CN102559916A - 一种结核分枝杆菌耐多药检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种结核分枝杆菌耐多药检测方法。目的是提供的方法应能同时测定结核分枝杆菌对异烟肼和利福平的耐药性，具有特异性与灵敏度较高、检测快速以及操作简便的特点。技术方案是：一种结核分枝杆菌耐多药检测方法，其步骤是：A、建立MTB临床菌株和标准菌株H37Rv的PCR模板；B、设计与异烟肼和利福平耐药密切相关katG、inhA和rpoB基因片段的三对引物，同时对临床菌株的katG、inhA和rpoB基因进行mPCR扩增；并对临床菌株和标准菌株H37Rv的katG、inhA和rpoB基因分别进行PCR扩增；C、采用单链构象多态性检测方法同时检测临床菌株耐INH和RFP相关的3个基因的突变情况。

Description

一种结核分枝杆菌耐多药检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于多重聚合酶式反应-单链构象多态性(mPCR-SSCP)用于同时检测结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，简称MTB)临床分离株耐异烟肼和利福平相关的基因突变的方法，可同时用于临床结核分枝杆菌异烟肼和利福平耐药性的快速检测。

背景技术

中国结核病人数位于全球第二，近年来结核分支杆菌的耐药性呈现显著的增长趋势，中国也是耐药性程度最高的国家之一，耐药结核菌株的出现已经成为一个严重的公众健康问题。异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(SM)和乙胺丁醇(EMB)是临床一线抗结核药物。所谓耐多药结核病是指至少对INH和RFP两个主要抗结核药物耐药的结核病，全球约有4.3％的结核病例发生耐多药，部分高发地区的耐多药更是高达10％以上，耐药的上升特别是耐多药率逐年上升，成为结核病日趋流行的主要原因。回顾性调查结果表明，中国结核分支杆菌的总耐药率为27.8％，耐多药率为10.7％。

及早的MTB药敏试验结果以便制订个性化治疗方案是结核控制的关键。由于MTB生长缓慢，经典的药敏试验以细菌培养为基础，目前虽然有新的液体培养基的出现，但耗时仍然较长，不能及时获得药敏试验结果；不仅影响治疗效果，而且不能及时阻断传播还可能促进耐药株形成。因此，开发一种快速测定MTB耐药性特别是同时检测耐多药性的检测方法，对于规范用药、及时阻断耐结核株的传播，提高结核病治愈率具有重要意义。大量研究结果显示，耐多药结核分枝杆菌中多个药物作用靶位基因突变是引起耐多药的主要原因。近年来报道了许多检测结核耐药相关基因突变的分子生物学方法；然而，这些方法往往需要高昂的成本、专业的仪器设备及极强的专业操作技能。基于以上原因，目前国内用于MTB耐药相关基因突变检测多停留在研究机构或实验室内，目前还没有一种不用专业技术人员操作能在临床应用的检测方法。

PCR-SSCP技术是1989年日本关谷实验室将PCR反应与单链DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳相结合而创立的。其基本原理为：DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的；单链DNA片段碱基发生改变时，影响其空间构象，使构象发生改变；空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开，即所谓的单链构象多态性(Single-Strand Conformation PolymorPhism，SSCP)。将SSCP检测方法用于检查PCR扩增产物的基因突变，建立的PCR-SSCP技术，可用于科学研究中检测基因点突变和短序列的缺失和插入，进行DNA定量分析。该方法操作简便，且以PCR扩增为基础，能检测到单个基因突变产生的改变，其灵敏度、特异性高，也可用于一般临床实验室。2007年香港Chan等报道过用PCR-SSCP检测MTB某些基因突变与耐药的相关性，包洪等2007年利用PCR-SSCP检测了痰标本中与利福平耐药相关基因rpoB突变与耐药的相关性，特异性和灵敏度都有很好的临床意义；但由于MTB耐药基因数量多，逐个进行PCR-SSCP分析仍然十分麻烦且费时费工；国内的程晓东等报道用mPCC-SSCP同时检测与异烟肼耐药相关三个基因突变，解决了单个PCR-SSCP费时费工的缺陷，但只检测了单个药物异烟肼耐药相关基因突变；不适应逐年增加的MTB的多耐药率。

