KR100232640B1 - 에리트로포이에틴 (epo)을 생산하는 세포주, 그의 제조방법 및 이를 이용한 epo의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 에리트로포이에틴 (erythropoietin, 이하 'EPO'라고 약칭함)을 생산하는 세포주 및 이를 이용한 EPO 의 제조방법에 관한 것이다.

보다 상세하게는, 본 발명은 dhfr (dihydrofolate reductase)유전자 및 EPO 유전자를 포함한 발현 벡터로 형질전환된 EPO 를 생산하는 세포주를 낮은 메토트렉세이트 (Methotrexate, MTX) 농도에서 장기 계대배양하여 선별한 EPO 를 효율적으로 생산하는 세포주, 그의 제조방법 그리고 본 발명의 세포주를 이용하여 고역가의 EPO 를 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

에리트로포이에틴(EPO)을 생산하는 세포주, 그의 제조방법 및 이를 이용한 EPO 의 제조방법

본 발명은 에리트로포이에틴 (erythropoietin, 이하 'EPO'라고 약칭함)을 생산하는 세포주 및 이를 이용하여 EPO 를 제조하는 방법에 관한 것이다.

보다 상세하게는, 본 발명은 dhfr (dihydrofolate reductase) 유전자 및 EPO 유전자를 포함한 발현 벡터로 형질전환된 EPO 를 생산하는 세포주를 낮은 메토트렉세이트 (Methotrexate, MTX) 농도에서 장기 계대배양하여 선별한 EPO 를 효율적으로 생산하는 세포주, 그의 제조방법 그리고 본 발명의 세포주를 이용하여 고역가의 EPO 를 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

에리트로포이에틴 (EPO)은 골수 내에서 생성된 적아구를 적혈구로 분화시키는 당단백질로서, 적혈구 형성 자극인자라고도 하는 166개의 아미노산으로 구성되고 탄수화물이 결합된 산성 당단백질 호르몬이다. EPO 는 건강한 사람의 경우 보통 혈액 내에 10-20 mU/ml 가 존재하며, 사고 등으로 다량 출혈이 유발되어 인체 내 산소 농도가 감소하는 경우에는 EPO 의 생산이 자극되어 그 생산성이 최소한 1천배까지 증가한다. 또한 신장에 이상이 있는 경우에는 EPO 의 생산이 감소하여 극심한 빈혈을 초래하기도 한다 (Jacobson et al., Nature, 179, 633, 1957).

따라서 EPO 는 1989년에 혈우병, 생리적 빈혈 및 만성 신부전증 등에 사용할 수 있는 악성 빈혈치료제로 승인되었고, 1991년에는 아자사이티딘 (AZT)을 사용하는 후천성 면역결핍증 환자에 사용할 수 있는 악성 빈혈 치료제로서 허가되었다. 이외에도 EPO 는 약물 치료를 받고 있는 류마티스성 관절염 환자 또는 암 환자에서 빈혈증을 치료하고, 수술전후에 수혈을 대체하는 등에 이용되고 있으며, 그 적용 범위는 점점 확대되는 추세에 있다.

지금까지 임상적으로 사용된 EPO 는 주로 양의 혈장 (미국특허 3,033,753호), 사람의 오줌 (미국특허 3,865,801호) 등에서 추출된 것으로 그 양이 충분하지 않아 널리 이용되지 못하였다. 따라서 EPO 를 유전공학적 방법으로 생산하고자 많은 시도들이 이루어 졌는데, 구체적으로 사람 EPO 유전자의 cDNA가 클로닝되고 (미국특허 4,703,008호), 이 유전자를 포유동물 세포주인 CHO 세포주 유래의 dhfr 변이주 (ATCC CRL 9096) 등에 형질전환시켜 순수한 EPO 를 생산하는 방법 등이 시도되었다 (Jacobs et al., Nature, 313, 806, 1985; Lin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 7580, 1985).

