Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

CN118064296A - 一种抑制平菇细菌性病害的复合菌剂 - Google Patents

一种抑制平菇细菌性病害的复合菌剂 Download PDF

Info

Publication number
CN118064296A
CN118064296A CN202311429920.0A CN202311429920A CN118064296A CN 118064296 A CN118064296 A CN 118064296A CN 202311429920 A CN202311429920 A CN 202311429920A CN 118064296 A CN118064296 A CN 118064296A
Authority
CN
China
Prior art keywords
disease
bacillus
lactobacillus brevis
oyster mushroom
yss1
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202311429920.0A
Other languages
English (en)
Inventor
张殿朋
卢彩鸽
刘建斌
赵爽
高琪
宋爽
郭远
刘宇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BEIJING ACADEMY OF AGRICULTURE AND FORESTRY SCIENCES
Original Assignee
BEIJING ACADEMY OF AGRICULTURE AND FORESTRY SCIENCES
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BEIJING ACADEMY OF AGRICULTURE AND FORESTRY SCIENCES filed Critical BEIJING ACADEMY OF AGRICULTURE AND FORESTRY SCIENCES
Priority to CN202311429920.0A priority Critical patent/CN118064296A/zh
Publication of CN118064296A publication Critical patent/CN118064296A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/22—Bacillus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
    • A01P1/00—Disinfectants; Antimicrobial compounds or mixtures thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • C12R2001/24—Lactobacillus brevis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

本发明公开了一种抑制平菇细菌性病害的复合菌剂。其活性成分包括上述贝莱斯芽孢杆菌和/或其代谢物及上述短乳杆菌和/或其代谢物。所述病害为平菇细菌性病害，具体可为下述至少一种：美洲爱文氏菌病害、托拉斯假单胞菌病害。本发明筛选并开发了一种防控平菇细菌性病害的复合菌剂，所述复合菌剂能够有效抑制平菇病原菌Ewingella americana及平菇病原菌托拉斯假单胞菌(Pseudomonas tolassii)，是一种绿色无污染的平菇细菌性病害防控手段。

