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CN118460751A - 一种基于CRISPR-Cas14a检测结核分枝杆菌耐药性相关位点的引物组合及其应用 - Google Patents

一种基于CRISPR-Cas14a检测结核分枝杆菌耐药性相关位点的引物组合及其应用 Download PDF

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CN118460751A
CN118460751A CN202410912380.XA CN202410912380A CN118460751A CN 118460751 A CN118460751 A CN 118460751A CN 202410912380 A CN202410912380 A CN 202410912380A CN 118460751 A CN118460751 A CN 118460751A
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CN
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rpob
mycobacterium tuberculosis
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seq
gene
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张国良
肖国辉
刘厚明
欧敏
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Shenzhen National Clinical Research Center For Infectious Diseases
Original Assignee
Shenzhen National Clinical Research Center For Infectious Diseases
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Abstract

本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas14a检测结核分枝杆菌耐药性相关位点的引物组合及其应用，所述基于CRISPR‑Cas14a检测结核分枝杆菌耐药性相关位点的引物组合的引物组合包括gRNA转录引物组合，所述gRNA转录引物组合是针对利福平耐药及异烟肼耐药的常见突变位点设计，所述的gRNA转录引物组合可以用于扩增gRNA转录DNA模板，通过体外转录获得检测所需的靶标特异性gRNA，后续应用过程中可以特异性的识别和鉴定结核分枝杆菌耐药相关突变位点，从而能够快速、准确的实现对结核分枝杆菌耐药性的检测，特异性好、灵敏度高、方法简单、易于推广。

Description

一种基于CRISPR-Cas14a检测结核分枝杆菌耐药性相关位点 的引物组合及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药的核酸检测和基因分型技术领域，特别涉及一种基于CRISPR-Cas14a检测结核分枝杆菌耐药性相关位点的引物组合及其应用。
背景技术
目前，全球耐药结核病（DR-TB）的治疗成功率为60%，仍较低。在抗结核治疗药物中，利福平和异烟肼是最有效的两种一线抗结核药物，而对这两种药物的耐药是最令人担忧。目前耐药结核病尤其是耐多药肺结核患者的治愈率偏低、病死率高，给人类健康造成了严重危害。因此，准确、及时地诊断结核病和耐药性至关重要，以便启动适当的治疗和有效控制疾病，同时防止其进一步传播。目前耐药结核病的诊断技术主要包括细菌学检测方法和分子生物学检测方法。细菌学诊断方法首先必须建立在结核菌培养阳性的结果基础上，并根据结核菌的生长和代谢状况来判断耐药情况。目前传统的药敏试验仍是耐药结核的诊断金标准。但是由于结核菌生长速度缓慢，传统固体药敏试验通常需3个月才能获得药敏结果，易延误耐药结核病患者治疗。
近年来，分子生物学诊断技术的飞速发展为结核病和耐药结核病的快速诊断提供了重要手段。基于分子生物学基础的检测方法可以省去培养细菌的过程，这样大大缩短结核病和耐药结核病的诊断时间。目前比较流行分子生物学检测方法主要包括GeneXpertMTB/RIF、线性探针技术(MTBDR plus)、高分辨熔解曲线技术（High Resolution Melting,HRM）、基因芯片技术和全基因组测序( Whole Genome Sequencing, WGS)。GeneXpert MTB/RIF由美国Cepheid公司研发，是目前应用最广泛的利福平耐药分子检测方法，该系统自动化程度非常高，操作简单，耗时较短，交叉污染较小，对环境和实验室人员安全，是世界卫生组织重点推荐的利福平耐药检测技术，但该检测系统仅能检测利福平耐药情况，且该技术设备和相关试剂属于国外进口，费用较昂贵。