所述甘露糖苷酶II的所述核酸包含编码将所述编码的甘露糖苷酶II靶向至高尔基体的靶向序列的核苷酸序列，其中所述甘露糖苷酶II在所述真菌细胞中的表达生成包含GlcNAcMan₃GlcNAc₂N-聚糖的蛋白质。

12.权利要求1或权利要求11的方法，所述方法进一步包括将编码半乳糖基转移酶的核酸导入所述细胞中，其中编码所述半乳糖基转移酶的所述核酸包含编码将所述编码的半乳糖基转移酶靶向至高尔基体的靶向序列的核苷酸序列，其中所述半乳糖基转移酶在所述真菌细胞中的表达生成包含GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂或GalGlcNAcMan₃GlcNAc₂N-聚糖的蛋白质。

13.权利要求12的方法，所述方法进一步包括将编码靶蛋白的核酸导入所述细胞中，其中所述细胞生成修饰为包含所述GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂或GalGlcNAcMan₃GlcNAc₂N-聚糖的所述靶蛋白。

14.权利要求12的方法，其中所述半乳糖基转移酶是UDP-Glc-4-差向异构酶和β-1,4-半乳糖基转移酶I的催化域的融合物。

15.权利要求13的方法，进一步包括分离修饰为包含所述GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂或GalGlcNAcMan₃GlcNAc₂N-聚糖的所述靶蛋白。

16.一种生成包含GlcNAcMan₃GlcNAc₂N-聚糖的靶蛋白的方法，所述方法包括：

a)提供遗传工程化改造为包含编码GlcNAc转移酶I、α-1,2-甘露糖苷酶、和甘露糖苷酶II的核酸的真菌细胞，其中所述核酸包含编码将每种编码的蛋白质靶向至胞内区室的靶向序列的核苷酸序列，其中所述真菌细胞是OCH1活性缺陷的；并

b)将编码靶蛋白的核酸导入所述细胞中，其中所述细胞生成包含所述GlcNAcMan₃GlcNAc₂N-聚糖的所述靶蛋白。

17.权利要求16的方法，其中所述真菌细胞是解脂耶氏酵母或陆地酵母。

18.权利要求16的方法，其中编码所述α-1,2-甘露糖苷酶的所述核酸包含将所述编码的α-1,2-甘露糖苷酶靶向至内质网的内质网靶向序列。

19.权利要求18的方法，其中所述靶向序列是HDEL序列。

20.权利要求16的方法，其中编码所述GlcNAc转移酶I和所述甘露糖苷酶II的所述核酸包含编码将所述编码的GlcNAc转移酶I和甘露糖苷酶II靶向至高尔基体的高尔基靶向序列的核苷酸序列。

21.权利要求16的方法，其中所述靶蛋白结合Fc受体。

22.权利要求16的方法，其中所述靶蛋白是抗体或其片段。

23.权利要求16的方法，其中所述靶蛋白是治疗性糖蛋白。

24.权利要求16的方法，其中所述靶蛋白是干扰素-β、GM-CSF、干扰素γ、或促红细胞生成素。

25.权利要求16的方法，进一步包括将编码半乳糖基转移酶的核酸导入所述细胞中，其中编码所述半乳糖基转移酶的所述核酸包含编码将所述编码的半乳糖基转移酶靶向至高尔基体的靶向序列的核苷酸序列，其中所述半乳糖基转移酶在所述真菌细胞中的表达生成修饰为包含GalGlcNAcMan₃GlcNAc₂N-聚糖的所述靶蛋白。

