CN1995380B - 一种检测和鉴定分枝杆菌菌种的方法及其专用试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测和鉴定分枝杆菌菌种的方法及其专用试剂盒。该分枝杆菌菌种检测及鉴定试剂盒，包括分枝杆菌属特异引物和分枝杆菌菌种检测芯片；所述分枝杆菌菌种检测芯片包括分枝杆菌菌种检测探针；所述分枝杆菌菌种检测探针由分枝杆菌属特异探针，结核分枝杆菌复合群特异探针和27个分枝杆菌种特异探针组成。本发明所提供的利用上述试剂盒检测分枝杆菌的方法，是以待测分枝杆菌样品的基因组DNA为模板，利用所述分枝杆菌属特异引物进行PCR扩增，将得到的PCR扩增产物与所述分枝杆菌菌种检测芯片进行杂交，根据杂交信号判定待测分枝杆菌。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测和鉴定分枝杆菌菌种的方法及其专用试剂盒。
背景技术
在微生物分类中，分枝杆菌属于原核生物界，厚壁菌门，裂殖菌纲，放线菌目，分枝杆菌科，分枝杆菌属。分枝杆菌属内菌种繁多，Bergey’s manual of systemativebacteridogy(伯杰系统细菌学手册)所确认的分枝杆菌有54种。分枝杆菌属内除结核分枝杆菌复合群菌种(结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌)和麻风分枝杆菌外，其它菌种统称为非结核分枝杆菌(NTM)。对人类致病的NTM有20余种，其中慢生长分枝杆菌包括堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、苏加分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、马尔摩分枝杆菌、施氏分枝杆菌，还有过去通常认为非致病性的戈登分枝杆菌、不产色分枝杆菌、土地分枝杆菌、次要分枝杆菌、亚洲分枝杆菌也可见病例报道；快生长分枝杆菌包括偶然分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌，甚至过去认为的腐物寄生菌，如耻垢分支杆菌现已报导病例不下数10例，且偶有AIDS播散性感染，微黄分枝杆菌也偶尔可引起肺部和关节感染。近年来，在世界范围内由结核分枝杆菌(MTB)及NTM引起的结核病及非结核分枝杆菌病发病率明显升高。
目前，结核病临床实验室分枝杆菌细菌学检测、鉴定方法有：
1、涂片染色：镜检见到抗酸杆菌，报告抗酸染色阳性(+～++++)，不能确定所见抗酸分枝杆菌为MTB还是NTM，需经分枝杆菌菌种鉴定方可确定。
2、分离培养：采用改良罗氏等固体培养基，见到菌落生长，报告分枝杆菌培养阳性(+～++++)，采用Bactec-TB960培养系统或Bact ALERT 3D培养系统，仪器判定为阳性后，取培养物涂片抗酸染色，阳性者报告分枝杆菌培养阳性。分枝杆菌培养阳性不能确定其是MTB还是NTM，需经分枝杆菌菌种鉴定方可确定。
3、分枝杆菌菌种鉴定
(1)、MTB与NTM鉴别：主要依据PNB培养基上生长试验，(-)判定为MTB，(+)判定为NTM。
(2)、分枝杆菌菌种鉴定：依据生长特性，多种鉴别培养基上生长试验和多种生化反应等近20项试验指标综合分析判定结果。
该分枝杆菌菌种鉴定方法具有以下缺点：a、鉴定方法繁杂，需进行近20项试验。b、鉴定试验所需细菌培养物量较大，通常在取得初代分离培养物后需传代培养，用传代培养物进行试验。初代分离培养物→传代培养物→鉴定试验→报告结果，快速生长分枝杆菌需3～4周，缓慢生长分枝杆菌需8～12周。c、结果准确度差：同一菌种不同菌株间，伯杰系统细菌学手册报导约15％生物学表型存在异质性，使菌种难以明确鉴定或鉴定错误。
用于分枝杆菌基因检测及鉴定的商品化试剂盒主要分为以下二类：
1、用于结核分枝杆菌复合群检测及鉴定的试剂盒(李国利，结核病分子生物学检测方法的理论与实践，见：肖和平主编.结核病防治新进展.上海：复旦大学出版社，2004.128-135；卫生部临床检验中心.附录3：有关PCR试剂、仪器厂家试剂、仪器说明.临床基因扩增诊断实验室技术人员培训班资料汇编104-106，109-111，118-120)
(1)、德国Roche公司生产的Amplicor试剂盒(Amplicor mycobacteriumtuberculosis)：以16S rRNA基因(16S rDNA)为靶基因设计分枝杆菌属特异性引物扩增分枝杆菌，以扩增片段内部结核分枝杆菌复合群特异序列设计杂交探针，采用PCR-微孔板杂交法。
(2)、国内多家公司生产荧光PCR试剂盒：以结核分枝杆菌复合群特异的IS6110为靶基因序列设计引物及探针，分别采用Taqman技术和分子信标(molecular beacon)技术。
上述两类试剂盒用于检测鉴定临床样品中结核分枝杆菌复合群，不能检出、鉴定NTM。荧光PCR需荧光PCR仪，价格较贵。
2、用于分枝杆菌菌种鉴定的试剂盒(Tortoli E，Nanetti A，Piersimoni C，et al.Performance assessment of new multiplex probe assay for identification ofmycobacteria.J clin Microbiol，2001，39：1079-1084；Miller N，Infante S and ClearyT.Evaluation of the LipA MYCOBACTERIA assay for identification of mycobacterialspecies from BACTEC 12 B bottles.J Clin Microbiol，2000，38：1415-1919)
(1)、美国gen-probe公司生产的Accuprobe Mycobaterium试剂盒：以16S rRNA为靶序列，设计结核分枝杆菌复合群、鸟分枝杆菌复合群、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和戈登分枝杆菌6种吖啶酯(acridinium ester，AE)标记的cDNA探针，采用液相杂交技术-杂交保护试验(Hybridization protect assay，HPA)。HPA的基本原理及方法为：AE是一种化学发光物质，AE标记的群或种特异性探针在液相中与经处理后待测分枝杆菌释放的rRNA进行杂交；加入选择试剂，与靶序列互补杂交的探针与未杂交的游离探针在选择试剂作用下水解速度相差了百万倍，游离探针迅速水解破坏，失去化学发光特性，而杂交后的探针受到保护，在一定时间内不被水解破坏，产生化学发光，通过化学发光检测仪检测其相对发光值判定结果。
该试剂盒的优点在于方法简便、快速，2小时内报告结果。其局限性在于只适用于对分枝杆菌培养物进行鉴定；试剂盒仅包括6种探针，只能鉴定试剂盒所包括探针的结核分枝杆菌复合群、鸟分枝杆菌复合群、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和戈登分枝杆菌菌种，临床可见的其他致病性分枝杆菌菌种必须通过其他方法鉴定；试验需化学发光检测仪以及试剂盒售价较贵。
(2)、比利时Innogenetics公司生产的LipA(Line Probe assay)Mycobacteria试剂盒：以PCR扩增和反向核酸分子杂交为原理，采用16S-23S rDNA内转录间隔区(ITS)为靶基因序列设计了14条分枝杆菌寡核苷酸探针，以横向线状纵向水平排列固定于硝酸纤维素膜上，制备LipA测试条，与用生物素标记的分枝杆菌属引物扩增的PCR产物杂交，再与碱性磷酸酶标记的链亲和素结合，显色，根据与相应探针杂交线条判定分枝杆菌菌种或复合群。
该试剂盒具有方法简便、快速，3小时～4小时报告结果的优点，但仅适用于对分枝杆菌培养物进行鉴定，且由于针对某一菌种有的使用了2～3条探针，因此14条探针仅能对结核分枝杆菌复合群、堪萨斯分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、戈登分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌和龟分枝杆菌，共8种分枝杆菌进行鉴定.8种以外的分枝杆菌需通过其他方法鉴定至种.