线性探针技术（MTBDR plus）可以检测利福平，异烟肼和耐多药的位点，为耐药检测提供了新手段，同时弥补GeneXpert MTB/RIF技术只能检测利福平耐药的缺陷，但该技术在操作过程中需提取DNA，自动化程度不如GeneXpertMtb/RIF，易出现假阴性。高分辨率溶解曲线法（High Resolution Melting, HRM）是针对耐药突变频率较高的基因设计特异性引物，以实时PCR和 HRM相结合快速检测MDR-TB的方法，该方法结果直观、易于判断，敏感性较高、耗材便宜，需时2-3天，但存在一定的假阳性。基因芯片技术和全基因组测序(WGS)可以检测多个耐药位点基因突变，准确率高，但是且费用较昂贵，目前多应用于科学研究。尽管分子生物学检测技术能够快速诊断结核菌的耐药性的，但是目前的方法都需要昂贵的仪器，不利于基层医院的推广应用。且目前的分子生物学检测方法主要是基于核酸或者探针杂交的原理检测结核耐药性，受分辨率的限制，这些方法在特异性鉴别SNP上存在一定的局限性。
CRISPR-Cas12a和CRISPR-Cas13a广泛应用于核酸检测，但其在细菌耐药性检测中的应用鲜有文献报道。这是因为CRISPR-Cas12a和CRISPR-Cas13a需要PAM基序进行底物识别，并且不在gRNA中引入额外突变碱基的情况下实现单碱基分辨率具有挑战性。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种用于检测结核分枝杆菌耐药性相关位点的引物组合及其应用，旨在解决目前的检测结核分枝杆菌耐药性方法要么需要昂贵的仪器，不利于基层医院的推广应用，要么受碱基分辨率的限制，存在一定的局限性。
为实现上述目的，本发明提出一种基于CRISPR-Cas14a检测结核分枝杆菌耐药性相关位点的gRNA转录引物组合，所述基于CRISPR-Cas14a检测结核分枝杆菌耐药性相关位点的引物组合包括gRNA转录引物组合，所述gRNA转录引物组合包括：
针对所述结核分枝杆菌的rpoB基因1349位点的野生型rpoB-1349C，所述rpoB-1349C的序列如SEQ ID NO.7所示；
针对所述结核分枝杆菌的rpoB基因1349位点的突变型rpoB-1349T，所述rpoB-1349T的序列如SEQ ID NO.8所示；
针对所述结核分枝杆菌的rpoB基因1349位点的突变型rpoB-1349G，所述rpoB-1349G的序列如SEQ ID NO.9所示；
针对所述结核分枝杆菌的rpoB基因1333位点的野生型rpoB-1333C，所述rpoB-1333C的序列如SEQ ID NO.10所示；
针对所述结核分枝杆菌的rpoB基因1333位点的突变型rpoB-1333T，所述rpoB-1333T的序列如SEQ ID NO.11所示；
针对所述结核分枝杆菌的rpoB基因1333位点的突变型rpoB-1333G，所述rpoB-1333G的序列如SEQ ID NO.12所示；
针对所述结核分枝杆菌的rpoB基因1334位点的野生型rpoB-1334A，所述rpoB-1334A的序列如SEQ ID NO.13所示；
针对所述结核分枝杆菌的rpoB基因1334位点的突变型rpoB-1334T，所述rpoB-1334T的序列如SEQ ID NO.14所示;
针对所述结核分枝杆菌的rpoB基因1334位点的突变型rpoB-1334G，所述rpoB-1334G的序列如SEQ ID NO.15所示；
针对所述结核分枝杆菌的rpoB基因1303-1304位点的野生型rpoB-1303-1304-GA，所述rpoB-1303-1304-GA的序列如SEQ ID NO.16所示;
针对所述结核分枝杆菌的rpoB基因1303位点的突变型rpoB-1303T，所述rpoB-1303T的序列如SEQ ID NO.17所示；
针对所述结核分枝杆菌的rpoB基因1304位点的突变型rpoB-1304T，所述rpoB-1304TC的序列如SEQ ID NO.18所示；
针对所述结核分枝杆菌的inhA基因-777位点的野生型inhA-777G，所述inhA-777G的序列如SEQ ID NO.19所示；
针对所述结核分枝杆菌的inhA基因-777位点的突变型inhA-777A的序列，所述inhA-777A如SEQ ID NO.20所示；
针对所述结核分枝杆菌的KatG基因944位突变位点的野生型katG- 944G，所述katG- 944G的序列如SEQ ID NO.21所示；
针对所述结核分枝杆菌的KatG基因944位点的突变型katG- 944C，所述katG-944C的序列如SEQ ID NO.22所示；以及，
针对所述结核分枝杆菌的KatG基因944位突变位点的突变型katG- 944A，所述katG- 944A的序列如和SEQ ID NO.23所示。
所述多重PCR扩增引物包括：
针对所述结核分枝杆菌的rpoB基因设计的rpoB-F和rpoB-R，所述rpoB-F的序列如SEQ ID NO.1所示和所述rpoB-R的序列如SEQ ID NO.2所示；
针对所述结核分枝杆菌的katG基因突变位点设计的KatG-F和KatG-R，其中，所述KatG-F的序列如SEQ ID NO.3所示和所述KatG-R的序列如SEQ ID NO.4所示；以及，