Description

一种抑制平菇细菌性病害的复合菌剂
技术领域
本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及一种抑制平菇细菌性病害的复合菌剂，更具体涉及一种贝莱斯芽孢杆菌、短乳杆菌及其在平菇细菌性病害绿色防控中的应用。
背景技术
食用菌(Edible mushroom)是指能形成大型肉质或胶质的子实体或菌核类组织并能供人们食用或药用的一类大型真菌。我国已知的食用菌约 41 科，132 属，657 种，食用菌在分类上属于菌物界真菌门，绝大多数属于担子菌亚门(如平菇、香菇)，少数属于子囊菌亚门(如羊肚菌)。
食用菌不仅味道鲜美，而且营养价值十分丰富。从食用价值来看，食用菌含有丰富的蛋白质和氨基酸，其含量是一般蔬菜和水果的几倍到几十倍。除此之外，食用菌还含有维生素以及多种矿质元素，例如银耳中就含有大量的磷，有助于恢复和提高大脑功能。从药用价值来看，食用菌中含有生物活性物质，能有效的维护人体健康。其主要的药用保健功能有：抗癌作用、抗菌抗病毒作用、降血压血脂、利胆保肝、免疫调节等作用。除此之外，食用菌的药用价值还表现在化妆品领域，如抗氧化，抗老化，抗皱，美白和保湿功效，食用菌栽培的废弃物可以作为肥料和添加剂循环使用，可改善植树和土壤条件。
平菇是食用菌的重要一个成员，因其容易栽培、产量高、生长季节较短等优点。
由美洲爱文氏菌(Ewingella americana)引起的平菇褐斑病是一种细菌病害，它是平菇上的一类重要的病害。美洲爱文氏菌病的普遍发生造成了平菇的大量减产，严重影响了子实体的食用价值和市场价值，导致了菇农的经济收入降低。由于缺少必要的有效防控药剂，平菇细菌性病害引起的损失量占总量的30%以上。细菌性病的发生已给现代食用菌生产与加工造成了严重影响。
由于平菇鲜食采摘，生长周期极短，因此对食品安全要求较高。目前市场上登记的对平菇细菌性病害的有效防控的化学药剂较少，主要是因为不同于田间作物、大棚蔬菜种植，食用菌对食品安全要求极高。所以利用有益微生物开发能够防控平菇细菌性病害的绿色植保投入品显得较为迫切和重要。但是因为平菇本身也是一种微生物，是一种大型真菌，因此相比其他农业作物而言，筛选及开发防控平谷细菌性病害的微生物生防产品难度较大、工作量也较大。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种贝莱斯芽孢杆菌。
本发明所提供的贝莱斯芽孢杆菌，为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，其菌株号为YSS1， 其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No. 28604。
所述贝莱斯芽孢杆菌的16S rRNA 基因的核苷酸序列含有序列表中 SEQ ID NO.1所示的 DNA 分子。
所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YSS1 的形态学特征为：菌体细胞呈短杆状，直或近直，芽孢中生，柱状或椭圆形，具有运动性；在LB 培养基上不产色素，菌落为白色不透明，扁平或圆形，无光泽，随着培养时间增长，菌落变厚变干，边缘不整齐，菌落上有褶皱，变为乳脂色。
所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YSS1 的生理生化特征为：革兰氏染色阳性，形成菌膜；该菌在pH值7.5环境下能够正常生长，在pH值8.5和pH值9.5环境下不能生长；该菌株能够利用甘油、L-阿拉伯糖、D-核糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、卫茅醇、肌醇、甘露醇、α-甲基-D-甘露糖糖苷、α-甲基-D-葡萄糖糖苷、N-乙酰-葡萄糖胺、苦杏仁苷、熊果苷、七叶灵柠檬酸铁、水杨苷、D-纤维二糖、D-麦芽糖、D-乳糖、D-蜜二糖、D-蔗糖、D-松三糖、D-棉子糖、淀粉、木糖醇、D-龙胆二糖、葡萄糖酸钾、2酮基-葡萄糖酸钾；YSS1在环境温度为4℃下生长势弱，在20 ℃和40 ℃下生长良好，60 ℃下不能生长，在55℃-80℃下处理15min，仍可正常生长；所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YSS1 产纤维素酶、蛋白酶和几丁质酶。
本发明的目的之二在于提供一种短乳杆菌。
本发明所提供的短乳杆菌，为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，其菌株号为DR1，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为 CGMCC No.27389。
所述短乳杆菌的16S rRNA 基因的核苷酸序列含有序列表中 SEQ ID NO.2所示的DNA 分子。
所述短乳杆菌(Lactobacillus brevis) DR1的菌体细胞在400倍光学显微镜下菌体细胞呈短杆状，直或近直，柱状或椭圆形；在MRS琼脂平板上培养24小时后，菌落为圆形白色不透明，表面平，湿润，边缘整齐，菌落上无褶皱，乳脂色；菌株DR1的生理生化特征为革兰氏染色阳性，接触酶、氧化酶反应阴性，形成菌膜，甲基红、乙酰甲基甲醇、硝酸盐还原、吲哚反应、、尿酶阳性，可水解明胶、纤维素、淀粉和七叶苷，氧化酶反应、分解酪氨酸阴性，产生硫化氢，利用柠檬酸盐，不利用丙二酸盐，精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶反应阳性，苯丙氨酸脱氨酶反应阴性，葡萄糖、蔗糖产酸产气，可利用葡萄糖、乳糖、果糖、麦芽糖、蜜二糖、蔗糖等；不可利用甘露糖、甘露醇。
本发明的目的之三在于提供上述贝莱斯芽孢杆菌和/或其代谢物在抑制病原菌、制备病原菌抑制剂、抑制病害、制备病害抑制剂中的应用。
本发明的目的之四在于提供上述短乳杆菌和/或其代谢物在抑制病原菌、制备病原菌抑制剂、抑制病害、制备病害抑制剂中的应用。