分枝杆菌菌种鉴定在NTM病与结核病的诊断、鉴别诊断、治疗和流行病学调查等方面具有重要意义：
1、诊断：涂片抗酸染色镜检和分枝杆菌分离培养是结核病的主要确诊方法，但由于方法学的限制，即使是涂片或/和培养阳性也难以确定其是MTB还是NTM，因此，需进行分枝杆菌菌种鉴定，使结核病的诊断更趋于科学。
2、鉴别诊断：NTM病与结核病临床症状及肺部X线表现极为相似，难以鉴别，必须依靠菌种鉴定结果，才能明确诊断。
3、治疗：NTM与MTB对药物敏感性不同，多数NTM对抗结核药物天然耐药，不同NTM菌种对药物敏感性亦不同，NTM病与结核病治疗方案应有所不同。
4、流行病学：在流行病学调查上有重要价值。
目前国内外研究及使用较多的分枝杆菌检测、鉴定的靶基因主要是插入序列(insertion sequence，IS)，蛋白质编码基因序列，16S rRNA基因(16S rDNA)序列和16S-23S rRNA基因(16S-23S rDNA)内转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)序列。这些基因序列大致可分为两类：一类是仅存在于结核分枝杆菌复合群菌种高度保守的特异性序列，如IS6110，IS1081，蛋白质编码基因MTP40，MPB70和MPB64，可选择用于结核分枝杆菌复合群的检测和鉴定，其中IS6110是检测、鉴定结核分枝杆菌复合群试剂盒最常采用的基因序列。另一类是分枝杆菌属菌种共有的既高度保守又有种间多态性的序列，如分枝杆菌属菌种共有的蛋白质编码基因序列(65KD蛋白、32KD蛋白、dnaj蛋白和RNA聚合酶β亚单位编码基因)，16S rDNA和16S-23S rDNA ITS序列，可选择用于分枝杆菌菌种的检测和鉴定。
16S rDNA是在基因水平上细菌分类鉴定的传统的靶基因序列。现已完成50余种分枝杆菌菌种16S rDNA的全部或部份核苷酸测序，通过分析比较发现，它们既含有分枝杆菌属特异核苷酸序列，又含有种水平上的特异可变区，分枝杆菌16S rDNA含有两个可变区，既位于126～267位核苷酸的A可变区和位于430～500位核苷酸的B可变区。A可变区核苷酸种间变异高于B可变区，分枝杆菌菌种鉴定多在A可变区水平上进行。但某些临床上重要的致病性NTM，如堪萨斯分枝杆菌、胃分支杆菌、瘰疬分枝杆菌和猿猴分枝杆菌之间，苏加分枝杆菌和马尔摩分枝杆菌之间，海分枝杆菌与溃疡分枝杆菌之间，龟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌之间在此水平上序列完全相同，只能将其鉴定至复合群水平，不能鉴定至种。
近年来，16S-23S rDNA ITS序列作为一种新的在基因水平上细菌分类鉴定的靶基因序列为人们所采用。对50余种分枝杆菌16S-23S rDNA ITS测序结果分析表明，分枝杆菌16S-23S rDNA ITS序列依菌种不同其碱基排列顺序及长度均变异较大，核苷酸序列长度从200多bp～400多bp。在整个核苷酸序列内含2个分枝杆菌属保守片段和数个高度可变的种特异序列，其种间多态性明显高于16S rDNA，与16S rDNA相比较，更适于菌种的鉴定。除海分枝杆菌与溃疡分枝杆菌间序列完全一致不能鉴别外，能将堪萨斯分枝杆菌、胃分支杆菌、瘰疬分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、苏加分枝杆菌、马尔摩分枝杆菌、龟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌鉴定至种。
发明内容
本发明的目的是提供一种简便、快速、准确检测及鉴定分枝杆菌菌种的方法及其专用试剂盒。
本发明所提供的分枝杆菌菌种检测及鉴定试剂盒，包括分枝杆菌属特异引物和分枝杆菌菌种检测芯片；
所述分枝杆菌菌种检测芯片包括分枝杆菌菌种检测探针；所述分枝杆菌菌种检测探针由分枝杆菌属特异探针，结核分枝杆菌复合群特异探针和以下分枝杆菌种特异探针组成：堪萨斯分枝杆菌、海-溃疡分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、戈登分枝杆菌、苏加分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、蟾蜍-施氏分枝杆菌、马尔摩分枝杆菌、土地分枝杆菌、不产色分枝杆菌、胃分支杆菌、次要分枝杆菌、亚洲分枝杆菌、施氏分枝杆菌、偶然分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、草分枝杆菌、淡黄分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、迪氏分枝杆菌、母牛分枝杆菌、金色-迪氏-楚布分枝杆菌、新金色分枝杆菌特异探针；
所述分枝杆菌属特异引物为具有序列表中序列1和序列2的核苷酸序列的两个寡核苷酸；
所述分枝杆菌属特异探针是至少具有序列表中序列3的核苷酸序列的寡核苷酸；
所述结核分枝杆菌复合群特异探针是至少具有序列表中序列5和/或序列7的核苷酸序列的寡核苷酸；
所述堪萨斯分枝杆菌特异探针是至少具有序列表中序列9和/或序列10的核苷酸序列的寡核苷酸；
所述海-溃疡分枝杆菌特异探针是至少具有序列表中序列12的核苷酸序列的寡核苷酸；
所述猿猴分枝杆菌特异探针是至少具有序列表中序列14和/或序列16的核苷酸序列的寡核苷酸；
所述瘰疬分枝杆菌特异探针是至少具有序列表中序列18的核苷酸序列的寡核苷酸；
所述戈登分枝杆菌特异探针是至少具有序列表中序列20的核苷酸序列的寡核苷酸；
