ES2258371B1

ES2258371B1 - Levadura transformante productora de hormona paratiroidea humana y procedimiento para producir la hormona.

Info

Publication number: ES2258371B1
Application number: ES200350014A
Authority: ES
Inventors: Sang Ki Rhee; Hyun Ah Kana; Bonbg Hyun Chung; Su Min Ko
Original assignee: Dong Kook Pharmaceutical Co Ltd; Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Current assignee: Dong Kook Pharmaceutical Co Ltd; Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Priority date: 2000-08-31
Filing date: 2000-08-31
Publication date: 2007-05-16
Anticipated expiration: 2020-08-31
Also published as: GB2381273B; AU2001280242A1; WO2002018570A1; US20040029252A1; CN1449441A; GB2381273A; US7244591B2; GB0303081D0; KR100386836B1; EP1313848A1; EP1313848B1; ES2258371A1; DE10196565B4; JP3957630B2; DE10196565T1; JP2004507270A; KR20020017754A

Abstract

Levadura transformante productora de hormona paratiroidea humana y procedimiento para producir la hormona.

Se proporcionan cepas mutantes de Saccharomyces cerevisiae nuevas para producir hormona paratiroidea humana. Las nuevas cepas están genéticamente alteradas en al menos uno de los genes que codifican las proteasas de la familia de las yapsinas, Yapsina 1, Yapsina 2 y Yapsina 3 y alojan un gen de la hormona paratiroidea humana en sus genomas. El cultivo de las cepas nuevas tiene como resultado la secreción de hPTH intacta al medio ce cultivo con un elevado rendimiento.

Description

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención

Esta invención trata de la producción de hormona paratiroidea humana (denominada, en lo sucesivo, "hPTH"). En concreto, la presente invención trata del uso de cepas mutantes de Saccharomyces cerevisiae que se delecionan genéticamente en al menos una de las proteasas aspárticas de la familia de las Yapsinas YPS1, YPS2 y YPS3, y se transforman con un vector de expresión en el que se ha insertado un gen hPTH, para producir la hormona.

2. Descripción de la técnica anterior

hPTH es un péptido de 84 residuos de aminoácidos producido por la glándula paratiroidea. La hPTH mantiene la homeostasis del calcio en los riñones y los huesos, y su función fisiológica es estimular el metabolismo del calcio y la osteogénesis. En EE UU y Europa, los estrógenos y la calcitonina se han usado predominantemente como tratamiento de la osteoporosis, sin embargo, se ha descubierto que obstruyen la absorción ósea. Por tanto, las principales empresas farmacéuticas del mundo están investigando intensiva y extensivamente la hPTH para desarrollar tratamientos para la osteoporosis aprovechando la capacidad de la hPTH para estimular la osteogénesis. Particularmente, se presta la máxima atención a la profilaxis y tratamiento de la osteoporosis debido al envejecimiento de la sociedad moderna. Por estas razones, la investigación activa se está dirigiendo actualmente al desarrollo de procedimientos de biotecnología para la producción masiva de hPTH, que se espera que sea un prometedor sustituto terapéutico de los tratamientos convencionales de la osteoporosis.

Por ejemplo, se han hecho varios intentos de desarrollar procedimientos para la producción masiva de hPTH recombinante usando E.coli como célula huésped porque las bacterias procariotas tienen una eficacia de expresión relativamente elevada. Sin embargo, hay grandes dificultades para replegar y purificar las proteínas recombinantes producidas por E.coli. En cambio, la levadura, una única célula eucariota, tiene la ventaja de expresar y secretar proteínas adecuadamente plegadas y, por tanto, activas, porque tienen unos sistemas de transcripción y traducción genética, así como de secreción de proteínas muy similares a los de las especies superiores. Además, las levaduras presentan ventajas como huéspedes productores de proteínas de interés porque secretan pocas proteínas extracelulares, lo que facilita la recuperación y purificación de proteínas exógenas. Es más, la levadura Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo GRAS (generalmente reconocido como seguro) no patógeno para el organismo y no produce endotoxinas. Con la esperanza de que sea muy útil como productora de hPTH recombinante farmacológica, Saccharomyces cerevisiae se ha estudiado para desarrollar sistemas de expresión de hPTH. A pesar de sus diversas ventajas como huésped de expresión para la producción de hPTH recombinante, Saccharomyces cerevisiae no se usa industrialmente como tal huésped porque la hPTH recombinante secretada extracelularmente es degradada por enzimas proteolíticas endógenas de la propia levadura, por lo que sólo se puede recuperar una pequeña cantidad de la molécula de hPTH intacta (Gabrielsen y col., Gene 90, 255 (1990)).