针对所述结核分枝杆菌的inhA基因突变位点设计的inhA-F和inhA-R，所述inhA-F的序列如SEQ ID NO.5所示和所述inhA-R的序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明提供一种用于检测结核分枝杆菌耐药相关突变位点的试剂盒，包含如上所述的多重PCR扩增引物和如上所述的多重PCR扩增引物。
在一实施方式中，一种用于检测结核分枝杆菌耐药性的检测方法，包括以下步骤：
S10、提供如上所述的试剂盒；
S20、将所述gRNA转录引物组合中对各靶标的gRNA转录引物分别与T7-R混合，以合成的gRNA骨架DNA为模板，扩增应用于gRNA转录得DNA模板，以所述DNA模板为gRNA转录模板，体外转录合成获得靶标特异性的gRNA；
S30、将多重PCR扩增引物扩增目标基因，得PCR产物；
S40、将所述PCR产物与CRISPR-Cas14a检测体系混合、获得荧光信号，根据所述荧光信号的强弱确定结核分枝杆菌的耐药性的类型，其中，所述CRISPR-Cas14a检测体系包括靶标特异性的gRNA。
在一实施方式中，所述CRISPR-Cas14a检测体系还包括：缓冲液、Cas14a、FQ报告基因和T7核酸外切酶。
本发明还提供一种基于CRISPR-Cas14a检测结核分枝杆菌耐药性相关位点的引物组合在制备检测结核分枝杆菌耐药性诊断试剂、试纸条或生物传感器中应用。
本发明公开了一种基于CRISPR-Cas14a检测结核分枝杆菌耐药性相关位点的引物组合，所述基于CRISPR-Cas14a检测结核分枝杆菌耐药性相关位点的引物组合包括gRNA转录引物组合包括gRNA转录引物组合，所述gRNA转录引物组合是针对利福平耐药及异烟肼耐药的常见突变位点设计，所述的gRNA转录引物组合可以用于扩增gRNA转录DNA模板，通过体外转录获得检测所需的靶标特异性gRNA，后续应用过程中可以特异性的识别和鉴定结核分枝杆菌耐药相关突变位点，从而能够快速、准确的实现对结核分枝杆菌耐药性的检测，特异性好、灵敏度高、方法简单、易于推广。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本发明一实施例设计的多重PCR扩增引物电泳结果示意图：
图2为本发明一实施例设计的gRNA组合的有效性测试结果示意图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
目前，线性探针技术可以检测利福平、异烟肼和耐多药的位点，为耐药检测提供了新手段，同时弥补GeneXpert MTB/RIF技术只能检测利福平耐药的缺陷，但该技术在操作过程中需提取DNA，自动化程度不如GeneXpert Mtb/RIF，易出现假阴性。高分辨率溶解曲线法（High Resolution Melting, HRM）是针对耐药突变频率较高的基因设计特异性引物，以实时PCR和HRM相结合快速检测MDR-TB的方法，该方法结果直观、易于判断，敏感性较高、耗材便宜，需时2-3天，但存在一定的假阳性。基因芯片技术和全基因组测序(WGS)可以检测多个耐药位点基因突变，准确率高，但是且费用较昂贵，目前多应用于科学研究。尽管分子生物学检测技术能够快速诊断结核菌的耐药性的，但是目前的方法都需要昂贵的仪器，不利于基层医院的推广应用。且目前的分子生物学检测方法主要是基于核酸或者探针杂交的原理检测结核耐药性，受分辨率的限制，这些方法在特异性鉴别SNP上存在一定的局限性。
鉴于此，本发明提出一种基于CRISPR-Cas14a检测结核分枝杆菌耐药性相关位点的引物组合，所述基于CRISPR-Cas14a检测结核分枝杆菌耐药性相关位点的引物组合包括gRNA转录引物组合，所述gRNA转录引物组合包括：
针对所述结核分枝杆菌的rpoB基因1349位点的野生型rpoB-1349C，所述rpoB-1349C的序列如SEQ ID NO.7所示，所述rpoB-1349C的序列具体为；
CGCCGACTGTCGGCGCTGGGGTTGCATTCCTTCATTCTTTC；
针对所述结核分枝杆菌的rpoB基因1349位点的突变型rpoB-1349T，所述rpoB-1349T的序列如SEQ ID NO.8所示，所述rpoB-1349T的序列具体为：
CGCCGACTGTTGGCGCTGGGGTTGCATTCCTTCATTCTTTC；
针对所述结核分枝杆菌的rpoB基因1349位点的突变型rpoB-1349G，所述rpoB-1349G的序列如SEQ ID NO.9所示，所述rpoB-1349G的序列具体为：
CGCCGACTGTGGGCGCTGGGGTTGCATTCCTTCATTCTTTC；
针对所述结核分枝杆菌的rpoB基因1333位点的野生型rpoB-1333C，所述rpoB-1333C的序列如SEQ ID NO.10所示，所述rpoB-1333C的序列具体为：
GGGGTTGACCTACAAGCGCCGTTGCATTCCTTCATTCTTTC；
针对所述结核分枝杆菌的rpoB基因1333位点的突变型rpoB-1333T，所述rpoB-1333T的序列如SEQ ID NO.11所示，所述rpoB-1333T的序列具体为：
GGGGTTGACCGACAAGCGCCGTTGCATTCCTTCATTCTTTC；