发明内容

本发明的目的是克服上述背景技术的不足，提供一种结核分枝杆菌耐多药检测方法，该方法应能同时测定结核分枝杆菌对异烟肼和利福平的耐药性，具有特异性与灵敏度较高、检测快速、操作简便易行、易于规范化且成本低、以及有利于在临床实验室普及的特点。

本发明提供的技术方案是：一种结核分枝杆菌耐多药检测方法，其步骤是：

A、建立MTB临床菌株和标准菌株H37Rv的PCR模板；

B、设计与异烟肼和利福平耐药密切相关katG、inhA和rpoB基因片段的三对引物，同时对临床菌株的katG、inhA和rpoB基因进行mPCR扩增；并对临床菌株和标准菌株H37Rv的katG、inhA和rpoB基因分别进行PCR扩增；

C、采用单链构象多态性检测方法同时检测临床菌株耐INH和RFP相关的3个基因的突变情况；

所述步骤B中的mPCR引物以及PCR引物是：扩增katG基因的上、下游引物分别为5’-AAG GAA GCC ACC TGG CTC GGC-3’以及5’-GCC GAA CGG GTC CGG GAT GGT-3’，扩增产物预期的大小为510bp；扩增inhA基因的上、下游引物分别为5’-GGC ATC CAC ATCTCG GCG-3’以及5’-CAG CGC GCA CAC CGT CTT GGC-3’，扩增产物预期的大小为381bp；扩增rpoB基因的上、下游引物分别为5’-ACA TCC GGC CGG TGG TCG CCG-3’以及5’-TTT CGA TCG GGC ACA TCC GGC-3’，扩增产物预期的大小为207bp。

所述mPCR扩增的反应体系为：PCR总体积100μL，内含2.5mol/L dNTP、katG、inhA和rpoB基因的各自上、下游引物250mmol/L、2.5U Ex-Taq DNA聚合酶(TaKaRa)、2μL模板、1×PCR缓冲液(pH8.3)。

所述mPCR扩增的参数为：94℃4min；94℃30s、52℃30s、72℃45s，循环35轮；72℃5min；采用1μg/mL溴乙锭预染2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

所述PCR扩增的反应体系中只加katG、inhA或rpoB基因的各自上、下游引物250mmol/L，反应体系其它成分以及PCR参数与mPCR相同。

所述单链构象多态性检测方法是：将上述mPCR产物以及结核分枝杆菌标准菌株H37RvkatG、inhA和rpoB基因的PCR产物各10μL分别与等体积变性剂混合，沸水浴5min后冰浴2min，5000r/min 4℃离心2min，取水相加入8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上样孔，13℃400V电泳5min后120V电泳10h，然后取胶板进行银染法染色，观察结果(单基因PCR产物经变性后形成2条或3条单链，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后呈现1～3条带)；若单链位置与标准菌株H37Rv单链位置不同，称为运动变位，判定为基因突变。

还对MTB临床菌株和标准菌株H37Rv的katG、inhA和rpoB基因分别进行DNA直接测序，然后对测序结果进行比较，验证单链构象多态性检测方法的可靠性。

对MTB临床菌株进行DNA测序时设置H37Rv株作标准对照；临床菌株与H37Rv株的katG、inhA或rpoB基因扩增片段分别用PCR产物纯化试剂盒(BioColor)提纯、回收后，测序。

还对MTB临床菌株和标准菌株H37Rv进行药物敏感试验，根据药敏结果判定标准，测定结核分枝杆菌临床菌株对异烟肼和利福平耐药性。

所述药物敏感试验是：采用绝对浓度法检测MTB临床菌株对INH和RFP的耐药性，实验中以对INH和RFP敏感的标准菌株H37Rv为质控菌株，药物浓度为低高两个浓度，INH为1和10μg/mL，RFP为50和250μg/mL，实验重复三次以确保结果正确。

