CN101429233A - 聚乙二醇修饰抗菌肽及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一系列不同分子量的聚乙二醇修饰阳离子抗菌肽，修饰的抗菌肽在水介质中自组装成为纳米胶束，胶束的形成能起到保护抗菌肽，减弱蛋白酶对抗菌肽的降解的作用，同时提高了多肽在血清中的稳定性和抗菌活性。聚乙二醇的修饰还明显降低了抗菌肽的溶血毒副作用。

Description

聚乙二醇修饰抗菌肽及用途

技术领域

本发明涉及多肽的修饰，具体地说是聚乙二醇修饰阳离子抗菌肽，聚乙二醇修饰的阳离子抗菌肽在水介质中自组装形成抗菌肽为核、聚乙二醇为壳的的胶束，从而降低抗菌肽被蛋白酶的降解作用。

背景技术

近年来，阳离子抗菌肽及其类似物作为抗耐药细菌的新一代抗菌素已引起人们的高度重视。特别是在随着传统抗菌素的广泛使用，细菌逐渐对其产生了耐药性，迫使人们不断寻找新的抗菌素的背景下，阳离子抗菌肽由于独特的抗菌机理细菌不易对其产生耐药性(M.Zasloff，Nature，2002，415，389-395)而得到广泛关注和研究。研究证实各种生物(包括植物、动物和人类)体内存在抗菌肽，用来对付细菌、病毒和真菌等，这是一类最古老但至今仍很有效的广谱抗菌素，说明细菌不易对其产生耐药性。这类多肽因都含有较多的碱性氨基酸，亦称阳离子抗菌肽。天然阳离子抗菌肽种类繁多，已发现的超过800种；结构各异，大小从几个氨基酸到近百个氨基酸，有线型肽也有含二硫健或不含二硫健的环肽。但抗菌肽都含有较多的碱性氨基酸和疏水性氨基酸。作为抗耐药细菌的抗菌素，一些抗菌肽已进入临床试验(M.Zasloff，Nature，2002，415，389-395)。但抗菌肽在体内易被蛋白水解酶降解，体内循环半衰期短。即使在体外抗菌活性较高，在体内抗菌活性往往很低。此外一些天然抗菌肽除其抗菌活性外，还有很强的溶血等副作用。

用聚乙二醇(PEG)修饰蛋白质和多肽药物可大大增加蛋白质和多肽药物的抗蛋白水解酶的降解作用，聚乙二醇的分子量愈大，则修饰的蛋白质和多肽药物的抗蛋白水解酶的能力愈强。但聚乙二醇修饰后蛋白质和多肽药物的体外药效会降低。对蛋白质类药物，由于PEG修饰后在体内的循环半衰期显著增长，PEG修饰蛋白质药物的体内的药效是增大的。如已成功开发出聚乙二醇修饰的蛋白质药物有：酰苷脱氨酶(PEG-ADA)、干扰素α-2b(peginterferon alfa-2b)、干扰素α-2a(peginterferon alfa-2a)、重组人粒细胞集落刺激因子(pegfilgrastim)等。但多肽药物用PEG修饰后往往使其体外药效显著降低，PEG的分子量愈大则药效较低的愈多，修饰后在体内的循环半衰期的增加带来的益处不足以抵消药效的降低，修饰后的体内药效增加得不多甚至有所降低。如在抗菌肽的PEG修饰方面，A.Guiotto和Y.Imura等用5kDa PEG分别修饰抗菌肽nisin A和tachyplesin I(参考文献A.Guiotto，et al.，IlFarmaco 2003，58，45-50和Y.Imura，et al.，Biochim.Biophys.Acta 2007，1768，1160-1169)，结果抗菌肽经PEG修饰后活性急剧降低，甚至完全失去活性。

根据如上所述的抗菌肽在体内易被蛋白酶降解、PEG的分子量对修饰的多肽药物的抗蛋白水解酶的作用和药效的相互矛盾的影响、PEG修饰往往使抗菌肽的抗菌活性显著降低的问题，提出了本发明的发明内容。