针对所述结核分枝杆菌的rpoB基因1333位点的突变型rpoB-1333G，所述rpoB-1333G的序列如SEQ ID NO.12所示，所述rpoB-1333G的序列具体为：
GGGGTTGACCAACAAGCGCCGTTGCATTCCTTCATTCTTTC；
针对所述结核分枝杆菌的rpoB基因1334位点的野生型rpoB-1334A，所述rpoB-1334A的序列如SEQ ID NO.13所示，所述rpoB-1334A的序列具体为：
GGGGTTGACCCACAAGCGCCGTTGCATTCCTTCATTCTTTC；
针对所述结核分枝杆菌的rpoB基因1334位点的突变型rpoB-1334T，所述rpoB-1334T的序列如SEQ ID NO.14所示，所述rpoB-1334T的序列具体为：
GGGGTTGACCCTCAAGCGCCGTTGCATTCCTTCATTCTTTC；
针对所述结核分枝杆菌的rpoB基因1334位点的突变型rpoB-1334G，所述rpoB-1334G的序列如SEQ ID NO.15所示，所述rpoB-1334G的序列具体为：
GGGTTGACCCGCAAGCGCCGGTTGCATTCCTTCATTCTTTC；
针对所述结核分枝杆菌的rpoB基因1303-1304位点的野生型rpoB-1303-1304-GA，所述rpoB-1303-1304-GA的序列如SEQ ID NO.16所示，所述rpoB-1303-1304-GA的序列具体为：
CCAATTCATGGACCAGAACAGTTGCATTCCTTCATTCTTTC；
针对所述结核分枝杆菌的rpoB基因1303位点的突变型rpoB-1303T，所述rpoB-1303T的序列如SEQ ID NO.17所示，所述rpoB-1303T的序列具体为：
CCAATTCATGTACCAGAACAGTTGCATTCCTTCATTCTTTC；
针对所述结核分枝杆菌的rpoB基因1304位点的突变型rpoB-1304T，所述rpoB-1304TC的序列如SEQ ID NO.18所示，所述rpoB-1304TC的序列具体为：
CAATTCATGGTCCAGAACAAGTTGCATTCCTTCATTCTTTC；
针对所述结核分枝杆菌的inhA基因-777位点的野生型inhA-777G，所述inhA-777G的序列如SEQ ID NO.19所示，所述inhA-777G的序列具体为：
CGCGGCGAGACGATAGGTTGGTTGCATTCCTTCATTCTTTC；
针对所述结核分枝杆菌的inhA基因-777位点的突变型inhA-777A的序列，所述inhA-777A如SEQ ID NO.20所示，所述inhA-777A序列具体为：
CGCGGCGAGATGATAGGTTGGTTGCATTCCTTCATTCTTTC；
针对所述结核分枝杆菌的KatG基因944位突变位点的野生型katG- 944G，所述katG- 944G的序列如SEQ ID NO.21所示，所述katG- 944G的序列具体为：
GCGATCACCAGCGGCATCGAGTTGCATTCCTTCATTCTTTC；
针对所述结核分枝杆菌的KatG基因944位点的突变型katG- 944C，所述katG-944C的序列如SEQ ID NO.22所示，所述katG- 944C的序列具体为：
GCGATCACCAACGGCATCGAGTTGCATTCCTTCATTCTTTC；以及，
针对所述结核分枝杆菌的KatG基因944位突变位点的突变型katG- 944A，所述katG- 944A的序列如和SEQ ID NO.23所示，所述katG- 944A的序列具体为：
GCGATCACCACCGGCATCGAGTTGCATTCCTTCATTCTTTC。
所述所述基于CRISPR-Cas14a检测结核分枝杆菌耐药性相关位点的引物组合包括gRNA转录引物组合，所述gRNA转录引物组合针对利福平耐药及异烟肼耐药的常见突变位点设计，所述的gRNA转录引物组合用于扩增gRNA转录DNA模板，通过体外转录获得检测所需的靶标特异性gRNA，从而能够快速、准确的实现对结核分枝杆菌耐药性的检测，特异性好、灵敏度高、方法简单、易于推广。
需要说明的是，gRNA是用于CRISPR基因编辑技术中的一种小型RNA分子，gRNA全称为"guide RNA"，它的作用是指导Cas蛋白靶向特定的基因序列。gRNA通常由两部分组成：1.引导序列（guide sequence），它与目标基因的特定序列互补，从而使Cas蛋白与目标基因结合；2.功能元件，通常是CRISPR系统中所使用的RNA元件，用于稳定gRNA与Cas蛋白的结合，并确保CRISPR/Cas系统能够精确地识别和切割目标基因，通常短的gRNA可以公司商业合成（技术成熟，合成成本较低），长的gRNA只能通过T7聚合酶体外转录获得，由于本申请中的gRNA碱基数超过100nt，因此，只能通过T7聚合酶体外转录获得。
通过设计合适的gRNA引物，研究人员可以实现对基因组中特定基因的编辑，例如靶向基因突变、基因敲除或插入新的DNA序列，这使得CRISPR技术成为了一种强大的工具，用于研究基因功能、治疗遗传疾病以及改良农作物等领域。
在一实施方式中，本发明中，还包括一种用于设计和制备gRNA引物序列的方法，包括以下步骤：