所述药敏结果判定标准是：在无药对照培养基上被检菌株生长良好时，含药培养基斜面无菌落生长为敏感；菌落生长占斜面面积1/4为耐药1+；菌落生长占斜面面积1/2耐药2+；菌落生长占斜面面积3/4为耐药3+。低浓度含药培养基菌落生长1+以上提示耐药。

所述步骤A中PCR模板的DNA从经过培养的MTB临床菌株以及标准菌株H37RvDNA基因组中提取。

所述PCR模板的DNA提取方法是：将细菌培养物移入1.5ml离心管中，用生理盐水洗涤3次，6000r/m、4℃离心5min弃上清，取沉淀用提取DNA试剂盒提取DNA。

所述变性剂的成分为：95％重量比的甲酰胺、10mmoL/LEDTA、0.02％重量比的溴酚蓝，其余为水。

本发明的有益效果是：

1)本发明利用Genbank公布的NC_000962 H37Rv基因序列设计的三对一次性检测异烟肼和利福平耐药相关基因的mPCR引物序列，可使所有临床菌株均能扩增出对应目的基因片段。

2)本发明通过mPCR-SSCP同时检测与结核分支杆菌INH和RFP耐药密切相关的katG、inhA和rpoB基因突变，与常规绝对浓度法药敏试验比较，方法的特异性分别为100％和97.8％，灵敏度为78.6％和91.1％；高于传统的结核分枝杆菌药敏试验，表明我们发明的mPCR-SSCP能用于临床菌株多耐药性检测。

3)本发明通过对mPCR扩增产物进行单链构象多态性(SSCP)检测(如MTB临床菌株katG、inhA和rpoB基因片段存在突变，则通过电泳后与H37Rv株比较DNA单链的数目及位置是否存在不同)，由此筛选出存在目的基因突变菌株；又通过PCR直接测序确定目的基因突变位点，进一步验证了SSCP的可靠性(检测证明：所有INH敏感结核分枝杆菌相关基因与PCR-DS结果全部一致，RFP敏感菌符合率为98.9％；INH耐菌株mPCR-SSCP检测结果与PCR-DS符合率为91.7％)。还通过药物敏感试验测定了耐药性(RFP耐药菌株mPCR-SSCP检测结果与PCR-DS符合率为95.3％。mPCR-SSCP与PCR-DS总符合率至少为91.7％)。进一步验证了mPCR-SSCP的检测结核分支杆菌INH和RFP耐药密切相关的katG、inhA和rpoB基因突变的可靠性。

4)本发明通过引物设计在同一PCR反应体系中进行多个与耐药相关基因目的片段扩增，结合单链DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，不仅利用了PCR的高灵敏度，而且通过设计引物建立mPCR同时扩增三个与异烟肼和利福平耐药相关的基因片段，简化了实验操作、降低了试验成本。

5)本发明特异性与灵敏度较高，能检测通过培养的MTB，也可以直接检测疑似结核病人痰标本，能在1～2天内快速获得实验结果，不仅MTB检出率高于涂片阳性率，且由于本发明操作简便、不需要昂贵的仪器设备、易于规范化成本又低，有利于在临床实验室推广普及，将会带来显著的经济效益和社会效益。

此外，本发明可用于痰液标本直接检测；由于提取MTB使用痰量限制，检出率明显低于直接用MTB样本进行检测；本发明用mPCR-SSCP同时检测了疑似结核病人痰液标本与INH耐药相关的katG和inhA基因突变，以及与RFP耐药相关的rpoB基因突变，方法步骤与培养MTB为标本的mPCR-SSCP相同；发现虽然灵敏度与特异性降低，但以病人痰液为直接检测对象，检测结果可以在24h内给出；与传统MTB药敏需时2～3月比极大缩短时间，为及时阻断MTB耐药菌株的传播提供了有力的技术支持。