发明内容

本发明公开了用低分子量聚乙二醇修饰疏水性抗菌肽的策略，用低分子量的聚乙二醇修饰疏水性较强的抗菌肽，由于PEG的分子量较低，修饰后的抗菌肽的体外活性降低得较小。由于抗菌肽的疏水性较强，PEG修饰的抗菌肽在水介质中自组装形成以PEG为壳、抗菌肽为核的胶束，PEG壳保护核中的肽，使蛋白水解酶不易接近并降解抗菌肽，提高修饰后的抗菌肽抗蛋白水解酶的降解的能力。所用疏水性抗菌肽为蜂毒肽的有效片段(参考文献：H.S.Yan，et al，Int.J.Peptide Protein Res.1994，43，107)的部分取代之后多肽序列，根据疏水性对蜂毒肽片段的抗菌活性的影响(H.S.Yan，et al.，FEBS Letters，2003，554，100-104)，设计的抗菌肽的氨基酸序列为：GLLALILWIKRKR-NH₂，简写为MA。MA抗金黄色葡萄球菌和枯草杆菌的最低抑菌浓度(MIC)分别为11.6μmol/L和2.9μmol/L。用分子量为500-2000的单甲氧基聚乙二醇(mPEG-OH)在MA的N端修饰。聚乙二醇修饰MA的具体过程为：用Rink酰胺树脂，以Fmoc策略合成MA，在从树脂上裂解MA之前，用含单羧基的单甲氧基聚乙二醇与树脂上的MA的N端氨基(已脱掉Fmoc保护基)缩合，然后采用Fmoc策略的裂解条件，将缩合了聚乙二醇的MA从树脂上裂解下来，得到单甲氧基聚乙二醇修饰的MA，用mPEG-MA表示。向单甲氧基聚乙二醇中引入单羧基的方法可以采用任何现有的引入方法，单甲氧基聚乙二醇的分子量范围为500-2000。

mPEG-MA具有明显的两亲性，在水溶液中能自组装成为胶束。胶束直径约为20～50nm，如用分子量1000的单甲氧基聚乙二醇修饰的MA(用mPEG₁₀₀₀-MA表示)的透射电镜照片见图1。图2为mPEG₁₀₀₀-MA胶束增溶芘的芘溶解度(水介质，用紫外吸收表示)与mPEG₁₀₀₀-MA浓度的关系。图1和图2说明mPEG-MA在水介质中形成了胶束。MA用单甲氧基聚乙二醇修饰后保留了较高的抗菌活性。由于采用了低分子量的PEG修饰抗菌肽，mPEG-MA的最低抑菌浓度较MA的没有明显提高，修饰后抗菌肽的体外抗菌活性仍比较高，甚至有部分修饰抗菌肽较原来多肽有了更高的抗菌活性，见表2。

本发明合成的mPEG-MA抗糜蛋白酶降解能力以及在血清中的稳定性得到了明显提高，在血清和糜蛋白酶溶液中的降解速度明显延缓，见图3和图4。多肽和蛋白质药物在人体内易受各种蛋白酶分解而降低药效，糜蛋白酶为一种内切酶，对于MA有多个切割位点；而血清中有多种蛋白水解酶，能够水解多肽MA。选用这两种体系比较MA和mPEG-MA在其中的降解速度，发现mPEG-MA在血清和糜蛋白酶溶液中的降解速度较未修饰的MA明显降低。

本发明的另一个发现是在血清存在下mPEG-MA的抗菌活性明显高于MA的抗菌活性。抗菌肽在血清中容易被其中的蛋白酶降解导致抗菌活性明显降低，我们发现相比于体外营养肉汤培养基中的抗菌测试，MA在血清中的抗菌活性明显降低，抗菌效果变差，而修饰后的抗菌肽活性基本不变，或只有很小的降低，修饰后的抗菌肽在血清中的抗菌活性明显高于未修饰的MA。