汇总结核分枝杆菌耐药相关的突变位点；
根据突变位点占比选择高频率的位点；
设计gRNA转录引物序列，使其与待检测的突变碱基匹配，
具体地，通过汇总指南中利福平耐药及异烟肼耐药的常见突变位点，并对各个耐药突变位点占各自耐药总突变的比例进行统计，选择占比最高的RpoB耐药突变相关位点1349、1334、1333、1304和1303位点，kat耐药突变相关位点944位点，inhA耐药突变相关位点-777位点。针对每个位点设计多条gRNA转录引物，通过实验筛选出靶标特异性的gRNA转录引物组合。
在一实施方式中，所述引物组合还包括多重PCR扩增引物，所述多重PCR扩增引物包括：
针对所述结核分枝杆菌的rpoB基因设计的rpoB-F和rpoB-R，所述rpoB-F的序列如SEQ ID NO.1所示和所述rpoB-R的序列如SEQ ID NO.2所示；
针对所述结核分枝杆菌的katG基因突变位点设计的KatG-F和KatG-R，其中，所述KatG-F的序列如SEQ ID NO.3所示和所述KatG-R的序列如SEQ ID NO.4所示；以及，
针对所述结核分枝杆菌的inhA基因突变位点设计的inhA-F和inhA-R，所述inhA-F的序列如SEQ ID NO.5所示和所述inhA-R的序列如SEQ ID NO.6所示。
具体地，针对rpoB基因突变位点设计，也即针对rpoB基因的利福平耐药决定区域设计，包括rpoB-F和rpoB-R，其中，rpoB-F的序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：C*A*G*A*TCCGGGTCGGCATGTC；rpoB-R的序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：AGACCGATGTTGGGCCCCTC；
针对所述结核分枝杆菌的katG基因突变位点设计的KatG-F和KatG-R，其中，KatG-F的序列如SEQ ID NO.3所示，具体为:
C*T*C*C*GCTGGAGCAGATGGGCTT；
KatG-R的序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：
TCCCACTCGTAGCCGTACAGGA；
针对所述结核分枝杆菌的inhA基因突变位点设计的inhA-F和inhA-R，其中，inhA-F的序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：
G*T*A*A*CCCCAGTGCGAAAGTTCC；
inhA-R的序列如SEQ ID NO.6所示，具体为：
AAACAGCCCCTTTGGCGCTC。
进一步地，上述每个上游引物F中的前五个碱基之间进行硫代修饰（*表示），后续用T7酶消化掉后只剩余被硫代修饰单链DNA。
本发明中，通过设计多重PCR扩增引物组合，用以同时扩增出结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药的相关基因rpoB、katG和inhA，从而减少PCR步骤，提高检测效率。
本发明提供一种用于检测结核分枝杆菌耐药性相关位点的试剂盒，包含如上所述的多重PCR扩增引物和如上所述的gRNA转录引物，采用该方法可以不需要昂贵的检测设备，速度快，非常适合大规模推广应用，将为耐药结核病的快速诊断提供可靠的工具。
在一实施方式中，一种用于检测结核分枝杆菌耐药性的检测方法，包括以下步骤：
S10、提供如上所述的多重PCR扩增引物和如上所述的gRNA转录引物组合；
S20、将所述gRNA转录引物组合中对各靶标的gRNA转录引物分别与T7-R混合，以合成的gRNA骨架DNA为模板，扩增应用于gRNA转录得DNA模板，以所述DNA模板为gRNA转录模板，体外转录合成获得靶标特异性的gRNA；
S30、将多重PCR扩增引物扩增目标基因，得PCR产物；
S40、将所述PCR产物与CRISPR-Cas14a检测体系混合、获得荧光信号，根据所述荧光信号的强弱确定结核分枝杆菌的耐药性的类型，其中，所述CRISPR-Cas14a检测体系包括体外转录获得的靶标特异性gRNA。
本检测方法建立了CRISPR-Cas14a MTB RIF/INH技术平台，通过将gRNA转录引物组合体外转录获得检测所需的靶标特异性gRNA，可引导Cas14a核酸酶识别与gRNA互补的靶标位点，从而激活Cas14a的非特异性核酸切割功能，从而切割荧光报告探针进而产生荧光信号，而非靶标位点则不能被识别，所以不能激活Cas14a的非特异性核酸切割功能，从而不切割或者微弱地切割荧光报告探针进而只能产生微弱的荧光信号，通过荧光信号强弱可以特异性的识别和鉴定结核分枝杆菌耐药相关突变位点，从而能够快速、准确的实现对结核分枝杆菌耐药性的检测，特异性好、灵敏度高、方法简单、易于推广。
从而实现了耐利福平结核及耐异烟肼结核双联检检测体系，检测步骤简单、快速、易于在推广。