26.权利要求25的方法，进一步包括分离修饰为包含所述GalGlcNAcMan₃GlcNAc₂N-聚糖的所述靶蛋白。

27.一种制备能够生成包含GlcNAcMan₃GlcNAc₂N-聚糖的蛋白质的真菌细胞的方法，所述方法包括：

a)提供遗传工程化改造为生成包含Man₃GlcNAc₂N-聚糖的蛋白质的真菌细胞；

b)将编码GlcNAc转移酶I的核酸导入所述细胞中，其中所述核酸包含编码将所述编码的GlcNAc转移酶I靶向至胞内区室的靶向序列的核苷酸序列，其中所述GlcNAc转移酶I在所述真菌细胞中的表达生成包含GlcNAcMan₃GlcNAc₂N-聚糖的蛋白质。

28.权利要求27的方法，所述方法进一步包括将编码靶蛋白的核酸导入所述细胞中，其中所述细胞生成修饰为包含所述GlcNAcMan₃GlcNAc₂N-聚糖的所述靶蛋白。

29.权利要求27的方法，其中所述靶蛋白结合Fc受体。

30.权利要求27的方法，其中所述靶蛋白是抗体或其片段。

31.权利要求27的方法，其中所述靶蛋白是治疗性糖蛋白。

32.权利要求27的方法，其中所述靶蛋白是干扰素-β、GM-CSF、干扰素γ、或促红细胞生成素。

33.权利要求27的方法，其中所述胞内区室是高尔基体。

34.权利要求27的方法，其中遗传工程化改造为生成包含Man₃GlcNAc₂N-聚糖的蛋白质的所述真菌细胞是ALG3活性缺陷的，并且包含编码α-1,2-甘露糖苷酶的核酸，所述核酸包含编码将所述编码的α-1,2-甘露糖苷酶靶向至内质网的靶向序列的核苷酸序列。

35.权利要求34的方法，其中遗传工程化改造为生成包含Man₃GlcNAc₂N-聚糖的蛋白质的所述真菌细胞进一步是OCH1活性缺陷的。

36.权利要求34或35的方法，其中遗传工程化改造为生成包含Man₃GlcNAc₂N-聚糖的蛋白质的所述真菌细胞进一步包含编码α-1,3-葡萄糖基转移酶的核酸。

37.权利要求36的方法，其中所述α-1,3-葡萄糖基转移酶是ALG6。

38.权利要求27的方法，其中所述真菌细胞是解脂耶氏酵母或陆地酵母。

39.权利要求27的方法，所述方法进一步包括将编码GlcNAc转移酶II的核酸导入所述细胞中，其中编码所述GlcNAc转移酶II的所述核酸包含编码将所述编码的GlcNAc转移酶II靶向至胞内区室的靶向序列的核苷酸序列，其中所述GlcNAc转移酶II在真菌细胞中的表达生成包含GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂N-聚糖的蛋白质。

40.权利要求27或权利要求39的方法，所述方法进一步包括将编码半乳糖基转移酶的核酸导入所述细胞中，其中编码所述半乳糖基转移酶的所述核酸包含编码所述将所述编码的半乳糖基转移酶靶向至高尔基体的靶向序列的核苷酸序列，其中所述半乳糖基转移酶在所述真菌细胞中的表达生成包含GalGlcNAcMan₃GlcNAc₂或Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂N-聚糖的蛋白质。

41.权利要求40的方法，所述方法进一步包括将编码靶蛋白的核酸导入所述细胞中，其中所述细胞生成修饰为包含所述GalGlcNAcMan₃GlcNAc₂或Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂N-聚糖的所述靶蛋白。

42.权利要求40的方法，其中所述半乳糖基转移酶是UDP-Glc-4-差向异构酶和β-1,4-半乳糖基转移酶I的催化域的融合物。

43.权利要求40的方法，所述方法进一步包括将编码葡萄糖苷酶II的α和β亚基的核酸导入所述细胞中，其中所述葡萄糖苷酶II的所述α和β亚基在所述真菌细胞中的表达生成包含GalGlcNAcMan₃GlcNAc₂或Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂N-聚糖的蛋白质。

