CN112641032B - 基于隐球酵母y3胞内酶降解赭曲霉毒素a的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物防治技术领域，涉及一种基于隐球酵母Y3胞内酶降解赭曲霉毒素A的用途；步骤为：首先将隐球酵母Y3接入NYDB培养基中，培养活化后，取菌液涂布于NYDA培养基；然后，挑选单菌落接种到PM培养基中，培养后经离心得到菌体，无菌蒸馏水清洗后，稀释成1×10⁸cells/mL的菌悬液，接种于PM培养基中培养后，离心收集菌体，加入液氮、研磨，得到粉末状的菌体；再加入Tris‑HCl缓冲液重悬，震荡后经冰浴处理、离心，收集上清液，通过有机针孔滤膜过滤除菌，得到胞内酶溶液；在胞内酶溶液中加入赭曲霉毒素A，在避光环境下，震荡培养，即可实现降解赭曲霉毒素A的用途；本发明安全环保，可高效快速降解赭曲霉毒素A。

Description

基于隐球酵母Y3胞内酶降解赭曲霉毒素A的用途

技术领域

本发明属于生物降解毒素的方法，具体涉及一种基于隐球酵母Y3胞内酶降解赭曲霉毒素A的用途。

背景技术

真菌毒素是由真菌类微生物产生的次级代谢产物，到目前为止，人们发现了至少300种真菌毒素。世界上毒性最强的五类真菌毒素中，赭曲霉毒素A排列第二，其最明显的毒性作用是肾毒性，其次还有肝脏、免疫毒性等，被国际癌症研究机构列为2B类人类致癌物。

除了严重的毒性作用，赭曲霉毒素A在食品和饲料中污染严重。自然界中产生赭曲霉毒素A的主要霉菌有两类，第一类是Aspergillus ochraceus和Penicilliumverrucosum，这两类真菌的寄主主要是农作物，包括玉米、小麦、水稻等，该类霉菌在热带和亚热带地区发病较为严重；还有一种霉菌是Aspergillus carbonarins，其寄主主要是葡萄，该类霉菌在寒冷的地区发病比较严重。到目前为止，赭曲霉毒素A已经被发现存在于各类食品中，如酱油，葡萄及其制品，以及肉类产品和咖啡中。赭曲霉毒素A在人体中的存在也是令人担忧的问题，2019年基于葡萄牙地区的研究发现，超过90％的儿童的尿液中被检测到该毒素。

由于赭曲霉毒素A极强的毒性和广泛的污染，在食品和饲料中控制其含量是保障食品安全的重要举措。赭曲霉毒素A是由-羧基-5-氯-8-羟基-3，4-二氢-3-R-甲基异香豆素(赭曲霉毒素α)和L-β-苯丙氨酸通过酰胺键连在一起的聚酮类化合物，耐酸性和高温环境，在自然环境中较难降解。一般通过断裂酰胺键，生成赭曲霉毒素α和L-β-苯丙氨酸达到解毒的效果。

目前对赭曲霉毒素A的控制方法包括物理方式、化学方式、生物方式。物理方式降解赭曲霉毒素A包括吸附和加热降解；吸附是常见的脱除毒素的方法，但是不能彻底降解毒素，使其残留在环境中，造成二次污染；加热也是脱除赭曲霉毒素A的有效方式，但是容易造成产品品质降低的问题。化学方式降解赭曲霉毒素A也是常见的脱毒方式，而且已经研究出的降解赭曲霉毒素A的化学方式多样化，如利用过氧化物酶(POD)、蛋白质和糖类降解赭曲霉毒素A，但是操作复杂，成本较高。

近年来，采用微生物及其产生的酶降解毒素成为研究的热点，虽然已有较多的酵母菌、乳酸菌和霉菌被发现具有降解赭曲霉毒素A的功效，但是发掘出来的降解酶的种类有限、而且降解效果不佳，因此，挖掘新的高效降解酶是非常必要的。

发明内容

针对现有技术的缺陷与不足，本发明提供一株分离筛选自土壤的隐球酵母(Cryptococcus podzolicus)Y3，基于隐球酵母Y3的胞内酶降解赭曲霉毒素A，其具有高安全性和极高的降解效果。

本发明所提供的降解赭曲霉毒素A的隐球酵母系从镇江市句容市果园收集的土壤中筛选分离到的，在NYDA固体培养基平板上28℃培养3d，进行形态学观察；已经对该菌株的5.8S rDNA-ITS区序列进行分析并进行了分子生物学鉴定。同时，本发明所提供的酵母菌株，现保藏于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC NO：M2017505，建议的分类命名为隐球酵母(Cryptococcus podzolicus)Y3。此外，本发明所利用的菌株申请人已经申请中国发明专利，CN201711183834.0，发明名称为：一株降解桔霉素的酵母菌及应用。