所述苏加分枝杆菌特异探针是至少具有序列表中序列22的核苷酸序列的寡核苷酸；
所述鸟分枝杆菌特异探针是至少具有序列表中序列24的核苷酸序列的寡核苷酸；
所述胞内分枝杆菌特异探针是至少具有序列表中序列26的核苷酸序列的寡核苷酸；
所述蟾蜍-施氏分枝杆菌特异探针是至少具有序列表中序列28和/或序列30的核苷酸序列的寡核苷酸；
所述马尔摩分枝杆菌特异探针是至少具有序列表中序列32的核苷酸序列的寡核苷酸；
所述土地分枝杆菌特异探针是至少具有序列表中序列34的核苷酸序列的寡核苷酸；
所述不产色分枝杆菌特异探针是至少具有序列表中序列36的核苷酸序列的寡核苷酸；
所述胃分支杆菌特异探针是至少具有序列表中序列38的核苷酸序列的寡核苷酸；
所述次要分枝杆菌特异探针是至少具有序列表中序列40的核苷酸序列的寡核苷酸；
所述亚洲分枝杆菌特异探针是至少具有序列表中序列42的核苷酸序列的寡核苷酸；
所述施氏分枝杆菌特异探针是至少具有序列表中序列44的核苷酸序列的寡核苷酸；
所述偶然分枝杆菌特异探针是至少具有序列表中序列46的核苷酸序列的寡核苷酸；
所述龟分枝杆菌特异探针是至少具有序列表中序列48和/或序列50的核苷酸序列的寡核苷酸；
所述脓肿分枝杆菌特异探针是至少具有序列表中序列52的核苷酸序列的寡核苷酸；
所述耻垢分枝杆菌特异探针是至少具有序列表中序列54的核苷酸序列的寡核苷酸；
所述草分枝杆菌特异探针是至少具有序列表中序列56的核苷酸序列的寡核苷酸；
所述淡黄分枝杆菌特异探针是至少具有序列表中序列58的核苷酸序列的寡核苷酸；
所述浅黄分枝杆菌特异探针是至少具有序列表中序列60的核苷酸序列的寡核苷酸；
所述迪氏分枝杆菌特异探针是至少具有序列表中序列62的核苷酸序列的寡核苷酸；
所述母牛分枝杆菌特异探针是至少具有序列表中序列64的核苷酸序列的寡核苷酸；
所述金色-迪氏-楚布分枝杆菌特异探针是至少具有序列表中序列66的核苷酸序列的寡核苷酸；
所述新金色分枝杆菌是至少具有序列表中序列68和/或序列70和/或序列72的核苷酸序列的寡核苷酸。
上述分枝杆菌属特异引物、分枝杆菌菌种检测芯片、分枝杆菌菌种检测探针均属于本发明的保护范围。
本发明所提供的利用上述试剂盒检测分枝杆菌的方法，是以待测分枝杆菌样品的基因组DNA为模板，利用所述分枝杆菌属特异引物进行PCR扩增，将得到的PCR扩增产物与所述分枝杆菌菌种检测芯片进行杂交，根据杂交信号确定待测分枝杆菌的种。
所述待测分枝杆菌样品为涂片抗酸染色阳性的分枝杆菌培养物或涂片抗酸染色阳性的痰标本。
所述杂交为导流杂交。
导流杂交技术使传统的核酸分子杂交法二维平面分子间相互作用，提升到三维平面分子间相互作用，使传统核酸分子杂交过程中分子被动渗入膜孔相互作用通过导流变为主动相互作用，提高了核酸分子间杂交效率，缩短了各操作步骤时间，操作简便且节约试剂，降低试验成本。
本发明具有以下特点：
1、设计的1对分枝杆菌属引物，经研究试验能扩增所试51种分枝杆菌菌种。
2、经研究试验筛选，选择分枝杆菌属特异探针、结核分枝杆菌复合群特异探针和各种NTM种特异探针27种，制备检测芯片。根据杂交信号，对分枝杆菌进行鉴定。该探针涵盖了结核分枝杆菌复合群和临床可见的各种致病性NTM菌种，同时为扩大鉴定范围，还涵盖了偶见致病性NTM菌种及自然界广泛分布的腐物寄生NTM菌种，探针数量多。其优势在于：
(1)、用于检测、鉴定结核分枝杆菌复合群：根据显示分枝杆菌属探针、结核分枝杆菌复合群探针杂交信号，检测、鉴定结核分枝杆菌复合群。
(2)、用于检测、鉴定各种NTM菌种：根据显示分枝杆菌属探针，相应NTM种探针杂交信号，可检测、鉴定堪萨斯分枝杆菌、海-溃疡分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、戈登分枝杆菌、苏加分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、马尔摩分枝杆菌、土地分枝杆菌、不产色分枝杆菌、胃分支杆菌、次要分枝杆菌、亚洲分枝杆菌、施氏分枝杆菌、偶然分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、草分枝杆菌、淡黄分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、迪氏分枝杆菌、母牛分枝杆菌、金色-楚布分枝杆菌、新金色分枝杆菌。
(3)、用于检测、鉴定结核分枝杆菌复合群与NTM菌种混合感染：根据显示分枝杆菌属探针、结核分枝杆菌复合群探针、相应NTM种探针杂交信号，能检测、鉴定结核分枝杆菌复合群与NTM菌种混合感染。
(4)、用于检测、鉴别结核分枝杆菌复合群与NTM：当检测、鉴定膜芯片探针涵盖之外的NTM菌种时，则显示分枝杆菌属探针杂交信号，能将其鉴定为NTM，但不能鉴定至种水平。
3、经研究试验，建立了待测标本DNA模板制备方法-高温裂解法。
(1)、固体培养基上分枝杆菌培养物：取培养物少许加裂解液，煮沸、离心取上清用于PCR扩增。
(2)、液体培养基内分枝杆菌培养物：取培养液离心后，沉淀加裂解液煮沸、离心取上清用于PCR扩增。
(3)、病人痰标本：液化处理痰标本，洗涤后沉淀加裂解液煮沸、离心取上清用于PCR扩增。
本发明的试剂盒不仅能用于分枝杆菌培养物的鉴定，而且能从病人痰标本中直接检测、鉴定结核分枝杆菌复合群及NTM菌种。
4、采用PCR-导流杂交技术，经研究试验优化、确定最佳PCR扩增及导流杂交检测条件，检测分枝杆菌敏感性达102～103/ml菌细胞悬液，寡核苷酸探针特异性强，仅与相应分枝杆菌杂交，分枝杆菌菌种鉴定准确度高.
