CN101830963A - 一种蟾蜍内酯类化合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域，是一种蟾蜍内酯类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。所说蟾蜍内酯类化合物是指华蟾毒精醇及其衍生物，包括其药学上可接受的盐。化学结构通式如下：，其中：基团R₁、R₂、R₃、R₄分别选自氢、卤素、C₁-C₆直链或支链的饱和或不饱和烃基、C₃-C₇环烃基、苄基、芳香基或5-7元杂环基。体外细胞学实验表明，本发明化合物可显著抑制肝癌、肺癌细胞增殖，因此可以用于制备抑制肿瘤生长的药物。

Description

一种蟾蜍内酯类化合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，是一种蟾蜍内酯类化合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用。所说蟾蜍内酯类化合物是指华蟾毒精醇及其衍生物，包括其药学上可接受的盐。

背景技术

蟾蜍属动物有250多种，分布于世界各地。我国有近10种，主要的3种分别是：大蟾蜍华西亚种、大蟾蜍中华亚种以及黑眶蟾蜍。古方验方广泛应用蟾蜍拔毒消肿、定酮杀虫、强心利尿。目前市场上有蟾酥镇痛膏、蟾酥注射剂、华蟾素注射液和复方蟾皮胶囊等制剂应用于临床抗肿瘤、镇痛、利水消肿、增强机体免疫力。蟾蜍制剂在临床上用于肿瘤的辅助治疗具有标本兼治的优点，能够显著抑制肿瘤的转移、提高机体免疫力，与化疗药物相比，具有能够减轻肿瘤患者痛苦，显著改善生活质量，延长生命周期的特点，同时也能够与化疗药物联合使用增强疗效。然而，目前的蟾蜍制剂，都是以粗提物入药、成份极其复杂，除含有蟾毒配基、蟾蜍毒素、吲哚类生物碱外，还含有氨基酸、还原糖、甾类、肽类等多种类型的化学成分。因此，在临床使用中，蟾蜍制剂具有以下两个主要缺点：对肿瘤细胞的杀伤率低；出现过敏反应。这都是由于未能去除无效、不良反应成份，未能对真正的有效成分进行控制造成的。

以蟾蜍为基原的常用中药材有蟾酥、蟾皮、干蟾，其化学成份相当复杂，按溶解性可分为脂溶性甾族类(蟾毒配基类、蟾蜍毒素类)、水溶性吲哚生物碱类。目前研究较多的化合物包括蟾毒灵、日蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒精、脂蟾毒配基等。

至今未见华蟾毒精醇及其衍生物用于制备肿瘤生长抑制药物的报道。

发明内容

本发明的目的之一是提供一类华蟾毒精醇衍生物；目的之二是提供一类华蟾毒精醇及其衍生物或其药学上可接受的盐用于抗肿瘤药物的用途。本发明华蟾毒精醇及其衍生物化学结构通式如下：

其中：基团R₁代表氢、卤素、C₁-C₆直链或支链的饱和或不饱和烃基、C₃-C₇环烃基、苄基、芳香基或5-7元杂环基，R₂代表氢、卤素、C₁-C₆直链或支链的饱和或不饱和烃基、C₃-C₇环烃基、苄基、芳香基或5-7元杂环基，R₃代表氢、卤素、C₁-C₆直链或支链的饱和或不饱和烃基、C₃-C₇环烃基、苄基、芳香基或5-7元杂环基，R₄代表氢、卤素、C₁-C₆直链或支链的饱和或不饱和烃基、C₃-C₇环烃基、苄基、芳香基或5-7元杂环基；

所说的卤素选自氟、氯、溴或碘；所说的芳香基选自苯基、取代苯基、萘基或联苯基；所说的取代苯基包括1～4个取代基，该取代基选自卤素、C₁-C₆直链或支链烃基、氰基、硝基、氨基、羟基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、C₁-C₄烷氧基、巯基和C₁-C₄酰基；所说的5-7元杂环基为含有1-3个选自氧、硫或氮的杂原子，和/或被结构式中的苯基并合，和/或含有-个或多个选自卤素、C₁-C₆直链或支链烃基、氰基、硝基、氨基、羟基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、C₁-C₄烷氧基、巯基C₁-C₄酰基和芳香基的取代基。