需要时说明的是，所述gRNA转录引物组合是针对利福平耐药及异烟肼耐药的常见突变位点设计，所述的gRNA转录引物用于扩增gRNA转录DNA模板，通过体外转录获得检测所需的靶标特异性gRNA，后续应用过程中可引导CRISPR-Cas14a检测体系中的Cas14a核酸酶识别与gRNA互补的靶标位点，从而激活Cas14a的非特异性核酸切割功能，从而切割荧光报告探针进而产生荧光信号，而非靶标位点则不能被识别，所以不能激活Cas14a的非特异性核酸切割功能，从而不切割或者微弱地切割荧光报告探针进而只能产生微弱的荧光信号，通过荧光信号强弱可以特异性的识别和鉴定结核分枝杆菌耐药相关突变位点，从而能够快速、准确的实现对结核分枝杆菌耐药性的检测。
需要说明的是，步骤S40中，根据多个所述荧光信号确定结核分枝杆菌的耐药性的类型的步骤包括：1）当靶向野生型的CRISPR反应腔产生荧光信号，且对应的靶向突变型的CRISPR反应腔无荧光信号，表明该位点未发生突变；2）当靶向野生型的CRISPR反应腔产生荧光信号，而对应的靶向突变型的CRISPR反应腔也产生荧光信号，表明检测的底物中既包含野生型也含有突变型的基因型；3）当靶向野生型的CRISPR反应腔内没有产生荧光信号，而对应的靶向突变型的CRISPR反应腔内产生荧光信号，表明该位点发生了突变；4）当靶向野生型的CRISPR反应腔内没有产生荧光信号，且对应的靶向突变型的CRISPR反应腔内也没有产生荧光信号，表明非耐药相关位点发生突变。
在一实施方式中，所述CRISPR-Cas14a检测体系包括：缓冲液，gRNA、Cas14a、FQ报告基因和T7核酸外切酶。
需要说明的是，CRISPR家族成员Cas14a不依赖PAM基序进行底物识别，可以实现真正的单碱基识别，因此非常适合检测单碱基突变引起的耐药性，本发明通过建立CRISPR-Cas14a MTB RIF/INH技术平台实现耐利福平结核及耐异烟肼结核双联检检测体系，从而实现CRISPR-Cas14a MTB RIF/INH技术可以精确检测耐利福平和异烟肼相关的基因突变，同时，CRISPR-Cas14a MTB RIF/INH技术不需要依赖昂贵的检设备来实现耐利福平和异烟肼结核检测，成本较低，速度快，非常适合大规模推广应用，将为耐药结核病的快速诊断提供可靠的工具。
本发明还提供一种基于CRISPR-Cas14a检测结核分枝杆菌耐药性相关位点的引物组合在制备检测结核分枝杆菌耐药性诊断试剂、试纸条或生物传感器中应用，可以将所述引物组合制备出各种试剂或者试剂条，用以检测结核分枝杆菌耐药性。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：多重PCR扩增引物的设计和筛选
本发明中，针对利福平耐药及异烟肼耐药相关的基因rpoB、katG、inhA promoter，使用Primer Premier V5.0 软件设计多重PCR扩增引物同时扩增rpoB、katG、inhApromoter（具体如表1所示），如图1所示：琼脂糖胶电泳检测多重PCR扩增效果图中，1~9是分别从九个肺结核病人里面分离出来的结核菌株，10是阴性对照，设计的多重PCR扩增引物，RpoB、katG和inhA三条带清晰地扩增出来了，且没有杂带，说明设计的多重PCR扩增引物很成功，能够应用于后续的实验。
表1多重PCR扩增引物
实施例2：gRNA引物序列设计、制备和有效性测试
（1）gRNA引物序列设计
本发明中，通过汇总专利及指南中利福平耐药及异烟肼耐药的常见突变位点，并对各个耐药突变位点占各自耐药总突变的比例进行统计，选择占比最高的KatG-R50L、KatG-R50W、H445Y、H445D、H445L、H445R、D435Y、D435V、KatG-F15T、inhA_C-15T进行gRNA引物的设计。
gRNA引物序列设计原则：gRNA引物与靶标匹配的序列长度为20bp，待检测的突变碱基与gRNA引物的第9-10碱基匹配。gRNA的引物序列，如下表2所示：（划线部分序列是与检测靶标匹配的序列）。
表2gRNA转录引物组合中各gRNA引物的序列
（2）gRNA的制备
以针对各耐药检测位点的gRNA转录（SEQ ID NO.7~23）引物与T7-R（SEQ IDNO.25）从含有T7启动子gRNA骨架序列（SEQ ID NO.24）的PUC19载体中通过PCR扩增出gRNA的DNA转录模板，以扩增的PCR产物作为DNA模板，通过T7快速高产RNA合成试剂盒在37℃下体外转录获得靶标特异性的gRNA，然后使用RNA纯化试剂盒(NEB)纯化，获得纯化的gRNA，-70℃下储存备用，其中，gRNA骨架序列如SEQ ID NO.24，具体序列为：
GTTGCATTCCTTCATTCTTTCAAATGAATTTGTTTCGAGGGTTACTTTCCGAAGAAAGCACTTCTCGACATTAGGCTGATGCAAGCAGCCCACCTTCACTCAAGTTCTAATCCCCTAAGGGACAGCTTTTGGTGAAGCGGTTCTCCACTTTATCAGTGAAccctatagtgagtcgtattagaattc；
T7-R的序列如SEQ ID NO.25所示，具体序列为：
GAATTCTAATACGACTCACTATAGGGTTCACTGATAAAGTGG。
（3）gRNA有效性的测试