5、与传统膜核酸分子杂交技术相比，导流杂交技术操作更为简便、快速，杂交过程1～1.5小时。整个检测过程从PCR扩增到杂交完成仅需约3.5小时～4小时。且节约试剂，降低试验成本。
具体实施方式
本发明以16S-23S rDNA ITS为靶基因序列，采用分枝杆菌属共有的靶基因序列设计分枝杆菌属特异引物及属特异寡核苷酸探针，用所设计引物PCR扩增含有菌种变异区的基因片段。以菌种变异区设计一系列种或群特异寡核苷酸探针，按一定顺序排列固定于尼龙膜载体上，制备检测芯片(膜芯片)。本发明采用一种新型的核酸分子杂交技术方法，即PCR-导流杂交(flow-through hybridization)法，杂交检测过程采用导流杂交仪，杂交过程可随时根据需要调节作用温度，其基本原理及操作方法为：
1、在凯普导流杂交仪(HybriMax)内安装入膜芯片(15孔模具)；
2、在检测孔内加入0.8ml杂交液作用2～3min，导流，预杂交；
3、加入待测含生物素标记变性单链PCR扩增产物杂交液0.5ml作用5～10min，导流，单链靶核酸分子通过膜孔时，与固定于膜孔内相应寡核苷酸探针杂交结合，形成探针生物素标记靶核酸分子复合物；
4、加入洗涤剂0.8ml，导流，未杂交结合分子穿过膜被洗涤清除，洗涤三次；
5、加入阻断剂0.5ml，导流，再加入阻断剂0.5ml作用3～5min，导流，阻断膜芯片上空白点；
6、加链亲和素-碱性磷酸酶结合物(SA-AP)0.5ml作用3min，导流，SA-AP分子通过膜孔时，与探针-生物素标记靶核酸分子复合物结合；
7、加入洗涤剂0.8ml，导流，未结合分子穿过膜被洗涤清除，洗涤四次；
8、加入酶底物(NBT/BCIP溶液)0.5ml作用5～10min，导流，底物显色；
9、加入洗涤剂0.8ml，导流，终止显色反应，洗涤二次；
10、取出膜芯片，用蒸馏水漂洗后，自然干燥。根据与相应属、复合群、种特异探针杂交信号，鉴定分枝杆菌。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、分枝杆菌菌种检测及鉴定试剂盒
本试剂盒利用PCR技术和导流杂交技术原理，PCR扩增产物与固定分枝杆菌属、结核分枝杆菌复合群和各种NTM菌种特异寡核苷酸探针的低密度膜芯片杂交，对分枝杆菌培养物，包括固体培养基和液体培养基培养物进行分枝杆菌菌种鉴定；也可直接从涂片抗酸染色(+)痰标本中检测并鉴定分枝杆菌菌种。
一、试剂盒组成
本发明的分枝杆菌菌种检测及鉴定试剂盒由下述PCR试剂和导流杂交试剂组成，具体成分如下：
(一)PCR试剂
| PCR试剂 | 规格 | 数量 |
| 裂解液 | 850μl/管 | 2管 |
| 10倍PCR混合液 | 3μl/管 | 24管 |
| 阳性对照品 | 30μl/管 | 1管 |
| 阴性对照品 | 30μl/管 | 1管 |
| 灭菌去离子水 | 1ml/管 | 1管 |
其中，裂解液由以下成分组成：20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，0.5％(V/V)TritonX-100，0.5％(V/V)NP-40溶液。
10倍PCR混合液由以下成分组成：100mmol/L Tris-HCl(pH8.3)，500mmol/L KCl，20mmol/L MgCl2，0.1mmol/L EGTA-Na2，0.2％(0.2g/100ml)BSA，1％(V/V)TritonX-100，各2mmol/L dATP、dUTP、dGTP、dCTP，各2μmol/L引物I、引物II，1.5U Taq DNA聚合酶/3μl 10倍PCR混合液，0.5U UNG酶/3ul 10倍PCR混合液。
其中，分枝杆菌属特异引物I序列：5’-ACCTCCTTTCTAAGGAGCACC-3’5’端生物素标记；分枝杆菌属特异引物II序列：5’-GATGCTCGCAACCACTATCCA-3’
阳性对照品：灭活的106/ml结核分支杆菌菌细胞悬液。
阴性对照品：灭菌去离子水。
上述PCR试剂在-20℃保存。
(二)导流杂交试剂
| 导流杂交试剂 | 规格 | 数量 |
| 溶液1(杂交液) | 85ml/瓶 | 2瓶 |
| 溶液2(封阻剂) | 30ml/瓶 | 1瓶 |
| 溶液3(洗涤剂) | 100ml/瓶 | 1瓶 |
| 溶液4(显色剂) | 20ml/瓶 | 1瓶 |
| 酶标记液 | 15ml/瓶 | 1瓶 |
| NBT溶液 | 70μl/管 | 1管 |
| BCIP溶液 | 60μl/管 | 1管 |
| 膜芯片 | 1张(15人份)/袋 | 2袋 |
其中，溶液1：0.3mol/L NaCl，0.03mol/L柠檬酸三钠，0.1％(0.g/100ml)SDS，用NaOH调pH至7.0.