所说的药学上可接受的盐选自与丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、等有机酸和天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸形成酯后再与无机碱形成的盐，如钠、钾、钙、铝盐和铵盐，或与有机碱形成的盐，如甲胺盐、乙胺盐、乙醇胺盐等；或与赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸等碱性氨基酸形成酯后再与盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸，或与甲酸、乙酸，苦味酸、甲磺酸、乙磺酸等有机酸形成的盐。

体外细胞学实验表明，本发明化合物可引起肝癌、肺癌、前列腺癌及白血病等多种肿瘤细胞周期阻滞，显著抑制细胞增殖，因此可以用于制备针对包括肝癌在内的多种肿瘤生长的抑制药物。

附图说明

图1为本发明60种蟾蜍内酯类化合物(4×10^-4mg/ml)对SMMC-7721细胞抑制率图

图2为本发明60种蟾蜍内酯类化合物(4×10^-4mg/ml)对A549细胞抑制率图

图3为本发明中的华蟾毒精醇对SMMC-7721细胞抑制率比较图

图4为本发明中的华蟾毒精醇作用于正常细胞L02和293T的效果图

图5为本发明中的华蟾毒精醇对体内肿瘤的治疗曲线图

具体实施方式

现结合附图和实施例对本发明作详细描述。

实施例1.华蟾毒精醇的制备

(1)蟾蜍内酯提取物的制备

取蟾皮10Kg，按常规用95％乙醇提取3次，每次用醇量为10倍蟾皮重量，提取时间为120分钟，合并滤液，滤液减压浓缩至10L，上XAD-4大孔树脂(罗门哈斯)，先依次用水和30％乙醇洗去杂质，再用95％的乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，干燥得到蟾蜍内酯提取物125g。

(2)华蟾毒精醇的制备

取(1)所制得的蟾蜍内酯提取物75g，经制备型HPLC分离(Waters Xterra C18，A：0.1％甲酸水；B：0.1％甲酸乙腈，梯度条件：5％B～25％B，30min；25％B～50％B，22min；50％B～95％B，18min；95％B，5min，300nm)，分为60个成分(Fr.1～Fr.60)。

Fr.16回收溶剂，经HPLC分离(功能化色谱柱，梯度条件为：95％B～60％B，40min，其中A：0.1％甲酸水；B：0.1％甲酸乙腈，检测波长300nm。)，收集其中主要的色谱峰，回收溶剂，得到化合物I 11mg，HPLC检测含量为99％，理化测定数据与文献(Linde H.，Hofer P.，Meyer K.，1966，Cinobufaginol-Uber Krotengifte.32.，HELVETICA CHIMICA ACTA，49，1243-&.)报道的化合物华蟾毒精醇基本一致，据此可认为化合物I为华蟾毒精醇。

实施例2.60种蟾蜍内酯类化合物化合物对SMMC-7721和A549的细胞毒性实验

细胞：SMMC-7721和A549肿瘤细胞系，均为国际通用细胞株，取自中国人民解放军第二军医大学东方肝胆外科研究所

蟾蜍内酯类化合物：实施例1制备(下同)

分别以SMMC-7721和A549为细胞模型，用CCK-8细胞增殖试剂盒(日本同仁化学研究所产品)初筛了60个化合物。实验设计如下：

分别将对数生长期SMMC-7721和A549细胞以10％小牛血清DMEM培养基调整至5×10⁴个/ml，分设对照组和实验组，每组3个复孔，各100μl接种于96孔板内，置于37℃、含5％C0₂的培养箱中，待24h贴壁后，换10％小牛血清DMEM培养基100μl，实验组加入4×10^-4mg/ml各化合物。48h后，按照CCK-8试剂盒步骤操作，吸去培养基，各孔加入0.1％小牛血清DMEM培养基100μl，再加入CCK-8试剂10μl，另于3个空白孔内加入0.1％小牛血清DMEM培养基100μl及CCK-8试剂10μl，置于37℃、含5％CO₂的培养箱孵育90min，用多功能酶标仪测450nm处吸光值(A值)，以不加细胞的空白孔调零，计算细胞增殖抑制率。抑制率＝(1-实验组A值/对照组A值)×100％。结果如图1、图2所示。