44.一种生成包含Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂N-聚糖的靶蛋白的方法，所述方法包括：

a)提供遗传工程化改造为ALG3活性缺陷并包含编码GlcNAc转移酶I、GlcNAc转移酶II、和半乳糖基转移酶的核酸的真菌细胞，其中编码所述GlcNAc转移酶I、所述GlcNAc转移酶II、和所述半乳糖基转移酶的所述核酸包含编码将每种编码的蛋白质靶向至胞内区室的靶向序列的核苷酸序列；

b)将编码靶蛋白的核酸导入所述细胞中，其中所述细胞生成包含所述Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂N-聚糖的所述靶蛋白。

45.权利要求44的方法，其中所述真菌细胞进一步是OCH1活性缺陷的。

46.权利要求44或45的方法，其中所述真菌细胞进一步包含编码α-1,3-葡萄糖基转移酶的核酸。

47.权利要求46的方法，其中编码所述α-1,3-葡萄糖基转移酶的所述核酸是ALG6。

48.权利要求44、权利要求45或权利要求46的方法，其中所述真菌细胞进一步包含编码葡萄糖苷酶II的所述α和β亚基的核酸，其中所述葡萄糖苷酶II的所述α和β亚基在所述真菌细胞中的表达生成包含所述Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂N-聚糖的所述靶蛋白。

49.一种遗传工程化改造为生成包含GlcNAcMan₃GlcNAc₂N-聚糖的蛋白质的分离的真菌细胞，其中所述真菌细胞是OCH1活性缺陷的，并且包含编码α-1,2-甘露糖苷酶、GlcNAc转移酶I、和甘露糖苷酶II的核酸，其中编码所述α-1,2-甘露糖苷酶、所述GlcNAc转移酶I、和所述甘露糖苷酶II的所述核酸包含编码将每种编码的蛋白质靶向至胞内区室的靶向序列的核苷酸序列，其中所述α-1,2-甘露糖苷酶、所述GlcNAc转移酶I、和所述甘露糖苷酶II在所述真菌细胞中的表达生成包含GlcNAcMan₃GlcNAc₂N-聚糖的蛋白质。

50.权利要求49的真菌细胞，其中所述经遗传工程化改造的真菌细胞进一步包含编码靶蛋白的核酸，其中所述细胞生成修饰为包含所述GlcNAcMan₃GlcNAc₂N-聚糖的所述靶蛋白。

51.权利要求49或权利要求50的真菌细胞，其中所述经遗传工程化改造的真菌细胞进一步包含编码GlcNAc转移酶II的核酸，其中编码所述GlcNAc转移酶II的所述核酸包含编码将所述编码的GlcNAc转移酶II靶向至胞内区室的靶向序列的核苷酸序列，其中所述GlcNAc转移酶II在所述真菌细胞中的表达生成包含GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂N-聚糖的蛋白质。

52.权利要求51的真菌细胞，所述真菌细胞进一步包含编码半乳糖基转移酶的核酸，其中编码所述半乳糖基转移酶的所述核酸包含编码将所述编码的半乳糖基转移酶靶向至高尔基体的靶向序列的核苷酸序列，其中所述半乳糖基转移酶在所述真菌细胞中的表达生成包含Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂N-聚糖的蛋白质。

53.一种遗传工程化改造为生成包含GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂N-聚糖的蛋白质的分离的真菌细胞，其中所述真菌细胞被遗传工程化改造为ALG3活性缺陷的，并且包含编码GlcNAc转移酶I和GlcNAc转移酶II的核酸，其中编码所述GlcNAc转移酶I和所述GlcNAc转移酶II的所述核酸包含编码将每种编码的蛋白质靶向至胞内区室的靶向序列的核苷酸序列，其中所述GlcNAc转移酶I和所述GlcNAc转移酶II在所述真菌细胞中的表达生成包含GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂N-聚糖的蛋白质。