溶液2：阻断剂(Surmodics公司产品)。
溶液3：0.1mol/L Tris-HCl(pH7.5)，0.15mol/L NaCl，0.1％(V/V)Tween-20。
溶液4：0.1mol/L Tris-HCl(pH9.5)，0.1mol/L NaCl，0.05mol/L MgCl2。
酶标记液由以下成分组成：AP稳定剂(Surmodics公司产品)1∶3000倍稀释链亲和素-碱性磷酸酶结合物〔streptavidin-Alkaline Phosphate Conjugate，SA-AP(Amershum公司产品)〕。
NBT溶液由以下成分组成：75mg/ml NBT溶液，70％二甲基甲酰胺溶液配制。
BCIP溶液由以下成分组成：50mg/ml BCIP溶液，二甲基甲酰胺溶液配制。
该试剂盒包括膜芯片A，膜芯片A′，膜芯片B，膜芯片B′，膜芯片C和膜芯片C′中的至少一种：
膜芯片A的分枝杆菌菌种检测探针是表1中的探针编号为1a、2a、3a、4a、5a、6a、7a、8a、9a、10a、11a、12a、13a、14a、15a、16a、17a、18a、19a、20a、21a、22a、23a、24a、25a、26a、27a、28a、29a的29个寡核苷酸探针。
膜芯片A′的分枝杆菌菌种检测探针是表1中的探针编号为1a′、2a′、3a、4a′、5a′、6a′、7a′、8a′、9a′、10a′、11a′、12a′、13a′、14a′、15a′、16a′、17a′、18a′、19a′、20a′、21a′、22a′、23a′、24a′、25a′、26a′、27a′、28a′、29a′的29个寡核苷酸探针。
膜芯片B′的分枝杆菌菌种检测探针是表1中的探针编号为1a′、2b′、3b′、4a′、5b′、6a′、7a′、8a′、9a′、10a′、11b′、12a′、13a′、14a′、15a′、16a′、17a′、18a′、19a′、20b′、21a′、22a′、23a′、24a′、25a′、26a′、27a′、28a′、29b′的29个寡核苷酸探针。
膜芯片B的分枝杆菌菌种检测探针是表1中的探针编号为1a、2b、3b、4a、5b、6a、7a、8a、9a、10a、11b、12a、13a、14a、15a、16a、17a、18a、19a、20b、21a、22a、23a、24a、25a、26a、27a、28a、29b的29个寡核苷酸探针。
膜芯片C的分枝杆菌菌种检测探针是表1中的探针编号为1a、2a、3a、4a、5a、6a、7a、8a、9a、10a、11a、12a、13a、14a、15a、16a、17a、18a、19a、20a、21a、22a、23a、24a、25a、26a、27a、28a、29c的29个寡核苷酸探针。
膜芯片C′的分枝杆菌菌种检测探针是表1中的探针编号为1a′、2b′、3b′、4a′、5b′、6a′、7a′、8a′、9a′、10a′、11b′、12a′、13a′、14a′、15a′、16a′、17a′、18a′、19a′、20b′、21a′、22a′、23a′、24a′、25a′、26a′、27a′、28a′、29c′的29个寡核苷酸探针。
表1.分枝杆菌菌种检测探针
膜芯片按照下述方法制备：
取5’端氨基修饰寡核苷酸探针定量溶解于NaHCO3(PH8.4)溶液内，分别取5～10pmol按顺序排列点于乙基-(3-二甲基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDAC)活化处理过BiodyneC尼龙膜(Pall公司产品)上，待干燥用NaOH溶液浸泡后，蒸馏水洗涤，干燥后封存，4℃保存备用。
上述导流杂交试剂在4℃保存。
二、适用仪器：各种型号的PCR扩增仪、Hybrimax医用核酸分子快速杂交仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶支架板和梳子。
三、标本要求
(1)改良罗氏等固体培养基培养物：涂片抗酸染色(+)的分枝杆菌培养物。
(2)Bactec-T960 MGIT液体培养瓶或BacT ALERT 3D结核分枝杆菌液体培养瓶阳性培养物：涂片抗酸染色(+)的分枝杆菌培养物。
(3)涂片抗酸染色(+)痰标本3～5ml，如当日不处理，置-20℃保存，保存期1个月。
四、操作方法
(一)、样品处理
1、固体培养基培养物处理：取固体培养基表面生长分枝杆菌物少许至1.5ml离心管内，加入裂解液50μl混匀，95℃～100℃加热15～20min，12000rpm离心5min，取上清液为PCR反应模板。
2、液体培养基培养物处理：取液体培养瓶内阳性培养物1～1.5ml至1.5ml离心管内，12000rpm离心10min，尽量除尽上清液，沉淀加入裂解液50μl混匀，95℃～100℃加热15～20min，12000rpm离心5min，取上清液为PCR反应模板。
3、痰标本处理
(1)、视痰液粘稠度向痰液中加入等量至2倍量液化剂，振荡后室温放置30～60min，中间振荡数次，使之充分液化至清亮。液化剂自备，配制方法如下：4％NaOH溶液及2.94％枸橼酸三钠溶液高压灭菌后备用。使用前根据用量取4％NaOH溶液及2.94％枸橼酸三钠溶液等量混后，加入N-乙酰-L半胱氨酸终浓度5mg/ml，24h内使用。
(2)、取液化后痰液1ml至1.5ml离心管内，12000rpm离心10min，小心倾去上清液.