由图1、图2可见，华蟾毒精醇对肝癌细胞系SMMC-7721和肺癌细胞系A549的增殖均有明显的抑制作用，其浓度在4×10^-4mg/ml时，抑制率已达到饱和水平(90％)，其他小分子在此浓度也有一定的抑制作用(10-20％)。

实施例3.华蟾毒精醇对SMMC-7721的细胞毒性实验

细胞：SMMC-7721肿瘤细胞系，为国际通用细胞株，取自中国人民解放军第二军医大学东方肝胆外科研究所

华蟾毒精醇：实施例1制备(下同)

华蟾素注射液：安徽金蟾生化股份有限公司(下同)

以SMMC-7721为细胞模型，用CCK-8细胞增殖试剂盒筛选不同浓度华蟾毒精醇的抑制率，实验设计如下：

将对数生长期SMMC-7721细胞以10％小牛血清DMEM培养基调整至5×10⁴个/ml，分设对照组(华蟾素注射液折合生药浓度分别为0.5×10^-3g/ml、1×10^-3g/ml、2×10^-3g/ml、4×10^-3g/ml、8×10^-3g/ml、16×10^-3g/ml，对应图3中A1-A6)和实验组(华蟾毒精醇0.25×10^-4mg/ml、0.5×10^-4mg/ml、1.0×10^-4mg/ml、2.0×10^-4mg/ml、3.0×10^-4mg/ml、4.0×10^-4mg/ml，折合生药浓度为0.375×10^-3g/ml、0.75×10^-3g/ml、1.5×10^-3g/ml、3×10^-3g/ml、4.5×10^-3g/ml、6×10^-3g/ml，对应图3中B1-B6)，每组3个复孔，各100μl接种于96孔板内，置于37℃、含5％CO₂的培养箱中，待24h贴壁后，换10％小牛血清DMEM培养基100μl，两组均按预定方案加入药物。48h后，按照CCK-8试剂盒步骤操作，吸去培养基，各孔加入0.1％小牛血清DMEM培养基100μl，再加入CCK-8试剂10μl，另于3个空白孔内加入0.1％小牛血清DMEM培养基100μl及CCK-8试剂10μl，置于37℃、含5％CO₂的培养箱孵育90min，用多功能酶标仪测450nm处吸光值(A值)，以不加细胞的空白孔调零，计算细胞增殖抑制率。抑制率＝(1-实验组A值/对照组A值)×100％。结果如图3所示。

由图3可见，华蟾毒精醇4×10^-4mg/ml时已达到饱和水平(90％)，折合生药浓度为8×10^-4g/ml；而为达到相同疗效，华蟾素注射液则需要160×10^-4g/ml(依据生药浓度换算)，两者浓度差距非常之大。

实施例4.华蟾毒精醇对非肿瘤细胞系的毒性作用

细胞：L02和293T，均为国际通用细胞株，取自中国人民解放军第二军医大学东方肝胆外科研究所

华蟾毒精醇：实施例1制备(下同)

为排除华蟾毒精醇是否存在非特异的细胞毒作用，选择非肿瘤细胞系L02和293T进行检测，实验设计如下：

分别将对数生长期正常肝上皮细胞L02和人胚肾上皮细胞293T以10％小牛血清DMEM培养基调整至5×10⁴个/ml，分设对照组和实验组，每组3个复孔，各100μl接种于96孔板内，置于37℃、含5％CO₂的培养箱中，待24h贴壁后，换10％小牛血清DMEM培养基100μl，实验组加入药物使得终浓度为1×10^-4mg/ml、2×10^-4mg/ml、3×10^-4mg/ml、4×10^-4mg/ml。48h后，按照CCK-8试剂盒步骤操作，吸去培养基，各孔加入0.1％小牛血清DMEM培养基100μl，再加入CCK-8试剂10μl，另于3个空白孔内加入0.1％小牛血清DMEM培养基100μl及CCK-8试剂10μl，置于37℃、含5％CO₂的培养箱孵育90min，用多功能酶标仪测450nm处吸光值(A值)，以不加细胞的空白孔调零，计算细胞增殖抑制率。抑制率＝(1-实验组A值/对照组A值)×100％。结果如图4所示(A为L02细胞，B为293T细胞)。

