CN102124109B - 猪α-S1-酪蛋白基因，其启动子及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及猪α-S1-酪蛋白，猪α-S1-酪蛋白基因启动子，包含上述启动子的表达载体，和使用上述表达载体制备靶蛋白的方法。本发明的启动子促进靶蛋白的乳腺特异性表达。相应的，用所述启动子转化的动物在奶中以高浓度分泌靶蛋白，因此可优势的用于制备有益蛋白质。
Description
技术领域
本发明涉及猪α-S1-酪蛋白，猪α-S1-酪蛋白基因启动子，包含其的表达载体，和使用其制备靶蛋白的方法。
背景技术
为了获得在医药领域中有益蛋白质的最大产量，主要使用了应用细胞培养技术的大量生产方法。
韩国专利申请号94-12082公开了含有修饰的重组人红细胞生成素(rhEPO)基因的表达载体。尽管在用相同的表达载体转染的动物细胞系COS-7(ATCC CRL 1651，非洲绿猴肾细胞)中EPO的大量生产可行，此技术的缺点在于需要麻烦的连续转染，不适于靶蛋白的工业规模生产。此外，韩国专利号10-0232640和韩国专利号10-0434729也公开了通过转基因细胞系培养的EPO制备。然而，这些细胞培养方法仍然具有一些缺点，例如由于使用动物血液作为培养基的高生产成本，和对专家和培养技术的复杂知识的要求。另一方面，使用转基因动物制备有益蛋白质由于具有下述优势引起了许多注意，例如与传统细胞培养技术相比，容易和便利的制备、分离和纯化靶蛋白以及较高活性的维持，其原因是靶蛋白是包含在动物分泌的体液中。例如，韩国专利号10-0358754公开了用于在猪奶中制备EPO的转基因动物，使用乳清酸性乳蛋白启动子(WAP)。
作为大量广泛和深入的研究和实验以解决上述问题和开发在奶中高效表达靶蛋白的乳腺特异性启动子的结果，本发明的发明者成功的测定了α-S1-酪蛋白及其启动子的序列。本发明完全基于此发现。
发明内容
技术问题
本发明旨在提供猪α-S1-酪蛋白基因及其启动子，和使用其大量生产靶蛋白的方法。
技术解决方案
本发明提供了猪α-S1-酪蛋白基因。
本发明的猪α-S1-酪蛋白基因具体的包含SEQ ID NO：1中陈列的序列，SEQ ID NO：1的序列包含启动子和3’非翻译区(UTR)序列。
此外，本发明提供了SEQ ID NO：2的启动子，其对应SEQ IDNO：1序列中的1至9300位连续的核苷酸序列，所述启动子位于结构基因的5’末端，由此控制结构基因的表达。
本发明的猪α-S1-酪蛋白基因或启动子可选自在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2序列中具有一或多个中断、缺失、插入、点、取代、无义、错义、多态性和重排突变的其功能等同物。
此外，本发明提供了包含SEQ ID NO：2启动子的全部或部分的表达载体。优选的，本发明的表达载体包含SEQ ID NO：3或SEQID NO：4的序列。SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4序列作为启动子通过其合并进入载体，在此称为启动子序列或猪α-S 1-酪蛋白基因启动子序列。如此处使用的，术语“猪α-S1-酪蛋白基因启动子”指来自猪α-S1-酪蛋白基因的启动子。
SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4分别对应SEQ ID NO：1的猪α-S1-酪蛋白基因全基因组序列中，由3568至9037位核苷酸组成的序列和由4321至9300位核苷酸组成的序列，并共同包含外显子-1区域。
如果需要，本发明的表达载体可在其合适的位点或基因座另外包含调控因子。调控因子的示例可包括另外的启动子、增强子、选择标记、5’-非翻译区(UTR)、3’-UTR、多腺苷酸化信号、核糖体结合序列、能够被插入基因组特异性区域的序列、内含子和土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。将这些另外的元件并入表达载体将提供多种优势，例如容易和便利的构建目的转基因细胞系，以及靶蛋白的最大化和稳定表达。
选择标记优选的为新霉素抗性基因或类似基因。可选的，选择标记可为从市售载体中切除的选择标记。新霉素抗性基因是赋予对G418(2R，3S，4R，5R，6S)-5-氨基-6-[(1R，2S，3S，4R，6S)-4，6-二氨基-3-[(2R，3R，4R，5R)-3，5-二羟基-5-甲基1-4-甲基氨基噁烷-2-基]氧-2-羟基环己基]氧-2-(1-羟乙基)环氧乙烷-3，4-二醇)的抗性的基因，G418是在构建细胞系中使用的试剂，在处于启动子控制下表达靶蛋白的动物细胞系的构建中其可作为有效的选择标记。
绝缘子是帮助启动子相邻调节因子起作用和促进蛋白质的位置无关表达的因子。绝缘子允许处于启动子控制下的蛋白质的稳定表达。绝缘子可为从市售载体中切除的绝缘子。
WPRE是调控因子，其有助于mRNA分子的稳定性，因此增加蛋白质的合成。此调控子能使处于启动子控制下的蛋白质高表达。WPRE也可为来自市售载体的截短的WPRE。
本发明的表达载体可另外包含SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6中陈列的序列。SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6序列组成载体的3’臂，并帮助转化细胞系的容易构建和靶蛋白表达的最大化和稳定性。
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6分别对应SEQ ID NO：1的猪α-S1-酪蛋白基因全基因组序列中核苷酸26344至核苷酸30599和核苷酸14447至核苷酸19401的序列。
图1显示了SEQ ID NO：3，4，5和6序列在猪α-S1-酪蛋白基因全基因组序列中的位置。
优选的构建包含SEQ ID NO：3序列和SEQ ID NO：5序列的本发明的载体。
具体的，本发明的载体具有如图2中所示的酶切图。pBC1-猪αS1酪蛋白载体保存于韩国典型菌种保藏中心(KCTC)，韩国生物科学和生物技术研究所(KRIBB，Daejon，Korea)，编号KCTC11324BP。本发明的表达载体pBC1-猪αS1酪蛋白以pBC1载体为基本骨架，在其中融合了新霉素抗性基因作为选择标记。
本发明的表达载体可通过在启动子序列的3’末端另外并入靶蛋白编码序列表达靶蛋白。
靶蛋白是工业可应用的有益蛋白质，可为任意作为例如药物活性成分使用的蛋白质。靶蛋白的示例可包括EPO(红细胞生成素)、醛固酮、促肾上腺皮质激素、凝血因子、促性腺激素、胰岛素、催乳激素和血管升压素。优选的为hEPO(人红细胞生成素)。
本发明提供了具有图3的酶切图的载体，作为含有新霉素抗性基因、绝缘子、WPRE等等的表达载体的优选示例。具体的，pBC1-猪αS1酪蛋白+hEPO-WPRE载体保存于韩国典型菌种保藏中心(KCTC)，韩国生物科学和生物技术研究所(KRIBB，Daejon，Korea)，编号KCTC 11325BP。
表达载体pBC1-猪αS1酪蛋白+hEPO-WPRE以pBC1为基本骨架，其中hEPO编码基因融合至本发明启动子区的3’末端，WPRE融合至hEPO基因的3’末端。
本发明的表达载体可以敲入载体的形式构建。
在本发明的上下文中，敲入载体是能够将靶基因插入基因组的特异性位点或基因座的载体，其包含与靶向的具体基因同源的序列，从而导致在其间的同源重组。本发明的敲入载体为α-S1-酪蛋白靶向载体，其中靶蛋白编码核酸序列插入基因组中存在的α-S1-酪蛋白基因。
优选的构建包含SEQ ID NO：4序列和SEQ ID NO：6序列的本发明敲入载体。
如果需要，可构建敲入载体使用正和/或负选择标记选择转基因细胞。选择标记旨在选择被载体转化的细胞，可应用能够赋予可选择的表型的基因，例如药物抗性、营养缺陷型、细胞毒性剂抗性和表面蛋白的表达。选择标记可大体上分为正选择标记和负选择标记。
如此处使用的，术语“正选择标记”指使细胞表达正选择标记以对抗选择剂存活的基因，从而其能够赋予表达该标记的细胞正选择特征。正选择标记的示例可包括新霉素(Neo)抗性基因，潮霉素(Hyg)抗性基因，等等。
术语“负选择标记”指去除随机整合细胞的基因，从而其能够赋予表达该标记的细胞负选择特征。负选择标记的示例包括单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(Hprt)基因、胞嘧啶脱氨酶基因、白喉毒素基因等等。负选择标记位于启动子区域的5’末端或3’臂的3’末端。