本发明的另一个发现是PEG化多肽对人体血红细胞的溶血活性明显降低。蜂毒肽等多肽具有很强的溶血副作用，我们选用的模板肽MA同样具有较强的溶血活性。同等条件下比较PEG化的MA和模板肽MA对人血红细胞的破坏作用，发现经修饰的MA明显降低了溶血现象，减少了毒副作用。

具体实施方式

下面，通过示例性的实施例具体说明本发明。应当理解，本发明的范围不应局限于实施例的范围。任何不偏离本发明主旨的变化或改变能够为本领域的技术人员所理解。本发明的保护范围由所附权利要求的范围确定。

mPEG₅₀₀-MA，mPEG₇₅₀-MA，mPEG₁₀₀₀-MA，mPEG₁₅₀₀-MA，mPEG₂₀₀₀-MA分别代表用平均分子量为500，750，1000，1500，2000的聚乙二醇修饰的MA。

实施例1

带侧链保护基的多肽MA树脂的合成：在50mL反应瓶加入1g Rinkamide MBHA树脂(0.74mmol/g)，加15mL二甲基甲酰胺(DMF)溶胀10分钟，抽滤去掉溶剂，然后加入15mL 20％哌啶/DMF溶液，搅拌30分钟，抽滤。用DMF洗涤树脂6次，抽滤去掉溶剂。向反应瓶中加入1.44g Fmoc-Arg(Pbf)-OH(Pbf为2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)、0.46g(2.22mmol)DIC(N，N-二异丙基碳二亚胺)和0.30g(2.22mmol)HOBt(1-羟基苯并三氮唑)和15mL DMF，室温下搅拌进行反应。反应2小时后取少量树脂进行茚三酮显色试验，结果表明缩合反应已完全。抽滤，用DMF洗涤树脂6次，抽滤去掉溶剂。C端的第一个(保护的)氨基酸已联接于树脂上。后面接着联接由C端起的第二个至最后一个(保护的)氨基酸，反应步骤重复上面的操作，即从用20％哌啶/DMF溶液脱保护开始，到茚三酮显色试验后用DMF洗涤止。如果茚三酮显色试验表明缩合未完全，则可延长缩合时间直至完全。所有氨基酸的α-氨基都用Fmoc保护，有侧链保护基的氨基酸为：Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH。最后一个氨基酸甘氨酸缩合完成之后洗涤树脂，并加入15mL20％哌啶/DMF溶液，搅拌30分钟，脱除末端的Fmoc保护基。最后树脂用甲醇洗涤三次，真空干燥，得到侧链带有Boc，Pbf保护基团的多肽MA树脂。

实施例2

多肽MA的制备：将实施例1得到的多肽MA树脂0.5g加入到50mL圆底烧瓶中，加入10mLK试剂(三氟乙酸/水/苯酚/苯甲硫醚/1，2-二巯基乙二醇＝82.5/5/5/5/2.5，体积比)，室温下搅拌4小时。过滤，收集滤液。用三氟乙酸洗三次树脂。合并滤液，旋蒸滤液除去大部分的三氟乙酸，加入体积为8-10倍的乙醚沉淀出多肽MA，将乙醚沉淀液放入冰箱中过夜。离心，除去乙醚，真空干燥，得到多肽MA粗品。

将200mg多肽MA粗品溶于5mL纯水中，用制备型反相HPLC纯化，色谱柱为μBondapak C18(19×300mm，10μm)，流动相为：三氟乙酸/乙腈/水(0.1/32/68，体积比)，流速为12mL/min。收集液经旋转蒸发浓缩，然后冷冻干燥得纯品多肽MA。

