CN101457212A - 一株同时降解黄曲霉毒素b1、赭曲霉毒素a的菌株的筛选、培养和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开1株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)菌株，能够同时降解真菌毒素(mycotoxins)中的黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)和赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)。首先通过香豆素为惟一碳源的培养基初筛目的菌株，再用AFB1和OTA的毒素纯品二次筛选，然后应用到加标的粮食样本中，该菌株对加标粮食中AFB1和OTA的平均降解率分别达到82.2和78.7％。该发明可以应用到食品及饲料行业，脱除粮食、饲料中的AFB1和OTA。

Description

一株同时降解黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A的菌株的筛选、培养和应用

技术领域

本发明涉及一种同时降解AFB1和OTA的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)MZH-11，已经于2008.10.10在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏编号为CGMCC No.2775；本发明还涉及地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)CGMCC No.2775的分离、培养保存方法及应用。

背景技术

黄曲霉毒素(aflatoxin，AFT)是由Aspergillus flavus、A.nomius、A.parasiticus等多种真菌产生的次级代谢产物，其中黄曲霉毒素B1(AFB1)分布范围最广且化学性质最稳定，具有很强的致癌性、致突变性和致畸性，是国际认可的A类致癌物。

赭曲霉毒素A(OTA)是赭曲霉毒素中毒性最强，分布范围最广的化合物。1993年IARC将其确定为2B类致癌物。食品法典委员会(2001)认定赭曲霉毒素对人类威胁最重要的食品类别依次为：谷类>葡萄及其制品>咖啡豆及其制品>其他。

AFB1和OTA均属于剧毒化学品(LD50≤1mg.kg^-1.bw)。而且在谷物里会同时存在，AFB1和人类的肝癌有正相关；OTA可能是地区性慢性肾病以及尿道肿瘤的原因。针对婴儿食品，国际黄曲霉毒素B1的最低限量标准为0.10μg·kg^-1，2006年欧盟最新的赭曲霉毒素A的最大限量为0.50μg·kg^-1。

地衣芽孢杆菌是普遍认可的一个功能菌株。已经在医学方面有应用，例如调整肠道菌群等。地衣芽孢杆菌可以抑制真菌，本发明中解除毒素的作用，可以应用到饲料领域；其纯化的代谢物也可以有条件的应用到食品领域。

发明内容

为了减少AFB1和OTA对人和动物的危害，减少真菌毒素在饲料和食品中的含量，最终保证食品安全，本文通过选择样本、初筛、复筛、验证效果，获得1株地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)CGMCC No.2775，该菌株可以同时降解AFB1和OTA，加标玉米中AFB1和OTA的平均降解率分别达到78％和83％。

地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)CGMCC No.2775的形态学特征为：杆状，芽孢中生，革兰氏染色阳性，菌落光滑，边缘不整齐，与营养琼脂培养与培养基结合较紧密；地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)CGMCC No.2775的形态学特征为：接触酶阴性，氧化酶阴性，发酵葡萄糖、果糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖，不发酵半乳糖、棉籽糖、乳糖，菌株生长耐10％的盐，耐60℃温度，淀粉水解酶阳性，明胶水解阴性，pH值5-9生长；其分子生物学特征，16srDNA序列(TACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAGCCTCGCGGCTTCGCTGCCCTTTGTTCTGCCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGAAGCCCTATCTCTAGGGTTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTTGCTGCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTACCGCCCTATTCGAACGGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGTTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCTAAAAGCCACCTTTTATGATTGAACCATGCGGTTCAATCAAGCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTGACCTAAGGGAGCAAGCTCCCGTCGGTCCGCTCGAC)