正选择标记和负选择标记可具有独立的启动子、聚腺苷酸(poly(A))等等。在本发明中可使用的启动子的示例可包括猿猴病毒40(SV40)、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、莫洛尼(Moloney)病毒、巨细胞病毒(CMV)启动子、埃-巴二氏(Epstein-Barr)病毒(EBV)启动子、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子，等等。
当同源重组在本发明的敲入载体和基因组中的α-S1-酪蛋白基因之间发生时，载体上的靶蛋白编码核酸整合至宿主细胞的α-S1-酪蛋白基因组基因，之后替代宿主细胞的α-S1-酪蛋白表达。
本发明提供了具有图4的酶切图的载体，作为应用新霉素抗性基因作为正选择标记和单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)作为负选择标记的敲入载体的优选示例。具体的，猪αS1酪蛋白-hEPO敲入载体保存于韩国典型菌种保藏中心(KCTC)，韩国生物科学和生物技术研究所(KRIBB，Daejon，Korea)，编号KCTC 11326BP。
猪β酪蛋白-hEPO敲入载体以Lox A neo载体为基本骨架，其中hEPO融合至启动子的3’末端(参见图4中所示的猪β酪蛋白αS1酪蛋白5’臂)，新霉素抗性基因作为正选择标记融合至hEPO的3’末端，3’臂(参见图4中所示的猪αS1酪蛋白3’臂)融合至新霉素抗性基因的3’末端，单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因(TK)融合至3’臂的3’末端。
本发明的载体可通过本领域熟知的任意传统基因重组技术构建。位点特异性DNA切割和剪接可使用本领域已知的传统酶进行。
此外，本发明提供了通过引入本发明的表达载体转化的动物体细胞。
本发明载体将要引入的动物体细胞可为来自合适动物(包括猪)的初级、次生或永久细胞。
本发明载体的细胞内引入可通过任意核酸的传统细胞内引入方法，即本领域已知技术例如电穿孔、磷酸钙共沉淀、逆转录病毒感染、显微注射、二乙氨乙基葡聚糖促进的转染、阳离子脂质体介导的转染等等进行。当期望进行载体的细胞内引入时，载体可以现成的线性化载体形式或通过用合适的限制酶消化环状载体以无质粒的线性化载体形式引入。
本发明的启动子基因仅在乳腺组织中特异表达靶蛋白。酪蛋白占猪奶中蛋白质成分的90％，大体上分为α-、β-和γ-酪蛋白。由于分为α-S1-酪蛋白和κ-酪蛋白的α-酪蛋白占蛋白质成分的相当大部分，达70％，α-S1-酪蛋白占α-酪蛋白的55％。因此，可构建应用猪α-S1-酪蛋白启动子的载体在授乳动物特别是猪中展示乳腺特异性的外源靶蛋白表达。
此外，本发明提供了动物胚胎，其通过将本发明表达载体转化的动物体细胞核核转移至无核卵中制备。
如此处使用的，术语“核转移”指将细胞核植入无核卵。通过核转移的受精卵(或胚胎)的植入产生的后代为遗传上完全一致的克隆，因为核供体细胞的遗传物质完全和完整的转移至核受体的细胞质。
此外，本发明提供了通过本发明动物胚胎的植入获得的转基因动物。
具体的，表达载体的引入可通过以下技术进行，例如显微注射技术在受精后的原核期将基因立即注射至合子的雄原核，干细胞插入技术将基因插入胚胎干细胞并将细胞转移至胚泡胚胎，逆转录病毒插入技术通过逆转录病毒载体将基因注射至胚胎，或精子介导的基因转移技术将基因注射至雄性的睾丸以将基因插入精子并将精子转移至卵母细胞。优选的为显微注射技术。
本发明也提供了通过本发明动物胚胎的植入获得的转基因动物。可用本发明的表达载体转化的动物示例包括所有授乳动物，包括猪、小鼠、牛、绵羊和山羊。
通过本领域已知的传统方法进行使用本发明表达载体的转基因动物的制备。
例如，当用于转化的动物为小鼠时，从健康个体中收集胚胎(或受精卵)，将本发明的表达载体引入胚胎。之后，使用输精管结扎的小鼠获得假孕小鼠，将胚胎植入作为代孕母亲(或受体)的假孕小鼠的输卵管，从代孕母亲产生的后代中选择转基因小鼠。
当用于转化的动物为猪时，从健康动物中收集猪卵泡卵母细胞并在体外成熟(IVM)培养基中培养。之后，将本发明的表达载体引入从猪胎中收集和培养的供体体细胞，选择并培养引入载体的体细胞。将体外成熟的卵去核，将供体细胞注射至已去除核的卵细胞的无核区域，通过电融合技术将供体细胞和核转移的卵母细胞细胞质融合，之后体外培养融合细胞。将得到的克隆胚胎植入经超排卵处理的受体猪，从受体猪产生的后代中选择转基因猪。
之后，从确认发生正确转化的个体中收集奶，分离和纯化靶蛋白，由此制备最终的蛋白质(A.Gokana，J.J.Winchenn，A.Ben-Ghanem，A.Ahaded，J.P.Cartron，P.Lambin(1997)Chromatographic separation of recombinant human erythropoietinisoforms，Journal of Chromatography，791，109-118)。
在本发明的靶蛋白的制备中，蛋白质的分离和纯化可通过本领域已知的传统方法进行，例如可使用过滤或层析以分离和纯化靶蛋白。
如此构建的本发明的转基因动物可在奶中表达靶蛋白。
因此，本发明的猪α-S1-酪蛋白基因，其启动子和表达载体以及使用其的转基因动物可有益的用于靶蛋白的制备。
有关本发明中遗传工程技术的细节可在以下文献中找到：Sambrook，等人Molecular Cloning，A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，(2001)；和Frederick M.Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology卷1，2，3，John Wiley & Sons，Inc.，(1994)。
有益效果
猪α-S1-酪蛋白基因使靶蛋白的乳腺特异性表达更容易。因此，本发明的启动子和使用相同启动子构建的表达载体转化的动物能够高浓度的在奶中分泌靶蛋白，因此这对医学和药学上有价值的有效蛋白质的制备提供了益处。
附图说明
图1显示了用于寻找依照本发明的猪α-S1-酪蛋白基因序列的探针的位置和由探针找到的序列的位置。
图2显示了根据本发明的一个实施方案的pBC1-猪αS1酪蛋白载体的结构。
图3显示了根据本发明的一个实施方案的pBC1-猪αS1酪蛋白+hEPO-WPRE载体的结构。
图4显示了根据本发明的一个实施方案的猪αS1酪蛋白-hEPO敲入载体的结构。
图5为图表，显示了在转染了根据本发明的一个实施方案的猪αS1酪蛋白+hEPO-WPRE载体的细胞系中hEPO的表达结果。
图6显示了聚合酶链式反应(PCR)的结果，用于选择转化了根据本发明的一个实施方案的pBC1-猪αS1酪蛋白+hEPO-WPRE载体的小鼠。
图7显示了PCR的结果，用于在用根据本发明的一个实施方案的pBC1-猪αS1酪蛋白+hEPO-WPRE转化后的小鼠后代中鉴定转化。
图8显示了蛋白质印迹试验的结果，使用根据本发明的一个实施方案的转基因小鼠的奶进行。
具体实施方式
现在，本发明将通过以下实施例更详细的描述。提供这些实施例仅用于说明本发明，不应理解为限制本发明的范围和精神。
实施例1：猪α-S1-酪蛋白基因的分离和克隆
为了构建本发明的乳腺特异性基因，使用猪基因组DNA文库(Promega)和国家家畜研究所(77 Chuksan-gil，564 Omokchun-dong，Gwonsun-gu，Suwon，Korea)提供的细菌人工染色体(BAC)克隆对猪α-S1-酪蛋白基因(猪αS1酪蛋白基因)测序。
1)使用猪基因组DNA文库对猪α-S1-酪蛋白基因测序
因为还未发现猪α-S1-酪蛋白基因序列，根据物种间的高同源性和高度保守区域通过比较序列已知的人、牛、马和小鼠的α-S1-酪蛋白序列构建用于猪α-S1-酪蛋白PCR扩增的引物序列。