实施例3

聚乙二醇羧基衍生物(mPEG₅₀₀-COOH)的制备：将平均分子量为500的mPEG-OH3.2g与20g蒸馏水，0.4g KOH混合，用冰盐浴冷却到0.5℃，慢慢滴加0.4g丙烯腈。溶液在0-5℃下搅拌2小时。慢慢滴加30g浓硫酸，于95-100℃下加热3小时。冷却到室温后，加200mL蒸馏水，用二氯甲烷萃取3次，每次30mL。二氯甲烷萃取液用无水Na₂SO₄干燥，减压蒸去溶剂后得到mPEG₅₀₀-COOH。

实施例4

聚乙二醇羧基衍生物(mPEG₇₅₀-COOH)的制备：将平均分子量为750的mPEG-OH5.0g与20g蒸馏水，0.4gKOH混合，用冰盐浴冷却到0.5℃，慢慢滴加0.4g丙烯腈。溶液在0-5℃下搅拌2小时。慢慢滴加30g浓硫酸，于95-100℃下加热3小时。冷却到室温后，加200mL蒸馏水，用二氯甲烷萃取3次，每次30mL。二氯甲烷萃取液用无水Na₂SO₄干燥，减压蒸去溶剂后得到mPEG₇₅₀-COOH。

实施例5

聚乙二醇羧基衍生物(mPEG₁₀₀₀-COOH)的制备：将平均分子量为1000的mPEG-OH6.5g与20g蒸馏水，0.4g KOH混合，用冰盐浴冷却到0.5℃，慢慢滴加0.4g丙烯腈。溶液在0-5℃下搅拌2小时。慢慢滴加30g浓硫酸，于95-100℃下加热3小时。冷却到室温后，加200mL蒸馏水，用二氯甲烷萃取3次，每次30mL。二氯甲烷萃取液用无水Na₂SO₄干燥，减压蒸去溶剂后得到mPEG₁₀₀₀-COOH。

实施例6

聚乙二醇羧基衍生物(mPEG₁₅₀₀-COOH)的制备：将平均分子量为1500的mPEG-OH10.0g与20g蒸馏水，0.4gKOH混合，用冰盐浴冷却到0.5℃，慢慢滴加0.4g丙烯腈。溶液在0-5℃下搅拌2小时。慢慢滴加30g浓硫酸，于95-100℃下加热3小时。冷却到室温后，加200mL蒸馏水，用二氯甲烷萃取3次，每次30mL。二氯甲烷萃取液用无水Na₂SO₄干燥，减压蒸去溶剂后得到mPEG₁₅₀₀-COOH。

实施例7

聚乙二醇羧基衍生物(mPEG₂₀₀₀-COOH)的制备：将平均分子量为2000的mPEG-OH12.0g与20g蒸馏水，0.4gKOH混合，用冰盐浴冷却到0.5℃，慢慢滴加0.4g丙烯腈。溶液在0-5℃下搅拌2小时。慢慢滴加30g浓硫酸，于95-100℃下加热3小时。冷却到室温后，加200mL蒸馏水，用二氯甲烷萃取3次，每次30mL。二氯甲烷萃取液用无水Na₂SO₄干燥，减压蒸去溶剂后得到mPEG₂₀₀₀-COOH。

实施例8

mPEG₅₀₀-MA的制备：将实施例1中得到的多肽MA树脂0.5g加入到反应瓶中，用10mL DMF/DCM(二氯甲烷)(体积比9/1)溶涨15分钟。加入0.2g mPEG₅₀₀-COOH，混合溶液，搅拌15分钟后加入0.4g HOBt和0.4mL DIC，催化剂量的4-二甲氨基吡啶(DMAP)，于室温在氮气保护下搅拌反应3天。过滤溶液，用大量的DCM和DMF洗涤树脂。转移树脂到50mL圆底烧瓶中，真空干燥后加入10mL K试剂(三氟乙酸/水/苯酚/苯甲硫醚/1，2-二巯基乙二醇＝82.5/5/5/5/2.5，体积比)，室温下搅拌反应4小时。过滤，收集滤液。用三氟乙酸洗三次树脂。合并滤液，将滤液旋蒸除去大部分的三氟乙酸，加入体积为8-10倍的乙醚沉淀。收集的沉淀放入冰箱中过夜，离心，除去乙醚，真空干燥，得到平均分子量为500的聚乙二醇修饰的MA(mPEG₅₀₀-MA)粗品。