Durante la pasada década, se han realizado amplios estudios para resolver el problema de la proteólisis de la hPTH recombinante. Por ejemplo, basado en el hallazgo de que la fragmentación de la hPTH se produce entre los aminoácidos Arg-25 y Lys-26, idéntico a los sitios de reconocimiento de KEX2, una proteasa presente en el aparato de Golgi de la levadura, se fabricó un mutante por sustitución de la hPTH con glutamina en la posición 26 de su secuencia de aminoácidos en vez de lisina, con el objeto de impedir la proteólisis por KEX2, que es una proteasa putativa de fragmentación de la hPTH (Reppe y col., J.Biol.Chem. 226, 14198 (1991)). Usando la tecnología de recombinación genética, una proteína relacionada con la hPTH se ligó directamente al extremo 3' del gen ubiquitina de la levadura para producir una proteína relacionada con la hPTH no fragmentable (Rian y col., Eur.J. Biochem., 213, 641 (1993)). Sin embargo, si las proteínas mutantes se usan con fines terapéuticos, se deben realizar pruebas rigurosas para obtener autorización para su uso terapéutico, porque se suelen reconocer como medicamentos nuevos. Cuando se usa la tecnología de fusión genética, es necesario extraer el sitio de fusión mediante digestión esperada, ya que pueden producirse proteínas de interés a rendimientos relativamente moderados debido a la presencia del sitio de fusión.

Como resultado de la investigación para prevenir la degradación de la hPTH sin recurrir a mutantes proteicos de hPTH o fusiones, los presentes inventores desarrollaron un procedimiento en el que la fragmentación de la hPTH se puede evitar en gran medida simplemente añadiendo elevadas concentraciones de L-arginina al medio de cultivo (Chung y Park, Biotechnol. Bioeng. 57, 245 (1998)). El hecho de que se pueda impedir la escisión de la hPTH mediante la presencia de L-arginina en el medio de cultivo, indica que la fragmentación de la hPTH se lleva a cabo principalmente por proteasas extracelulares más que por la proteasa intracelular Kex2p. A partir de este hallazgo, los presentes inventores dedujeron que la Yap3p (proteasa aspártica de levaduras 3), que, al igual que KEX2, es capaz de fragmentar el extremo C o sitios centrales de uno o dos aminoácidos básicos y se une a la membrana citoplasmática de la levadura, es prácticamente responsable de la fragmentación de la hPTH secretada al medio de cultivo de la levadura. De acuerdo con esta deducción, los presentes inventores desarrollaron una cepa de levaduras delecionada en el gen de YAP3 (YAP3\Delta) y crearon un sistema de producción de hPTH usando la levadura mutante. Al cultivar en frascos, se descubrió que el sistema de producción de hPTH evitaba le fragmentación de la hPTH con una eficiencia tan elevada como del 80%, produciendo por tanto la molécula intacta de hPTH con un elevado rendimiento (Kang y col., Appl. Microbiol. Biotechnol., 50, 187 (1998); patente coreana nº 0246932, cedida el 8 de diciembre de 1999). Aunque exhibe una productividad de hPTH mucho mayor que la cepa salvaje, se observó que el mutante ypa3\Delta permitía un grado significativo de fragmentación de hPTH en un estadio tardío del cultivo de concentración elevada (Song y Chung, Process Biochem 35,503 (2000)), lo que indica que la degradación de la hPTH no la produce la Yap3p, sino otras proteasas en un estadio tardío del cultivo. Se ha comunicado que Saccharomyces cerevisiae tiene la proteasa aspártica MKc7p, cuya estructura y función son muy similares a las de la Yap3p (Komano y Fuller, Proc Natl Acad Sci. Estados Unidos, 92, 10752 (1995)). Los presentes inventores crearon una levadura mutante con deleción de ambos genes (yap3\Delta/mkc7\Delta) para usar en la observación de la influencia de las enzimas en la fragmentación de la hPTH en el último estadio de cultivo. Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas entre los mutantes yap3\Delta y yap3\Delta/mkc7\Delta (Choi, y col., J.Microbiol Biotechnol 9, 679 (1999)). Estos resultados demostraron que la proteasa Mkc7p, a través de su alta homología con Yap3p (53% de homología) y participando en el procesamiento del factor pro-cruzamiento en ausencia de Kex2p, no es muy responsable de la degradación de la hPTH.

Mediante el análisis de la información sobre el genoma de Saccharomyces cerevisiae recientemente descrito, se realizó una búsqueda de genes homólogos de YAP3 (recientemente cambiada de nombre a YPS1), con el resultado del hallazgo de la existencia de tres nuevos genes que codifican proteasas aspárticas desconocidas, además de PEP4 y BAR1 (Olsen y col., Biochem. J- 339, 407 (1999)).

Asumiendo que codificaban nuevos miembros de la familia de las yapsinas de las proteasas aspárticas, como YPS1 e YPS2, los tres nuevos genes se denominaron YPS3, YPS6 e YPS7, respectivamente. Se encontró que YPS3 tenía 50% de homología con YPS1 e YPS2, mientras que la homología entre YPS6 y BAR1 era 35% y entre YPS7 y PEP4 era 25%. A partir de la homología entre YPS3 e YPS1, los presentes inventores dedujeron que la fragmentación de hPTH en los estadios finales del cultivo de la cepa yps1\Delta (antes yap3\Delta) podría deberse a la acción de la yapsina 3.

Resumen de la invención

Teniendo en cuenta estos antecedentes, la presente invención tiene el objeto de proporcionar un sistema de expresión de proteínas que pueda producir hPTH con un elevado rendimiento.

Otro propósito de la presente invención es proporcionar un procedimiento de producción de hPTH con un rendimiento elevado.