상기에서 형질전환된 CHO 세포는 메토트렉세이트 (MTX)를 첨가한 배지에 단계적으로 적응시켜 EPO 유전자를 증폭시킴으로써 EPO 의 생산량을 효율적으로 증가시킬 수 있다 (Malik et al., DNA and Cell Biol., 11, 453, 1992). 구체적으로 기린-암젠사의 특허 (국제특허공개 85-2610호)는 1μM MTX 농도에서 적응한 세포주로부터 21μg/ 10⁶세포/ 48시간 농도로 EPO 를 생산하였다. 그러나 1μM MTX 농도 까지 단계별로 세포를 적응시키기 위해서는 6개월 이상의 오랜 배양 기간이 필요하고, 세포의 성장이 저하되는 부작용이 있으며 EPO 를 대량 생산하는데 비용도 많이 든다.

한편 본 발명자들은 낮은 MTX 농도의 배양액을 사용하여 CHO 세포주로부터 외래 유전자를 대량으로 발현시키기 위하여, SV40 프로모터의 128-270 부위를 제거하여 dhfr 유전자를 연결하고 상기 세포주에 형질전환시킴으로써 20mM MTX 농도에서도 외래 유전자를 대량 발현할 수 있는 세포주를 개발하였다. 구체적으로 플라스미드 벡터 pRc/CMV 에 dhfr 유전자를 삽입하여 발현 벡터 pCMV-dhfr (KCTC 8671 P)를 얻고, 상기 발현 벡터에 EPO 유전자를 삽입하여 발현 벡터 pEpoG-dhfr (KCTC 0181 P)또는 pEpoC-dhfr (KCTC 0180 P)를 제조하였다. 이들 발현 벡터를 dhfr 변이 CHO 세포주에 형질전환시켜 각각 낮은 MTX 농도에서도 유전자를 증폭할 수 있는 g2 (KCTC 0183 P)와 EC1 (KCTC 0182 P)세포주를 개발하였다 (한국 특허출원 제 95-22441 호). 또한 상기 g2 또는 EC1 세포주에서 유래한 g2-20과 EC1-20 세포주를 선별하여 EPO 생산성을 확인한 결과 각 세포주의 생산성은 각각 23μg/ 10⁶세포/ 24시간과 45μg/ 10⁶세포/ 24시간으로 나타났다.

이 때 상기 EC1-20 세포주의 EPO 생산성은 종래의 기린-암젠사에서 개발한 1μM MTX 농도에 적응한 세포주의 생산성보다 높음을 확인할 수 있었다.

이에 더하여 본 발명자들은 더욱 효율적으로 EPO를 생산하는 세포주를 개발하기 위하여, 상기에서 얻은 EC1-20 세포주를 낮은 MTX 농도의 세포 배지를 이용하여 세포 배양, 세포 서브클로닝, 세포 클론 팽창의 과정을 반복하는 장기 계대배양을 통하여 EPO 를 효율적으로 생산하는 세포주 EC1-71-1C8 를 선별하고 이를 이용하여 고역가의 EPO 를 대량 생산함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 에리트로포이에틴을 효율적으로 생산하는 세포주 EC1-71-1C8 (수탁번호 : KCTC 0296 BP)를 제공함에 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 낮은 MTX 농도의 세포 배지를 이용하여 세포 배양, 세포 서브클로닝, 세포 클론 팽창의 과정을 반복하는 장기 계대배양을 통하여 EPO 를 효율적으로 생산하는 세포주를 선별하는 방법을 제공함에 그 목적이 있다.

이 때 MTX 농도는 20 nM 인 것이 바람직하고, 계대배양은 5개월 이상 하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 세포주 EC1-71-1C8 를 배양하여 고역가의 EPO 를 대량으로 얻는 제조방법을 제공한다.