使用5′UTR正向引物(5′-TGACAACCATGAAACTTCTCAT-3′；SEQ ID NO：8)，5′UTR反向引物(5′-GTTCCTGATGCCTGAGAGGA-3′；SEQ ID NO：9)，3′UTR正向引物(5′-AACCATTTTATCTGAAGACTTTG-3′；SEQ ID NO：10)和3′UTR反向引物(5′-TCTCAGTCACTGCACACAATT-3′；SEQ ID NO：11)，在以下条件下对猪基因组DNA进行PCR扩增(PT-200，BIO-RAD)：94℃变性5分钟；之后94℃变性30秒，56℃引物退火30秒和72℃延伸5分钟，循环35次。结果得到包含5′UTR的3.3-kb序列(SEQ ID NO：12)和3′UTR的303-bp序列(SEQ ID NO：13)的PCR产物。得到的产物克隆至pGEM-T载体(Promega，USA)，之后测序，由此确认产物是猪α-S1-酪蛋白基因的一部分。对5′UTR的3.3-kb片段和3′UTR的303-bp片段测序。
为了从猪α-S1-酪蛋白基因的已鉴定的3.3-kb序列中制备5′UTR探针，使用正向引物5′-TGACAACCATGAAACTTCTCAT-3′(SEQ ID NO：14)和反向引物5′-CTAAGACTCTCATACTGAGTG-3′(SEQ ID NO：15)在以下条件下进行PCR扩增(PT-200，BIO-RAD)：94℃变性5分钟；之后94℃变性30秒，56℃引物退火30秒和72℃延伸30秒，循环35次。结果得到551-bp的产物(SEQ ID NO：16)。
为了制备用于鉴定猪α-S1-酪蛋白序列的探针，将100ng上面制备的包含551-bp 5′UTR和303-bp 3′UTR的PCR产物煮沸5分钟，之后在冰上冷却，使其变性。将变性的DNA加入含有引物、dNTP和[α-32P]dCTP(3000 Ci/nmol，NEN)的反应缓冲液中，之后在其中加入Klenow片段(Promega，USA)并允许反应在37℃进行1小时。之后，使用Sephadex G-50柱纯化反应溶液，由此制备32P-标记的猪α-S1-酪蛋白基因探针。
为了鉴定猪α-S1-酪蛋白基因，筛选了猪基因组文库。在此实施例中，使用了猪基因组DNA文库(Promega)。
用以下方式制备用于引入文库的宿主细菌。
将1个细菌菌落接种于5ml包含0.2％麦芽糖的LB培养基(Scharlau，Spain)中并于37℃培养过夜。将1％培养物转移至50ml包含0.2％麦芽糖的新鲜LB培养基中并培养2.5小时。当在600nm的吸光度达到约0.5时，将培养物以2500rpm离心10分钟。将得到的细胞沉淀在10ml灭菌的硫酸镁溶液中重悬为终浓度1×1010细胞/ml并储存于4℃直至使用。
用于滴定，在SM缓冲液(0.1M NaCl，8mM MgSO4，50mMTris-HCl(pH 7.5)，0.01％明胶)中以不同浓度连续稀释文库。在培养箱中以37℃加热包含固体LB培养基的平板，将上层琼脂融化并置于48℃水浴中。将10μl以不同浓度稀释的各噬菌体溶液与100μl上面制备的宿主细菌混合并在37℃感染宿主细菌。将感染噬菌体的噬菌体细菌加入上层琼脂并摇晃均匀，之后倒入上面制备的LB培养基。15分钟后，将平板上下颠倒并置于培养箱中于37℃培养过夜。在经过夜培养的平板的培养基中形成噬菌斑，指示噬菌体复制了文库DNA并之后裂解了宿主细菌。将培养基在4℃冷却1小时或更久以用于后续试验。
准备不同序列号的NC滤膜(Amersharm Biosciences；GB)，以首先接触滤膜中间部分的方式将滤膜覆盖在上面制备的DNA文库平板上。
用针以垂直方向刺穿滤膜以标记位置，1分钟后，将滤膜小心的从培养基上分离。
将各滤膜连续浸入变性溶液(0.5M NaOH，1.5M NaCl；Sigma，USA)、中和溶液(1M Tris-HCl(pH 7.5)，1.5M NaCl；Sigma，USA)和2×SSC溶液(0.3M NaCl，0.03M柠檬酸钠，Sigma，USA)，每种溶液1分钟，之后置于烘箱中于80℃放置2小时，从而将转移的文库DNA完全固化。
将各固化的滤膜置于乙烯塑料袋，向其中加入预杂交溶液(40ml 50％甲酰胺，20ml 20X SSPE(盐水-磷酸钠-EDTA缓冲液)，8ml50X Dehardt′s溶液，1.2ml 100ng/ml鲑鱼精子DNA，1.2ml 10％SDS(十二烷基硫酸钠)，0.6ml蒸馏水；Sigma，USA)。之后，将滤膜于68℃预杂交1小时，同时缓慢搅动。预杂交后，将100ng上面制备的探针加入各滤膜，之后于68℃杂交18小时，同时缓慢搅动。杂交后，将滤膜浸入包含0.1％SDS的2×SSC溶液中并于65℃摇晃10分钟清洗滤膜，此步骤重复2次。清洗后，将各滤膜在空气中干燥并用于放射自显影。通过比较放射自显影结果和平板，选择显示阳性信号的噬菌斑。将选择的噬菌斑置于500μl SM缓冲液中，加入1滴氯仿并与溶液混合均匀，将混合物保存于4℃。此筛选过程重复2次，最后得到显示阳性信号的克隆。将得到的克隆进行PCR扩增(PT-200，BIO-RAD)，使用一对制备探针的引物(正向引物(SEQID NO：14)和反向引物(SEQ ID NO：15))以及T7和SP6引物对(Cosmo，Korea)，使用以下条件：94℃变性5分钟；之后94℃变性30秒，56℃引物退火30秒和72℃延伸5分钟，循环35次。作为PCR扩增的结果，551bp的5’UTR探针得到3.7kb的5’产物(SEQ IDNO：17)，303bp的3′UTR探针得到303kb的5’产物(SEQ ID NO：18)和6.3kb的3’产物(SEQ ID NO：19)。将PCR产物克隆至pGEM-T载体(Promega，USA)，由此得到完整的核苷酸序列。
得到的基因由Solgent(Korea)进行测序。
2)使用BAC克隆对猪α-S1-酪蛋白测序
使用猪基因组DNA文库进行的测序过程中使用用于制备探针的引物(SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15)，基因在以下条件下进行PCR扩增(PT-200，BIO-RAD)：94℃变性5分钟；之后94℃变性30秒，56℃引物退火30秒和72℃延伸30秒，循环35次。结果得到4个克隆(155F1，188A9，616B6和874E5)。将得到的克隆连续测序，由此鉴定全长33kb的完整核苷酸序列。
表1
| SEQ ID NO | 测序引物 |
| 20 | 5′-TAACGAATCCAACTAGGAACC-3′ |
| 21 | 5′-TCCTTCTCCAACCCTATATTC-3′ |
| 22 | 5′-TGAGAGGGGAATAGAAAGAAC-3′ |
| 23 | 5′-TATCAATAGGTCTCAGAAGATC-3′ |
| 24 | 5′-TAGACTTCGAGTTTGGAGGG-3′ |
| 25 | 5′-TATAAGGCACAAATGAGCCCTT-3′ |
| 26 | 5′-AAATGCTCAACATCCCTGATTA-3′ |
| 27 | 5′-TATTCCGTGTTCATGGATTGG-3′ |
| 28 | 5′-AAGTATTCTCCACTGCCTTAC-3′ |
| 29 | 5′-TGTGAGTATGGTAGAGAATTT-3′ |
| 30 | 5′-CTATTGTGAATAGAGCTGCAAT-3′ |
| 31 | 5′-GTGTGAGAGTGTGTACCAGTT-3′ |
| 32 | 5′-TGTTCCCTTGTGATATATAGC-3′ |
| 33 | 5′-CTTGTTCCCACAGTTCAAATG-3′ |
| 34 | 5′-TAGATACCTCCACCAAGAGC-3′ |
| 35 | 5′-TTCTCAGGTTTCCTGAGGTG-3′ |
| 36 | 5′-GTGCACATTTACATACTGATAG-3′ |
| 37 | 5′-ATCATCAATGAACTGAACAGGGT-3′ |
| 38 | 5′-TTGAGACCTAAGTCACAGCTA-3′ |
| 39 | 5′-TC CATAATAATTTATGTCAAGGG-3′ |
| 40 | 5′-TAAGGCAAAATGTGCATGAGTG-3′ |
3)对巴克夏猪的α-S1-酪蛋白的测序
基于从猪基因组DNA文库分析和Bac克隆得到的猪α-S1-酪蛋白的DNA序列，从巴克夏猪的基因组DNA中对α-S1-酪蛋白测序。此处使用的基因组DNA是使用基因组DNA提取试剂盒(货号17231；iNtRON，Korea)从高等猪研究所(Gyeongsangnam-do，Korea)得到的猪体细胞中分离的。将上面章节2)中测定的α-S1-酪蛋白的33-kb序列分为总共7部分(4.6kb，5.7kb，4.9kb，5.4kb，5.3kb，4.7kb和4.4kb)，对应于在PCR扩增(PT-200，BIO-RAD)中使用的引物序列(SEQ ID NO：42至SEQ ID NO：55)。PCR按照下述进行：94℃变性5分钟循环1次；94℃变性30秒，56℃引物退火30秒和72℃延伸4分钟，循环35次。