El conocimiento de la modificación postraduccional de la hPTH permite modificaciones y adaptaciones que conducen a la presente invención

Como resultado de una investigación intensiva y exhaustiva de la producción biológica de hPTH, los presentes inventores averiguaron que la deleción de los genes de las yapsinas produjo una sorprendente disminución de la degradación endógena de la hPTH recombinante en Saccharomyces cerevisiae.

Conforme a un aspecto de la presente invención, se proporciona una cepa mutante de Saccharomyces cerevisiae en la que se produce la deleción de los genes YPS1 e YPS3 o todos los genes YPS1, YPS2 e YPS3.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para producir hPTH usando la cepa mutante de Saccharomyces cerevisiae como productor.

Breve descripción de los dibujos

Estos y otros objetos, características y otras ventajas de la presente invención se entenderán con más claridad a partir de la siguiente descripción detallada junto con los dibujos adjuntos, en los que:

Fig.1 es un diagrama que muestra un procedimiento de creación de un casete para la deleción del gen YPS3 usando un marcador de selección de descarga URA3;

Fig.2 es un diagrama que muestra un procedimiento de deleción del gen YPS3 de Saccharomyces cerevisiae y de recuperación del marcador de selección URA3;

Fig.3 muestra los resultados de un SDS-PAGE de la moléculas de hPTH obtenidas de los cultivos de Saccharomyces cerevisiae 2805 (carril 1), Saccharomyces cerevisiae 2805/pG10-hPTH1 (carriles 2 y 3), Saccharomyces cerevisiae SY28Y3/pG10-hPTH1 (carriles 4 y 5) y Saccharomyces cerevisiae SY28Y4/pG10-hPTH1 (carriles 6 y 7), junto con 1 \mug de hPTH nativa (C) y un marcador de peso molecular de las proteínas previamente teñido (M), en crecimiento durante 24 horas (a) y 48 horas (b), donde la banda i representa la hPTH intacta (1-84 aa), la banda d1 representa un fragmento de la hPTH (27-84 aa) y la banda d2 es hPTH (1-80 aa);

Fig.4 muestra los resultados de SDS-PAGE de moléculas de hPTH obtenidas de los cultivos de Saccharomyces cerevisiae L3262 (carril 1), Saccharomyces cerevisiae L3262/pGl0-hPTH1 (carriles 2 y 3), Saccharomyces cerevisiae SLH15/pG10-hPTH1 (carriles 4 y 5) y Saccharomyces cerevisiae SLH16/pG10-hPTH1 (carriles 6 y 7), Saccharomyces cerevisiae SLH17/pG10-hPTH1 (carriles 9 y 10) y Saccharomyces cerevisiae SLH18/pG10-hPTH1 (carriles 10 y 11), junto con 1 \mug de hPTH nativa (C) y un marcador de peso molecular de las proteínas previamente teñido (M), en crecimiento durante 24 horas (a) y 48 horas (b), donde la banda i representa la hPTH intacta (1-84), la banda d1 representa un fragmento de la hPTH (27-84 aa) y la banda d2 es hPTH (1-80 aa); y

la Fig.5 muestra los resultados de SDS-PAGE de moléculas de hPTH obtenidas de los cultivos de Saccharomyces cerevisiae L3262 (carril 1), Saccharomyces cerevisiae L3262 con deleción doble en YPS1/YPS3 (a); Saccharomyces cerevisiae L3262/pG10-hPTH1 (carriles 2 a 7) y Saccharomyces cerevisiae SLH11/pG10-hPTH1 (carriles 8 a 13), Saccharomyces cerevisiae L3262 con triple deleción en YPS1, YPS2, YPS3 (b): Saccharomyces cerevisiae SLH16/pG10-hPTH1 (carriles 2 a 7) y Saccharomyces cerevisiae SLH18/pG10-hPTH1 (carriles 8 a 13), junto con 1 \mug de hPTH nativa (C) y un marcador de peso molecular de las proteínas previamente teñido (M), en crecimiento durante 72 horas con suministro continuo de galactosa, donde la banda i representa la hPTH intacta (1-84), la banda d1 representa un fragmento de la hPTH (27-84 aa) y la banda d2 es hPTH (1-80 aa).

Descripción detallada de la invención

La presente invención trata de un procedimiento para producir hPTH recombinante procedente de una levadura que no puede producir al menos una de las proteasas de la familia de las yapsinas YPS1, YPS2 e YPS3.

El hecho de que muestren actividad exoproteasa para fragmentar extremos C o N de la hPTH, las proteasas Yapsina 1 (denominada en lo sucesivo "YSP1"), Yapsina 2 (denominada en lo sucesivo "YPS2") o Yapsina 3 (denominada en lo sucesivo "YPS3"),dificulta la producción de molécula de hPTH intacta en la levadura huésped. Por tanto, la presente invención comprende un procedimiento para producir la molécula de hPTH intacta con un alto rendimiento usando como célula huésped una cepa mutante incapaz de expresar al menos una de las tres proteasas YPS1, YPS2 e YPS3.