도 1은 기존의 세포주 EC1, EC1-20 와 본 발명의 EC1-71-1C8 세포주에서 EPO 생산성을 비교한 것이고,

도 2은 기존의 세포주 EC1, EC1-20 와 본 발명의 세포주 EC1-71-1C8 에서 생산된 EPO mRNA 양을 나타낸 것이고,

도 3a는 기존의 세포주 EC1, EC1-20 및 본 발명의 세포주 EC1-71-1C8 를 각각〔S³⁵〕-방사성 메치오닌으로 표지시켜 10분, 20분, 60분이 경과한 다음 세포 상층액으로 분비된 EPO 양을 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동으로 나타낸 것이고,

도 3b는 기존의 세포주 EC1, EC1-20 및 본 발명의 세포주 EC1-71-1C8 를 각각〔S³⁵〕-방사성 메치오닌으로 표지시켜 0분, 10분, 20분, 60분이 경과한 다음 세포내에 존재하는 EPO 양을 웨스턴 블럿으로 나타낸 것이고,

도 4는 본 발명의 방법으로 분리·정제된 EPO 를 15% SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동 (A)하여 웨스턴 블럿팅 (B)한 결과를 나타낸 것이고,

도 5는 본 발명의 방법으로 정제된 EPO 의 생물학적 활성을 조사하여 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 EPO 를 효율적으로 대량 생산하는 세포주를 제공한다. 구체적으로 본 발명은 고역가의 EPO 를 생산하는 세포주 EC1-71-1C8 (수탁번호 : KCTC 0296 BP)을 제공한다.

이미 보고된 바 있는 EC1-20 세포 (한국 특허출원 제 95-22441 호, 하기 참조예에서 그 제조방법을 기술한다)를 투석된 혈청, 낮은 농도의 G418 이 첨가된 배지에서 일정한 간격으로 배지를 교환하면서 약 1달 동안 배양한 다음 생쥐 항-인간 EPO 항체 등을 이용하여 FACScan 으로 분석한 결과, EPO 가 생산되는 수준이 다른 다양한 세포들이 섞여 있음이 관찰된 바 있다. 이들 결과는 유전자 증폭을 이용하는 발현 벡터를 포함하는 세포주를 MTX 등을 포함하는 배지와 같이 선택조건 (selection pressure)을 준 상태에서 장기간 배양하면, 각 세포가 MTX 농도에 적응하는 정도가 다양함을 나타낸다. 그 결과 어떤 세포는 유전자 증폭을 상대적으로 많이 하여 EPO 를 더 많이 생산하고, 어떤 세포는 오히려 증폭된 유전자를 소실하여 EPO 의 생산성이 줄어든다

<참고예 1> 발현 벡터 pEpoG-dhfr 및 pEpoC-dhfr 의 제조

플라스미드 벡터 pCMV-dhfr 를 제한효소 HindⅢ 와 ApaI 으로 절단하고 크레노 (klenow)로 수식하여 EPO 의 게놈 유전자 EpoG 를 첨가하여 발현 벡터 pEpoG-dhfr 를 얻었다. 또한, 플라스미드 벡터 pCMV-dhfr 에 EPO 의 cDNA 유전자 EpoC 를 연결하여 발현 벡터 pEpoC-dhfr 를 얻었다.

<참고예 2> ECl 세포주의 제조

발현 벡터 pEpoG-dhfr 또는 pEpoC-dhfr로 dhfr 변이 CHO 세포주 (ATCC CRL 9096) 세포에 형질전환시켜 인간 EPO 생성능력을 가진 형질전환체 ECl 을 얻었다. 이 세포들을 MTX를 함유하는|A-MEM 배지에서 배양하였다.

<참고예 3> dhfr 변이 CHO 세포주의 배양

배양액 - 송아지 혈청 10%가 첨가된 DMEM/F12 배지(기브코사 제품)에 하이폭산틴 (hypoxanthin) 10μg/ml, 티미딘 (thymidine) 10μg/ml, 글리신 (glycine) 50μg/ml, 글루타민 (glutamine) 587μg/ml, 포도당 (glucose) 4.5mg/ml, 페니실린-스트렙토마이신 (penicillin-streptomycin) 100IU/ml (시그마사 제품)를 첨가하였다 - 에 탄산개스가 5% 유지되도록 37℃에서 계대배양한 dhfr 변이 CHO 세포를 원심분리기를 이용하여 회수하였다. 지름 6cm의 접시에 5×10⁵세포/ml 되도록 접종하고, 다음날 OPTI MEM I (기브코사 제품)으로 2회 세척하였다.