附图说明

图1是本发明的检测方法示意图。

图2是本发明中用于mPCR扩增的各基因上、下游引物序列设计区域示意图。

图3是结核分枝杆菌katG、inhA和rpoB基因mPCR扩增产物的凝胶电泳图。其中：泳道M：DNA Marker；泳道1：H37Rv株扩增条带；泳道2：对INH及RFP敏感的临床菌株；泳道3和4：仅对INH耐药的临床菌株；泳道5和6：仅对RFP耐药的临床菌株；泳道7和8：对INH和RFP均耐药的临床菌株。

图4是结核分枝杆菌katG、inhA和rpoB基因mPCR-SSCP分析检测图。其中：泳道MK、MI和M R分别表示结核分枝杆菌H37Rv株的katG、inhA和rpoB基因PCR-SSCP电泳结果；泳道1和5：H37Rv株；泳道2：katG变位临床菌株电泳结果；泳道3：inhA变位临床菌株电泳结果；泳道4：rpoB变位临床菌株电泳结果；泳道6：katG+inhA变位临床菌株电泳结果；泳道7：katG+rpoB变位临床菌株电泳结果；泳道8：inhA+rpoB变位临床菌株电泳结果；泳道9：katG+inhA+rpoB变位临床菌株电泳结果。

具体实施方式

序列表说明

序列1是根据GenBank(DNA序列数据库)公布的H37Rv基因序列(Accession：NC_000962)设计的扩增结核分枝杆菌katG基因目的片段的上游引物，为核苷酸序列。

序列2是根据GenBank公布的H37Rv基因序列(Accession：NC_000962)设计的扩增结核分枝杆菌katG基因目的片段的下游引物，为核苷酸序列。

序列3是根据GenBank公布的H37Rv基因序列(Accession：NC_000962)设计的扩增结核分枝杆菌inhA基因目的片段的上游引物，为核苷酸序列。

序列4是根据GenBank公布的H37Rv基因序列(Accession：NC_000962)设计的扩增结核分枝杆菌inhA基因目的片段的下游引物，为核苷酸序列。

序列5是根据GenBank公布的H37Rv基因序列(Accession：NC_000962)设计的扩增结核分枝杆菌rpoB基因目的片段的上游引物，为核苷酸序列。

序列6是根据GenBank公布的H37Rv基因序列(Accession：NC_000962)设计的扩增结核分枝杆菌rpoB基因目的片段的下游引物，为核苷酸序列。

本发明利用根据基因突变是引起结核分枝某些菌耐药的主要原因这一耐药机制，通过分子生物学手段建立检测与多耐药相关基因的突变的mPCR-SSCP。

基因选择的依据：所谓耐多药结核病是指至少对INH和RFP两个主要抗结核药物耐药的结核病，大量研究结果显示，耐多药结核分枝杆菌中多个药物作用靶位基因突变是引起多重耐药的主要原因，其中结核杆菌耐多药相关基因katG、inhA和rpoB的突变与细菌对INH和RFP耐药密切相关。所以通过检测katG、inhA和rpoB的突变为临床提供结核分枝杆菌临床菌株耐多药特点，我们构建了能同时检测上述基因突变的mPCR-SSCP用于检测MTB对应基因的突变，结果表明突变检出率达90％以上，且检测方法灵敏度、特异性高，是一种简便易行、灵敏、特异的检测方法。

本发明采用mPCR-SSCP的理由是：基因突变是引起结核分枝杆菌耐药的主要原因(耐多药结核分枝杆菌中多个药物作用靶位基因突变是引起多重耐药的主要原因)；目前以单一基因突变检测为目的的PCR-SSCP已有不少研究报道，随着耐多药率的不断升高，常常需要同时检测临床菌株对多种药物的耐药性；若使用多个PCR-SSCP检测多个耐药基因突变，不仅提高检测成本，而且操作过程繁复而增加了实验误差发生率；通过mPCR(多重扩增)可一次性检测多个基因的目的片段，简化了实验操作、降低了试验成本。

检测结核分枝杆菌耐多药相关基因katG、inhA和rpoB的突变的mPCR-SSCP，包含以下的步骤：

1)建立MTB临床菌株和标准菌株H37Rv的PCR模板(同时作为mPCR扩增模板)