得到的PCR产物分别克隆至pGEM-T载体，之后测序。序列分析由Sogent(Korea)使用Bioedit程序进行。
表2
| 引物 | SEQ ID NO | |
| 正向 4.6kb | 5′-AGGAATTCAAGATTGCTGTTGGA-3′ | 42 |
| 反向 4.6kb | 5′-AAAATCGTCAACTACCCTGATTA-3′ | 43 |
| 正向 5.7kb | 5′-AGCTGCAATGAACATGTGGGTG-3′ | 44 |
| 反向 5.7kb | 5′-CACCCACATGTTCATTGCAGCT-3′ | 45 |
| 正向 4.9kb | 5′-CACTCAGTATGAGAGTCTTAG-3′ | 46 |
| 反向 4.9kb | 5′-CTGTTCAGTTCATTGATGATTTC-3′ | 47 |
| 正向 5.4kb | 5′-TTTGGTTCTGCTGTGCCATAA-3′ | 48 |
| 反向 5.4kb | 5′-GTAGAGCTTAGAGTTCAACTC-3′ | 49 |
| 正向 5.3kb | 5′-CACTCAGGATGAGATTCTCTA-3′ | 50 |
| 反向 5.3kb | 5′-AACTGATTGATGACTACTATGTT-3′ | 51 |
| 正向 4.7kb | 5′-AGATCTGACACCTTCTAATTAC-3′ | 52 |
| 反向 4.7kb | 5′-GTGTATTCCTGCACAGCAAC-3′ | 53 |
| 正向 4.4kb | 5′-GTCAAACTGCCTTCTAGAGTC-3′ | 54 |
| 反向 4.4kb | 5′-GTAGACTTATGTGAAGCTCTG-3′ | 55 |
结果成功得到巴克夏猪的猪β-酪蛋白基因组DNA序列(SEQID NO：1)和其序列信息。
SEQ ID NO：1序列是猪α-S1-酪蛋白基因的全部基因组序列，具有33248bp的长度。在SEQ ID NO：1序列中，结构基因区为从核苷酸7760至核苷酸27875的序列，起始密码子为从核苷酸9326至核苷酸9328的序列，终止密码子为从核苷酸25982至25983和核苷酸26593的序列。此外，5′UTR区为从核苷酸7760至核苷酸7804和从核苷酸9314至核苷酸9325的序列，3′UTR区为从核苷酸26594至核苷酸26636和核苷酸27482至核苷酸27875的序列，poly(A)信号区为从核苷酸27855至核苷酸27860的序列。外显子区为从核苷酸7760至核苷酸7804，从核苷酸9314至核苷酸9376，从核苷酸12653至核苷酸12685，从核苷酸13117至核苷酸13137，从核苷酸13537至核苷酸13578，从核苷酸14049至核苷酸14072，从核苷酸14780至核苷酸14803，从核苷酸16568至核苷酸16591，从核苷酸17617至核苷酸17646，从核苷酸18423至核苷酸18446，从核苷酸18533至核苷酸18580，从核苷酸20563至核苷酸20604，从核苷酸22369至核苷酸22386，从核苷酸22868至核苷酸22906，从核苷酸24004至核苷酸24030，从核苷酸25018至核苷酸25041，从核苷酸25835至核苷酸25983，从核苷酸26593至核苷酸26636，和从核苷酸27482至核苷酸27875的序列。内含子区为从核苷酸7805至核苷酸9313，从核苷酸9377至核苷酸12652，从核苷酸12686至核苷酸13116，从核苷酸13138至核苷酸13536，从核苷酸13579至核苷酸14018，从核苷酸14073至核苷酸14779，从核苷酸14804至核苷酸16567，从核苷酸16592至核苷酸17616，从核苷酸17647至核苷酸18422，从核苷酸18447至核苷酸18532，从核苷酸18581至核苷酸20562，从核苷酸20605至核苷酸22368，从核苷酸22387至核苷酸22867，从核苷酸22907至核苷酸24003，从核苷酸24031至核苷酸25017，从核苷酸25042至核苷酸25834，从核苷酸25984至核苷酸26592，和从核苷酸26637至核苷酸27481的序列。此外，编码区为从核苷酸9326至核苷酸9376，从核苷酸12653至核苷酸12685，从核苷酸13117至核苷酸13137，从核苷酸13537至核苷酸13578，从核苷酸14049至核苷酸14072，从核苷酸14780至核苷酸14803，从核苷酸16568至核苷酸16591，从核苷酸17617至核苷酸17646，从核苷酸18423至核苷酸18446，从核苷酸18533至核苷酸18580，从核苷酸20563至核苷酸20604，从核苷酸22369至核苷酸22386，从核苷酸22868至核苷酸22906，从核苷酸24004至核苷酸24030，从核苷酸25018至核苷酸25041，从25835至核苷酸25983和核苷酸26593的序列。
此外，分析了α-S1-酪蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO：7)。
图1显示了探针的位置和由探针鉴定的序列的位置和结构。
在图1中，“63/12-ATG-48”表示ATG(起始密码子)位于猪α-S1-酪蛋白外显子2的63个核苷酸中的12个核苷酸序列之后，之后为外显子2的48个核苷酸。类似的，“149/147-TG”表示TGA(终止密码子)的TG位于猪α-S1-酪蛋白外显子17的149个核苷酸中的147个核苷酸序列之后。此外，“44/A-43”表示终止密码子的A位于猪α-S1-酪蛋白外显子18的44个核苷酸中，之后为外显子18的43个核苷酸。
分析的猪α-S1-酪蛋白序列和其信息已在NCBI上登记(EU025875)。
实施例2：pBC1-猪αS1酪蛋白克隆载体的构建
通过将用新霉素抗性基因取代氨苄青霉素抗性基因的pBC1载体(Invitrogen，USA)中的山羊β-酪蛋白启动子区和3′基因组DNA区分别替换为猪α-S1-酪蛋白序列和3′臂序列构建克隆载体{能够赋予对G418药物抗性的“Neo”基因是通过使用正向引物5′-GCGGCCGCGCGCGTCAGGTGGCAC-3′(SEQ ID NO：81)和反向引物5′-CGATCGGACGCTCAGTGGAACGAAAACTC-3′(SEQ IDNO：82)，通过1.9-kbPCR产物(SEQ ID NO：83)的扩增从pEGFP-N1载体(Clontech，USA)中获得的，之后克隆至pGEM T-easy载体。克隆至T-载体的1.9-kb neo基因使用限制性内切酶Not I和Pvu I消化以制备插入物。此外，pBC1载体的amp基因(氨苄青霉素抗性基因)区通过Not I和Pvu I切割去除以制备载体。将得到的插入片段和载体部分连接以构建插入neo基因(新霉素抗性基因)的pBC1载体}。
使用引物序列(SEQ ID NO：56至SEQ ID NO：59)对5.5kb的猪α-S1-酪蛋白启动子序列(SEQ ID NO：3)和4.3kb的3′臂序列(SEQ IDNO：5)进行PCR扩增(PT-200，BIO-RAD)。按如下进行PCR：94℃变性5分钟循环1次；94℃变性30秒，56℃引物退火30秒和72℃延伸5分钟，循环35次。得到的各PCR产物克隆至pGEM-T载体(Promega，USA)。
表3
| 引物 | SEQ ID NO | |
| 用于扩增启动子的正向引物 | 5′-GGATCCGGCTGTCGTTTTGTTATGATT-3′ | 56 |
| 用于扩增启动子的反向引物 | 5′-CTCGAGAACTAAAAGGCACAGGGAACT-3′ | 57 |
| 用于扩增3′臂的正向引物 | 5′-CTCGAGTTACAATTCAGTGTGGGGAAT-3′ | 58 |
| 用于扩增3′臂的反向引物 | 5′-GCGGCCGCCAGCTTTATTACAGGCAGAGG-3′ | 59 |