由图4可见，在非肿瘤细胞系L02和293T中，华蟾毒精醇对细胞的增殖作用不明显，且无特定的量效关系，低浓度与高浓度时抑制效果基本一致。最高浓度的抑制率仅能达到20％，说明它对肿瘤细胞的抑制不是非特异性毒性作用引起的(若为毒性作用，则应随着浓度的增高而存活率降低)。

实施例5.华蟾毒精醇对肿瘤的抑制作用

动物：Nude小鼠，由第二军医大学动物中心提供；SMMC-7721肿瘤细胞系，为国际通用细胞株，取自中国人民解放军第二军医大学东方肝胆外科研究所

华蟾毒精醇：实施例1制备(下同)

为检测华蟾毒精醇在动物体内抗肿瘤活性，选择Nude小鼠为模型，以华蟾素注射液作阳性参照，观察其治疗肿瘤效果。实验设计如下：

取8周Nude小鼠，6只均重约25克，雄性，皮下注射肝癌细胞系SMMC-7721细胞2×10⁶个，3周后成功荷瘤，随机分成2组，对照组3只，实验组3只。实验组按0.5mg*kg^-1*d^-1连续瘤内注射华蟾毒精醇，对照组连续瘤内注射等量生理盐水，观察4周。结果如图5所示。

由图5可见，与对照组相比，实验组肿瘤体积显著缩小，用配对t检验进行统计学分析，P＜0.05，表明华蟾毒精醇对肝癌有明显的治疗效果。

Claims (2)

1.一种蟾蜍内酯类化合物及其药学上可接受的盐，化学结构通式如下：

其中：基团R₁代表氢、卤素、C₁-C₆直链或支链的饱和或不饱和烃基、C₃-C₇环烃基、苄基、芳香基或5-7元杂环基，R₂代表氢、卤素、C₁-C₆直链或支链的饱和或不饱和烃基、C₃-C₇环烃基、苄基、芳香基或5-7元杂环基，R₃代表氢、卤素、C₁-C₆直链或支链的饱和或不饱和烃基、C₃-C₇环烃基、苄基、芳香基或5-7元杂环基，R₄代表氢、卤素、C₁-C₆直链或支链的饱和或不饱和烃基、C₃-C₇环烃基、苄基、芳香基或5-7元杂环基；

所说的卤素选自氟、氯、溴或碘；所说的芳香基选自苯基、取代苯基、萘基或联苯基；所说的取代苯基包括1～4个取代基，该取代基选自卤素、C₁-C₆直链或支链烃基、氰基、硝基、氨基、羟基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、C₁-C₄烷氧基、巯基和C₁-C₄酰基；所说的5-7元杂环基为含有1-3个选自氧、硫或氮的杂原子，和/或被结构式中的苯基并合，和/或含有一个或多个选自卤素、C₁-C₆直链或支链烃基、氰基、硝基、氨基、羟基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、C₁-C₄烷氧基、巯基C₁-C₄酰基和芳香基的取代基；

所说的药学上可接受的盐选自与丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、等有机酸和天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸形成酯后再与无机碱形成的盐，如钠、钾、钙、铝盐和铵盐，或与有机碱形成的盐，如甲胺盐、乙胺盐、乙醇胺盐等；或与赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸等碱性氨基酸形成酯后再与盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸，或与甲酸、乙酸，苦味酸、甲磺酸、乙磺酸等有机酸形成的盐。

2.权利要求1所述蟾蜍内酯类化合物及其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。

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