Se cree que YPS1 e YPS2 ejercen su actividad enzimática sobre todo en los estadios tempranos del cultivo de los transformantes para producir hPTH, mientras que la YPS3 fragmenta la hPTH principalmente en el estadio tardío. En el caso de la cepa yps1\Delta, en la que se ha incapacitado al gen de YPS1, se puede obtener hPTH con un alto rendimiento en los estadios iniciales del cultivo por la ausencia de YPS1, pero con muy poco rendimiento en los estadios finales debido al inevitable actividad proteolítica de YPS3.

En consecuencia, para mejorar el rendimiento de la producción de hPTH mediante el cultivo de una levadura como huésped, se usa como huésped una cepa mutante defectiva preferiblemente en YPS1 e YPS3 (yps1\Delta/yps3\Delta), y más preferiblemente en todas YPS1, YPS2 e YPS3 (yps1\Delta/yps2\Delta/yps3\Delta).

La deleción de las proteasas de puede llevar a cabo eliminando al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en YPS1, YPS2 e YPS3 usando un marcador de selección enzimático.

El marcador de selección de la levadura no está particularmente limitado, aunque es preferible uno que pueda descargarse. En la forma de realización preferida de la presente invención, se proporciona un marcador de selección URA3 en forma de casete. El casete de descarga con el marcador de selección de la levadura tiene fragmentos codificantes de los sitios en los extremos N y C de YPS1, YPS2 e YPS3 para ambos extremos, de manera que los genes diana contenidos en el genoma de la levadura, es decir, yps1, yps2 e yps3, se puedan eliminar mediante un procedimiento de recombinación por homología. Se puede usar cualquier marcador de selección que pueda seleccionar la levadura con el casete en su genoma. En la presente invención, la cepa mutante yps3\Delta en la que el marcador de selección URA3 elimina el gen yps3, se expresa por yps3::URA3.

Según la presente invención, un gen de hPTH se transporta al interior de la levadura mediante un vector de expresión. Por tanto, la presente invención se relaciona con un vector de expresión recombinante en el que se inserta el gen de hPTH. El vector de expresión útil en la presente invención tiene los medios para expresa un gen en levaduras y para contralor la expresión. La selección del vector y la creación del vector recombinante resultan obvias para un experto en la materia y sus detalles se describen en los siguientes ejemplos.

En otro aspecto, la presente invención trata de un transformante preparado a partir de las cepas mutantes yps1\Delta/
yps3\Delta o yps1\Delta/yps2\Delta/yps3\Delta con el vector de expresión recombinante.

En la forma de realización preferida de la presente invención, el vector recombinante pG10-hPTH1 se transforma en los mutantes de Saccharomyces cerevisiae (yps1\Delta/yps3\Delta y yps1\Delta/yps2\Delta/yps3\Delta) para crear transformantes SLH16/pG10-hPTH y SLH18/pG10-hPTH, que se depositaron en la Colección coreana de tipos de cultivo del Instituto coreano de investigación en biociencia y biotecnología (KRIBB) con números de acceso KCTC 0815BP y KCTC 0816BP, respectivamente, el 6 de julio de 2000.

Se puede obtener una mejor comprensión de la presente invención a la luz de los siguiente ejemplos que se han establecido para ilustrar, pero no deben interpretarse para limitar la presente invención.

Cepa y plásmido experimental

Para la expresión de hPTH en Saccharomyces cerevisiae se usó el plásmido pG10-hPTH1, que contiene un casete de expresión de hPTH compuesto por promotor GAL10::ppL::hPTHdb?::terminador GAL7 (Chung y Park, Biotechnol. Bioeng. 57,245(1998)). Se preparó un casete con un marcador de selección de descarga URA3 (URA3::tc5) de
un fragmento BamHI de 18kb derivado de pTcUR3 (Kang y col., Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 575-582 (200)). Saccharomyces cerevisiae 2805 y Saccharomyces cerevisiae L3262a se usaron como células parentales para preparar los mutantes con deleción de YPS3 (Kang y col., J.Microbiol. Biotechnol., 8, 42-48 (1998)).

También, las células usadas en la presente invención fueron las cepas de levadura SLH11 (Kang y col., Appl. Microbiol. Biotechnol., 59, 187 (1998), SLH12 y SLH14 (Choi y col., J. Biosci. Bioengin., 89, 77 (2000)), que son defectivas en los genes YPS1 (antes YAP3), YPS2 (antes MKC7) o ambas. Las características genéticas de las cepas de levadura se resumen en la tabla 1, a continuación.

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TABLA 1 Cepas de Saccharomyces cerevisiae usadas en la invención

Cepa	Descripción/genotipo
2805	una cepa parental
	(MATa pep4::His3 prb-\Delta1.6R can1 his3-20 ura3-52)
S2BY3	una cepa 2805 con deleción en yps1
	(MATa pep4::His3 prb-\Delta1.6R can1 his3-20 ura3-52 yps1::tc5)
L3262	una cepa parental
	(MATa ura3-52 leu2-3,112 his4-34)
SLH11	una cepa L3262 con deleción en yps1
	(MATa ura3-52 leu2-3,112 his4-34 yps1::LEU2)
SLH12	una cepa L3262 con deleción en yps2
	(MATa ura3-52 leu2-3,112 his4-34 yps2::LEU2)
SLH14	una cepa L3262 con deleción en yps3
	(MATa ura3-52 leu2-3,112 his4-34 yps1::HIS4 yps2::LEU2)

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Composición del medio y condiciones de cultivo

Al transformar cepas de levadura con un casete URA3 para eliminar el gen yps3 o con el vector de expresión pg10-hpth1, se usó el medie sintético SC-URA que sólo carecía de uracilo. Para recuperar el marcador de selección URA de la cepa mutante yps3::URA3 obtenida, se usó un medio 5-FOS (5-fluorotato) (Adams y col., Methods in yeast genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1997). Para la inducción de la expresión de hPTH bajo el 3 control del promotor GALIO, los cultivos se hicieron crecer en un medio YPDG (1% de extracto de levadura, 2% de Bactopeptona, 1% de glucosa y 1% de galactosa) durante 48 horas.