为了避免可能的Bam HI消化，将猪β-酪蛋白启动子序列中存在的2个Bam HI位点(GGATCC)按如下进行重复的点突变。为引入点突变，首先选择2个限制性内切位点中的1个并构建对应的引物。将包含猪α-S1-酪蛋白5′启动子区的pGEM-T载体DNA纯化并使用20ng模板DNA和一对点突变引物进行PCR扩增。按如下进行PCR：95℃变性30秒循环1次；95℃变性30秒，55℃引物退火1分钟和72℃延伸8.5分钟，循环15次。为了去除模板(未引入点突变)DNA，向其中加入1μl MutazymeTM，之后在37℃反应1小时。将10μl反应产物转化进DH10B感受态细胞(Invitrogen，USA)，之后将其涂板于LB+氨苄青霉素固体培养基并于37℃培养20小时。在LB+氨苄青霉素固体培养基上生长的菌落培养于LB+氨苄青霉素液体培养基，之后通过DNA纯化和测序以确定是否Bam HI位点发生了点突变(GGATCC-＞GGACCC)。使用在1个限制性内切位点具有点突变的菌落DNA，根据相同的方法在另一个Bam HI位点也制造了点突变。此处使用的点突变方法使用定点诱变试剂盒(iNtRON)进行。
用于启动子序列点突变的引物序列显示于下表4。
表4
pGEM-T载体中存在的猪α-S1-酪蛋白启动子序列用Bam HI和Xho I消化以制备8.5-kb的载体。此外，包含3′臂的序列区域用Xho I和Not I消化以制备4.3-kb的插入物(SEQ ID NO：5)。将得到的两个限制性内切片段连接以克隆pGEM-T-猪αS1酪蛋白5’+3’载体。
pBC1载体用Bam HI和Not I消化以制备10-kb的载体，pGEM-T-猪αS1酪蛋白5’+3’载体用Bam HI和Not I消化以制备9.8-kb的插入物。将得到的2个限制性内切片段连接以构建pBC1-猪αS1酪蛋白克隆载体。
构建的pBC1-猪αS1酪蛋白克隆载体的结构显示于图2。
在图2中，“P αS1酪蛋白”表示包含外显子1(E1)的猪αS1酪蛋白启动子序列(SEQ ID NO：2)。“外显子1”指排列在SEQ ID NO：1序列5′→3′方向的第一个外显子。
在图2中，“αS1酪蛋白3′基因组DNA”表示包含外显子18(E18)、外显子19(E19)和内含子18(IVS18)的3′臂序列(SEQID NO：5)。“外显子18”和“外显子19”分别指在SEQ ID NO：1序列5′→3′方向的第18个和第19个外显子。
由于具有Xho I限制性内切位点，所以可将靶蛋白基因插入载体。
2Xβ-球蛋白绝缘子和pBR322分别代表绝缘子和来自pBC1载体的载体成分。新霉素代表来自pEGFP-N1载体(Clontech，USA)的新霉素抗性基因。
将如此构建的pBC1-猪αS1酪蛋白载体保存于韩国典型菌种保藏中心(KCTC)，韩国生物科学和生物技术研究所(KRIBB，Daejon，Korea)，编号KCTC 11324BP。
实施例3：pBC1-猪αS1酪蛋白+hEPO-WPRE载体的构建
将红细胞生成素(hEPO)克隆至用新霉素抗性基因取代氨苄青霉素抗性基因的pBC1载体(Invitrogen，USA)中{能够赋予对G418药物抗性的“Neo”基因从pEGFP-N1载体(Clontech，USA)中获得，使用正向引物5′-GCGGCCGCGCGCGTCAGGTGGCAC-3′(SEQ IDNO：81)和反向引物5′-CGATCGGACGCTCAGTGGAACGAAAACTC-3′(SEQ ID NO：82)，通过1.9-kbPCR产物的扩增，之后克隆至pGEM T-easy载体。克隆至T-载体的1.9-kb neo基因使用限制性内切酶Not I和Pvu I消化以制备插入物。此外，pBC1载体的amp基因(氨苄青霉素抗性基因)区通过Not I和Pvu I切割去除以制备载体。将得到的插入片段和载体部分连接以构建插入neo基因(新霉素抗性基因)的pBC1载体}，之后将载体中存在的山羊β-酪蛋白启动子区和3′基因组DNA区替换为猪α-S1-酪蛋白序列(SEQ ID NO：3)和3′臂序列(SEQID NO：5)。此外，通过在hEPO的3’末端添加WPRE(土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件)来最大化hEPO表达，已知WPRE通过稳定mRNA提高蛋白质的表达。
对hEPO和WPRE分别进行PCR扩增(PT-200，BIO-RAD)。按如下进行PCR：94℃变性5分钟；94℃变性30秒，56℃引物退火30秒，72℃延伸2.5分钟用于hEPO和30秒用于WPRE，循环35次。得到的2.3kb(SEQ ID NO：69)和0.6kb(SEQ ID NO：70)PCR产物分别克隆至pGEM-T载体(Promega，USA)，之后确认其序列。含有hEPO的pGEM-T载体用Eco RV和Not I消化，含有WPRE的pGEM-T载体用Eco RV和Not I消化，将得到的2个限制性内切片段连接。
用于hEPO和WPRE的PCR扩增的引物序列显示于下表5。
表5
| 引物 | SEQ ID NO | |
| 用于hEPO扩增的正向引物 | 5′-GGATCCTGTGGTCACCCGGCGCGC-3′ | 64 |
| 用于hEPO扩增的反向引物 | 5′-GATATCCCATGGGACTGGCTGGCGCT-3′ | 65 |
| 用于WPRE扩增的正向引物 | 5′-GATATCTCTGTTCCTGTTAATCAACCTC-3′ | 66 |
| 用于WPRE扩增的反向引物 | 5′-GCGGCCCGCGAGCCCGAGGCGAAACAG-3′ | 67 |
pBC1载体用Bam HI和Not I消化以去除山羊β-酪蛋白启动子区和3′基因组DNA区，由此制备载体。此外，克隆至pGEM-T载体的hEPO+WPRE用Bam HI和Not I消化以制备2.9-kb的插入物。将得到的载体和插入物连接以构建pBC1+hEPO-WPRE。为了将猪α-S1-酪蛋白启动子和3′臂区克隆至pBC1+hEPO-WPRE，将5.4kb的启动子序列(SEQ ID NO：3)和4.3kb的3’臂序列(SEQ ID NO：5)通过PCR扩增克隆至pGEM-T载体(Promega，USA)。
用于猪α-S1-酪蛋白启动子序列和3′臂序列的PCR扩增的引物序列显示于下表6。
表6
| 引物 | SEQ ID NO | |
| 用于启动子扩增的正向引物 | 5′-GGATCCGGCTGTCGTTTTGTTATGATT-3′ | 70 |
| 用于启动子扩增的反向引物 | 5′-GGATCCAACTAAAAGGCACAGGGAACT-3′ | 71 |
| 用于3’臂扩增的正向引物 | 5′-GCGGCCGCTTACAATTCAGTGTGGGGAAT-3′ | 72 |
| 用于3’臂扩增的反向引物 | 5′-GCGGCCGCCAGCTTTATTACAGGCAGAGG-3′ | 73 |
通过定点诱变试剂盒(iNtRON)，使用引物(SEQ ID NO：60 toSEQ ID NO：63)在猪α-S1-酪蛋白启动子序列中存在的2个Bam HI位点(GGATCC)中引入点突变。pBC1+hEPO-WPRE载体用Bam HI消化，并用碱性磷酸酶(CIP)处理30分钟以制备载体。此外，包含点突变的猪α-S1-酪蛋白5’启动子DNA的pGEM-T载体用BamHI消化以制备5.5-kb的插入物(SEQ ID NO：3)。将得到的2个限制性内切片段连接以克隆pBC1-猪αS1酪蛋白5′+EPO-WPRE载体。将pBC1-猪αS1酪蛋白5′+EPO-WPRE载体用Not I消化并用CIP处理30分钟以制备载体。此外，包含3’臂DNA的pGEM-T载体用Not I消化以制备4.3-kb的插入物(SEQ ID NO：5)。将得到的2个限制性内切片段连接以构建pBC1-猪αS1酪蛋白+EPO-WPRE载体。
所构建的pBC1-猪αS1酪蛋白+hEPO-WPRE载体的结构显示于图3。
在图3中，PαS1酪蛋白代表猪αS1酪蛋白启动子序列(SEQ IDNO：3)，αS1酪蛋白基因组DNA代表3’臂序列(SEQ ID NO：6)。
hEPO代表人EPO基因，WPRE代表土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件基因。
2Xβ-球蛋白绝缘子和pBR322分别代表绝缘子和来自pBC1载体的载体成分。新霉素代表来自pEGFP-N1载体(Clontech，USA)的新霉素抗性基因。