上述应用中，所述病原菌为下述至少一种：美洲爱文氏菌Ewingella americana、托拉斯假单胞菌Pseudomonas tolaasii；
所述病害为食用菌细菌性病害，具体可为：平菇美洲爱文氏菌病害、托拉斯假单胞菌病害中至少一种。
本发明还提供一种复合菌剂。
本发明所提供的复合菌剂，其活性成分包括上述贝莱斯芽孢杆菌和/或其代谢物及上述短乳杆菌和/或其代谢物。
所述贝莱斯芽孢杆菌的代谢物可从所述莱斯芽孢杆菌的发酵液中获得。
所述短乳杆菌的代谢物可从所述短乳杆菌的发酵液中获得。
具体地，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YSS1的代谢物可按照如下方法制备得到：在液体培养基中培养所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YSS1，除去液体培养物(发酵液)中的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YSS1 即得到所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YSS1的代谢物。
本发明中的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YSS1对平菇细菌性病害包括Ewingella americana和Pseudomonas tolaasii具有抑制作用。
具体地，短乳杆菌 (Lactobacillus brevis) DR1的代谢物具体可按照如下方法制备得到：在液体MRS培养基中培养所述短乳杆菌 (Lactobacillus brevis) DR1，除去液体培养物(发酵液)中的短乳杆菌 (Lactobacillus brevis) DR1 即得到所述短乳杆菌(Lactobacillus brevis) DR1的代谢物。
本发明中的短乳杆菌 (Lactobacillus brevis) DR1 对平菇细菌性病害包括Ewingella americana和Pseudomonas tolaasii具有抑制作用。
所述复合菌剂中，按照贝莱斯芽孢杆菌YSS1(有效菌含量10-100亿 cfu/ml)和短乳杆菌DR1 (有效菌含量100-1000亿 cfu/g)体积比计算，YSS1占比8-9份，DR1占比1-2份。
所述复合菌剂还进一步含有吐温80和尿素，其中，吐温80占复合菌剂的总质量的0.01-0.1份，尿素占复合菌剂总质量的0.01-0.1份。
上述复合菌剂在抑制病原菌、制备病原菌抑制剂、抑制病害、制备病害抑制剂中的应用也属于本发明的保护范围。
所述应用中，所述病原菌为下述至少一种：美洲爱文氏菌Ewingella americana、托拉斯假单胞菌Pseudomonas tolaasii；
所述病害为平菇细菌性病害，具体可为下述至少一种：美洲爱文氏菌病害、托拉斯假单胞菌病害。
本发明还提供一种平菇细菌性病害抑制剂。
本发明所提供的平菇细菌性病害抑制剂，含有上述贝莱斯芽孢杆菌和/或其代谢物、上述短乳杆菌和/或其代谢物和上述复合菌剂中的至少 一种。
本发明筛选并开发了一种防控平菇细菌性病害的复合菌剂，所述复合菌剂能够有效抑制平菇病原菌Ewingella americana及平菇病原菌托拉斯假单胞菌 (Pseudomonastolassii)，是一种绿色无污染的平菇细菌性病害防控手段。
保藏说明
菌种名称：贝莱斯芽孢杆菌
拉丁名：Bacillus velezensis
菌株编号：YSS1
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号
保藏日期：2023年10月 10日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No. 28604
菌种名称：短乳杆菌
拉丁名：Lactobacillus brevis
菌株编号：DR1
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号
保藏日期：2023年05月19日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No. 27389
附图说明
图1为本发明实施例1中贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YSS1 革兰氏染色结果。
图2为本发明实施例1中贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YSS1 在PDA平板上对平菇病原菌Ewingella americana的抑制效果。
图3为本发明实施例2中短乳杆菌 (Lactobacillus brevis) DR1在PDA平板上对平菇病原菌Ewingella americana的抑制效果。
图4为本发明实施例3中贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YSS1和短乳杆菌(Lactobacillus brevis) DR1复合菌剂在PDA平板上对平菇病原菌Ewingella americana的抑制效果。
图5为本发明实施例3中贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YSS1和短乳杆菌(Lactobacillus brevis) DR1复合菌剂在PDA平板上对平菇病原菌托拉斯假单胞菌(Pseudomonas tolassii)的抑制效果。
图6为本发明实施例4中贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YSS1和短乳杆菌(Lactobacillus brevis) DR1复合菌剂在平菇生产中对平菇病原菌Ewingella americana的抑制效果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用到的病原菌，公众可从野外采集，也可从北京市农林科学院获得，以重复本申请实验。