Ejemplo 1 Creación de una levadura mutante en YPS3

La creación de un vector recombinante que contenga un casete URA3 para usar en la deleción del gen YPS3 se ilustra en la Fig. 1.

Los fragmentos de los extremos N y C del gen YPS3 necesarios para la recombinación por homología que conduce a la eliminación del gen YPS3 se sintetizaron mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa), usando dos pares de cebadores sintetizando según la secuencia de bases de YPS3 de Saccharomyces cerevisiae, registrado en GenBank. Para la comodidad de la posterior manipulación genética, se designaron un conjunto de cebadores (^{1)}5'-GACGAATTCCAGAAACGTCTGAGTGGAG-3' y ^{2)}5'-GCAGCATCCGTACTCTACCGAATGCCG-3') para amplificar los fragmentos N-terminales con sitios de reconocimiento para EcoRI y BamHI en sus respectivos sitios de los extremos 5'(partes subrayadas), mientras que se introdujeron sitios de restricción para BamHI y XbaI en los extremos 5' de un conjunto de cebadores (^{3)}5'-CGCGGATCCCTATGCAGACCAGTGTGG-3' y ^{4)}5'-CGCTC
TAGACTGCATGCAAGGTCTGAC-3') para amplificar el fragmento del extremo C (partes subrayadas). La PCR se realizó en una centrifugadora térmica, como la fabricada por Perkin Elmer, identificada como "GeneAmp PCR 2400", con 25 ciclos de temperatura, cada uno de ellos consistente en 95ºC/30s para desnaturalizar, 55ºC/30s para la hibridación y 72ºC/30s para la extensión, para producir un fragmento de 800 pares de bases y otro de 700 que codifican para los extremos N y C del gen YPS3, respectivamente, del ADN de Saccharomyces cerevisiae. Los productos de la PCR, es decir, los fragmentos con los extremos N y C de YPS3, se sometieron a una doble digestión con las enzimas de restricción EcoRI/BamHI y BamHI/XbaI, respectivamente, seguido de la inserción de los productos de la digestión enzimática en el vector pbluescript II KS(+) (Stratagen) previamente tratado con EcoRI/XbaI. En el sitio de reconocimiento de la BamHI localizado entre los fragmentos terminales del vector recombinante resultante pB-YPS3NC, se introdujo un marcador de selección de descarga URA3, para crear el vector pB-yps3::URA3:tc5 para la deleción del gen YPS3.

A continuación, se produjo la deleción del gen YPS3 de Saccharomyces cerevisiae usando los casetes con URA3, seguido de la recuperación del marcador de selección URA3 de allí, como se ilustra en la Fig. 2.

En detalle, después de la transfección del fragmento de ADN obtenido mediante el tratamiento con enzimas de restricción del vector pB-yps3::URA3:tc5 con EcoRI/XbaI en las cepas de Saccharomyces cerevisiae 2805, L3262a, SLH11 (yps1\Delta), SLH12 (yps2\Delta) y SLH14 (yps\Delta/yps2\Delta), se realizó una selección primaria de los transformantes URA en medio de selección SC.URA. Se efectuó una PCR para identificar si los transformantes URA presentaban deleción en el gen YPS3, después de lo cual, los transformantes yps3::URA3::tc5 seleccionados se extendieron en placas con 5-FOA para seleccionar los clones yps3::tc resultantes de la descarga del gen URA3 mediante recombinación por homología.

La deleción del gen YPS3 en los mutantes yps3A finales se identificó otra vez mediante PCR para obtener las cepas yps3 mutadas, S28Y4, SLH15, SLH16, SLH17 y SLH18, que opcionalmente eran defectivas en otros genes de proteasas de la familia de las yapsinas. Estas cepas mutantes se resumen en la tabla 2, a continuación.