将200mg mPEG₅0₀-MA粗品溶于5mL纯水中，用制备型反相HPLC纯化，色谱柱为μBondapak C18(19×300mm，10μm)，流动相为：三氟乙酸/乙腈/水(0.1/32/68，体积比)，流速为12mL/min。收集液经旋转蒸发浓缩，然后冷冻干燥得到纯品mPEG₅₀₀-MA。

实施例9

mPEG₇₅₀-MA的制备：将实施例1中得到的多肽MA树脂0.5g加入到反应瓶中，用10mL DMF/DCM(体积比9/1)溶涨15分钟.加入0.3g的mPEG₇₅₀-COOH，混合溶液机械搅拌15分钟之后加入0.4g HOBt和0.4M1DIC，催化剂量的DMAP，混合物于室温在氮气保护下搅拌反应3天.过滤溶液，用大量的DCM和DMF洗涤树脂.转移树脂到50mL圆底烧瓶中，真空干燥后加入10mLK试剂(三氟乙酸/水/苯酚/苯甲硫醚/1，2-二巯基乙二醇＝82.5/5/5/5/2.5，体积比)，室温下搅拌反应4小时。过滤，收集滤液。用三氟乙酸洗三次树脂。合并滤液，将滤液旋蒸除去大部分的三氟乙酸，加入体积为8-10倍的乙醚沉淀。收集的沉淀放入冰箱中过夜，离心，除去乙醚，真空干燥，得到平均分子量为750的聚乙二醇修饰的MA(mPEG₇₅₀-MA)粗品。

将200mg mPEG₅₀₀-MA粗品溶于5mL纯水中，用制备型反相HPLC纯化，色谱柱为μBondapak C18(19×300mm，10μm)，流动相为：三氟乙酸/乙腈/水(0.1/32/68，体积比)，流速为12mL/min。收集液经旋转蒸发浓缩，然后冷冻干燥得纯品mPEG₇₅₀-MA。

实施例10

mPEG₁₀₀₀-MA的制备：将实施例1中得到的多肽MA树脂0.5g加入到反应瓶中，用10mL DMF/DCM(体积比9/1)溶涨15分钟.加入0.3g的mPEG₁₀₀₀-COOH，混合溶液机械搅拌15分钟之后加入0.4g HOBt和0.4ml DIC，催化剂量的DMAP，混合物于室温在氮气保护下搅拌反应3天.过滤溶液，用大量的DCM和DMF洗涤树脂.转移树脂到50mL圆底烧瓶中，真空干燥后加入10mLK试剂(三氟乙酸/水/苯酚/苯甲硫醚/1，2-二巯基乙二醇＝82.5/5/5/5/2.5，体积比)，室温下搅拌反应4小时。过滤，收集滤液。用三氟乙酸洗三次树脂。合并滤液，将滤液旋蒸除去大部分的三氟乙酸，加入体积为8-10倍的乙醚沉淀。收集的沉淀放入冰箱中过夜，离心，除去乙醚，真空干燥，得到平均分子量为1000的聚乙二醇修饰的MA(mPEG₁₀₀₀-MA)粗品。

将200mg mPEG₁₀₀₀-MA粗品溶于5mL纯水中，用制备型反相HPLC纯化，色谱柱为μBondapak C18(19×300mm，10μm)，流动相为：三氟乙酸/乙腈/水(0.1/32/68，体积比)，流速为12mL/min。收集液经旋转蒸发浓缩，然后冷冻干燥得纯品mPEG₁₀₀₀-COOH。