(3)、沉淀中加入1ml灭菌生理盐水，振荡混匀，12000rpm离心10min，小心倾去上清液。
(4)、重复步骤(3)，离心后用吸头尽量吸尽全部上清液。
(5)、沉淀中加入50μl裂解液，充分振荡混匀，95℃～100℃加热15min，12000rpm离心5min，取上清液为PCR反应模板。
4、阳性和阴性对照品处理：取阳性和阴性对照品，待融化后混匀，取5μl分别加至1.5ml离心管内，加入裂解液45μl混匀，95℃～100℃加热15～20min，12000rpm离心5min，取上清液为PCR模板。
(二)、PCR扩增
根据样品数取10倍PCR混合液管，每管分别加灭菌去离子水24μl混匀，加DNA模板3μl混匀，稍离心后PCR扩增。每一批次同时扩增阳性对照和阴性对照各一份。
扩增条件：先37℃10min；然后94℃5min：再94℃45sec，59℃45sec，72℃45sec共35循环；最后72℃7min。
(三)、琼脂糖凝胶电泳
1、试剂：自备。
(1)50×Tris-冰乙酸(TAE)电泳缓冲液：Tris 242.38克，冰乙酸57.1ml，1M EDTA(PH8.0)50ml，加蒸馏水溶解、定容至1000ml。使用前50倍稀释(1×TAE电泳缓冲液)。
(2)10mg/ml溴化乙锭(EB)水溶液，置4℃避光保存。
(3)载样缓冲液：0.25％溴酚蓝、40％蔗糖水溶液，置4℃保存。
2、方法
(1)取琼脂糖2克，加1×TAE缓冲液100ml，置微波炉内加热或水浴煮沸溶解。加入10mg/ml EB水溶液10μl(终浓度5μg/ml)，轻轻混匀。
(2)用胶布条将电泳支持板两端封住，放上梳子，梳子底边应离开支持板表面1mm左右，待凝胶溶液冷却至60℃左右，倒入，厚度约2～3mm。待凝胶完全凝固后，小心取出梳子，去掉胶布条，将其放入电泳槽内。倒入1×TAE电泳缓冲液，没过凝胶2～3mm。EB为致癌剂，操作时应戴一次性手套。
(3)取PCR扩增产物5μl，加入载样缓冲液1μl混匀后，加入凝胶样品孔内。
(4)接通电源，在5V/cm左右电压下电泳(样品孔位于负极端)。
(5)电泳结束后关闭电源，取出凝胶，用紫外检测仪或凝胶成像仪观察结果。紫外线对人体眼睛和皮肤有损害，应使用防紫外线眼镜和玻璃挡板防护。
3、结果
阳性和阴性对照品应分别(+)和(-)。临床样品(+)扩增产物进行导流杂交。
(四)、导流杂交
每个检测样品占用分隔室一孔，以下试剂用量为单孔用量。
1、实验前准备
(1)将杂交检测试剂平衡至室温。
(2)溶液1在使用前预热至49℃。
(3)检测样品准备：PCR产物98℃加热变性5min立即至冰浴至少2～5min，在0.5ml溶液1内加入15～20μl变性PCR产物.
(4)NBT/BCIP显色工作液配制：根据用量配制NBT/BCIP显色工作液。计算依据1ml用量：1ml溶液4内加入4.5μl NBT溶液，混匀，再加入3.5μl BCIP溶液，混匀，24h内使用。
2、杂交仪准备
(1)打开杂交仪的电源。
(2)在杂交仪后部的废液出口安装好废液缸。
(3)根据控制板指示，选定[Manual Mode]，按[Enter]键进入温度设定界面，输入温度49℃后，按[Enter]键确认并进行升温。
(4)用蒸馏水充满反应室，放置好金属多孔板并打开水泵，排出多孔板上面的水份后，关闭水泵。
(5)用镊子将膜芯片放置在金属多孔板上。
(6)将相对应孔数的塑料薄膜放置在膜芯片上。
(7)在塑料薄膜上面放置硅胶封圈和分隔室。
(8)固定好压扣盖，固定时应对准反应室尾部两个孔按下向前推到底。
(9)开泵排走残留在膜上的水份后关泵。
3、杂交
(1)在杂交仪准备好条件下，于49℃(±1℃)进行杂交。
(2)在检测孔内加入0.8ml预热的溶液1，盖上盖板孵育2～3min，开泵排出溶液，然后关泵。
(3)在检测孔内加入0.5ml已准备好的检测样品，盖上盖板孵育5～10min，开泵排出溶液。
(4)在开着泵的条件下，用预热的溶液1洗膜3次，每次0.8ml。在第二次洗膜后，按〔ESC〕键进入温度修改界面，输入温度36℃后，按〔Enter〕键确认。不必降至36℃就进行第三次洗膜。
(5)在检测孔内加入0.5ml溶液2，开泵排出溶液，关泵，再加入0.5ml溶液2，盖上盖板孵育5min，开泵排出溶液，关泵。
(6)温度为36℃(±1℃)时，在检测孔内加入0.5ml酶标记液，盖上盖板孵育3～5min，开泵排出溶液。
(7)在开着泵的条件下，用溶液3洗膜4次，每次0.8ml。
(8)关掉水泵。
(9)在检测孔内加入0.5ml NBT/BCIP显色工作液，盖上盖板显色5～10min，开泵排出溶液。
(10)在开着泵的条件下，用溶液1洗膜2次，每次0.8ml。
(11)关掉水泵，打开压扣盖，取出分隔室，用镊子取出杂交膜置蒸馏水内漂洗后，放在吸水纸上。
(四)、结果分析
肉眼观察，蓝紫色斑点为阳性杂交信号，根据杂交信号分析判定结果。
五、局限性
本试剂盒用于结核分枝杆菌复合群及29种NTM菌种检测及鉴定。结核分枝杆菌复合群及29种NTM菌种以外的临床极为罕见的分枝杆菌仅能初步鉴定为NTM，而不能鉴定至种。
六、试剂规格
PCR试剂34人份/盒，导流杂交试剂30人份/盒。
七、保存条件
PCR试剂保存于-20℃，避免多次反复冻融。导流杂交试剂保存于4℃。有效期8个月。
实施例2、利用实施例1的试剂盒检测分枝杆菌
分枝杆菌及非分枝杆菌标准参考菌株来源于中国医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)和中国普通微生物菌种保藏管理中心(CCGMC)。
分枝杆菌临床分离菌株：固体培养基培养物分别来自上海市肺科医院(上海)，北京市结核病胸部肿瘤研究所(北京1)，北京市昌平区疾病控制中心(北京2)，深圳市疾病控制中心(深圳)，广州市胸科医院(广州)，福建省南平市疾病控制中心(福建)。
液体培养基培养物分别来自沈阳市胸科医院(沈阳)，重庆市胸科医院(重庆)和解放军总医院第二附属医院(北京3)。
痰标本来自北京市肺科医院(北京4)，北京1和北京3。
利用实施例1的试剂盒(包括膜芯片A，膜芯片A′，膜芯片B，膜芯片B′，膜芯片C和膜芯片C′)按照实施例1的方法，检测表2中的51种分枝杆菌及10种非分枝杆菌标准参考菌株，表3中的分枝杆菌临床分离株。膜芯片A，膜芯片A′，膜芯片B，膜芯片B′，膜芯片C和膜芯片C′的检测结果均和标准参考菌株情况相符，并且与菌株的16S-23S rDNA ITS测序鉴定结果相符。
其中膜芯片A的检测结果如表2和表3所示：
表2分枝杆菌及非分枝杆菌标准参考菌株PCR扩增及与特异探针杂交结果
表3
分枝杆菌临床分离株(固体培养基培养物)鉴定结果