Cepas de levaduras con deleción en Yps3

Cepa	Descripción/genotipo
S28Y4	una cepa con deleción en yps3
	(MATa pep4::His3 prb-\Delta1.6R can1 his3-20 ura3-52 yps3::tc5)
SLH15	una cepa L3262 con deleción en yps3
	(MATa ura3-52 leu2-3,112 his4-34 yps3::tc5)
SLH16	una cepa L3262 con deleción doble en yps1/yps3
	(MATa ura3-52 leu2-3,112 his4-34 yps1::LEU2 yps3::tc5)
SLH17	una cepa L3262 con deleción doble en yps2/yps3
	(MATa ura3-52 leu2-3,112 his4-34 yps2::HIS4 yps3::tc5)
SLH18	una cepa L3262 con deleción triple en yps1/yps2/yps3
	(MATa ura3-52 leu2-3,112 his4-34 yps1::LEU2 yps2::HIS4 yps3::tc5)

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Ejemplo 2 Creación de una cepa de levadura recombinante que expresa hPTH y análisis de la expresión de hPTH

Las cepas salvajes 2805 y L3262 de Saccharomyces cerevisiae y los mutantes de Saccharomyces cerevisiae S28Y4, SLH15 (yps3\Delta), SLH16 (yps1\Delta/yps3\Delta), SLH17 (yps2\Delta/yps3\Delta) y SLH18 (yps1\Delta/yps2\Delta/yps3\Delta), se transformaron con el vector de expresión pG10-hPTH1, seguido de la selección de transformantes Ura+. Estas cepas de levadura recombinantes capaces de expresar hPTH fueron sometidas a análisis de la expresión de hPTH.

Las levaduras mutantes se cultivaron previamente a 30ºC durante 24 horas en caldos de cultivo selectivos mínimos (0,67% de sustrato nitrogenado de levadura sin aminoácidos, 2% de glucosa, 0,5% de ácido casamino), un 2% de cada uno de los cultivos se inoculó en un medio YPDG (1% de extracto de levadura, 2% de bactopeptona, 1% de glucosa, 1% de galactosa) e incubado a 30ºC durante 48 horas. Durante esta incubación, se extrajeron muestras a 24 y a 48 horas. Se centrifugaron 500 \mul de cada muestra a 5.000 rpm durante 5 minutos para separar el sobrenadante de la biomasa. Se añadió un décimo del volumen del sobrenadante de DOC (ácido desoxicólico) y de TCA (ácido tricloroacético), que se dejó reposar a 0ºC durante 30 minutos para que precipiten las proteínas contenidas en él. La centrifugación a 12.000 rpm produjo un precipitado que se lavó con acetona para eliminar los restos de solución TCT que quedan en la proteína precipitada, y se disolvió en 25 \mul de un tampón de lisis, seguido de calentamiento a 100ºC durante 5 minutos para obtener la fracción proteica extracelular. Se cargaron 10 \mul de esta fracción proteica extracelular en un gel separador de poliacrilamida al 15% (pH 8,8, 10 cm de ancho, 8 cm de longitud y 0,7 mm de grosor) y se sometieron a una electroforesis a 125 V y 25 mA durante 1,5 horas. Las proteínas que corren en el gel se visualizaron mediante azul Coumassie. Los resultados de la electroforesis se muestran en la Fig. 3a para la muestra de 24 horas, y en la Fig. 3b para la muestra de 48 horas.

Como se observa en estas fotografías de la electroforesis, la hPTH recombinante secretada por las cepas de Saccharomyces cerevisiae se separan en SDS-PAGE, apareciendo tres bandas: i para la molécula intacta (1-84); d1 para la molécula fragmentada en su extremo N (27-84); y d2 para la molécula fragmentada en su extremo C (1-80). Las proteínas localizadas en las bandas i y d1 se transfirieron a una membrana de PVDF (fluoruro de polivinilideno). La secuenciación de los aminoácidos del extremo N con la ayuda del secuenciador de proteínas Milligen/Bisearch M 600 identificó las secuencias aminoacídicas ^{5)}Ser-Val-Ser-Glu-Ile y ^{6)}Lys-Leu-Gln-Asp-Val en las regiones de los extremos N de las proteínas de las bandas i y d1, respectivamente, lo que indica que la proteína de la banda i es la molécula de hPTH intacta mientras que la proteína de la banda d1 es la forma fragmentada (27-84) que no tiene los 26 residuos aminoacídicos del extremo N de la hPTH. En cuanto a la banda d2, su proteína, aunque muestra una banda electroforética 14 kDa más larga que la de la molécula intacta, se descubrió que era una forma fragmentada de hPTH carente de 4 a 5 aminoácidos del extremo C (1-70, 80), como se observó al analizarla mediante HPLC, espectrometría de masas MALDI y secuenciación de los aminoácidos del extremo C. El patrón electroforético característico se ha atribuido al cambio conformacional que se produce en la proteína como consecuencia de la eliminación del extremo C (Vad y col., Protein Expr. Purif. 13:396-402 (1998)).

Ejemplo 3 Patrones de expresión de hPTH en mutantes deficientes de proteasas de la familia de las yapsinas

Para estudiar el efecto de la deleción de los genes YPS1 e YPS3 sobre la expresión de hPTH, las moléculas de hPTH secretadas por la cepa salvaje, no transformada de Saccharomyces cerevisiae 2802, la cepa salvaje transformada Saccharomyces cerevisiae 2805/pG10-hPTH1, la cepa mutante yps1\Delta transformada S28Y3/pG10-hPTH1 y la mutante yps3\Delta transformada S28Y4/pG10-hPTH1 se sometieron a electroforesis en SDS-PAGE. Los resultados de la electroforesis se muestran en la Fig. 3.