平菇病原菌Ewingella americana和Pseudomonas tolaasii为北京市农林科学院植物保护研究所生防研究室田间采集、鉴定和保藏。
实施例1贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YSS1的分离与菌株鉴定
1、样品采集
从有中国北方野生芦笋中茎基部。
2、菌株的分离筛选及拮抗筛选
从芦笋分离菌株，取芦笋茎基部，表面用75%酒精消毒30秒后，切成1-2 cm的碎片，取5克，溶于无菌水10 ml，摇床震荡180 rpm, 10min，采用常规梯度稀释涂布分离，用LB，NA，KB和CM0002 共4 种培养基分别在28℃条件下培养，挑取菌落形态差异较大并可纯培养的细菌，在LB培养基上纯化保存，并以平菇病菌Ewingella americana为靶标病原菌以平板对峙法进行拮抗菌的初筛和多次复筛，最终得到一株抑菌活性强的细菌菌株，命名其为YSS1。
3、菌株的鉴定
对菌株YSS1进行形态学、生理生化特性和部分保守序列的分析。参考《土壤微生物研究原理与方法》(林先贵. 土壤微生物研究原理与方法[M]，高等教育出版社，2010)中描述方法进行生理生化和环境耐受性特性的测定。
结果表明，菌株YSS1的菌体细胞在400倍光学显微镜下菌体细胞呈短杆状，直或近直，芽孢中生，柱状或椭圆形，具有运动性；在LB 培养基上不产色素，菌落为白色不透明，扁平或圆形，无光泽，随着培养时间增长，菌落变厚变干，边缘不整齐，菌落上有褶皱，变为乳脂色。所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YSS1 的生理生化特征为革兰氏染色阳性，形成菌膜。该菌在pH值7.5环境下能够正常生长，在pH值8.5和pH值9.5环境下不能生长。该菌株能够利用甘油、L-阿拉伯糖、D-核糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、卫茅醇、肌醇、甘露醇、α-甲基-D-甘露糖糖苷、α-甲基-D-葡萄糖糖苷、N-乙酰-葡萄糖胺、苦杏仁苷、熊果苷、七叶灵柠檬酸铁、水杨苷、D-纤维二糖、D-麦芽糖、D-乳糖、D-蜜二糖、D-蔗糖、D-松三糖、D-棉子糖、淀粉、木糖醇、D-龙胆二糖、葡萄糖酸钾、2酮基-葡萄糖酸钾。YSS1在环境温度为4℃下生长势弱，在20 ℃和40 ℃下生长良好，60 ℃下不能生长，在55℃-80℃下处理15 min，仍可正常生长。所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YSS1 产纤维素酶、蛋白酶和几丁质酶，这些都是生防菌的关键性生防指标。菌株YSS1 的16S rDNA 序列如SEQ ID No.1所示。
SEQ ID No.1
Bacillus velezensis YSS1的16S rRNA 基因序列
GCCTATACTGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTAGGAGCCAGC
图1为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YSS1 革兰氏染色结果。由图1可知，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YSS1为革兰氏染色阳性。
图2为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YSS1 在PDA平板上对平菇病原菌Ewingella americana的抑制效果。由图2可知，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YSS1对Ewingella americana有抑制作用。
实施例2、短乳杆菌 (Lactobacillus brevis) DR1的分离与菌株鉴定
1、样品采集
从中国四川当地泡菜中分离获取。
2、菌株的分离筛选及拮抗筛选
从泡菜中分离菌株。取5克泡菜，切成1-2 cm的碎片，溶于无菌水10 ml，摇床震荡180 rpm, 10min，采用常规梯度稀释涂布分离，用MRS和PDA共2 种培养基分别在28℃条件下培养，挑取菌落形态差异较大并可纯培养的细菌，在MRS培养基上纯化保存，并以平菇病菌Ewingella americana为靶标病原菌，在PDA平板上对峙法，进行拮抗菌的初筛和多次复筛，最终得到一株抑菌活性强的细菌菌株，命名其为DR1。
3、菌株的鉴定
对菌株DR1进行形态学、生理生化特性和部分保守序列的分析。参考《乳酸细菌分类鉴定和实验方法》(凌代文、陈秀珠. 乳酸细菌分类鉴定和实验方法 [M]，中国轻工业出版社，1999)中描述方法进行生理生化和环境耐受性特性的测定。
结果表明，菌株DR1的菌体细胞在400倍光学显微镜下菌体细胞呈短杆状，直或近直，柱状或椭圆形；在MRS琼脂平板上 培养24小时后，菌落为圆形白色不透明，表面平，湿润，边缘整齐，菌落上无褶皱，乳脂色。菌株DR1的生理生化特征为革兰氏染色阳性，接触酶、氧化酶反应阴性，形成菌膜，甲基红、乙酰甲基甲醇、硝酸盐还原、吲哚反应、、尿酶阳性，可水解明胶、纤维素、淀粉和七叶苷，氧化酶反应、分解酪氨酸阴性，产生硫化氢，利用柠檬酸盐，不利用丙二酸盐，精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶反应阳性，苯丙氨酸脱氨酶反应阴性，葡萄糖、蔗糖产酸产气，可利用葡萄糖、乳糖、果糖、麦芽糖、蜜二糖、蔗糖等；不可利用甘露糖、甘露醇。液化明胶反应阴性，硝酸盐还原反应阴性，不产生硫化氢，15℃ 能够生长。菌株DR1 的16S rDNA 序列如SEQ ID No.2 所示。