54.权利要求53的真菌细胞，其中所述经遗传工程化改造的真菌细胞进一步是OCH1活性缺陷的。

55.权利要求53或权利要求54的真菌细胞，其中所述经遗传工程化改造的真菌细胞进一步包含编码α-1,3-葡萄糖基转移酶的核酸。

56.权利要求53、权利要求54或权利要求55的真菌细胞，其中所述经遗传工程化改造的真菌细胞进一步包含编码靶蛋白的核酸，其中所述细胞生成修饰为包含所述GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂N-聚糖的所述靶蛋白。

57.权利要求53-56中任一项的真菌细胞，所述真菌细胞进一步包含编码葡萄糖苷酶II的所述α和β亚基的核酸，其中所述葡萄糖苷酶II的所述α和β亚基在所述真菌细胞中的表达生成包含所述GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂N-聚糖的所述蛋白质。

58.权利要求57的真菌细胞，所述真菌细胞进一步包含编码半乳糖基转移酶的核酸，其中编码所述半乳糖基转移酶的所述核酸包含编码将所述编码的半乳糖基转移酶靶向至高尔基体的靶向序列的核苷酸序列，其中所述半乳糖基转移酶在所述真菌细胞中的表达生成包含Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂N-聚糖的蛋白质。

59.解脂耶氏酵母细胞的基本上纯的培养物，大量的所述解脂耶氏酵母细胞被遗传工程化改造为生成包含Gal₂GlcNac₂Man₃GlcNAc₂N-聚糖的糖蛋白，其中将所述细胞工程化改造为ALG3活性缺陷的，并且包含编码GlcNAc转移酶I、GlcNAc转移酶II、和半乳糖基转移酶的核酸，其中编码所述GlcNAc转移酶I、所述GlcNAc转移酶II、和所述半乳糖基转移酶的所述核酸包含编码将每种编码的蛋白质靶向至胞内区室的靶向序列的核苷酸序列，其中所述GlcNAc转移酶I、所述GlcNAc转移酶II、和所述半乳糖基转移酶在所述细胞中的表达生成包含Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂N-聚糖的蛋白质。

60.权利要求59的基本上纯的培养物，其中所述细胞进一步是OCH1活性缺陷的。

61.权利要求59或权利要求60的基本上纯的培养物，其中所述细胞进一步包含编码α-1,3-葡萄糖基转移酶的核酸。

62.权利要求59、权利要求60或权利要求61的基本上纯的培养物，其中所述细胞进一步包含编码葡萄糖苷酶II的所述α和β亚基的核酸，其中所述葡萄糖苷酶II的所述α和β亚基在所述真菌细胞中的表达生成包含所述Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂N-聚糖的所述靶蛋白。

63.解脂耶氏酵母细胞的基本上纯的培养物，大量所述解脂耶氏酵母细胞被工程化改造为生成包含Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂N-聚糖的糖蛋白，其中将细胞工程化改造为OCH1活性缺陷的，并且包含编码α-1,2-甘露糖苷酶、GlcNAc转移酶I、甘露糖苷酶II、GlcNAc转移酶II、和半乳糖基转移酶的核酸，其中编码所述α-1,2-甘露糖苷酶、所述GlcNAc转移酶I、所述甘露糖苷酶II、所述GlcNAc转移酶II、和所述半乳糖基转移酶的所述核酸包括编码将每种编码的蛋白质靶向至胞内区室的靶向序列的核苷酸序列，其中所述α-1,2-甘露糖苷酶、所述GlcNAc转移酶I、所述甘露糖苷酶II、所述GlcNAc转移酶II、和所述半乳糖基转移酶在所述细胞中的表达生成包含Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂N-聚糖的蛋白质。

64.包含糖蛋白的组合物，其中所述糖蛋白上的所述N-聚糖的至少50%是GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂N-聚糖。

65.权利要求64的组合物，其中所述糖蛋白上的所述N-聚糖的至少70%是GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂N-聚糖。

66.权利要求64的组合物，其中所述糖蛋白上的所述N-聚糖的至少85%是GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂N-聚糖。

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