Como se observa en las fotografías de la electroforesis, no se expresaron moléculas de hPTH en la cepa salvaje sin transformar (carril 1). Aproximadamente, 50% o más de la hPTH expresada en la cepa salvaje transformada 2805 era en la forma fragmentada d1 (carriles 3 y 4). En el caso de la cepa yps\Delta1 mutante S28Y3, las formas fragmentadas de la hPTH secretadas al medio comprendían como máximo 5% de la hPTH total cuando procedía de los cultivos de 24 horas. En cambio, se descubrió que tanto como 30%-40% de la hPTH obtenida de los cultivos de 48 horas se encontraba en la forma d1. Los patrones de expresión de hPTH de la cepa S28Y4, mutada sólo en el gen YPS3, no eran diferentes de los de la cepa salvaje: aproximadamente 50% o más de la hPTH secretada en 24 horas se encontraba en formas fragmentadas.

Los resultados, considerados globalmente y mostrados en la Fig. 3, demuestran que la principal proteína causante de la fragmentación de la hPTH en los estadios tempranos de cultivo sea la Yapsina 1 y otras proteasas distintas a ella, son las responsables de la escisión de la hPTH en los estadios tardíos de cultivo. Sin embargo, en el caso de la cepa mutada en sólo el gen YPS3, no se pueden obtener efectos significativos ya que la actividad de la Yapsina 1 ya fragmenta la hPTH en gran medida en los estadios tempranos del cultivo.

Por tanto, se realizó un estudio del patrón de expresión de la producción de hPTH cuando se mutó el gen YPS1 junto con los genes YPS1 y YPS2. Así, la hPTH se expresó en la cepa salvaje no transformada Saccharomyces cerevisiae L3262, sirviendo como cepa control, el cepa transformada L3262/pG10-hPTH1, la mutante yps3\Delta transformada SLH15/pG10-hPTH1, la mutante yps1\Delta/yps3\Delta transformada SLH16/pG10-hPTH1, la mutante ysp2\Delta/ysp3\Delta transformada SLH17/pG10-hPTH1, y la mutante yps1\Delta/yps2\Delta/yps2\Delta transformada SLH18/pG10-hPTH1. Las proteínas secretadas fueron sometidas a electroforesis da la misma manera ya descrita y los resultados de la electroforesis mostrados en la Fig. 4a corresponden a las muestras obtenidas después de 24 horas de incubación, y los de la Fig. 4b corresponden a las muestras obtenidas tras 48 horas de incubación.

Como se observa en la Fig. 4, no se detectó hPTH en la cepa sin transformar (carril 1). Hasta 50% de la hPTH secretada por la cepa salvaje transformada (carriles 2 y 3), cepa mutada en YPS3 (carriles 4 y 5) y la cepa con doble mutación en YPS2 y YPS3 (carriles 6 y 7) se encontraba en la forma d1 fragmentada en su extremo N, cuando se recogió a las 24 horas. Después de 48 horas, se encontró una fragmentación todavía mayor y aumentó la proporción de hPTH fragmentada. Por otro lado, un hecho interesante es que ninguna de las moléculas de hPTH secretadas por la cepa con mutación doble en YPS1 e YPS3 (carriles 6 y 7) y la cepa con triple mutación en YPS1, YPS2 e YPS3 (carriles 10 y 11) presentaban la forma d1 fragmentada en su extremo N, incluso cuando procedían de muestras de cultivo de 48 horas. Además, se describió que la forma fragmentada de la banda d2 comprendía aproximadamente 20% de la hPTH total secretada por la cepa con mutación doble en YPS1 y YPS3, mientras que la hPTH intacta de la banda i, pero no la proteína de la banda d2, se observó incluso tras 48 de cultivo de la cepa con triple mutación en YPS1/YPS2/YPS3. Estos resultados, tomados en conjunto, muestran que el problema de la degradación de la hPTH que presentan las cepas salvajes de levadura puede resolverse casi por completo usando la cepa en la que se han mutado los genes YPS1, YPS2 e YPS3.

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Ejemplo 4 Patrones de expresión de hPTH en cultivos de alta concentración

Se llevó a cabo un experimento para estudiar si la hPTH expresada por las cepas mutantes defectivas en proteasas yapsinas creadas como se ha descrito, sufrió un proceso de proteólisis o no. A este respecto, se añadió galactosa de forma continua a los frascos de cultivo para imitar las condiciones de los cultivos de alta concentración en baño de fermentación. Después de 24 horas de incubación previa en caldos de cultivo YPDG, se cultivaron las cepas durante 72 horas añadiendo galactosa a los caldos a intervalos de 24 horas, para mantener la concentración de galacatosa en los caldos de cultivo a un 2%.

En estas condiciones, la hPTH se expresó en la cepa salvaje sin transformar Saccharomyces cerevisiae L3262 sirviendo como control, la transformada L3262/pG10-hPTH1, La mutante yps1\Delta transformada SLH11/pG10-hPTH1, la mutante yps1\Delta/yps3\Delta transformada SLH16/pG10-hPTH-1 y la mutante yps1\Delta/yps2\Delta/yps2\Delta transformada SLH18/
pG10-hPTH1. Las proteínas secretada fueron sometidas a electroforesis de la manera descrita anteriormente, y los resultados de la electroforesis correspondientes a las cepas L3262/pG10-hPTH y SLH11/pG10-hPTH1 se muestran en la Fig. 5a, y los de las cepas SLH16/pG19.hPTH1 y SLH18/pG10-hPTH1 en la Fig.5b.