为了实现以上目的，本发明采用的技术方案如下：

(1)配制菌悬液：将隐球酵母Y3接入NYDB培养基中，在28～30℃、180rpm震荡条件下，培养20～24h，进行活化，得到活化后的菌液；然后取活化后的菌液涂布于NYDA固体培养基，培养温度28℃～30℃，时间48-60h；然后，挑选NYDA固体培养基生长的隐球酵母Y3单菌落接种到PM培养基中进行培养，培养后经离心得到菌体，并用无菌蒸馏水清洗数次，清洗后再次离心，收集菌体用无菌水稀释成菌悬液；

(2)取步骤(1)制备的菌悬液，接种于PM培养基中，在28～30℃、180rpm震荡条件下，培养20～24h，离心收集酵母菌体，无菌蒸馏水清洗后再次离心收集酵母菌体，然后加入液氮速冻菌体，进行研磨，得到粉末状的菌体；然后将粉末状的菌体加入Tris-HCl缓冲液(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，50mM，pH 7.1)重悬，震荡后进行冰浴处理，处理后离心，收集上清液，即为胞内粗酶液；

(3)再将步骤(2)中得到的胞内粗酶液通过针孔滤膜过滤除菌，得到胞内酶溶液；在胞内酶溶液中加入赭曲霉毒素A，在避光环境下，震荡培养，即可实现快速降解赭曲霉毒素A的用途。

优选的，步骤(1)中所述离心的转速为7000r/min，时间为10min。

优选的，步骤(1)中所述的NYDA培养基成分如下：以1000mL计，牛肉膏8g，酵母浸出物5g，葡萄糖10g，琼脂20g，余量为蒸馏水，115℃湿热灭菌15min。

优选的，步骤(1)中所述的NYDB培养基成分如下：以1000mL计，酵母膏5g，葡萄糖10g，牛肉浸膏8g，余量为蒸馏水，pH自然，115℃湿热灭菌15min。

优选的，步骤(1)中所述PM培养基成分如下：麦芽糖2g，蔗糖10g，酵母浸5g，蛋白胨5g，一级蒸馏水1000mL，115℃湿热灭菌15min。

优选的，步骤(1)中所述单菌落接种到PM培养基中进行培养的温度为28℃～30℃，时间为48h。

优选的，步骤(1)中所述用无菌蒸馏水清洗数次具体为2～3次；所述菌悬液的浓度为1×10⁸cells/mL。

优选的，步骤(2)中所述菌悬液接种于PM培养基中的接种量为1％～2％；即菌悬液为PM培养基体积的1％～2％。

优选的，步骤(2)中所述震荡的时间为1～2min；所述冰浴处理的时间为30～35min；所述离心的条件为：4℃，15～20min、11000×g。

优选的，步骤(3)中所述针孔滤膜的孔径为0.22μm，所述滤膜为有机滤膜；所述震荡培养的条件为：28℃，180rpm，时间0～3h。

本发明的优点：

(1)本发明提供隐球酵母Y3的胞内酶可以高效快速降解赭曲霉毒素A，胞内酶与赭曲霉毒素A混合后就能够即时降解，而且降解效果显著；在0h，针对OTA初始浓度为1μg/mL，降解率为83.2％；在OTA初始浓度提高为10μg/mL，在0h的降解率仍为70％以上。

(2)本发明使用的隐球酵母Y3，已经经过小鼠急性毒性试验，确定其具有高度安全性，对人体无害，因此可应用于控制食品、饲料及其制品等中的赭曲霉毒素A污染，保障食品及其制品的食用安全性。

附图说明

图1为隐球酵母Y3的胞内酶对PM培养基中赭曲霉毒素A的降解效果图；其中：1μg/mL、10μg/mL和20μg/mL分别表示OTA与胞内酶溶液混合后的初始浓度。

具体实施方式

通过借助以下实施实例将更加详细的说明本发明；以下实施例仅是说明性的，本发明并不受这些实施实例的限制。

实施例1：

(1)配制菌悬液：将隐球酵母Y3接入NYDB培养基中，在28℃、180rpm震荡条件下，培养24h，进行活化，得到活化后的菌液；然后取活化后的菌液涂布于NYDA固体培养基，培养温度28℃，时间48h；然后，挑选2环NYDA固体培养基生长的隐球酵母Y3单菌落，接种到50mL的PM培养基中进行培养，培养后经离心得到菌体，并用无菌蒸馏水清洗3次，清洗后再次离心，收集菌体用无菌水稀释成1×10⁸cells/mL的菌悬液；

(2)取步骤(1)制备的菌悬液，按照2％的添加量接种于PM培养基中，在28℃、180rpm震荡条件下，培养24h，7000rpm离心10min离心收集酵母菌体，无菌蒸馏水清洗后再次离心收集酵母菌体；然后再加入无菌蒸馏水清洗、离心；如此重复清洗3次；收集菌体后加入液氮速冻菌体，进行研磨，得到粉末状的菌体；然后将粉末状的菌体加入Tris-HCl缓冲液(50mM，pH 7.1)重悬，震荡1min后进行冰浴处理30min，处理后，以11000×g离心15min，收集上清液，即为胞内粗酶液；