利用实施例1的试剂盒(包括膜芯片A，膜芯片A′，膜芯片B，膜芯片B′，膜芯片C和膜芯片C′)按照实施例1的方法，检测液体培养基培养物和痰标本。膜芯片A、膜芯片A′、膜芯片B、膜芯片B′、膜芯片C和膜芯片C′的检测结果均和菌株的16S-23S rDNA ITS测序鉴定结果相符：液体培养基培养物81份(沈阳)，试剂盒鉴定69份是结核分枝杆菌，12份是胞内分枝杆菌；液体培养基培养物2份(重庆)，试剂盒鉴定1份是脓肿分枝杆菌，1份是偶然分枝杆菌；液体培养基培养物5份(北京3)，试剂盒鉴定1份是胞内分枝杆菌，4份是脓肿分枝杆菌；抗酸染色阳性痰标本(+～++++)110份(北京1、北京3、北京4)，试剂盒鉴定102份是结核分枝杆菌，2份是胞内分枝杆菌，2份是瘰疬分枝杆菌，4份是脓肿分枝杆菌。
序列表
<160>73
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
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tcaccaagta gatatccact ac 22
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gctcacaccc tccccaacgg agagtgtctc 30
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gatgattcct caaagcagtg ttcccacacc 30
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tcggccaagt ttgtcatgtg 20
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aacgaatcga ccaaggtcac cgaac 25
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gacaacagca accgcctgac 20
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<400>73
ggcgacaaca gcaaccgcct gaccc 25
Claims (3)
1.分枝杆菌菌种检测及鉴定试剂盒，包括分枝杆菌属特异引物和分枝杆菌菌种检测芯片；
所述分枝杆菌菌种检测芯片包括分枝杆菌菌种检测探针；所述分枝杆菌菌种检测探针由分枝杆菌属特异探针，结核分枝杆菌复合群特异探针和以下27种分枝杆菌种特异探针组成：堪萨斯分枝杆菌、海-溃疡分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、戈登分枝杆菌、苏加分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、蟾蜍-施氏分枝杆菌、马尔摩分枝杆菌、土地分枝杆菌、不产色分枝杆菌、胃分支杆菌、次要分枝杆菌、亚洲分枝杆菌、施氏分枝杆菌、偶然分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、草分枝杆菌、淡黄分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、迪氏分枝杆菌、母牛分枝杆菌、金色-迪氏-楚布分枝杆菌、新金色分枝杆菌特异探针；
所述分枝杆菌属特异引物为序列表中序列1和序列2所示的两个寡核苷酸序列；
所述分枝杆菌属特异探针是序列表中序列3或序列4；
所述结核分枝杆菌复合群特异探针是下述1)至4)中的任一种：1)序列表中序列5和/或序列7；2)序列表中序列6和/或序列7；3)序列表中序列5和/或序列8；4)序列表中序列6和/或序列8；
所述堪萨斯分枝杆菌特异探针是下述5)至6)中的任一种：5)序列表中序列9和/或序列10；6)序列9和/或序列11；
所述海-溃疡分枝杆菌特异探针是序列表中序列12或序列13；
所述猿猴分枝杆菌特异探针是下述7)至10)中的任一种：7)序列表中序列14和/或序列16；8)序列表中序列15和/或序列16；9)序列表中序列14和/或序列17；10)序列表中序列15和/或序列17；
所述瘰疬分枝杆菌特异探针是序列表中序列18或序列19；
所述戈登分枝杆菌特异探针是序列表中序列20或序列21；
所述苏加分枝杆菌特异探针是序列表中序列22或序列23；
所述鸟分枝杆菌特异探针是序列表中序列24或序列25；
所述胞内分枝杆菌特异探针是序列表中序列26或序列27；
所述蟾蜍-施氏分枝杆菌特异探针是下述11)至14)中的任一种：11)序列表中序列28和/或序列30；12)序列表中序列29和/或序列30；13)序列表中序列28和/或序列31；14)序列表中序列29和/或序列31；
所述马尔摩分枝杆菌特异探针是序列表中序列32或序列33；
所述土地分枝杆菌特异探针是序列表中序列34或序列35；
所述不产色分枝杆菌特异探针是序列表中序列36或序列37；
所述胃分支杆菌特异探针是序列表中序列38或序列39；
所述次要分枝杆菌特异探针是序列表中序列40或序列41；
所述亚洲分枝杆菌特异探针是序列表中序列42或序列43；
所述施氏分枝杆菌特异探针是序列表中序列44或序列45；
所述偶然分枝杆菌特异探针是序列表中序列46或序列47；
所述龟分枝杆菌特异探针是下述15)至18)中的任一种：15)序列表中序列48和/或序列50；16)序列表中序列48和/或序列51；17)序列表中序列49和/或序列50；18)序列表中序列49和/或序列51；
所述脓肿分枝杆菌特异探针是序列表中序列52或序列53；
所述耻垢分枝杆菌特异探针是序列表中序列54或序列55；
所述草分枝杆菌特异探针是序列表中序列56或序列57；
所述淡黄分枝杆菌特异探针是序列表中序列58或序列59；
所述浅黄分枝杆菌特异探针是序列表中序列60或序列61；
所述迪氏分枝杆菌特异探针是序列表中序列62或序列63；
所述母牛分枝杆菌特异探针是序列表中序列64或序列65；
所述金色-迪氏-楚布分枝杆菌特异探针是序列表中序列66或序列67；
所述新金色分枝杆菌是下述19)至22)中的任一种：19)序列表中序列68和/或序列70和/或序列72；20)序列表中序列69和/或序列70和/或序列72；21)序列表中序列68和/或序列71和/或序列73；22)序列表中序列69和/或序列71和/或序列73。
2.分枝杆菌菌种检测芯片，包括分枝杆菌属特异探针，结核分枝杆菌复合群特异探针和以下分枝杆菌种特异探针：堪萨斯分枝杆菌、海-溃疡分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、戈登分枝杆菌、苏加分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、蟾蜍-施氏分枝杆菌、马尔摩分枝杆菌、土地分枝杆菌、不产色分枝杆菌、胃分支杆菌、次要分枝杆菌、亚洲分枝杆菌、施氏分枝杆菌、偶然分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、草分枝杆菌、淡黄分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、迪氏分枝杆菌、母牛分枝杆菌、金色-迪氏-楚布分枝杆菌、新金色分枝杆菌种特异探针；