<참고예 4> 형질전환된 ECl 세포주의 제조

플라스미드 5μg을 OPTI MEM I 1.5ml 에 희석하고, 동량으로 희석한 리포펙틴 (Lipofectin,기브코사 제품) 20μg을 혼합하여 10분간 방치한 뒤, 준비한 CHO 세포 위에 골고루 넣어주었다. 37℃, 5% 탄산개스 항온기에서 6시간 배양하고, 송아지 혈청 20%를 포함하는 DMEM/F12 배지를 3ml 첨가하고, 24시간 더 배양하였다. 0.25% 트립신 (기브코사 제품)을 처리하고, 원심분리하여 얻어진 세포를 웰당 2×10⁴세포 되도록 96웰 플레이트에 분주하였다. 투석된 혈청 (기브코사 제품 26300-020) 10%, G418 550μg/ml을 함유하는 |A-MEM 배지 (기브코사 제품)를 첨가하여 배양하고 4일 간격으로 배지를 갈아주면서 2주간 배양하였다. 생존한 각 클론들을 수십개 얻었고, 각 클론의 EPO 생산능력을 측정하기 위하여 생쥐 항-인간 EPO 항체 (ATCC CRL8164)의 하이브리도마의 배양액을 본 연구실에서 분리 $정제한 것임)와 과산화효소와 결합된 염소 항-생쥐 IgG 항체 (Sigma사 제품)를 이용하여 간접 이라이자 방법 (Engvall & Perlman, J. Immunol. 109, 129, 1972)을 수행한 결과, 상기 발현 벡터 pEpoG-dhfr 또는 pEpoC-dhfr 를 함유한 형질전환체들 중에서 EPO 를 가장 많이 생산하는 세포주 ECl 을 선별하였다.

선별한 세포주 ECl 각각을 1×10⁶개 취하여 지름 10cm 접시에 옮기고, 메토트렉세이트(MTX) 20nM 을 함유하는 |A-MEM 배지에서 4일 간격으로 배지를 교환하면서 2주간 배양하였다. 이 농도의 MTX 에서 적응한 세포들을 각각 ECl-20 이라 명명하였다. 이 ECl-20 의 EPO 생산량을 측정한 결과, 45|Lg/10⁶세포/24시간의 특이적 생산성을 나타내었다.

따라서, 본 발명은 상기 EC1-20 세포주 (KCTC 0182 BP)를 장기간 계대배양하여 세포를 낮은 MTX 농도에 적응시킨 다음, 세포 클론들을 서브클로닝 (subcloning)하여 EPO 를 효율적으로 대량 생산하는 세포주를 선별한다. EC1-20 세포주는 5개월 이상 장기 계대배양하여 MTX 농도에 적응시키는데, 구체적으로 20 nM MTX 가 들어있는 배지에서 2주 배양- 세포 서브클로닝 (cell subcloning)- 2주 이상의 세포 클론 팽창 (cell clone expansion)- 2주 배양- 세포 서브클로닝 (cell subcloning)- 2주 이상의 세포 클론 팽창 (cell clone expansion)- 2주 배양- 세포 클로닝 (cell cloning)의 과정을 반복하여 EPO의 생산성이 높은 EC1-71-1C8 세포주를 분리한다. 본 발명의 EC1-71-1C8 세포주는 EPO mRNA 수준, EPO 의 생산량, EPO 의 분비속도 등이 월등히 향상된 것으로 나타난다.