Como se observa en la Fig.5, hasta 50% de la hPYH secretada por la cepa salvaje de levadura (carriles 2-7, Fig. 5a) ya existía en la forma d1 fragmentada en su extremo N cuando se obtenía a las 24 horas. Por otro lado, en el caso de los cultivos de la cepa mutante yps1\Delta (Fig. 5a, carriles 8-13) y la mutante yps1\Delta/yps3\Delta (carriles 2-7, Fig. 5b), la hPTH no se degradó en los cultivos de 24 horas, mientras que se observó una degradación significativa de la hPTH en el cultivo de alta concentración de 48 horas al que se la había proporcionado galactosa de forma continua. En cambio, se observó que en los cultivos de mutantes yps1\Deltayps2\Deltayps3\Delta (carriles 8-13, Fig. 5b) no había hPTH en su forma d1 fragmentada en el extremo N y un aumento significativo de la hPTH intacta (banda i), incluso obtenida tras 72 horas. Incluso a las 144 horas, en los cultivos de las cepas con triple mutación no se encontraron formas fragmentadas de hPTH. Estos resultados claramente demostraron que el problema de la degradación de la hPTH que ocurre en los estadios tardíos de los cultivos de alta concentración, se puede resolver por completo usando un mutante en los genes YPS1, YPS2 e YPS3.

Como se ha descrito antes en la presente invención, las levaduras mutantes en los genes Yapsina 1 (anteriormente YPA3) y Yapsina 3 (yps1\Delta/yps3\Delta) o en todos los genes Yapsinal, Yapsina 2 (antes MKC7) y Yapsina3 (yps1\Delta/yps2\Delta/yps3\Delta) pueden secretar hPTH intacta, útil como tratamiento de varios trastornos, con un alto rendimiento debido a su incapacidad para degradar el péptido hormonal.

La presente invención se ha descrito de una forma ilustrativa, y se debe entender que la terminología se usa en aras de la descripción más que para el establecimiento de limitaciones. Son posibles muchas variaciones y modificaciones de la presente invención a la luz de las enseñanzas anteriores. Por tanto, se debe entender que, dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, la invención puede practicarse de una manera distinta a la descrita específica-
mente.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr}

10

11

12

13

<110> Dong Kook Pharmaceutical CO., LTD

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<120> Levadura transformante productora de hormona paratiroidea humana y procedimiento para producir la hormona.

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<130> A-02749/FJR/yg/sa

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<140> P 200350014

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<141> 2003-02-27

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<150> KR2000/0051267

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<151> 2000-08-31

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<160> 6

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 28

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<221> primer

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<222> (1)..(28)

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<223>

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<400> 1

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gacgaattcc agaaacgtct gagtggag

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28

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<210> 2

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<211> 27

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<221> primer

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<222> (1)..(27)

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<223>

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<400> 2

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gcaggatccg tactctaccg aatgccg

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27

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<210> 3

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<211> 27

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<221> primer

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<222> (1)..(27)

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<223>

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<400> 3

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cgcggatccc tatgcagacc agtgtgg

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27

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<210> 4

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<211> 27

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<221> primer

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<222> (1)..(27)

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<223>

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<400> 4

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cgctctagac tgcatgcaag gtctgac

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27

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<210> 5

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> Región N-terminal de la proteína de la banda i

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<222> (1)..(5)

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<223>

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<400> 5

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\sa{Ser Val Ser Glu Ile}

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y

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<210> 6

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> Región N-terminal de la proteína de la banda d1

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<222> (1)..(5)

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<223>

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<400> 6

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\sa{Lys Leu Gln Asp Val}

Claims

1. Un procedimiento para producir hormona paratiroidea humana recombinante (hPTH) a partir de una levadura huésped, comprendiendo los pasos de:

someter a la levadura huésped a una mutación por deleción en los genes YPS1 e YPS3;

transformar la levadura huésped con un vector de expresión que contiene un gen codificador de la hormona paratiroidea humana; y

cultivar la levadura huésped transformada en un medio adecuado; llevando a cabo la deleción por mutación, por alteración de dichos genes utilizando un marcador de selección de levaduras.

2. El procedimiento según las reivindicación 1, en el que la levadura huésped se altera en los tres genes, YPS1, YPS2 y YPS3.

3. Una cepa de levaduras, preparada mediante la transformación de una levadura mutante yps1\Deltayps3\Delta con un vector de expresión en el que se ha insertado un gen de la hormona paratiroidea humana.

4. La cepa de levadura según la reivindicación 5, en la que la cepa de levadura es Saccharomyces cerevisiae SLH16/pG10-hPTH (nº de acceso KCTC 0815BP) y el vector de expresión es pG10-hPTH1.

5. Una cepa de levadura, preparada mediante la transformación de una levadura mutante yps1\Deltayps2\Deltayps3\Delta con un vector de expresión en el que se ha insertado un gen de la hormona paratiroidea humana.

6. La cepa de levadura según la reivindicación 5, en la que la cepa de levadura es Saccharomyces cerevisiae SLH18/pG10-hPTH (KCTC 0816BP) y el vector de expresión es pG10-hPTHI