所述分枝杆菌属特异探针是序列表中序列3或序列4；
所述结核分枝杆菌复合群特异探针是下述1)至4)中的任一种：1)序列表中序列5和/或序列7；2)序列表中序列6和/或序列7；3)序列表中序列5和/或序列8；4)序列表中序列6和/或序列8；
所述堪萨斯分枝杆菌特异探针是下述5)至6)中的任一种：5)序列表中序列9和/或序列10；6)序列9和/或序列11；
所述海-溃疡分枝杆菌特异探针是序列表中序列12或序列13；
所述猿猴分枝杆菌特异探针是下述7)至10)中的任一种：7)序列表中序列14和/或序列16；8)序列表中序列15和/或序列16；9)序列表中序列14和/或序列17；10)序列表中序列15和/或序列17；
所述瘰疬分枝杆菌特异探针是序列表中序列18或序列19；
所述戈登分枝杆菌特异探针是序列表中序列20或序列21；
所述苏加分枝杆菌特异探针是序列表中序列22或序列23；
所述鸟分枝杆菌特异探针是序列表中序列24或序列25；
所述胞内分枝杆菌特异探针是序列表中序列26或序列27；
所述蟾蜍-施氏分枝杆菌特异探针是下述11)至14)中的任一种：11)序列表中序列28和/或序列30；12)序列表中序列29和/或序列30；13)序列表中序列28和/或序列31；14)序列表中序列29和/或序列31；
所述马尔摩分枝杆菌特异探针是序列表中序列32或序列33；
所述土地分枝杆菌特异探针是序列表中序列34或序列35；
所述不产色分枝杆菌特异探针是序列表中序列36或序列37；
所述胃分支杆菌特异探针是序列表中序列38或序列39；
所述次要分枝杆菌特异探针是序列表中序列40或序列41；
所述亚洲分枝杆菌特异探针是序列表中序列42或序列43；
所述施氏分枝杆菌特异探针是序列表中序列44或序列45；
所述偶然分枝杆菌特异探针是序列表中序列46或序列47；
所述龟分枝杆菌特异探针是下述15)至18)中的任一种：15)序列表中序列48和/或序列50；16)序列表中序列48和/或序列51；17)序列表中序列49和/或序列50；18)序列表中序列49和/或序列51；
所述脓肿分枝杆菌特异探针是序列表中序列52或序列53；
所述耻垢分枝杆菌特异探针是序列表中序列54或序列55；
所述草分枝杆菌特异探针是序列表中序列56或序列57；
所述淡黄分枝杆菌特异探针是序列表中序列58或序列59；
所述浅黄分枝杆菌特异探针是序列表中序列60或序列61；
所述迪氏分枝杆菌特异探针是序列表中序列62或序列63；
所述母牛分枝杆菌特异探针是序列表中序列64或序列65；
所述金色-迪氏-楚布分枝杆菌特异探针是序列表中序列66或序列67；
所述新金色分枝杆菌是下述19)至22)中的任一种：19)序列表中序列68和/或序列70和/或序列72；20)序列表中序列69和/或序列70和/或序列72；21)序列表中序列68和/或序列71和/或序列73；22)序列表中序列69和/或序列71和/或序列73。
3.用于分枝杆菌菌种检测的探针，由分枝杆菌属特异探针，结核分枝杆菌复合群特异探针和分枝杆菌种特异探针组成；所述分枝杆菌种特异探针由以下探针组成：堪萨斯分枝杆菌、海-溃疡分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、戈登分枝杆菌、苏加分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、蟾蜍-施氏分枝杆菌、马尔摩分枝杆菌、土地分枝杆菌、不产色分枝杆菌、胃分支杆菌、次要分枝杆菌、亚洲分枝杆菌、施氏分枝杆菌、偶然分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、草分枝杆菌、淡黄分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、迪氏分枝杆菌、母牛分枝杆菌、金色-迪氏-楚布分枝杆菌、新金色分枝杆菌种特异探针；
所述分枝杆菌属特异探针是序列表中序列3或序列4；
所述结核分枝杆菌复合群特异探针是下述1)至4)中的任一种：1)序列表中序列5和/或序列7；2)序列表中序列6和/或序列7；3)序列表中序列5和/或序列8；4)序列表中序列6和/或序列8；
所述堪萨斯分枝杆菌特异探针是下述5)至6)中的任一种：5)序列表中序列9和/或序列10；6)序列9和/或序列11；
所述海-溃疡分枝杆菌特异探针是序列表中序列12或序列13；
所述猿猴分枝杆菌特异探针是下述7)至10)中的任一种：7)序列表中序列14和/或序列16；8)序列表中序列15和/或序列16；9)序列表中序列14和/或序列17；10)序列表中序列15和/或序列17；
所述瘰疬分枝杆菌特异探针是序列表中序列18或序列19；
所述戈登分枝杆菌特异探针是序列表中序列20或序列21；
所述苏加分枝杆菌特异探针是序列表中序列22或序列23；
所述鸟分枝杆菌特异探针是序列表中序列24或序列25；
所述胞内分枝杆菌特异探针是序列表中序列26或序列27；
所述蟾蜍-施氏分枝杆菌特异探针是下述11)至14)中的任一种：11)序列表中序列28和/或序列30；12)序列表中序列29和/或序列30；13)序列表中序列28和/或序列31；14)序列表中序列29和/或序列31；
所述马尔摩分枝杆菌特异探针是序列表中序列32或序列33；
所述土地分枝杆菌特异探针是序列表中序列34或序列35；
所述不产色分枝杆菌特异探针是序列表中序列36或序列37；
所述胃分支杆菌特异探针是序列表中序列38或序列39；
所述次要分枝杆菌特异探针是序列表中序列40或序列41；
所述亚洲分枝杆菌特异探针是序列表中序列42或序列43；
所述施氏分枝杆菌特异探针是序列表中序列44或序列45；
所述偶然分枝杆菌特异探针是序列表中序列46或序列47；
所述龟分枝杆菌特异探针是下述15)至18)中的任一种：15)序列表中序列48和/或序列50；16)序列表中序列48和/或序列51；17)序列表中序列49和/或序列50；18)序列表中序列49和/或序列51；
所述脓肿分枝杆菌特异探针是序列表中序列52或序列53；
所述耻垢分枝杆菌特异探针是序列表中序列54或序列55；
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| PB01 | Publication | ||
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
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Granted publication date: 20100512 Termination date: 20140105 |