2)设计与异烟肼和利福平耐药密切相关各基因扩增的上、下游引物；

3)采用mPCR在同一反应体系中同时扩增临床菌株katG、inhA和rpoB目的基因片段；

4)katG、inhA和rpoB目的基因mPCR产物经SSCP筛选出目的基因突变菌株(通过与标准菌株对比进行筛选)；

5)PCR分别扩增临床菌株以及标准菌株H37Rv的katG、inhA和rpoB目的基因片段，扩

增产物纯化回收后进行DNA测序。

上述检测方法适用于各应用单位(医院、研究院所、疾病预防控制中心等)。

本发明还包括了以下内容：

1)对临床菌株与标准菌株进行绝对浓度法药敏试验，比较确定mPCR-SSCP方法特异性与灵敏度；

2)与PCR直接测序比较，确定mPCR-SSCP方法检测基因突变的检出率。

以下结合实施例进一步说明。

实施例：

本实施例中标本来源：为经培养并鉴定的结核分枝杆菌临床菌株，也可以是疑似结核病人的痰标本。

本实施例中试剂来源：本实施例中所用的一切实验用材料和试剂及相关设备均可从各自国内外相关产业公司或国外公司国内销售代理公司购得。在微生物学、分子生物学等技术领域的专业人员，均可重复本实施例中的制备方法并进行试用。

1.DNA基因组提取：从经过培养与鉴定的134例MTB临床菌株和标准菌株H37Rv的DNA基因组中提取；具体是：将细菌培养物移入1.5ml离心管中，用生理盐水洗涤3次，6000r/m(4℃)离心5min弃上清，取沉淀用提取DNA试剂盒提取DNA，用作mPCR及PCR扩增的模板。

2.mPCR引物设计：根据GenBank公布的H37Rv基因序列(Accession：NC_000962)，按扩增区域尽可能涵盖85％以上耐药基因突变位点为原则，选择katG、inhA和rpoB基因合适的扩增区域并采用Blast软件设计扩增引物(设计区域示意图见附图2)。扩增katG基因的上、下游引物分别为5’-AAG GAA GCC ACC TGG CTC GGC-3’以及5’-GCC GAA CGGGTC CGG GAT GGT-3’，扩增产物预期的大小为510bp；扩增inhA基因的上、下游引物分别为5’-GGC ATC CAC ATC TCG GCG-3’以及5’-CAG CGC GCA CAC CGT CTT GGC-3’，扩增产物预期的大小为381bp；扩增rpoB基因的上、下游引物分别为5’-ACA TCC GGC CGGTGG TCG CCG-3’以及5’-TTT CGA TCG GGC ACA TCC GGC-3’，扩增产物预期的大小为207bp。

3.mPCR反应体系：反应体系总体积100μL，内含2.5mol/L dNTP、katG、inhA和rpoB基因的各自上、下游引物250mmol/L、2.5U Ex-Taq DNA聚合酶(TaKaRa)、2μL模板、1×PCR缓冲液(pH8.3)。

4.mPCR参数：94℃4min；94℃30s、52℃30s、72℃45s，循环35轮；72℃5min。采用1μg/mL溴乙锭预染的2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

5.PCR扩增：PCR扩增的反应体系中只加katG、inhA或rpoB基因的各自上、下游引物250mmol/L，反应体系其它成分以及PCR参数与mPCR相同。

6.SSCP：上述mPCR产物及标准菌株katG、inhA和rpoB基因的PCR产物各10μL(共4份；其中mPCR产物1份，katG、inhA以及rpoB基因的PCR产物各1份)与等体积变性剂(成分及重量比为：95％甲酰胺、10mmoL/LEDTA、0.02％溴酚蓝，其余为水)混合，沸水浴5min后冰浴2min，5000r/min、4℃离心2min，取水相加入8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上样孔，13℃400V电泳5min后120V电泳10h，然后取胶板进行银染法染色，观察结果。单基因PCR产物经变性后形成2条或3条单链，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后呈现1～3条带。若临床菌株的单链位置与标准菌株H37Rv单链位置不同(称为运动变位)，判定为基因突变。