SEQ ID No.2
Lactobacillus brevis DR1的16SrRNA 基因序列
GGCATGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAGCTTCCGTTGAATGACGTGCTTGCACTGATTTCACCAATGAAGCGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAATCTGCCCAGAAGCAGGGGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGTATAACAACAAAATCCGCATGGATTTTGTTTGAAAGGTGGCTTCGGCTATCACTTCTGGATGATCCCGCGGCGTATTAGTTAGTTGGTGAGGTAAAGGCCCACCAAGACGATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAATGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACACCTTTGAGAGTAACTGTTCAAGGGTTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGGAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTAGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTCTGCCAATCTTAGAGATAAGACGTTCCCTTCGGGGACAGAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGTCGCGAAGTCGTGAGGCTAAGCTAATCTCTTAAAGCCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGCCGGTGAGATAACCTTCGGGAGTCAGCCGTCTAAGGTGGGACAGATGATTAGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGAGAA
图3为短乳杆菌 (Lactobacillus brevis) DR1在PDA平板上对平菇病原菌Ewingella americana的抑制效果。
实施例3、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YSS1和短乳杆菌(Lactobacillus brevis) DR1复合菌剂制备及对平菇细菌病防控效果测定
把YSS1在固体LBA培养基上，28℃恒温培养3d，然后挑取菌落，绿豆状大小，接种已经灭菌(121℃，1个大气压下，15min)的液体LB培养基中，进行28 ℃、180rpm、条件下摇床培养48小时，获得YSS1的发酵液，通过离心、进一步获得有效菌含量为50亿 cfu/ml的菌液；把DR1在MRS琼脂培养基上进行培养，然后挑取菌落，绿豆大小，接种已经灭菌(121℃，1个大气压下，15min)的液体MRS培养基中，进行28 ℃条件下静置培养48小时，获得DR1的发酵液，然后通过冷冻干燥(-45℃，真空，12小时)获得DR1菌粉，其有效菌含量1000亿cfu/g。将上述8份的YSS1和2份的DR1进行混合均匀，加入0.5%的吐温80，加入0.1%尿素，搅拌均匀，即为配制的复合菌剂。
分别以美洲爱文氏菌 (Ewingella americana)和托拉斯假单胞菌(Pseudomonastolassii)为靶标，涂布于PDA平板上，同时在平板中心两侧用无菌打孔器打孔，直径约5mm，孔里加入100微升复合菌剂的100倍稀释液，以仅接种无菌水的平板作为空白对照(CK)。然后平板25 ℃恒温培养 72小时，观察有无抑菌圈形成。结果表明复合菌剂稀释100倍液体后，在平板上对美洲爱文氏菌 (Ewingella americana)和托拉斯假单胞菌 (Pseudomonastolassii)都具有较好的抑制作用(图4和图5)。
实施例4、复合菌剂在实际生产过程中对平菇细菌性病害的防控效果检测
将实施例3中制备的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YSS1和短乳杆菌(Lactobacillus brevis) DR1复合菌剂用自来水稀释100倍，待平菇刚刚出菇后，均匀喷施菇蕾上，间隔12个后，再喷施1次，用清水处理的菇蕾作物发病对照，间隔12个小时后，接种美洲爱文氏菌 (浓度为1×104cfu/ml)， 不做任何处理的作为健康对照。每个处理10个菌棒，常规管理，平菇生长5天后，进行发病情况调查及测产。试验结果表明本发明复合菌剂能够显著抑制美洲爱文菌(Ewingella americana)的发生(图6)，能够显著降低病害带来的产量损失(表1)。
表1.本发明YSS1和DR1复合菌剂对平菇病原菌Ewingella americana的抑制及对平菇产量的影响
**发病对照是指平菇出菇蕾后接种病原菌而不施用YSS1和DR1复合菌剂；复合菌处理是指平菇出菇蕾后接种病原菌而施用YSS1和DR1复合菌剂；复合菌对照是指不接种病原菌，仅施用复合菌剂的处理；健康对照是指没有接种病原菌、没有施用YSS1和DR1复合菌剂。
*发病严重度就是和健康对照相比，出菇产量和病情指数进行结合的一个分级标准：产量减少范围在0-5%且不影响菇的商品价值的定义为0级；产量减少范围在5%-10%且不影响菇的商品价值的定义为I级；产量减少范围在10%-50%的不影响商品价值的定义为II级；若产量减少大于50%或者影响商品价值的定义为III级。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (10)