CRISPR-Cas14a检测体系包括：100nM Cas14a、100 nM 靶标特异性的gRNA、100nMFQ报告基因、100 nM底物DNA，核酸酶检测缓冲液NEbuffer4.0，总反应体积为20µl。使用荧光板读数器（VarioskanFlash，ThermoFisherScientific，MA，USA）在37℃下监测指定时间的反应。荧光测量采用492nm的激发波长和520nm的发射波长，检测结果如图2所示：图中纵坐标代表荧光强度，横坐标代表检测的野生型与突变型靶标ssDNA，CRISPR反应1小时后检测荧光强度。t-test用于评估显着差异。（n = 3 次技术重复；条形代表平均值±SEM，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001），结果表明：在CRISPR反应体系中，所述的gRNA检测位点与底物ssDNA的位点序列一直时，可以激发最强的荧光信号，若gRNA的检测位点与底物ssDNA的位点不一致时，荧光信号则较弱。因此从图中我们可以看出筛选出的gRNA可以特异性识别自己的靶标位点，引起强烈的荧光信号，说明设计的gRNA能够特异性的识别和鉴定结核分枝杆菌耐药相关突变位点，可用于结核分枝杆菌利福平和异烟肼的耐药检测。
实施例3：临床样本评估CRISPR-CarpoB-F4aMTBRIF/INH方法的可行性
（1）痰液样本DNA的提取：本发明总共收集了55份痰标本，涂片分析结果呈阳性。对培养阳性患者标本进行了RIF和INH药敏试验。在55个样本中，8个被鉴定为多重耐药，4个显示RIF单耐药，3个显示INH单耐药，41个对RIF和INH均敏感。使用商业化的DNA提取试剂盒（不限定公司品牌）提取各痰液样本的DNA。
（2）制备靶DNA：利用实施例1中制备出的多重PCR扩增引物进行扩增，富集靶标DNA，多重PCR扩增反应体系参照multiplexPCRKit（诺唯赞，南京，中国）：6μl多重PCR扩增引物组合（每个引物的终浓度为0.2μM）和100pgDNA模板组成，最终体积为50μl，PCR热循环参数设置如下：初始变性95℃3min，95℃30s、60℃30s、72℃1min共35个循环。最后的延伸步骤在72℃下进行10分钟。扩增后，使用1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。
（3）CRISPR检测利福平和异烟肼耐药：CRISPR--Cas14a检测体系为：在NEbuffer4.0缓冲液中，100nM CarpoB-F4a、100nM gRNA、100nM FQ报告基因、1U T7核酸外切酶（NEB公司）和2ul多重PCR产物组成，总体积为20µl，在37℃孵育1~2小时后测量荧光值，荧光测量采用492nm的激发波长和520nm的发射波长。
（4）耐药结果解读：1）当靶向野生型的CRISPR反应腔产生荧光信号，且对应的靶向突变型的CRISPR反应腔无荧光信号，表明该位点未发生突变；2）当靶向野生型的CRISPR反应腔产生荧光信号，而对应的靶向突变型的CRISPR反应腔也产生荧光信号，表明检测的底物中既包含野生型也含有突变型的基因型；3）当靶向野生型的CRISPR反应腔内没有产生荧光信号，而对应的靶向突变型的CRISPR反应腔内产生荧光信号，表明该位点发生了突变；4）当靶向野生型的CRISPR反应腔内没有产生荧光信号，且对应的靶向突变型的CRISPR反应腔内也没有产生荧光信号，表明非耐药相关位点发生突变。本实施例涉及使用CRISPR-Cas14aMTBRIF/INH方法评估临床痰液样本的耐药性。通过对痰液样本进行DNA提取、靶标DNA制备以及CRISPR检测，证明了该方法对于利福平和异烟肼耐药性的检测灵敏度和可行性。
（5）与药敏试验结果相比，检测耐药诊断性能，耐药与灵敏度的结果如表3所示：
表3临床样本评估 CRISPR-Cas14a RIF/INH 方法的耐药诊断性能
由表3可知：表格中给出了耐药试验和敏感试验的结果，以及计算的灵敏度和特异度的数据，且灵敏度计算公式为：灵敏度=真阳性人数/(真阳性人数+假阴性人数)*100%、特异性=真阴性数/(真阴性数+假阳性数)。
根据表格中的数据，对于利福平耐药性能评估：
真阳性人数为12、假阴性人数为0、真阴性人数为43、假阳性人数为2，因此灵敏度结果为12/（12+2）≈85.7%，且95%的置信区间（CI）为（71.2%-93.9%）；
利福平的特异度为43/(43+0)=100%，其中，且95%的置信区间在（98%，99.8%）。
根据表格中的数据，对于异烟肼耐药性能评估：真阳性人数为11、假阴性人数为0、真阴性人数为44、假阳性人数为0，异烟肼的敏感度为11/(11+0)=100%，且95%的置信区间（CI）在（90.8%，99.8%）异烟肼的特异度为44/(44+0)=1=100%，且95%的置信区间（CI）在（97.9%-99.7%）。
根据上述结果，可以得出结论：CRISPR-Cas14aRIF/INH方法在耐利福平和异烟肼药物敏感性检测方面表现良好，具有高的灵敏度和特异度。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (6)

1.一种基于CRISPR-Cas14a检测结核分枝杆菌耐药性相关位点的引物组合，其特征在于，所述基于CRISPR-Cas14a检测结核分枝杆菌耐药性相关位点的引物组合包括gRNA转录引物组合，所述gRNA转录引物组合包括：