본 발명의 선별방법은 단순히 세포를 서브 클로닝하는 것과는 다르고, 기존에 알려진 MTX 농도를 높이면서 세포를 MTX 에 적응시키는 방법과도 매우 다른 새로운 방법이다.

또한, 본 발명의 EC1-71-1C8 세포주로부터 생산된 EPO 를 젤 여과법 (Gel filtration) 등에 의하여 분리·정제한 다음 그 결과를 웨스턴 블럿팅 (Western blotting)과 SDS-폴리아크릴아미이드 젤 전기영동 (PAGE) 등으로 분석하고 (도 4 참조), 그의 생물학적 활성을 검증한다 (도 5 참조).

본 발명의 EC1-71-1C8 세포주는 한국과학기술연구원 생명공학연구소 부설 유전자은행에 1997년 1 월 18 일자로 기탁하였다 (수탁번호 : KCTC 0296 BP).

이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명하기로 한다.

단 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명이 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> EC1-20 세포의 장기 계대배양

기존의 EC1-20 세포주 (KCTC 0182P) 10⁶개를 10% 의 투석된 송아지 혈청 (기브코사 제품, 26300-020), 20nM MTX, 550μg/ml G418가 첨가된 α-MEM 배지 (기브코사 제품)를 담은 지름 10 cm 접시에 옮기고 이를 37℃, 5% 탄산개스 항온기에서 4일 간격으로 배지를 교환하면서 2주간 배양하였다. 이 세포들을 96 웰 플레이트에 웰당 0.5-1 개 세포가 되도록 분주하였다. 약 3주 후에 자란 세포 클론 배양액의 EPO 의 양을 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 방법에 의하여 측정하여 OD (Optical Density)값이 제일 높은 클론 #7을 선정하였다. 이 세포를 2주 이상 동안 계속 배양하여 세포 수를 늘린 뒤 다시 10⁶세포를 같은 배지에서 2주간 계대배양한 다음 다시 96 웰 플레이트에 웰당 0.5-1 개 세포가 되도록 분주하여 약 3주후에 자란 세포 클론 배양액을 ELISA 에 의하여 측정하여 OD 값이 제일 높은 클론 #71을 선정하였다. 이 세포를 위와 같은 절차를 또 한번 반복한 다음 EPO 생산성이 제일 높은 세포주 EC1-71-1C8 를 분리하였다.

즉 20nM MTX 가 들어있는 배지에서 2주 배양- 세포 서브클로닝- 2주 이상의 세포 클론 팽창- 2주 배양- 세포 서브클로닝- 2주 이상의 세포 클론 팽창- 2주 배양- 세포 클로닝의 과정을 통하여 EPO 의 생산성이 높은 EC1-71-1C8 세포주를 분리한 것이다. 이 방법은 단순히 세포를 서브클로닝하는 방법과는 다르고, MTX 의 농도를 높이면서 세포를 MTX 에 적응시키는 방법과도 다르다.

<실시예 2> EC1-71-1C8 세포주의 분리

EPO 생산성을 측정하기 위해 5x10⁵개 세포를 6 웰 플레이트에 분주하고 24시간 후에 배지를 교환하여 준 뒤, 다시 24시간 후에 세포 배양액을 취하여 분비된 EPO 의 생산량을 측정하였다.

이 때 여러 세포주들의 EPO 생산량을 측정하기 위하여, 본 연구실에서 확립한 ELISA 방법을 사용하였다. 즉, 정제된 항 EPO 생쥐 단일클론항체 (ATCC CRL8164 하이브리도마 배양액으로부터 본 발명자들이 분리·정제한 것임)를 3 μg씩 코팅한 ELISA 플레이트에 여러 농도로 희석시킨 세포 배양액을 가하여 EPO 를 결합시킨 다음, 아머샴사의 바이오틴화 키트를 이용하여 바이오틴화시킨 사람 EPO 에 대한 쥐 단일클론항체 (BF-11, 일본 교토대학의 Ryuzo Sasaki 박사님으로부터 얻음)를 가하였다. 다음 퍼옥시다제가 결합된 스트랩트아비딘을 1:1000 으로 희석하여 첨가하고 이에 발색반응을 시키고 495nm 에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선 (standard curve)을 구하기 위하여 상기의 샌드위치 ELISA 방법에서 세포 배양액 대신 정제된 사람 EPO (독일 베링거 만하임사 제품)를 여러 농도 (0 - 500 U/ml)로 가한 다음, 같은 방법으로 ELISA 를 수행하였다. 그 결과 100 - 400 U/ml 농도 사이에서는 표준곡선이 직선으로 얻어졌다. 이 범위 내에서 세포 배양액 시료의 EPO 양을 측정하여 EPO 의 생산성이 가장 높은 본 발명의 EC1-71-1C8 세포주를 분리하였다.

<실시예 3> 세포주의 EPO 특이적 생산성 측정

기존의 EC1, EC1-20 세포주 및 본 발명의 EC1-71-1C8 세포주의 EPO 특이적 생산성 (specific productivity)을 정확히 측정하기 위하여 상기 EC1-71-1C8 및 EC1, EC1-20 세포주를 각각 5x10⁵개로 세포주의 6 웰에 분주하고 24시간 후에 배지를 교환한 다음, 다시 24시간 후에 세포 배양액을 취하여 EPO 생산량을 정량하였다. EPO 양을 정량하기 위하여 베링거 만하임사의 EPO-ELISA 키트를 사용하였다. EPO에 대한 항체를 코팅한 플레이트에 세포 배양액을 몇 가지 농도로 첨가하고, 퍼옥시다제가 결합된 EPO 모노클로날 항체를 첨가하였다. 이 때 배양액에 존재하는 EPO 양을 정량하기 위해 키트에서 제공하는 정제된 EPO의 표준량을 배양액 시료들과 같이 정량하고, 이들로부터 표준곡선 (standard curve)을 구한 후 시료의 EPO가 나타내는 ELISA 값에 해당하는 EPO 양을 결정하였다. 그 결과 EC1-20 세포주는 37.1μg/ 10⁶세포/ 24시간, 본 발명의 EC1-71-1C8 세포주는 129.9 μg/ 10⁶세포/ 24시간으로 EPO를 생산함을 확인할 수 있었다 (도 1 참조).

<실시예 4> EPO mRNA의 정량 분석

본 발명의 EC1-71-1C8 세포주가 기존의 EC1-20 세포주와 비교하여 유전자를 더 많이 증폭함으로써 mRNA의 수준이 더 높아지는지를 확인하기 위하여, 본 발명의 EC1-71-1C8 세포주 및 대조군인 EC1-20 및 EC1 세포주로부터 전체 RNA를 분리하고,이들 RNA 를 각각 10 μg 1% 아가로스 젤에 전개시킨 다음 68℃에서 30 분 정도 말리고 이것을 하이브리디제이션 용액 [5X Denhardt's 용액, 5X SSPE, 0.1% SDS, 50% 포름아마이드 (formamide), 100 μg/ml 연어정자 DNA (salmon sperm DNA)]을 넣은 비닐 백에다 넣고 2 시간 동안 42℃에서 반응시켰다. 다시 방사성 표지된 EPO cDNA를 넣고 24시간 더 반응시킨 다음 0.1 X SSC, 0.1% SDS 용액으로 68℃에서 30분 세척하였다. 이렇게 세척된 젤을 X-선 필름에 감광시켜서 EPO mRNA 의 농도를 비교하였다. 그 결과 본 발명의 EC1-71-1C8 세포주에서 생산되는 EPO mRNA 수준이 기존의 EC1-20 세포주의 경우 보다 2배 이상 높음을 알 수 있었다 (도 2 참조).

<실시예 5> EPO 분비량의 비교

본 발명의 EC1-71-1C8 세포주는 기존의 EC1-20의 세포주와 비교하여 EPO mRNA 의 생성량이 많으므로 EC1-71-1C8 세포주가 EC1-20 세포주 보다 EPO 의 번역 (translation)도 더 많이 수행하고 EPO 도 더 많이 분비할 것으로 예상되므로 이를 증명하기 위하여, 각 세포의 EPO 분비 역학 (kinetics)을 측정하였다. 즉, 상기 EC1, EC1-20, EC1-71-1C8 세포주들을 각각 2 X 10⁵수 만큼 6 웰 플레이트에 6 개씩 접종한 다음, 활발히 자랄 때 메치오닌이 없는 배지에서 30 분간 배양하였다. 그 후 100 μCi의 〔S³⁵〕-방사성 메치오닌이 함유된 배지로 치환하여 3 시간 배양시켜 모든 단백질의 방사성 동위원소로의 표지를 유도하였다. 다시 방사성이 없는 배지로 교환한 다음 10분, 20분, 60분이 경과한 후 세포 상층액을 회수하고 또한 세포들을 회수하고 파쇄 용액 (0.1 M Tris-Cl, pH 8.0, 0.1 M NaCl, 0.1 M EDTA, 2% triton X-100, 0.1% SDS)으로 처리하여 원심분리한 다음 세포 추출물을 회수하였다. 상기의 세포 상층액과 세포 추출물에 EPO에 대한 항체를 넣고 4℃에서 밤새 반응시킨 다음 다시 단백질 A-세파로즈 (Protein A-Sepharose)를 넣은 후 4℃에서 1 시간 더 반응시켰다. 이 반응액을 원심분리하여 그 침전물을 트리스-트리톤 용액 (50 mM Tris-Cl pH 8.0, 150 mM NaCl, 2% Triton X-100, 0.1 mM EDTA), 10 mM Tris-Cl (pH 8.0) 용액 순서로 잘 세척한 후, 그 침전물을 40 μl의 SDS-PAGE 샘플 용액에 부유시켜 끓이고 12.5% SDS-PAGE 를 수행하였다. 이 젤을 잘 말려 X-선 필름에 감광시키고 그 결과를 도 3a 및 도 3b 에 나타내었다.

도 3a는 각각 EC1-20, EC1-71-1C8 세포를〔S³⁵〕-방사성 메치오닌으로 표지시킨 후 10분, 20분, 60분에 세포 상층액으로 분비된 EPO를 나타낸 것이다. 여기에서 레인 1은 EC1 세포, 레인 2는 EC1-20 세포, 레인 3는 EC1-71-1C8 세포의 시료를 나타낸 것이다. 이 그림에서 본 바와 같이 EC1-71-1C8 세포의 EPO 분비량이 EC1 세포보다 더 많음을 알 수 있다. 도 3b는 각 EC1, EC1-20, EC1-71-1C8 세포를〔S³⁵〕-방사성 메치오닌으로 표지시킨 후 0분, 10분, 20분, 60분의 세포 추출물의 EPO 양을 나타낸 것이다. 이 그림에서 본 바와 같이 EC1-71-1C8 세포내의 EPO 양은 EC1세포보다 더 많음을 알 수 있다.

<실시예 6> EPO 의 분리·정제

실시예 1 에서 얻은 형질전환된 EC1-71-1C8 세포주를 투석시킨 송아지 혈청이 10% 함유된 |A-MEM 배지에서 2일 배양한 후 무혈청 배지인 SFMII (기브코사 제품) 배지로 치환하여 5일간 배양하였다. 배양액에 동량의 황산암모늄 포화용액을 첨가하여 얻은 침전물을 10mM 트리스-염산 완충액 (pH 8.6)에 녹이고, 이틀간 동일한 완충액에 투석하였다. 모노-Q 칼럼 (파마시아사 제품)을 이용하여 FPLC에서 염 기울기법에 의해 0.25M 소금에 첨가된 완충액을 이용하여 EPO 를 1차로 분리하였다. 1차 분리된 EPO의 시료를 더 정제하기 위해 다시 세파크릴-200 칼럼에 주입하고 세척액 (50mM 트리스완충액에 0.5M 소금, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF를 첨가한 것, pH 7.5)으로 세척하여 젤 여과법 (Gel filtration)을 수행하여 EPO 를 정제하였다. 이 때 EPO 의 정제도는 15% SDS-PAGE (A)와 웨스턴 블럿팅 (B)에 의해 확인되었다 (도 4 참조).

도 4a에서 레인 M은 단백질 분자량에 대한 기준이고, 레인 1, 2, 3은 각각 최종 정제된 EPO 의 5, 3, 1 μg에 해당하는 양이다. 도 4b는 생쥐 항-인간 EPO 항체 (ATCC CRL8164 하이브리도마 배양액을 본 연구실에서 분리·정제한 것임)와 과산화효소와 결합된 염소 항-생쥐 IgG 항체 (Sigma 사 제품)을 이용하여 웨스턴 블럿팅한 것이다.

<실시예 7> 생물학적 활성 검증

EPO에 대해 민감하게 반응하여 증식하는 세포주로써 EP-FDC-P2 세포 (Dr. Ryuzo Sasaki, 일본 교토대학 식품공학과 교수 기증)를 이용하여 MTT 방법(Tasuda et al., Acta Haematol. JPN, 53, 1045, 1990)에 의한 EPO의 생체외 세포활성을 조사하였다. 96 웰 플레이트에 4×104 세포/웰로 세포를 현탁시키고 각 웰에 EPO 표준품 (베링거 만하임사)과 본 발명에서의 EPO 를 도 5에서와 같이 여러 농도로 첨가하였다. 37℃, CO₂인큐베이터에서 20시간 배양시킨 뒤 MTT용액 (5mg/ml)을 각 웰에 0.01ml씩 첨가하고 다시 4시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 1500rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 0.04N 염산을 녹인 이소프로판올 용액을 0.1ml씩 넣은 후 20분 뒤 3% SDS 용액을 다시 첨가하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과 본 발명을 통하여 얻은 EPO 가 EPO 표준품과 거의 동일한 생물학적 활성을 갖음을 확인하였다 (도 5 참조).

본 발명의 EC1-71-1C8 세포주는 기존의 EC1-20 세포가 37.1μg/10⁶세포/24 시간의 농도로 EPO 를 생산함과 비교하여 129.9μg/10⁶세포/24 시간의 농도로 EPO 를 생산할 수 있어 고역가의 EPO 를 생산하는데 매우 효율적이다. 구체적으로 기존의 EC1-20 세포주 보다 mRNA 양은 2배 이상 높게 나타나고, EPO 의 생산량은 약 3배 이상 높아졌으며, EPO 의 분비 속도도 향상되었다.

또한 본 발명의 세포주는 낮은 MTX 농도에서도 EPO 를 대량 생산할 수 있도록 낮은 MTX 농도의 배지를 사용하여 세포 배양, 세포 서브클로닝, 세포 클론 팽창을 반복하는 장기 계대배양으로 세포를 선별하므로 기존의 방법에 비하여 간편하고 비용이 적게 든다.

Claims (5)

1. 에리트로포이에틴 (EPO)을 생산하는 세포주 EC1-71-1C8 (수탁번호 KCTC 0296BP)
2. 낮은 MTX 농도의 세포 배지를 이용하여 세포 배양, 서브 클로닝, 세포 클론 팽창의 과정을 반복하는 장기 계대배양을 통하여 제 1 항의 세포주를 선별하는 제조방법.
3. 제 2 항에 있어서, MTX 농도는 20nM 인 것을 특징으로 하는 제조방법
4. 제 2 항에 있어서, 5개월 이상 계대배양하는 것을 특징으로 하는 제조방법
5. 제 1 항의 세포주 EC1-71-1C8 를 배양하여 EPO 를 대량 생산하는 제조방법

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