将如此构建的pBC1-猪αS1酪蛋白+hEPO-WPRE载体保存于韩国典型菌种保藏中心(KCTC)，韩国生物科学和生物技术研究所(KRIBB，Daejon，Korea)，编号KCTC 11325BP。
实施例4：使用猪α-S1-酪蛋白基因构建猪αS1酪蛋白-hEPO敲入载体
1)pGEM-T-hEPO载体的克隆
为了构建通过TK基因选择能够确认将基因正确引入特异性位点的猪α-S1-酪蛋白hEPO敲入载体，制备了2对特异性引物(SEQ IDNO：74至76)，其包含从猪α-S1-酪蛋白基因的外显子2区的起点至起始密码子并能够从起始密码子之后扩增hEPO基因的序列。使用上面制备的包含猪α-S1-酪蛋白外显子2区的引物，从人基因组DNA(Cho-A Pharm Co.，Ltd.；韩国专利号10-0769291的pBC1-hEPO载体)上按照以下条件进行第一轮PCR扩增(PT-200，BIO-RAD)：94℃变性5分钟；之后94℃变性30秒，56℃引物退火30秒和72℃延伸2.5分钟，循环30次。之后，使用第一轮PCR产物作为模板按照以下条件进行第二轮PCR扩增(PT-200，BIO-RAD)：94℃变性5分钟；之后94℃变性30秒，56℃引物退火30秒和72℃延伸2.5分钟，循环30次。
将包含范围从猪α-S1-酪蛋白外显子2区至起始密码子序列的PCR扩增产物2.3kb hEPO基因(SEQ ID NO：68)克隆进pGEM-T载体(Promega，USA)。
用于hEPO的PCR扩增的引物序列显示于下图7。
表7
2)pGEM-T-猪αS1酪蛋白5’臂和pGEM-T-猪αS1酪蛋白3’臂的构建
为了克隆猪α-S1-酪蛋白基因的启动子序列(5’臂)和3’臂序列(3’臂)，构建了SEQ ID NO：77至SEQ ID NO：80的引物，之后从猪基因组DNA上使用构建的引物进行PCR扩增。将得到的5.0kb(SEQ ID NO：4)和4.9kb(SEQ ID NO：6)PCR产物克隆进pGEM-T载体以构建pGEM-T-猪αS1酪蛋白5’臂和pGEM-T-猪αS1酪蛋白3’臂。
表8
| 引物 | SEQ ID NO | |
| 用于扩增启动子的正向引物 | 5′-GTCGACAGCTGCAATGAACATGTGGGTG-3′ | 77 |
| 用于扩增启动子的反向引物 | 5′-GATATCCAAAATAAAAATTTAGGTCTGACAG-3′ | 78 |
| 用于扩增3’臂的正向引物 | 5′-GCGGCCGCATGGCATATGGAAGTTCCCAGG-3′ | 79 |
| 用于扩增3’臂的反向引物 | 5′-CCGCGGTGGGAACTTCCATATGCCAT-3′ | 80 |
3)LoX A neo-hEPO载体的构建
将Lox A neo载体(Gerard Karsenty′s，遗传学和发展系(Department of Genetics and Development)，内科和外科学院(College of Physicians and Surgeons)，哥伦比亚大学，纽约，纽约10032)用限制性内切酶Eco RV和Eco RI限制性内切以制备载体。此外，将克隆的pGEM-T-hEPO用限制性内切酶Eco RV和Eco RI限制性内切以制备2.3-kb的插入物(SEQ ID NO：68)。将得到的2个限制性内切片段连接以构建Lox A neo-hEPO载体。
4)Lox A neo-hEPO-polyA载体的构建
为了将稳定RNA的polyA序列插入Lox A neo-hEPO载体的3’末端，将Lox A neo-hEPO载体用限制性内切酶Eco RI限制性内切并用碱性磷酸酶(New England Biolabs(NEB)，USA)处理30分钟以制备载体。此外，将来自pcDNA3载体(Invitrogen，USA)的牛生长激素(BGH)polyA用限制性内切酶Eco RI限制性内切以制备0.3-kb的插入物。将制备的2个片段连接以构建Lox A neo-hEPO-polyA载体。
5)Lox A neo-hEPO-polyA-5’臂载体的构建
为了将猪α-S1-酪蛋白5’臂插入Lox A neo-hEPO-polyA载体的5’末端，将Lox A neo-hEPO-polyA载体用限制性内切酶Sal I和EcoRV(New England Biolabs(NEB)，USA)限制性内切以制备载体。此外，将克隆的pGEM-T-猪αS1酪蛋白5’臂载体用限制性内切酶Sal I和Eco RV限制性内切以制备5.0-kb的插入物(SEQ ID NO：4)。将得到的2个限制性内切片段连接以构建Lox A neo-hEPO-polyA-5’臂载体。
6)Lox A neo-hEPO-polyA-5’臂-3’臂载体的构建
为了将猪α-S1-酪蛋白3’臂插入Lox A neo-hEPO-polyA-5’臂载体的3’端，将Lox A neo-hEPO-polyA-5’臂载体用限制性内切酶NotI(New England Biolabs(NEB)，USA)限制性内切并用碱性磷酸酶处理30分钟以构建载体。此外，将克隆的pGEM-T-猪αS1酪蛋白3’臂载体用限制性内切酶Not I限制性内切以制备4.9-kb的插入物(SEQ ID NO：6)。将得到的2个限制性内切片段连接以构建Lox Aneo-hEPO-polyA-5’臂-3’臂载体。
7)Lox A neo-hEPO-polyA-5’臂-3’臂-TK载体的构建
为了将单纯疱疹病毒-胸苷激酶(HSV-tk)基因作为凋亡基因插入Lox A neo-hEPO-polyA-5’臂-3’臂载体的3’末端，将Lox Aneo-hEPO-polyA-5’臂-3’臂载体用限制性内切酶Sac II(New EnglandBiolabs(NEB)，USA)限制性内切并用碱性磷酸酶处理30分钟以制备载体。将pBS-TK载体(Gerard Karsenty′s，遗传学和发展系(Department of Genetics and Development)，内科和外科学院(Collegeof Physicians and Surgeons)，哥伦比亚大学，纽约，纽约10032)用限制性内切酶Not I限制性内切以制备2.3-kb的插入物(编码单纯疱疹病毒-胸苷激酶基因)。将得到的2个限制性内切片段连接以构建Lox A neo-hEPO-polyA-5’臂-3’臂-TK载体(猪αS1酪蛋白-hEPO敲入载体)。
构建的猪αS1酪蛋白-hEPO敲入载体的结构显示于图4。在图4中，猪αS1酪蛋白5’臂代表猪αS1酪蛋白启动子(SEQ ID NO：4)，猪αS1酪蛋白3’臂代表3’臂(SEQ ID NO：6)。
hEPO代表人EPO基因，polyA代表聚腺苷酸信号编码基因，Neo盒代表作为正选择基因的新霉素抗性基因，PGK启动子代表磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子，TK代表作为负选择基因的单纯疱疹病毒-胸苷激酶(HSV-tk)基因，来自pBS-TK载体。
如此构建的猪αS1酪蛋白-hEPO敲入载体保存于韩国典型菌种保藏中心(KCTC)，韩国生物科学和生物技术研究所(KRIBB，Daejon，Korea)，编号KCTC 11326BP。
实施例5：转化细胞系的制备和hEPO表达的鉴定
1)外源基因转染
乳腺小鼠细胞(HC11，动物科学国家研究所(NationalInstitute ofAnimal Science)，Korea)、小鼠肌肉细胞(C2C12，ATCC，USA)、人肝癌细胞(HepG2，ATCC，USA)、人肾细胞(Caki，ATCC，USA)、人白血病细胞(U937，ATCC，USA)、大鼠脑神经胶质瘤细胞(C6，ATCC，USA)等等按照以下条件培养于培养箱中：
HC11-RPMI 1640(Gibco，USA)，10％胎牛血清(FBS，HyClone，USA)，1％青霉素链霉素(HyClone，USA)，5μg/ml胰岛素(Sigma，USA)，39℃，5％CO2；
C2C12和HepG2-DMEM(Gibco，USA)，10％FBS，1％青霉素链霉素，37℃，5％CO2；
Caki-McCoy′s 5A(Gibco，USA)，10％FBS，1％青霉素链霉素，37℃，5％CO2；
U937-RPMI 1640(Gibco，USA)，10％FBS，1％青霉素链霉素，37℃，5％ CO2.