针对所述结核分枝杆菌的rpoB基因1349位点的野生型rpoB-1349C，所述rpoB-1349C的序列如SEQ ID NO.7所示；
针对所述结核分枝杆菌的rpoB基因1349位点的突变型rpoB-1349T，所述rpoB-1349T的序列如SEQ ID NO.8所示；
针对所述结核分枝杆菌的rpoB基因1349位点的突变型rpoB-1349G，所述rpoB-1349G的序列如SEQ ID NO.9所示；
针对所述结核分枝杆菌的rpoB基因1333位点的野生型rpoB-1333C，所述rpoB-1333C的序列如SEQ ID NO.10所示；
针对所述结核分枝杆菌的rpoB基因1333位点的突变型rpoB-1333T，所述rpoB-1333T的序列如SEQ ID NO.11所示；
针对所述结核分枝杆菌的rpoB基因1333位点的突变型rpoB-1333G，所述rpoB-1333G的序列如SEQ ID NO.12所示；
针对所述结核分枝杆菌的rpoB基因1334位点的野生型rpoB-1334A，所述rpoB-1334A的序列如SEQ ID NO.13所示；
针对所述结核分枝杆菌的rpoB基因1334位点的突变型rpoB-1334T，所述rpoB-1334T的序列如SEQ ID NO.14所示；
针对所述结核分枝杆菌的rpoB基因1334位点的突变型rpoB-1334G，所述rpoB-1334G的序列如SEQ ID NO.15所示；
针对所述结核分枝杆菌的rpoB基因1303-1304位点的野生型rpoB-1303-1304-GA，所述rpoB-1303-1304-GA的序列如SEQ ID NO.16所示；
针对所述结核分枝杆菌的rpoB基因1303位点的突变型rpoB-1303T，所述rpoB-1303T的序列如SEQ ID NO.17所示；
针对所述结核分枝杆菌的rpoB基因1304位点的突变型rpoB-1304T，所述rpoB-1304TC的序列如SEQ ID NO.18所示；
针对所述结核分枝杆菌的inhA基因-777位点的野生型inhA-777G，所述inhA-777G的序列如SEQ ID NO.19所示；
针对所述结核分枝杆菌的inhA基因-777位点的突变型inhA-777A的序列，所述inhA-777A如SEQ ID NO.20所示；
针对所述结核分枝杆菌的KatG基因944位突变位点的野生型katG- 944G，所述katG-944G的序列如SEQ ID NO.21所示；
针对所述结核分枝杆菌的KatG基因944位点的突变型katG- 944C，所述katG- 944C的序列如SEQ ID NO.22所示；以及，
针对所述结核分枝杆菌的KatG基因944位突变位点的突变型katG- 944A，所述katG-944A的序列如和SEQ ID NO.23所示。
2.如权利要求1所述的基于CRISPR-Cas14a检测结核分枝杆菌耐药性相关位点的引物组合，其特征在于，所述引物组合还包括多重PCR扩增引物，所述多重PCR扩增引物包括：
针对所述结核分枝杆菌的rpoB基因设计的rpoB-F和rpoB-R，所述rpoB-F的序列如SEQID NO.1所示，所述rpoB-R的序列如SEQ ID NO.2所示；
针对所述结核分枝杆菌的katG基因突变位点设计的KatG-F和KatG-R，其中，所述KatG-F的序列如SEQ ID NO.3所示，所述KatG-R的序列如SEQ ID NO.4所示；以及，
针对所述结核分枝杆菌的inhA基因突变位点设计的inhA-F和inhA-R，所述inhA-F的序列如SEQ ID NO.5所示，所述inhA-R的序列如SEQ ID NO.6所示。
3.一种用于检测结核分枝杆菌耐药相关突变位点的试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1所述的gRNA转录引物组合和如权利要求2所述的多重PCR扩增引物。
4.一种用于检测结核分枝杆菌耐药性相关突变位点的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S10、提供如权利要求3所述的试剂盒；
S20、将所述gRNA转录引物组合中对各靶标的gRNA转录引物分别与T7-R混合，以合成的gRNA骨架DNA为模板，扩增应用于gRNA转录得DNA模板，以所述DNA模板为gRNA转录模板，体外转录合成获得靶标特异性的gRNA；
S30、将多重PCR扩增引物扩增目标基因，得PCR产物；
S40、将所述PCR产物与CRISPR-Cas14a检测体系混合、获得荧光信号，根据所述荧光信号的强弱确定结核分枝杆菌的耐药性的类型，其中，所述CRISPR-Cas14a检测体系包括靶标特异性的gRNA。
5.如权利要求4的用于检测结核分枝杆菌耐药性相关突变位点的检测方法，其特征在于，步骤S40中，所述CRISPR-Cas14a检测体系还包括：缓冲液、Cas14a、FQ报告基因和T7核酸外切酶。
6.如权利要求1所述的基于CRISPR-Cas14a检测结核分枝杆菌耐药性相关位点的引物组合在制备检测结核分枝杆菌耐药性诊断试剂、试纸条或生物传感器中应用。
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