7.PCR直接测序：为验证上述mPCR-SSCP检测的可靠性，还对临床菌株以及标准菌株的katG、inhA以及rpoB基因分别进行PCR直接测序(PCR-DS)；用于测序的单个基因的PCR扩增引物同mPCR，只是反应体系中只加katG、inhA和rpoB基因的各自上、下游引物250mmol/L，反应体系其它组成与mPCR相同，PCR参数也与mPCR相同；设置H37Rv株作标准对照，临床菌株与标准菌株H37Rv的katG、inhA和rpoB基因扩增片段用PCR产物纯化试剂盒(BioColor)提纯、回收后，测序。

8.药物敏感试验：为验证上述mPCR-SSCP检测的耐药性结果符合率，采用绝对浓度法检测结核分枝杆菌临床菌株对INH和RFP的耐药性；实验中以对INH和RFP敏感的标准菌株H37Rv为质控菌株，药物浓度为低高两个浓度，INH为1和10μg/mL，RFP为50和250μg/mL，实验重复三次以确保结果正确。

9.药敏结果判定标准：在无药对照培养基上被检菌株生长良好时，含药培养基斜面无菌落生长为敏感；菌落生长占斜面面积1/4为耐药1+；菌落生长占斜面面积1/2耐药2+；菌落生长占斜面面积3/4为耐药3+。低浓度含药培养基菌落生长1+以上提示耐药。

本实施例结果

1.药敏试验结果：134株临床菌株中，52株对INH或对RFP耐药，总耐药率为38.8％；35株同时对INH和RFP耐药呈耐多药，耐多药率为26.1％；分别有7和10株仅对INH或RFP耐药。

2.检测结果：所有(134株)结核分枝杆菌临床菌株mPCR和H37Rv株PCR后均出现510bp的katG基因、381bp的inhA基因和207bp的rpoB基因扩增片段(图3)。

3.PCR-DS结果(参见表1和表2)：134株临床分离株的katG、inhA和rpoB基因片段测序结果与H37Rv株相应基因序列(Accession：NC_000962)比较结果见表2。其中82株对INH和RFP均敏感菌株中，有81株的KatG和inhA基因片段序列与H37Rv株相应基因序列完全相同，1株rpoB基因发生L511M突变；10株仅对INH敏感菌株的katG和inhA基因片段、7株仅对RFP敏感菌株的rpoB基因片段与H37Rv株相应序列完全相同；PCR-DS检测临床菌株对INH和RFP耐药的特异性分别为100％和98.9％。42株对INH耐药的临床菌株中，katG和/或inhA基因突变36株，PCR-DS检测菌株对INH耐药的灵敏度为85.7％。INH耐药菌株中，katG基因测定区域有8个氨基酸发生10种类型的替换突变，以315位丝氨基酸突变最常见；其中22株发生S315N/T/I突变，4株为S315突变伴其它位点的双突变。inhA基因测定区域，7个氨基酸位点发生11次替换突变。45株RFP耐药菌株中检测到rpoB基因突变的菌株43株，PCR-DS检测临床菌株对RFP耐药的灵敏度为95.6％，最常见的突变位点为编码526、531和516位氨基酸的核苷酸序列，其突变频率H526D/Y/R/L(48.8％，21/43)＞S531L(39.5％，17/43)＞D516V/Y(9.3％，4/43)＞L533P(7.0％，3/43)，其中D516V+H526D和H526L+S531L双突变各1株。