将培养至约80-90％汇合的各细胞系用胰酶(HyClone)从细胞培养皿上分离，之后以1500rpm离心5分钟，之后去除上清。细胞用血球计数器(Reichert，USA)计数，之后在60-mm培养皿中以5×105细胞/皿的密度在培养箱中培养16-20小时。通过在各60-mm培养皿中使用lipofectamine(Invitrogen，USA)引入在实施例2和3中制备的载体各4μg进行外源基因的转染。在HC 11细胞系的情况下，外源基因转染后4小时，向细胞中加入5μg/ml胰岛素(Sigma，USA)，5μg/ml催乳素(Sigma，USA)and 5μg/ml氢化可的松(Sigma，USA)。
2)逆转录(RT)
外源基因转染后24小时，使用easy-BLUE总RNA提取溶液(iNtRON Biotechnology，Korea)从细胞中纯化RNA。使用4μg纯化的RNA和superscript III逆转录酶(Invitrogen，USA)进行逆转录。在这里，为了避免作为外源基因引入的DNA的污染，用DNase I进行处理。在逆转录酶中，将1μl 10pM oligo dT和1μl 10mMdNTP加入RNA，之后允许在65℃处理5分钟，接着在冰上反应1分钟。之后向其中加入4μl 5X缓冲液，1μl 0.1M DTT和1μl逆转录酶，之后允许在50℃处理60分钟，接着在70℃反应15分钟，由此合成cDNA。
3)实时PCR
使用高度敏感性的实时PCR试验分析各细胞系中的EPO表达。使用cDNA(使用逆转录酶制备的)和SYBR Green qPCR试剂盒(FINNZYMES，Finland)和DNA engine Opticon 2(BIO-RAD，USA)按照以下条件进行实时PCR：94℃变性5分钟；之后94℃变性30秒，56℃引物退火30秒和72℃延伸60秒，循环50次，之后测量荧光。荧光数值用载体的Neo基因和细胞的β肌动蛋白基因校准。使用GeneExMacro 3.0(BIO-RAD)程序分析实时PCR的结果。用于以上PCE扩增的引物(SEQ ID NO：84至SEQ ID NO：91)显示于下表9。
表9
| 引物 | SEQ ID NO | |
| 用于扩增EPO的正向引物 | 5′-CAAGGAGGCCGAGAATATCA-3′ | 84 |
| 用于扩增EPO的反向引物 | 5′-AAGTGTCAGCAGTGATTGTTCG3′ | 85 |
| 用于扩增Neo的正向引物 | 5′-GCTACCCGTGATATTGCTGAA-3′ | 86 |
| 用于扩增Neo的反向引物 | 5′-CAACACCGTGCGTTTTATTCT-3′ | 87 |
| 用于扩增人beta肌动蛋白的正向引物 | 5′-CGTGGGCCGCCCTAGGCACCA-3′ | 88 |
| 用于扩增人beta肌动蛋白的反向引物 | 5′-TTGGCCTTAGGGTTCAGGGGGG-3′ | 89 |
| 用于扩增小鼠beta肌动蛋白的正向引物 | 5′-TGTGATGGTGGGAATGGGTCAG-3′ | 90 |
| 用于扩增小鼠beta肌动蛋白的反向引物 | 5′-TTTGATGTCACGCACGATTTTCC-3′ | 91 |
实时PCR的结果显示于图5。
图5显示了在转染了pBC1-猪αS1酪蛋白载体和pBC1-猪αS1酪蛋白+hEPO-WPRE载体的乳腺细胞系和其他组织细胞系中hEPO表达的结果。作为对照，将pBC1载体(Invitrogen)和pBC1-hEPO-WPRE载体(Cho-A Pharm Co.，Ltd.；韩国专利号10-0769291)引入相同的细胞。在图5中，x轴表示细胞系，y轴表示hEPO的表达相对各pBC1-猪αS1酪蛋白表达的比率，pBC1载体的值设为1。在图5中，pPAC表示实施例2的pBC1-猪αS1酪蛋白载体，pPAC-hEPO表示pBC1-猪αS1酪蛋白+hEPO-WPRE载体。此外，pBC1表示Invitrogen公司的载体，其具有山羊启动子并允许乳腺特异性表达，pBC1-hEPO表示pBC1-hEPO-WPRE。
如在图5中所看见的，hEPO在小鼠乳腺细胞系HC11中表达最高，在人肝癌细胞系HepG2和小鼠肌肉细胞系C2C12中低表达，在其他组织细胞中不表达。这提示了可在转染了本发明载体的乳腺细胞中制备靶蛋白。
实施例6：通过显微注射制备动物胚胎，使用动物胚胎构建转基因动物，和在转基因动物中制备EPO
1)基因的纯化
在实施例中制备的载体用SalI(NEB，R0138)线性化，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Q-28706)从线性化载体中纯化DNA并在注射缓冲液(10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，pH 7.4)中以2ng/μl终浓度洗脱。以5μl的等份试样贮存于-20℃。
2)从超排卵的雌性小鼠中收集受精的胚胎
8周大C57BL/6雌性小鼠(Orient Bio，Korea)通过腹腔注射5IU怀孕母马血清促性腺激素(PMSG；Intervet，Netherlands)和46小时后5IU人绒毛膜促性腺激素(hCG，Intervet)诱导超排卵。光照控制为7AM至7PM的12小时循环，在11AM和9AM分别经腹腔注射PMSG和hCG。注射hCG后，将该小鼠与同株的雄性交配。第二天检查雌鼠的阴栓，其表示交配成功，之后切除输卵管。为从卵丘细胞中分离卵母细胞，将切除的输卵管转移至含有0.1％透明质酸酶(Sigma，H3884)的M2培养基(Sigma，M7167)中，之后使壶腹破裂。一段时间后，只收集卵母细胞被排除的胚胎，在新鲜的M2培养基中清洗，转移至M16培养基(Sigma，M7292)中，并在5％CO2培养箱中培养直到显微注射。
3)基因的显微注射
将少量M2培养基滴在腔式载玻片(Nunclon，Denmark)上，之后用油覆盖以避免蒸发，由此准备用于显微注射的平皿。之后，将收集的胚胎置于平皿中。在用于胚胎显微操作的OLYMPUS 1X71TH4-200倒置显微镜上进行胚胎的显微注射。使用微量上样器(Eppendorf，Hamburg，Germany)将上面章节1)中纯化的基因上样至连接Femtojet自动注射器(Eppendorf)的Femtotip注射移液管(Eppendorf)中。为准备显微注射，通过负压将胚胎吸在握住的移液管中，聚焦显微镜以定位原核。当移液器的尖端似乎在原核内后，通过Femtojet自动注射器施加注射压力。当看见原核膨胀后，将注射移液管从卵中撤出。显微注射后，将存活的卵转移至M16培养基并在5％CO2培养箱中于37℃培养。
4)胚胎的转移
显微注射前1天，6周大雌性BDF-1小鼠(Orient Bio，Korea)与同株的去势雄性交配以引发假孕。在试验前，检查雌性小鼠的阴栓以确认假孕。已诱导假孕的雌性小鼠通过腹腔注射阿佛丁(Sigma)麻醉，之后在侧腹和连接胸的腿之间的部分进行切割，拉出卵巢脂肪以分离卵巢和输卵管。用外科手术镊固定卵巢脂肪，使卵巢和输卵管周围的包囊破裂，将转移移液管插入输卵管的入口，由此转移卵。此处，将胚胎转移至两个输卵管。此处使用的转移移液管包含4个标记球以确认转移，15个显微注射胚胎和1个最终标记球。
5)基因转染的检查
胚胎转移3周生出后代后，切掉后代的尾巴并使用DneasyBlood&Tissue试剂盒(Qiagen，Q-69506)从中提取基因组DNA。为了鉴定转染了猪αS1酪蛋白基因的转基因小鼠，使用扩增提取的DNA的EPO-WPRE基因区和WPRE-3’臂基因区的引物，按照以下条件进行PCR扩增(PT-200，BIO-RAD)：94℃变性5分钟；之后94℃变性30秒，56℃引物退火30秒和72℃延伸30秒，循环35次。用这种方法鉴定了猪α-S1-酪蛋白基因的转染。
用于EPO-WPRE和WPRE-3’臂的PCR扩增的引物序列显示于下表10。
表10
| 引物 | SEQ ID NO | |
| 用于扩增EPO-WPRE的正向引物 | 5′-AACTCTTCCGAGTCTACTCCA-3′ | 92 |
| 用于扩增EPO-WPRE的反向引物 | 5′-CTCCTCATAAAGAGACAGCAAC-3′ | 93 |
| 用于扩增WPRE-3’臂的正向引物 | 5′-TTCCTGTTAATCAACCTCTGG-3′ | 94 |
| 用于扩增WPRE-3’臂的反向引物 | 5′-TACCAAAGGCCATAATTGTGG-3′ | 95 |
PCR扩增的结果显示于图6。图6显示了为选择用实施例3的pBC1-猪αS1酪蛋白+hEPO-WPRE表达载体转化的小鼠而进行的PCR结果。在图6中，EPO-WPRE表示EPO-WPRE基因区的结果，WPRE-3’臂表示EPO-αS13’臂基因区的结果。“M”表示大小标记，“V”表示pBC1-猪-αS1酪蛋白-EPO-WPRE载体，“N”表示作为阴性对照的正常小鼠基因组DNA，数字表示个体。
基于以上结果，确定基因是否引入，由此选择转基因小鼠。
6)转基因实验动物的繁殖和基因转移的检查
在确认转染了猪α-S1-酪蛋白基因的小鼠中，将雌性与正常雄性在6周后(达到性成熟)交配以产生后代。以如上面章节5)相同的方式检查后代的外源基因转染。
图7显示了为选择用实施例3的pBC1-猪αS1酪蛋白+hEPO-WPRE表达载体转化的小鼠而进行的PCR结果。在图7中，EPO-WPRE表示EPO-WPRE基因区的结果，WPRE-αS1表示EPO-αS1 3’臂基因区的结果。“M”表示大小标记，“V”表示pBC1-猪-αS1酪蛋白-EPO-WPRE载体，“N”表示作为阴性对照的正常小鼠基因组DNA，“1-1”至“1-6”表示转基因小鼠的后代。
7)转基因泌乳小鼠中EOP的存在和含量分析
泌乳后7天，分离后代，2小时后对泌乳小鼠腹腔注射10 IU奥施康定(oxycotin)。之后在按摩乳腺的同时收集奶。对收集的奶进行蛋白质印迹试验。为此，将奶上样于12％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶中(SDS-PAAGE)，之后转移至PVDF膜上(Millipore，USA)，接着在5％脱脂奶粉封闭溶液中孵育。将抗人EPO抗体(1∶1,000，hEPO抗兔抗体，R&D systems目录号AB-286-NA，货号HX01，USA)根据制造商的说明书加到膜上，接着在室温孵育1小时。之后，将膜用TBST缓冲液(Tris缓冲的盐缓冲液，0.01％tween-20)洗30分钟，之后向其加入过氧化物酶标记的抗兔抗体(1∶3,000；GE healthcare，目录号NA9340V，货号348424，GB)，接着在室温孵育1小时。接下来，将膜用TBST缓冲液清洗并在X光胶片上曝光。
蛋白质印迹试验的结果显示于图8。图8显示了使用转基因泌乳小鼠的奶进行的蛋白质印迹试验结果。在图8中，“1至4”表示EPO标准品(Calbiochem，USA)，5和6表示奶样品。
作为结果，观察到在奶中表达了具有32KDa分子量的蛋白质。
此外，为了测定泌乳小鼠奶中的hEPO浓度，使用ELISA试剂盒(Stem Cell Technology)根据制造商的说明书进行ELISA(酶联免疫吸附法)。作为结果，发现在奶中表达的hEPO浓度为50,000-200,000 IU/ml。
工业实用性
从上面的描述显而易见，本发明的猪α-S1-酪蛋白基因可用于制备猪αS1酪蛋白，猪α-S1-酪蛋白基因启动子促进了靶蛋白的乳腺特异性表达。相应的，用应用本发明启动子的表达载体转染的转基因动物同样允许靶蛋白在奶中的高浓度分泌，因此这将对医学和药学上有价值的有用蛋白质的制备提供益处。
Claims (11)
1.由SEQ ID NO:2序列组成的猪α-S1-酪蛋白基因启动子。
2.表达载体，其包含选自SEQ ID NO:2序列和SEQ ID NO:3序列的一或多条序列。
3.权利要求2的表达载体，其中载体另外包含选自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的一或多条序列。
4.权利要求3的表达载体，其中表达载体另外包含选自选择标记基因、绝缘子和WPRE（土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件）的一种或多种。
5.权利要求2的表达载体，其中载体具有图2的质粒结构图。
6.权利要求5的表达载体，其中载体是以编号KCTC11324BP保存的pBC1-猪αS1酪蛋白。
7.权利要求2至4中任一项的表达载体，其中载体另外包含在启动子序列3’末端的靶蛋白编码序列。
8.权利要求7的表达载体，其中靶蛋白为人EPO（红细胞生成素）。
9.权利要求8的表达载体，其中载体具有图3的质粒结构图。
10.权利要求9的表达载体，其中载体为以编号KCTC11325BP保存的pBC1-猪αS1酪蛋白+hEPO-WPRE。
11.用权利要求2至4中任一项的表达载体转化的动物体细胞。
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|---|---|---|---|---|