实施例11

mPEG₁₅₀₀-MA的制备：将实施例1中得到的多肽MA树脂0.5g加入到反应瓶中，用10mL DMF/DCM(体积比9/1)溶涨15分钟.加入0.35g的mPEG₁₅₀₀-COOH，混合溶液机械搅拌15分钟之后加入0.4g HOBt和0.4ml DIC，催化剂量的DMAP，混合物于室温在氮气保护下搅拌反应3天.过滤溶液，用大量的DCM和DMF洗涤树脂.转移树脂到50mL圆底烧瓶中，真空干燥后加入10mL K试剂(三氟乙酸/水/苯酚/苯甲硫醚/1，2-二巯基乙二醇＝82.5/5/5/5/2.5，体积比)，室温下搅拌反应4小时。过滤，收集滤液。用三氟乙酸洗三次树脂。合并滤液，将滤液旋蒸除去大部分的三氟乙酸，加入体积为8-10倍的乙醚沉淀。收集的沉淀放入冰箱中过夜，离心，除去乙醚，真空干燥，得到平均分子量为1500的聚乙二醇修饰的MA(mPEG₁₅₀₀-MA)粗品。

将200mg mPEG₁₅₀₀-MA粗品溶于5mL纯水中，用制备型反相HPLC纯化，色谱柱为μBondapak C18(19×300mm，10μm)，流动相为：三氟乙酸/乙腈/水(0.1/32/68，体积比)，流速为12mL/min。收集液经旋转蒸发浓缩，然后冷冻干燥得纯品mPEG₁₅₀₀-MA。

实施例12

mPEG₂₀₀₀-MA的制备：将实施例1中得到的多肽MA树脂0.5g加入到反应瓶中，用10mL DMF/DCM(体积比9/1)溶涨15分钟.加入0.4g的mPEG₂₀₀₀-COOH，混合溶液机械搅拌15分钟之后加入0.4g HOBt和0.4ml DIC，催化剂量的DMAP，混合物于室温在氮气保护下搅拌反应3天.过滤溶液，用大量的DCM和DMF洗涤树脂.转移树脂到50mL圆底烧瓶中，真空干燥后加入10mL K试剂(三氟乙酸/水/苯酚/苯甲硫醚/1，2-二巯基乙二醇＝82.5/5/5/5/2.5，体积比)，室温下搅拌反应4小时。过滤，收集滤液。用三氟乙酸洗三次树脂。合并滤液，将滤液旋蒸除去大部分的三氟乙酸，加入体积为8-10倍的乙醚沉淀。收集的沉淀放入冰箱中过夜，离心，除去乙醚，真空干燥，得到多肽mPEG₂₀₀₀-MA粗品。

将200mg mPEG₂₀₀₀-MA粗品溶于5mL纯水中，用制备型反相HPLC纯化，色谱柱为μBondapak C18(19×300mm，10μm)，流动相为：三氟乙酸/乙腈/水(0.1/32/68，体积比)，流速为12mL/min。收集液经旋转蒸发浓缩，然后冷冻干燥得纯品mPEG₂₀₀₀-MA。

实施例13

聚乙二醇修饰MA胶束的制备及临界胶束浓度的测定：将1.0mg的mPEG₁₀₀₀-MA溶解于1mL水中，静置24h后将溶液涂于镀碳膜的铜网上，观察透射电镜下的照片，如图1所示。电镜照片表明有胶束形成。同样条件下观察mPEG₅₀₀-MA、mPEG₇₅₀-MA、mPEG₁₅₀₀-MA和mPEG₂₀₀₀-MA的透射电镜照片，这些电镜照片表明这些样品都有胶束的形成，电镜照片显示的胶束的直径见表1。

向一系列不同浓度的mPEG₁₀₀₀-MA样品水溶液中分别加入过量的芘固体粉末，超声8h以后4000r/min离心1h，测量上清液在336nm处紫外吸收，作芘的溶解度(以紫外吸光度表示)对mPEG₁₀₀₀-MA浓度的关系曲线，见图2。由芘溶解度随mPEG₁₀₀₀-MA浓度变化曲线的拐点得到的临界胶束浓度为2.1μmol/L(参考：M.Kastantin，et al.，Macromol.Biosci.2007，7，189-194)。同样方法测得mPEG₅₀₀-MA、mPEG₇₅₀-MA、mPEG₁₅₀₀-MA和mPEG₂₀₀₀-MA的临界胶束浓度分别为：1.8、1.8、2.3和2.4μmol/L。