(3)再将步骤(2)中得到的胞内粗酶液通过0.22μm有机针孔滤膜过滤除菌，得到胞内酶溶液；在胞内酶溶液中加入赭曲霉毒素A，在避光环境下，180rpm，28℃震荡培养，即可实现降解赭曲霉毒素A的用途。

降解效果：

取样时间选择0、1、2、3h；以无菌缓冲液代替胞内酶为对照组。

在胞内酶溶液中加入赭曲霉毒素A，混合后即去取样，记为0h：

在胞内酶溶液中加入赭曲霉毒素A，混合震荡培养1h后即去取样，记为1h：

在胞内酶溶液中加入赭曲霉毒素A，混合震荡培养2h后即去取样，记为2h：

在胞内酶溶液中加入赭曲霉毒素A，混合震荡培养3h后即去取样，记为3h：

样品加入等量色谱级甲醇，涡旋振荡混匀，然后过0.22μm有机针孔滤头，置于棕色进样瓶中，放在4℃环境中，待用HPLC-FLD测定。

液相检测条件为：采用Zorbax SB-C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈(60％)：1％乙酸(40％)；流速为1.0mL/min；每次进样20μL，柱温为30℃；荧光检测器的激发波长为333nm，发射波长为460nm；出峰时间约为5.4min。

如图1所示，隐球酵母Y3的胞内酶在0h时，对赭曲霉毒素A的降解率为83.2％(初始浓度为1μg/mL)、70.1％(初始浓度为10μg/mL)和52.4％(初始浓度为20μg/mL)；

1h时，对赭曲霉毒素A的降解率为100％(初始浓度为1μg/mL)、99.5％(初始浓度为10μg/mL)和98.9％(初始浓度为20μg/mL)；

2h时，液相条件下已经检测不到赭曲霉毒素A；3h时，液相条件下也已经检测不到赭曲霉毒素A。

综合所述，隐球酵母Y3的胞内酶对酶赭曲霉毒素A具有极好的降解效果。

说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

Claims (10)

1.基于隐球酵母Y3胞内酶降解赭曲霉毒素A的用途，其特征在于，具体步骤如下：

(1)配制菌悬液：将隐球酵母Y3接入NYDB培养基中，在28～30℃、180rpm震荡条件下，培养20～24h，进行活化，得到活化后的菌液；然后取活化后的菌液涂布于NYDA固体培养基，培养温度28℃～30℃，时间48-60h；然后，挑选NYDA固体培养基生长的隐球酵母Y3单菌落接种到PM培养基中进行培养，培养后经离心得到菌体，并用无菌蒸馏水清洗数次，清洗后再次离心，收集菌体用无菌水稀释成菌悬液；

(2)取步骤(1)制备的菌悬液，接种于PM培养基中，在28～30℃、180rpm震荡条件下，培养20～24h，离心收集酵母菌体，无菌蒸馏水清洗后再次离心收集酵母菌体，然后加入液氮速冻菌体，进行研磨，得到粉末状的菌体；然后将粉末状的菌体加入Tris-HCl缓冲液重悬，震荡后进行冰浴处理，处理后离心，收集上清液，即为胞内粗酶液；

(3)再将步骤(2)中得到的胞内粗酶液通过针孔滤膜过滤除菌，得到胞内酶溶液；在胞内酶溶液中加入赭曲霉毒素A，在避光环境下，震荡培养，即可实现降解赭曲霉毒素A的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤(1)中所述离心的转速为7000r/min，时间为10min。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤(1)中所述的NYDA培养基成分如下：以1000mL计，牛肉膏8g，酵母浸出物5g，葡萄糖10g，琼脂20g，余量为蒸馏水，115℃湿热灭菌15min。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的NYDB培养基成分如下：以1000mL计，酵母膏5g，葡萄糖10g，牛肉浸膏8g，余量为蒸馏水，pH自然，115℃湿热灭菌15min。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤(1)中所述PM培养基成分如下：麦芽糖2g，蔗糖10g，酵母浸膏5g，蛋白胨5g，一级蒸馏水1000mL，115℃湿热灭菌15min。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤(1)中所述单菌落接种到PM培养基中进行培养的温度为28℃～30℃，时间为48h。

7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤(1)中所述用无菌蒸馏水洗涤数次具体为2～3次；所述菌悬液的浓度为1×10⁸cells/mL。

8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤(2)中所述菌悬液接种于PM培养基中的接种量为1％～2％。

9.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤(2)中所述震荡的时间为1～2min；所述冰浴处理的时间为30～35min；所述离心的条件为：4℃，15～20min、11000×g。

10.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤(3)中所述针孔滤膜的孔径为0.22μm，有机相；所述震荡培养的条件为：28℃，180rpm，时间0～3h。

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