4.SSCP结果(参见表1、表2及图4)：参考标准菌株H37Rv三个目的基因SSCP电泳图谱，82株对INH和RFP均敏感的结核分枝杆菌临床菌株SSCP结果显示，katG和inhA基因电泳未见异常，rpoB基因电泳检出有2株发生运动变位，17株仅对RFP或INH敏感菌株SSCP均未见异常；SSCP检测结核分枝杆菌对INH和RFP耐药的特异性分别为100％和97.8％。SSCP检测42株INH耐药临床菌株katG和inhA基因突变情况，检出katG和/或inhA基因电泳运动异常33株，SSCP检测临床菌株对INH耐药的灵敏度为78.6％(33/42)，katG基因和inhA基因mPCR-SSCP表现为电泳运动变位菌株数分别为27株和10株，其中4株katG和inhA两个基因mPCR-SSCP电泳运动同时变位。SSCP检测45株RFP耐药临床菌株rpoB基因突变情况，发现43株RFP耐药菌株rpoB基因电泳运动变位，SSCP检测临床菌株对RFP耐药的灵敏度为95.6％(43/45)，其中21株伴katG基因电泳运动变位，4株伴inhA基因电泳运动变位，2株出现katG、inhA和rpoB三个基因同时运动变位。

表1  52株耐药结核分枝杆菌mPCR-SSCP和PCR-DS检测结果

注：药敏结果R表示耐药，S表示敏感；测序结果S、N、H、D、R、A、G、L、C、V、I、T、Y、P和W分别代表丝氨酸、天冬酰胺、组氨酸、天冬氨酸、精氨酸、丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、酪氨酸、脯氨酸和色氨酸

表2mPCR-SSCP和PCR-DS检测方法的灵敏度和特异性

注：INH-R、INH+RFP-R、INH-S和RFP-R、INH+RFP-R、RFP-S分别表示对异烟肼耐药、同时对异烟肼耐药和利福平耐药、对异烟肼敏感菌株和对利福平耐药、同时对异烟肼耐药和利福平耐药、对利福平敏感菌株。

序列表

<110>孙爱华，严杰，李召东

<120>一种结核分枝杆菌多耐药检测方法

<160>6

<170>WinBlast v.0.2.0

<210>1

<211>核苷酸21

<212>DNA

<213>人工合成

<221>结核分枝杆菌katG基因的上游引物

<400>1

aaggaagcca cctggctcgg c

<210>2

<211>核苷酸21

<212>DNA

<213>人工合成

<221>结核分枝杆菌katG基因的下游引物

<400>1

gccgaacggg tccgggatgg t

<210>3

<211>核苷酸18

<212>DNA

<213>人工合成

<221>结核分枝杆菌inhA基因的上游引物

<400>1

ggcatccaca tctcggcg

<210>4

<211>核苷酸21

<212>DNA

<213>人工合成

<221>结核分枝杆菌inhA基因的下游引物

<400>1

cagcgcgcac accgtcttgg c

<210>5

<211>核苷酸21

<212>DNA

<213>人工合成

<221>结核分枝杆菌rpoB基因的上游引物

<400>1

acatccggcc ggtggtcgcc g

<210>6

<211>核苷酸21

<212>DNA

<213>人工合成

<221>结核分枝杆菌rpoB基因的下游引物

<400>1

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Claims (10)

1.一种结核分枝杆菌耐多药检测方法，其步骤是：

A、建立MTB临床菌株和H₃₇Rv标准菌株的PCR模板；

B、设计与异烟肼和利福平耐药密切相关katG、inhA和rpoB基因片段的三对引物，同时对临床菌株的katG、inhA和rpoB基因进行mPCR扩增；并对临床菌株和H₃₇Rv标准菌株的的katG、inhA和rpoB基因分别进行PCR扩增；

C、采用单链构象多态性检测方法同时检测临床菌株耐INH和RFP相关的3个基因的突变情况；

所述步骤B中的mPCR引物以及PCR引物是：扩增katG基因的上、下游引物分别为5’-AAG GAA GCC ACC TGG CTC GGC-3’以及5’-GCC GAA CGG GTC CGG GAT GGT-3’，扩增产物预期的大小为510bp；扩增inhA基因的上、下游引物分别为5’-GGC ATC CAC ATCTCG GCG-3’以及5’-CAG CGC GCA CAC CGT CTT GGC-3’，扩增产物预期的大小为381bp；扩增rpoB基因的上、下游引物分别为5’-ACA TCC GGC CGG TGG TCG CCG-3’以及5’-TTT CGA TCG GGC ACA TCC GGC-3’，扩增产物预期的大小为207bp。