本发明中提供了地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的筛选、分离方法以及培养、保存方法。

本发明之所以获得可以同时降解AFB1和OTA的地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)，主要是采用了合适的样本来源(从动物粪便、发霉粮食、腐败饲料、枯枝败叶以及发酵食品等)，初筛和复筛的二次筛选方法，而且，在初筛中选择了合适的、特定的初筛培养基(A：基本培养基，磷酸氢二铵0.01-0.1％，磷酸二氢钾0.1-0.2％，磷酸氢二钠0.3-0.4％，硫酸钠0.05-0.1％，硝酸钠0.1-0.2g，琼脂1.2-2％，pH7.2-7.4；B：香豆素≤0.5％)，培养温度36±1℃，筛选出的菌株可能能够降解具香豆素结构的化合物(例如，AFB1或者OTA)。

之后选择复筛降解AFB1的培养基(蛋白胨0.5-1％，牛肉膏0.3-1％，AFB1 0.1-5mg/L，pH7.2-7.4)，以及降解OTA的培养基(蔗糖2-3％，硝酸钠0.2-0.3％，磷酸二氢钾0.1-0.2％，硫酸镁0.05-0.1％，氯化钾0.05-0.1％，硫酸亚铁0.001-0.005％，OTA达到0.1-5mg/L，pH6.0-6.5)分别检测降解毒素的能力，温度36±1℃培养，该方法筛选出的阳性菌株就能够降解AFB1和OTA，选择其中生长最好的一株菌株MZH-11。

本发明之一还在于在常规培养和保存中，既能保有菌株降解AFB1和OTA的性质，又能保证其正常生长，采用了特殊的保存培养基(蛋白胨0.1-0.5％，牛肉膏0.1-0.5％，香豆素≤0.05％，pH7.2-7.4)，培养温度同上，常规保存温度在4℃。

本发明还包括应用到加标的粮食样本中(AFB1和OTA分别为0.1-5mg/L)，对AFB1和OTA的进行降解。可以初步应用到饲料行业。

有益效果

本发明通过使用地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)CGMCC No.2775，降解粮食中的AFB1和OTA，加标玉米的AFB1和OTA浓度分别为0.1-5mg/L时，多次试验的AFB1和OTA平均降解率分别达到82.2和78.7％。

保藏信息说明

本发明的地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)MZH-11菌株，已经于2008.10.10在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏(中国、北京、朝阳区大屯路甲3号中国微生物所内)，保藏编号为CGMCC No.2775。

具体实施方式

下面结合具体实施范例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

降解AFB1和OTA的芽孢杆菌(Bacillus spp)菌株的初筛

以动物粪便、发霉粮食、腐败饲料、枯枝败叶以及发酵食品等为材料，采用80℃水浴15min后的梯度稀释分离法，37℃好氧营养琼脂培养(蛋白胨5g；牛肉膏3g；水1000mL；pH7.2-7.4)，获得1500多株芽孢菌菌株。

以香豆素为惟一碳源和能源进行AFB1和OTA降解菌株的初筛。配制浓度为≤0.5％香豆素溶液(初筛培养基B组分)，选取筛选到的芽孢菌，用灭菌竹签接于装有香豆素溶液的36孔接种器中，然后接种到初筛培养基A中，保证香豆素成为惟一的碳源和能源，将其置于37℃培养箱中培养一周，观察菌株的生长情况。将10株生长较好的菌落在保存培养基试管斜面上划线培养(蛋白胨5g；牛肉膏3g；水1000mL；香豆素≤0.05％；pH7.2-7.4)。这些菌株可能降解具香豆素结构的化合物——AFB1、OTA。

菌株通过梯度稀释倾注平板法分离单菌落，镜检验证其纯度，试管斜面冷藏使用，并将菌株备份保存于甘油管中，放置于-20℃的冰箱保藏。

实施例2

降解AFB1芽孢杆菌(Bacillus spp)菌株的复筛

初筛菌株分别接种于降解AFB1的复筛培养基(不加AFB1)中发酵24小时，取800μL菌体发酵液加入200μL的AFB1(500μg·kg^-1)置于灭菌的玻璃试管中，以无菌降解AFB1的复筛培养基作为空白对照，将其置于37℃培养箱培养72小时，做三次重复。结果：MZH-11的降解AFB1能力最强，降解率达到84.5％；39-4的降解能力次之，第三是E-2(表1)。而且前几个菌株在固体培养基生长的速度比较快，香豆素利用能力较强，复筛结果证实这3株菌均能降解AFB1(AFB1降解率≥75％)。