实施例14

MA和mPEG₁₅₀₀-MA在糜蛋白酶溶液中的衰减比较测试：将MA或mPEG₁₅₀₀-MA样品溶于pH＝7.5的HEPES缓冲溶液中，把此溶液与含0.1M的HCl的100μg/mL的糜蛋白酶溶液混合，糜蛋白酶与抗菌肽的最终浓度分别为3.64，330μg/mL。分别在不同时刻取出溶液进行HPLC分析，得到其在糜蛋白酶溶液中的衰减曲线，见图3。结果表明mPEG₁₅₀₀-MA较MA抗蛋白酶降解的能力明显增加。

同样条件下分别测试mPEG₅₀₀-MA、mPEG₇₅₀-MA、mPEG₁₅₀₀-MA和mPEG₂₀₀₀-MA在糜蛋白酶中的衰减曲线，1小时后未被分解的修饰物浓度分别为初始浓度的：40.3％、41.9％、45.8％和52.6％。

实施例15

MA和mPEG₅₀₀-MA在血清中的衰减速度比较：将500μL血清加入到2mL1mg/mL的MA或mPEG₅₀₀-MA溶液中，置于37℃恒温摇床，分别在0min、10min、30min......等不同时刻取出100μL反应液，加入200μL的无水乙醇沉淀出血清中的蛋白，混合液低温静置10min后离心，用HPLC测试血清中MA或mPEG₅₀₀-MA的浓度。结果见图4。mPEG₅₀₀-MA较MA明显提高了在血清中的稳定性。

同样条件下分别测试mPEG₅₀₀-MA、mPEG₇₅₀-MA、mPEG₁₀₀₀-MA、mPEG₁₅₀₀-MA和mPEG₂₀₀₀-MA五小时后未被分解的修饰物浓度分别为初始浓度的：75％、76％，、79％、81％、和84％。

实施例16

MA和mPEG₇₅₀-MA抗菌活性的测定：用灭菌生理盐水配制浓度为1mg/mL的MA或mPEG₇₅₀-MA样品溶液。试验用菌种分别接种于营养肉汤，于37℃培养18-24小时，临用前用生理盐水作1:10⁵稀释，取12支细菌培养管并编号，于第一管中加入营养肉汤1.8mL，其余11管中均加入1.0mL肉汤。于第1管加入0.2mL多肽溶液，混匀，从中取出1.0mL加入到第2管中，混匀后从第2管中取出1.0mL加入到第3管中，如此反复，依次稀释到第12管，最后从第12管中取出的1mL弃去。每管各加备妥菌液0.2mL，轻轻振摇均匀，置37℃培养18-24小时，观察。培养后培养管呈现澄清，振摇后仍澄清，认为该管无菌生长；培养管呈现浑浊状态表明有菌生长。从无菌生长的各管中找出最低MA或mPEG₇₅₀-MA浓度的培养管，该管的浓度即为抑制细菌生长的最低抑菌浓度(MIC)。测定的结果为：MA抗金黄色葡萄球菌和枯草菌的MIC分别为：11.6μmol/L和2.9μmol/L；mPEG₇₅₀-MA抗金黄色葡萄球菌和枯草菌的MIC分别为12.6μmol/L和6.3μmol/L。同样方法测得其他修饰MA的抗菌结果见表2。