| WO2010002082A1 (en) * | 2008-06-30 | 2010-01-07 | Cho-A Pharm Co., Ltd. | A gene of porcine beta-casein, a promoter of the same and the use thereof |
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| CN102653773B (zh) * | 2012-04-26 | 2015-01-14 | 天津农学院 | 牛乳腺特异性表达载体pBC-αs1及制备方法 |
| KR101938956B1 (ko) | 2016-05-31 | 2019-01-15 | 제주대학교 산학협력단 | 신경세포 특이적으로 발현하는 돼지 Thy1 유전자 프로모터 |
| KR101928659B1 (ko) * | 2017-06-19 | 2018-12-13 | 서울대학교병원 | Dna 변형 유도 단백질 복합체 및 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터 |
| CN110257392A (zh) * | 2019-06-28 | 2019-09-20 | 西安医学院 | 转录后水平低氧调控基因、应用及其调控方法 |
| AU2021353004A1 (en) | 2020-09-30 | 2023-04-13 | Nobell Foods, Inc. | Recombinant milk proteins and food compositions comprising the same |
| US10947552B1 (en) | 2020-09-30 | 2021-03-16 | Alpine Roads, Inc. | Recombinant fusion proteins for producing milk proteins in plants |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5959171A (en) * | 1994-08-17 | 1999-09-28 | Pharming B.V. | Method for the production of biologically active polypeptides in a mammal's |
| WO2002072024A2 (en) * | 2001-03-12 | 2002-09-19 | Progenetics Llc | Transgenic proteins from multi-gene systems, methods, compositions, uses and the like relating thereto |
Family Cites Families (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0279582A3 (en) | 1987-02-17 | 1989-10-18 | Pharming B.V. | Dna sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion |
| US4873316A (en) | 1987-06-23 | 1989-10-10 | Biogen, Inc. | Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals |
| CA2157931A1 (en) | 1993-03-12 | 1994-09-15 | Clague P. Hodgson | Improved vectors for gene therapy |
| US5610053A (en) | 1993-04-07 | 1997-03-11 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | DNA sequence which acts as a chromatin insulator element to protect expressed genes from cis-acting regulatory sequences in mammalian cells |
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| KR100232640B1 (ko) | 1997-06-03 | 1999-12-01 | 박호군 | 에리트로포이에틴 (epo)을 생산하는 세포주, 그의 제조방법 및 이를 이용한 epo의 제조방법 |
| US6136597A (en) | 1997-09-18 | 2000-10-24 | The Salk Institute For Biological Studies | RNA export element |
| KR100434729B1 (ko) | 1998-03-18 | 2004-11-03 | 주식회사 엘지생명과학 | 천연 추출물을 첨가하여 중국햄스터 난소 유래세포에서 에리스로포이에틴의 생산 증대방법 |
| US6436707B1 (en) | 1998-03-27 | 2002-08-20 | Lexicon Genetics Incorporated | Vectors for gene mutagenesis and gene discovery |
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| JP2001197846A (ja) | 2000-01-18 | 2001-07-24 | Ys New Technology Kenkyusho:Kk | 免疫寛容動物の作製方法 |
| DK1252184T3 (da) | 2000-01-31 | 2008-02-04 | Pharming Intellectual Pty Bv | Human C1-inhibitor produceret i mælk af transgene dyr |
| KR100358754B1 (ko) | 2000-02-14 | 2002-11-07 | 대한민국 | 인간의 조혈촉진제 생산을 위한 형질전환 돼지를 생산하는방법 및 그 형질전환 돼지 |
| CN1283785C (zh) | 2002-05-20 | 2006-11-08 | 上海杰隆生物工程股份有限公司 | 利用转基因动物乳腺生产人促红细胞生成素的方法 |
| CU23102A1 (es) | 2002-10-21 | 2005-12-20 | Ct Ingenieria Genetica Biotech | Método para la producción de proteínas recombinantes en la glándula mamaria de mamíferos no transgénicos |
| KR100552634B1 (ko) | 2002-11-04 | 2006-02-20 | 조아제약주식회사 | 돼지의 유로플라킨 ⅱ 유전자의 프로모터 및 이를 이용한유용단백질의 생산 방법 |
| US7416886B2 (en) | 2002-11-04 | 2008-08-26 | Cho-A Pharm Co., Ltd. | Porcine uroplakin II promoter and the production method of useful proteins using said promoter |
| KR20040101793A (ko) | 2003-05-27 | 2004-12-03 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 사람 에리트로포이에틴을 생산하는 형질전환 복제소 및이의 생산 방법 |
| JP2005160359A (ja) | 2003-12-01 | 2005-06-23 | Rikogaku Shinkokai | Ｓｉｎｅの挿入多型を指標とした鯨種判別方法 |
| US7667089B2 (en) * | 2004-04-09 | 2010-02-23 | National Chung Hsing University | Transgenic mammal secreting B-domain deleted human FVII in its milk |
| AU2006242842B2 (en) * | 2005-05-02 | 2011-12-08 | Mileutis Ltd. | Pharmaceutical compositions comprising casein derived peptides and methods of use thereof |
| US7902352B2 (en) | 2005-05-06 | 2011-03-08 | Medtronic, Inc. | Isolated nucleic acid duplex for reducing huntington gene expression |
| KR100769291B1 (ko) | 2006-02-13 | 2007-10-24 | 조아제약주식회사 | 유선 특이적 인간 에리트로포이에틴 발현 벡터, 이를이용한 형질전환 동물 및 이를 이용한 인간에리트로포이에틴의 생산 방법 |
| WO2007131180A2 (en) | 2006-05-04 | 2007-11-15 | Wayne State University | Restoration of visual responses by in vivo delivery of rhodopsin nucleic acids |
| WO2008075911A1 (en) | 2006-12-20 | 2008-06-26 | Avixgen Inc. | Vector for expressing nc protein of hiv and method for producing nc protein using the same |
| CN101855352A (zh) | 2007-08-08 | 2010-10-06 | Cho-A制药株式会社 | 乳腺特异性人促红细胞生成素表达载体、转基因动物和利用其产生人促红细胞生成素的方法 |
| WO2010002082A1 (en) | 2008-06-30 | 2010-01-07 | Cho-A Pharm Co., Ltd. | A gene of porcine beta-casein, a promoter of the same and the use thereof |
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5959171A (en) * | 1994-08-17 | 1999-09-28 | Pharming B.V. | Method for the production of biologically active polypeptides in a mammal's |
| WO2002072024A2 (en) * | 2001-03-12 | 2002-09-19 | Progenetics Llc | Transgenic proteins from multi-gene systems, methods, compositions, uses and the like relating thereto |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Accession No..EU213063.《NCBI，Genbank》.2008, * |
| C.W.BEATTIE.The sequence of porcine aSl-casein cDNA: evidence for protein variants generated by altered RNA splicing.《Animal Genetics》.1992,第23卷(第3期),第283-288页. * |
| L.J.ALEXANDER & C.W.BEATTIE.The sequence of porcine aSl-casein cDNA: evidence for protein variants generated by altered RNA splicing.《Animal Genetics》.1992,第23卷(第3期),第283-288页. |
| L.J.ALEXANDER & * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |