CN102049038B - 明胶酶a抑制性多肽的修饰物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种明胶酶A抑制性多肽的修饰物的应用。该明胶酶A抑制性多肽的修饰物为mPEG-sc对多肽M205C4组氨酸氨基端的单点修饰产物，其分子量为11000~13000，该应用为在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。本发明的明胶酶A抑制性多肽的修饰物，克服M205C4活性肽的稳定性差和体内代谢快的不足，其具有活性高、稳定性好、半衰期长等优点，并且在胰腺癌动物模型中发挥了良好的抗肿瘤作用，为其在人体的治疗应用提供了重要基础和保证。
Description
技术领域
本发明涉及一种明胶酶A抑制性多肽(M205C4)，具体涉及一种明胶酶A抑制性多肽(M205C4)的修饰物的应用。明胶酶A抑制性多肽的修饰物，简称为M205C4-PEG。
背景技术
局部侵袭和远处转移是恶性肿瘤的主要生物学特征，也是导致肿瘤患者较高死亡率的主要原因。目前的研究认为在肿瘤的侵袭、转移过程中，细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的破坏是关键环节。在参与破坏细胞外基质的酶类中基质金属蛋白酶类(matrix metalloproteinases，MMPs)是最重要的蛋白水解酶，尤其是MMP2、MMP9在癌细胞侵袭转移过程中不仅可以酶解细胞间基质成分，还能酶解基底膜的主要成分Ⅳ型胶原。所以设计寻找针对MMPs拮抗药物就尤为重要。目前已有人工合成的MMPs抑制物，如：Marimastat、Batimastat、Mtastat、BAY12-9566、AG-3340、CGS-27023A和SC-204092等，正在进行不同阶段临床试验。虽然这类小分子化合物可以有效抑制基质金属蛋白酶的酶解作用，但同时所产生的细胞毒作用会给试用者带来强烈的副作用。由此研究人员把目光转向了基质金属蛋白酶类的组织抑制因子（tissue inhibitors of metalloproteinases , TIMPs）家族。TIMPs的主要功能是天然地抑制MMPs的活性，在调节细胞外基质的代谢中起到了重要作用。其中TIMP-1被认为是组织中MMPs活性主要调节者，控制着大多数的MMPs家族成员。然而TIMPs对肿瘤却是把双刃剑，一方面，通过对抗MMPs蛋白的水解作用抑制肿瘤的浸润。但肿瘤也需要对抗自身的过度水解，所以TIMPs对肿瘤生长同样是必须的。另外，还对肿瘤细胞增殖、凋亡、血管形成等方面起到了关键作用，因此对肿瘤的发展具有双向性。因此寻找结合了小分子化合物和TIMPs蛋白优势的新型药物是我们的研究重点。
多肽类药物具备高效、低毒和特异性强的显著性优势。M205C4是通过噬菌体展示技术筛选的特异性MMP2抑制性结合肽，拮抗作用完全模拟了TIMPs对MMPs活性调节的方式，可以有效的抑制肿瘤细胞的侵袭转移并于2006年成功报批国家专利（ZL200610085779.7）。经后期实验证明，M205C4对多种肿瘤细胞的生长及血管新生没有明显的促进作用，符合我们的新药筛选标准。但同时也存在肽类药物在体不稳定、易降解的问题，无法使药物在体发挥其特有的生物学活性。而对于药物的修饰同时要考虑到其自身空间结构改变所导致的活性变化和体内代谢行为两个重要因素以外，修饰的工艺化问题也是不容忽视的。所以修饰及其制备方法的选择对于药物的后期研究至关重要。
发明内容
发明目的：针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种M205C4的修饰物的应用，修饰后药物保留了原有生物学活性的同时，降低了免疫原性，延长了其在生物体内的半衰期。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种明胶酶A抑制性多肽的修饰物，为mPEG-sc对多肽M205C4组氨酸氨基端的单点修饰产物，结构式为
分子量为11000~13000；结构式中，为mPEG的结构式，HNWTRWLLHPDRGGGS为多肽M205C4的氨基酸序列。
明胶酶A抑制性多肽的修饰物的修饰方法，包括以下步骤：
（1）按摩尔比为1:1~5分别称取M205C4和mPEG-SC，定溶于pH5.0-8.0的PBS缓冲液中，M205C4的反应浓度为100 uM；在静音混合器上，4℃反应2.5h以上，制得M205C4-PEG混合液；
（2）采用SunfireTM C18 OBDTM 制备色谱柱对步骤（1）制得的M205C4-PEG混合液进行液相分离和浓缩，制得浓缩液；对浓缩液进质谱检测，纯度及分子量符合标准后，将浓缩液分装至2ml EP管中，在液氮中过夜保存；
（3）将过夜保存在液氮的制备样品放入冻干仪中浓缩至冻干粉末，即可。
步骤（1）中，优选：按摩尔比约为1:3分别称取M205C4和mPEG -SC，定溶于pH7.4的PBS缓冲液中，M205C4的浓度为100 uM；在静音混合器上，4℃反应3h。
上述的明胶酶A抑制性多肽的修饰物在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。
有益效果：本发明的明胶酶A抑制性多肽的修饰物的应用，克服M205C4活性肽的稳定性差和体内代谢快的不足，其具有活性高、稳定性好、半衰期长等优点，并且在胰腺癌动物模型中发挥了良好的抗肿瘤作用，为其在人体的治疗应用提供了重要基础和保证。
附图说明
图1是M205C4和M205C4-PEG的色谱图及质谱图。A、B、C和D图均为色谱图，E图为质谱图。
图2为基质金属蛋白酶II酶活检测实验结果图。P图为修饰后的结果图，Q图为未修饰的结果图。
图3是ICR小鼠的药代动力学检测结果图。I图式修饰后的结果图，II图是未修饰的结果图。
图4是比格犬实验中药物经修饰后提高了药代动力学行为检测结果图。G图式修饰后的结果图，F图是未修饰的结果图。
图5是给药干预45天后测量各组原位肿块（PNAC-1）大小的结果图。
图6是给药干预后部分改善了肿瘤细胞侵袭所致的肝功能异常结果图。H图是天门冬氨酸氨基转移酶（AST）测定结果图，K图是丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定结果图。
图7是两种胰腺癌细胞株原位荷瘤鼠的生存曲线结果图。M图是腺胰癌PANC-1细胞株，N图是腺胰癌CFPAC-1细胞株。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的解释。
以下实施例所使用的方法和药品具体如下：
M205C4活性肽为在中国专利ZL200610085779.7公开的活性肽，由上海吉尔生化公司合成，mPEG-SC（10KD）购于北京键凯公司。
SDS-PAGE电泳法：将所要检测的样品与4×非还原性上样缓冲液按3:1的体积比混合，室温放置15分钟后进行电泳。胶体共分为3层，上层为浓缩胶（4%），中层为间隔胶（10%），下层为分离胶（16%）。首先采用80V恒压进行电泳，待样品全部进入浓缩胶并压缩成直线后，改用120V恒压继续进行电泳。电泳结束后，将胶体浸入固定液（50%甲醇+10%乙酸）中，室温浸泡30分钟后置于染色液（10%乙酸+0.025%考马斯亮蓝R250）中，室温下染色过夜，将胶体转入脱色液（10%乙酸）中，室温脱色至样品条带清晰为止。 用BIO-RAD 凝胶成像系统Universal Hood Ⅱ对凝胶进行成像。
冻干仪：FreeZone（2.5L），购于LABCONCO公司；
其他没有药品和设备均为市售药品或常用药品和设备。
实施例1
单修饰M205C4-PEG的制备
用分析天平分别精密称取M205C4和mPEG-SC干粉1mg及15mg(摩尔比约为1:3)，定溶于5ml PBS缓冲液(pH7.4)中，M205C4的工作浓度为100 uM，4℃反应3h，整个反应在静音混合器上完成。
制备液相分离和纯化M205C4-PEG：型号：Waters 2545-2767-UV2489；柱子：SunfireTM C18 OBDTM 制备色谱柱 (30*150 mm, 5 μm)；流动相：甲醇-水-三氟乙酸(60:40:0.1)；流速：1.0ml/min；柱温：25℃；检测器：Waters 2489 （双波长，220nm及330nm）；
将回收的溶液浓缩并分装至2ml EP管中，进行质谱检测后在液氮中过夜保存。
M205C4-PEG冻干粉的制备：将过夜保存在液氮的制备样品放入冻干仪中浓缩至冻干粉末。
如图1所示，A图：M205C4标准品直接进样；B图：M205C4和mPEG- SC的反应样品；C图： M205C4和mPEG-SC的反应样品的ELSD检测结果；D图：制备的M205C4-PEG样品直接进样；E图：M205C4-PEG质谱结果，mPEG-SC为分子量9000-11000的长链混合物，由此所得到的修饰后产物的分子量区间为11000-13000，峰值在12000左右。其中1号峰为 M205C4，2号峰为M205C4-PEG，3号峰为PEG。
mPEG-SC的分子量约为9000~11000，制得的修饰产物为M205C4-PEG，是mPEG-sc对多肽M205C4组氨酸氨基端的单点修饰产物，其分子量为11000~13000。M205C4-PEG的结构式为：
结构式中，为mPEG的结构式，HNWTRWLLHPDRGGGS为多肽M205C4的氨基酸序列。
实施例2
基质金属蛋白酶II酶活检测实验
试剂盒: MMP-2 Fluorimetric Drug Discovery Kit (Biomol)
仪器：荧光酶标仪（Molecular Devices公司、Gemini EM）
操作方法参照试剂盒说明，结果如图2所示，为基质金属蛋白酶II酶活检测实验结果图，由此可得，修饰后产物对基质金属蛋白酶II(MMP2)的半数抑制浓度（IC50）为101.4uM，是未修饰多肽的4.1倍，即修饰后产物的生物学活性下降到24.3%。
实施例3
M205C4-PEG在动物中药代动力学行为
一、M205C4-PEG在ICR小鼠中药代动力学行为
（1）血药样品的采集：
ICR小鼠：雌性，6周龄，体重22-24g/只。
分组：共60只，随机分成10组（10个时间点），每组6只。
给药及血样的采集：尾静脉注射给药，20mg/kg/只(M205C4/M205C4-PEG)，眼眦取血，置于肝素钠抗凝的干燥2ml EP管中，3000 r??min-1离心5min，每只小鼠取血清200ul，用600ul乙腈沉淀蛋白，12000r??min-1离心5min，取上清600ul加入300ul超纯水及300ul氯仿，涡旋1min，静止分层后取上层水相200ul浓缩至冻干粉用作含量测定。
采血的时间点：给药前采集空白血样，给药后5min，15min，30min，1h，2h，4h，8h，16h，24h。
（2）血药浓度的测定：
样品处理：将每个样品（冻干粉）1mg溶解于50ul超纯水，12000r??min-1离心5min，去上清30ul进样。
色谱条件：型号：Waters 2690/5；柱子：GL science C18 (4.6*250mm，5um)；流动相：甲醇-水-三氟乙酸(10:90:0.1)；流速：0.8ml/min；柱温：30℃；检测器: Waters 2998（220nm）。
质谱条件及样品处理
质谱仪型号：Ultraflex II MALDI-TOF/TOF
样品的处理（溶剂法制样）：分别称取1mg M205C4-PEG，4mg冻干粉（血浆），溶于lmL TFA中，振荡溶解，得到淡黄色透明溶液。称取5mg PA6T分别溶于不同的样品溶剂(TFA，THF，FA，ACN，60％ACN／5％TFA)中，振荡至充分溶解，得到白色悬浊液。取2ul样品溶液点于Anchorchip 靶板PAC96上，在空气中自然风干后，再取2ul基质溶液点于风干后的样品上，待溶剂完全挥发后将样品靶送入靶仓。
质谱条件：MALDI-TOF质谱仪的脉冲氮激光(337nm)为离子解吸电离源。采用线性和高分辨率反射分析模型，加速电压为20 kV，平均每次测定样品的激光脉冲次数为120。采用外标法标定多肽质谱峰峰位。
如图3所示，在ICR小鼠实验中药物经修饰后显著性的提高了药代动力学行为，其半衰期是未修饰多肽的40.1倍。
二、M205C4-PEG在比格犬中药代动力学行为
（1）血药样品的采集
比格犬及其分组：6月龄，共10条，雌雄各5只，体重8-10kg/条，购于上海交通大学。
给药及血样的采集：右前肢静脉给药，15mg/kg (M205C4/M205C4-PEG) ，左前肢静脉取血，置于肝素钠抗凝的干燥15ml EP管中，3000 r??min-1离心5min，每只比格犬取血清1ml，用4ml乙腈沉淀蛋白，12000 r??min-1离心5min，取上清4ml分别加入2ml超纯水及氯仿，涡旋1min，静置分层，取上层水相1.6ml浓缩至冻干粉用作含量测定。
（2）血药浓度的测定，方法同“M205C4-PEG在ICR小鼠中药代动力学行为”的方法。
如图4所示，在比格犬实验中药物经修饰后提高了药代动力学行为，其半衰期是未修饰多肽的7.8倍。
实施例4
M205C4-PEG的抗肿瘤作用
一、胰腺癌细胞系原位动物模型建立
细胞系：胰腺癌细胞（PANC-1/CFPAC-1）；
BALB/c裸鼠：雌性，6周龄，约20g/只，购于上海斯莱克公司。
建立皮下移植肿瘤模型：消化对数生长期的细胞，冷PBS洗3次，离心浓缩（900转，5分钟），用无血清无双抗的DMEM培养液重悬成108个/ml的单细胞悬液。将0.1ml悬液接种于裸鼠右腋下。
建立原位移植肿瘤模型：三周左右待皮下瘤块长至1cm大小时，脊椎脱位处死荷瘤鼠，消毒皮肤，剥离肿块，侵入含有青霉素和链霉素的高糖无血清DMEM培养液中，去除死皮及中央坏死组织，选取正常肿瘤组织，剪成约为大小约5mm3肿块供原位移植用。
1%戊巴比妥钠溶液（50mg/kg）腹腔注射麻醉裸鼠，75%酒精消毒皮肤，于左上腹直肠旁行1cm的纵行切口，分开胃和脾之间的薄膜，暴露胰腺，剪开胰腺被膜，将5mm3肿块植入胰体尾处，以8-0可吸收线缝合胰腺被膜。将胰腺送回腹腔，6-0可吸收线单层缝合腹壁肌及皮肤。所有操作均在超净台内进行，术者佩戴外科手术放大镜。
二、给药干预后的有益效果
术后十天进行给药干预
分组：以肿瘤生长的均一性为标准，从40只术后荷瘤鼠中，挑选32只，进行随机性分组，每组8只，共4组。
给药方式：腹腔注射，每12小时给药一次；给药剂量(药物均溶于PBS缓冲液)；
治疗组：M205C4-PEG 50mg/kg；对照组1：PEG 45.3 mg/kg；对照组2：PBS0.25ml/只；对照组3: M204C4-PEG 5Omg/kg。M204C4 为体外实验活性较弱的相关肽，在CN1869063A中公开。
M205C4-PEG对裸鼠原位移植的胰腺癌细胞株PANC-1的生长抑制作用：待荷瘤鼠发病自然死亡后，取出腹部肿块。肿瘤的大小=长径×短径2
如图5所示，为试验结果图。图中明显得出，M205C4-PEG可减缓肿瘤的生长，与对照组2比较治疗组的抑瘤率为32.7%(P<0.05)。
M205C4-PEG对胰腺癌细胞株PANC-1荷瘤鼠肝功能的作用：测定荷瘤鼠血浆中的天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶(ALT)的含量 。试剂盒购于USCNLIFETM公司。方法参照该试剂盒。如图6所示，为试验结果图。给药干预后可部分逆转癌细胞诱发的肝功能异常。
M205C4-PEG对荷瘤鼠的生存率的影响：：生存率为对照组1和2存活率变为最低时所对应的治疗组的存活率的均值。如图7所示，M205C4-PEG分别显著性的提高了两种胰腺癌细胞株荷瘤鼠40%和30%的生存率，延缓肿瘤的恶性发展。
Claims (1)
1.明胶酶A抑制性多肽的修饰物在制备用于治疗肿瘤药物中的应用，所述的肿瘤为胰腺癌，所述的明胶酶A抑制性多肽的修饰物为mPEG-sc对多肽M205C4组氨酸氨基端的单点修饰产物，结构式为
，分子量为11000~13000；结构式中，
为mPEG的结构式，HNWTRWLLHPDRGGGS为多肽M205C4的氨基酸序列。
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