表1 初筛菌株降解AFB1的检测结果^*

^*对照的AFB1值设为100％-表示检测结果不确定

实施例3

同时降解OTA的芽孢杆菌MZH-11的复筛和鉴定

选择芽孢杆菌MZH-11、39-4、E-2菌株活化培养，分别接种于降解OTA的复筛培养基(不加OTA)中发酵24小时，取发酵液20mL，加入100μg的OTA(5mg·kg^-1)置于灭菌的玻璃试管中，以无菌的降解OTA的复筛培养基作为空白对照(CK)，将其置于37℃培养箱避光培养36小时，做三次重复。结果：MZH-11的降解OTA能力最强，降解率达到73.6％(表2)。而且该菌株在固体培养基生长的速度较快，菌落较大，复筛结果证实其不仅降解AFB1，还能够降解OTA。

选择MZH-11进行培养鉴定，形态学表现为杆状，有芽孢，革兰氏染色阳性，菌落光滑，边缘不整齐，与营养琼脂培养与培养基结合较紧密；生理生化反应结果为：接触酶阴性，氧化酶阴性，发酵葡萄糖、果糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖，不发酵半乳糖、棉籽糖、乳糖，菌株生长耐10％的盐，耐60℃温度，淀粉水解酶阳性，明胶水解阴性，pH值5-9生长，最适培养温度37℃；参考《伯杰氏细菌鉴定手册》初步鉴定MZH-11属于芽孢杆菌属(Bacillus，sp)，通过其16srDNA序列，鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。

表2 降解AFB1的菌株降解OTA的检测结果^*

^*对照的OTA值设为100％

实施例4

地衣芽孢杆菌CGMCC No.2775同时降解粮食中的AFB1和OTA(浓度分别为0.1mg/L)

粮食中含有AFB1或OTA会给人畜造成危害，AFB1表明和人类的肝癌有关系，OTA的实验动物结果表明其具致癌、致畸、致突变的危害。而且，常常多种真菌毒素存在于一类商品中。我国用于食用的粮食中规定其含量均低于5μg.kg^-1。本发明中的地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)CGMCC No.2775可同时降解粮食中的AFB1和OTA(浓度分别为0.1mg/L)，降解率均高于80％(表3)。

300mL三角瓶中加入100g不含AFB1和OTA的玉米面，灭菌备用。其中加入AFB1和OTA标准品，分别达到100μg.kg^-1，接种10⁷cfu/mL浓度的地衣芽孢杆菌100mL，37℃避光培养，实验设不加菌的对照(CK)。72小时后检测AFB1和OTA，设三个重复。

表3 地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)CGMCC No.2775降解玉米中AFB1和OTA的检测结果^*

^*对照的AFB1和OTA值设为100％

试验表明，地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)CGMCC No.2775能够同时降解加标玉米中AFB1和OTA，降解率达到88.6％和84.4％。

实施例5

地衣芽孢杆菌CGMCC No.2775同时降解玉米中的AFB1和OTA(浓度分别为0.5mg/L)

我国规定的作为饲料用粮食(尤其是玉米)中含有AFB1≤20μg.kg^-1，含有OTA的限量为≤100μg.kg^-1。我国的饲用用玉米中就同时检出过AFB1和OTA。玉米中的AFB1和OTA浓度分别为0.5mg/L时，本发明中的地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)CGMCC No.2775可同时降解其中的AFB1和OTA，AFB1和OTA的平均降解率分别达到78％和83％(表4)。

300mL三角瓶中加入100g不含AFB1和OTA的玉米面，灭菌备用。其中加入AFB1和OTA标准品，分别达到500μg.kg^-1，接种10⁷cfu/mL浓度的地衣芽孢杆菌100mL，37℃避光培养，实验设不加菌的对照(CK)。72小时后检测AFB1和OTA，设三个重复。