实施例17

MA及mPEG₇₅₀-MA在血清中抗菌活性的测定：分别配置不同浓度的多肽MA及mPEG₇₅₀-MA溶液，加入终体积占20％的血清，在37℃下培养1h后加入菌液，并恒温培养30h，依据实例16的方法确定MA及mPEG₇₅₀-MA在血清存在下的MIC。在血清存在条件下MA抗金黄色葡萄球菌和枯草菌的MIC分别为：163.2μmol/L和77.4μmol/L；mPEG₇₅₀-MA抗金黄色葡萄球菌和枯草菌的MIC分别为22.3μmol/L和16.6μmol/L。同样条件测得其他修饰MA的抗菌结果见表2。

实施例18

MA和mPEG₂₀₀₀-MA溶血活性的测定：将人血红细胞悬浮在磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中，得到血红细胞悬浮液(5％v/v)。将MA或mPEG₂₀₀₀-MA溶解在磷酸盐缓冲液中，配成1mg/mL储备液，取14支1.5mL离心管，于第1支离心管中加1mL多肽储备液，其余各管中加0.5mL磷酸盐缓冲液，从第1管中取出0.5mL多肽储备液加至第2管中，用微量混合仪混合均匀，再从第2管中取出0.5mL溶液加至第3管中混合均匀，以此类推，即以倍半稀释法依次稀释到第14管，弃去0.5mL，各管补加0.5mL配好的5％血红细胞悬浮液至终体积1.0mL，轻轻摇匀，37℃恒温箱中保温60分钟后于4000r/min离心10分钟，取上清液在414nm下测定其吸光值。以血红细胞悬浮在磷酸盐缓冲液中为空白，以血红细胞悬浮在1％TritonX-100中为100％溶血。溶血百分率用下式计算：

表3为MA和mPEG₂₀₀₀-MA的溶血活性比较，结果表明mPEG₂₀₀₀-MA明显地降低了对人血红细胞的溶血活性。

同样分别测得MA、mPEG₅₀₀-MA、mPEG₇₅₀-MA、mPEG₁₀₀₀-MA、mPEG₁₅₀₀-MA和mPEG₂₀₀₀-MA在浓度为40μmol/L时的溶血百分率为：95％、36％、33％、29％、25％和16％。

表1.聚乙二醇修饰抗菌肽形成胶束的粒径范围

表2.MA和mPEG-MA的最低抑菌浓度(MIC)

表3.MA和mPEG₂₀₀₀-MA对人血红细胞的溶血活性比较

附图说明：

图1.mPEG₁₀₀₀-MA的透射电镜照片

图2.芘在mPEG₁₀₀₀-MA水溶液中的溶解度(紫外吸收表示)随mPEG₁₀₀₀-MA浓度的变化

图3.MA和mPEG₁₅₀₀-MA在糜蛋白酶溶液中的衰减曲线

图4.MA和mPEG₅₀₀-MA在血清中被蛋白酶降解的衰减曲线

Claims (4)

1.一系列聚乙二醇修饰的抗菌肽，结构特征为：mPEG-GLLALILWIKRKR-NH₂，其中聚乙二醇的平均分子量为500～2000。

2.根据权利要求1所述的聚乙二醇修饰的抗菌肽的制备方法，其特征在于采用固相多肽合成的方法，用Rink酰胺树脂经Fmoc保护策略合成，在固相载体上通过脱保护、缩合逐个连接所需的氨基酸，缩合完最后一个氨基酸后，脱掉N末端的Fmoc基团，然后与单甲氧基单羧基聚乙二醇缩合，缩合方法同上述的固相多肽合成方法中的缩合方法，最后由三氟乙酸切割而得到。

3.根据权利要求1和权利要求2所述的聚乙二醇修饰的抗菌肽，其特征在于聚乙二醇修饰的抗菌肽在水介质中自组装成为纳米胶束，胶束的直径范围为20～50nm。

4.根据权利要求1、权利要求2和权利要求3所述的聚乙二醇修饰的抗菌肽的用途，其特征在于聚乙二醇修饰的抗菌肽与未修饰的原抗菌肽相比，能显著提高抗菌肽在血清中的稳定性，提高在血清中的抗菌活性，并降低溶血的毒副作用，作为抗菌素使用。

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