2.根据权利要求1所述的一种结核分枝杆菌耐多药检测方法，其特征在于所述mPCR扩增的反应体系为：PCR总体积100μL，内含2.5mol/L dNTP、katG、inhA和rpoB基因的各自上、下游引物250mmol/L、2.5UEx-TaqDNA聚合酶、2μL模板、pH8.3的1×PCR缓冲液。

3.根据权利要求2所述的一种结核分枝杆菌耐多药检测方法，其特征在于所述mPCR扩增的参数为：94℃4min；94℃30s、52℃30s、72℃45s，循环35轮；72℃5min；采用1μg/mL溴乙锭预染2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

4.根据权利要求2或3所述的一种结核分枝杆菌耐多药检测方法，其特征在于所述单链构象多态性检测方法是：将上述mPCR产物以及结核分枝杆菌H₃₇Rv标准菌株katG、inhA和rpoB基因的PCR产物各10μL分别与等体积变性剂混合，沸水浴5min后冰浴2min，5000r/min4℃离心2min，取水相加入8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上样孔，13℃400V电泳5min后120V电泳10h，然后取胶板进行银染法染色，观察结果；若单链位置与H37Rv标准菌株单链位置不同，称为运动变位，判定为基因突变。

5.根据权利要求4所述的一种结核分枝杆菌耐多药检测方法，其特征在于所述PCR扩增的反应体系中只加katG、inhA或rpoB基因的各自上、下游引物250mmol/L，反应体系其它成分以及PCR参数与mPCR相同。

6.根据权利要求5所述的一种结核分枝杆菌耐多药检测方法，其特征在于：还对MTB临床菌株和H₃₇Rv标准菌株的katG、inhA和rpoB基因分别进行DNA直接测序，然后对测序结果进行比较，验证单链构象多态性检测方法的可靠性；

对MTB临床菌株进行DNA测序时设置H37Rv株作标准对照；临床菌株与H37Rv株的katG、inhA或rpoB基因扩增片段分别用PCR产物纯化试剂盒提纯、回收后，测序。

7.根据权利要求6所述的一种结核分枝杆菌耐多药检测方法，其特征在于还对MTB临床菌株和H₃₇Rv标准菌株进行药物敏感试验，根据药敏结果判定标准，测定结核分枝杆菌临床菌株对异烟肼和利福平耐药性；

所述药物敏感试验是：采用绝对浓度法检测MTB临床菌株对INH和RFP的耐药性，实验中以对INH和RFP敏感的H₃₇Rv标准菌株为质控菌株，药物浓度为低高两个浓度，INH为1和10μg/mL，RFP为50和250μg/mL，实验重复三次以确保结果正确；

所述药敏结果判定标准是：在无药对照培养基上被检菌株生长良好时，含药培养基斜面无菌落生长为敏感；菌落生长占斜面面积1/4为耐药1+；菌落生长占斜面面积1/2耐药2+；菌落生长占斜面面积3/4为耐药3+。低浓度含药培养基菌落生长1+以上提示耐药。

8.根据权利要求7所述的一种结核分枝杆菌耐多药检测方法，其特征在于所述步骤A中PCR模板的DNA从经过培养的MTB临床菌株以及H₃₇Rv标准菌株DNA基因组中提取。

9.根据权利要求8所述的一种结核分枝杆菌耐多药检测方法，其特征在于所述PCR模板的DNA提取方法是：将细菌培养物移入1.5ml离心管中，用生理盐水洗涤3次，6000r/m、4℃离心5min弃上清，取沉淀用提取DNA试剂盒提取DNA。

10.根据权利要求9所述的一种结核分枝杆菌耐多药检测方法，其特征在于所述变性剂的成分为：95％重量比的甲酰胺、10mmoL/LEDTA、0.02％重量比的溴酚蓝，其余为水。

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