表4 地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)CGMCC No.2775降解玉米中AFB1和OTA的检测结果^*

^*对照的AFB1和OTA值设为100％

试验表明，地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)CGMCC No.2775能够同时降解加标玉米中AFB1和OTA，降解率分别达到80.5-85.2％和76.4-80.1％，平均降解率为82.9％和78.3％。

实施例6

地衣芽孢杆菌CGMCC No.2775同时降解玉米中的AFB1和OTA(浓度分别为5mg/L)

在玉米样本中添加AFB1和OTA浓度高达5mg/L时，地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)CGMCC No.2775仍然可以同时降解粮食中的AFB1和OTA，降解率超过70％(表5)。

300mL三角瓶中加入100g不含AFB1和OTA的玉米面，灭菌备用。其中加入AFB1和OTA标准品，分别达到5mg.kg^-1，接种10⁷cfu/mL浓度的地衣芽孢杆菌100mL，37℃避光培养，实验设不加菌的对照(CK)。72小时后检测AFB1和OTA，设三个重复。

表5 地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)CGMCC No.2775降解玉米中AFB1和OTA的检测结果^*

^*对照的AFB1和OTA值设为100％

试验表明，地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)CGMCC No.2775在玉米样本中添加AFB1和OTA浓度高达5mg/L时，仍然能够同时降解加标玉米中AFB1和OTA，玉米中AFB1和OTA平均降解率为75.0％和73.5％。

Claims (6)

1、筛选降解AFB1和OTA的地衣芽孢杆菌的筛选方法，其包括内容：从动物粪便、发霉粮食、腐败饲料、枯枝败叶以及发酵食品等样本中筛选能够降解香豆素的菌株；二次筛选能够降解黄曲霉毒素(AFB1)和赭曲霉毒素A(OTA)的菌株，采用初筛培养基(基础培养基含≤0.5％的香豆素)分离的多株能够降解香豆素的菌株，再用这些菌株同时分别接种复筛培养基(肉汤培养基+特定浓度的真菌毒素)，选择到1株同时降解两种毒素的细菌，通过形态学，生理、生化鉴定，以及16rDNA序列分析，确定该菌株是地衣芽孢杆菌。

2、根据权利要求1所获得的筛选降解AFB1和OTA的培养基配方，

初筛培养基：

A：基本培养基

   磷酸氢二铵 0.01-0.1％

   磷酸二氢钾 0.1-0.2％

   磷酸氢二钠 0.3-0.4％

   硫酸钠 0.05-0.1％

   硝酸钠 0.1-0.2g

   琼脂 1.2-2％

   pH7.2-7.4

B：香豆素(≤0.5％，过滤灭菌，实验中将菌株接于其中，再转接于初筛培养基A中)复筛培养基(降解AFB1)：

   蛋白胨 0.5-1％

   牛肉膏 0.3-1％

   AFB1 0.1-5mg/L

   pH7.2-7.4

复筛培养基(降解OTA)：

   蔗糖 2-3％

   硝酸钠 0.2-0.3％

   磷酸二氢钾 0.1-0.2％

   硫酸镁 0.05-0.1％

   氯化钾 0.05-0.1％

   硫酸亚铁 0.001-0.005％

   OTA达到 0.1-5mg/L

   pH6.0-6.5

3、根据权利要求1所述方法获得的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)MZH-11，保藏编号为CGMCC No.2775。

4、由权利要求1分离的权利要求3的菌株的培养，其特征在于所用培养和保存用培养基的组分

蛋白胨 0.1-0.5％

牛肉膏 0.1-0.5％

香豆素 ≤0.05％

pH7.2-7.4

5、权利要求3的地衣芽孢杆菌在分别或同时降解AFB1和OTA的应用。

6、权利要求5的地衣芽孢杆菌的解毒作用。主要应用在以粮食为原料的饲料行业。