1.贝莱斯芽孢杆菌为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，其菌株号为YSS1， 其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为 CGMCC No. 28604。
2.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于：所述贝莱斯芽孢杆菌的16SrRNA 基因的核苷酸序列含有序列表中 SEQ ID NO.1 所示的 DNA 分子。
3.短乳杆菌为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，其菌株号为DR1，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为 CGMCC No.27389。
4.根据权利要求2所述的短乳杆菌，其特征在于：所述短乳杆菌的16S rRNA 基因的核苷酸序列含有序列表中 SEQ ID NO.2所示的 DNA 分子。
5.权利要求1或2所述的贝莱斯芽孢杆菌和/或其代谢物在抑制病原菌、制备病原菌抑制剂、抑制病害、制备病害抑制剂中的应用。
6.权利要求3或4所述的短乳杆菌和/或其代谢物在抑制病原菌、制备病原菌抑制剂、抑制病害、制备病害抑制剂中的应用。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述病原菌为下述至少一种：美洲爱文氏菌Ewingella americana、托拉斯假单胞菌Pseudomonas tolaasii；
所述病害为食用菌细菌性病害，具体可为平菇美洲爱文氏菌病害、托拉斯假单胞菌病害中至少一种。
8.一种复合菌剂，其活性成分包括权利要求1或2所述的贝莱斯芽孢杆菌和/或其代谢物及权利要求3或4所述的短乳杆菌和/或其代谢物。
9.根据权利要求8所述的复合菌剂，其特征在于：所述复合菌剂中，按照贝莱斯芽孢杆菌YSS1 (有效菌含量10-100亿 cfu/ml)、短乳杆菌DR1 (有效菌含量100-1000亿 cfu/g)体积比计算，YSS1占比8-9份，DR1占比1-2份。
10.一种平菇细菌性病害抑制剂，含有权利要求1或2所述的贝莱斯芽孢杆菌和/或其代谢物、权利要求3或4所述的短乳杆菌和/或其代谢物和权利要求8或9所述的复合菌剂中的至少一种，所述平菇细菌性病害为平菇美洲爱文氏菌病害、托拉斯假单胞菌病害中至少一种。
CN202311429920.0A 2023-10-31 2023-10-31 一种抑制平菇细菌性病害的复合菌剂 Pending CN118064296A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311429920.0A CN118064296A (zh) 2023-10-31 2023-10-31 一种抑制平菇细菌性病害的复合菌剂

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311429920.0A CN118064296A (zh) 2023-10-31 2023-10-31 一种抑制平菇细菌性病害的复合菌剂

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN118064296A true CN118064296A (zh) 2024-05-24

Family

ID=91102875

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311429920.0A Pending CN118064296A (zh) 2023-10-31 2023-10-31 一种抑制平菇细菌性病害的复合菌剂

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN118064296A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116478868A (zh) * 2023-03-23 2023-07-25 曲阜师范大学 美洲爱文氏菌fhx6在促进杏鲍菇生长中的应用

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116478868A (zh) * 2023-03-23 2023-07-25 曲阜师范大学 美洲爱文氏菌fhx6在促进杏鲍菇生长中的应用
CN116478868B (zh) * 2023-03-23 2024-10-25 曲阜师范大学 美洲爱文氏菌fhx6在促进杏鲍菇生长中的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104498386B (zh) 酸枣内生解淀粉芽孢杆菌菌株sz23及发酵液的制备方法和应用
CN108148794B (zh) 一种广谱抑菌活性的枯草芽孢杆菌DYr3.3及制备方法和应用
CN103243044B (zh) 一种解淀粉芽孢杆菌及其应用
CN107099467B (zh) 一株铜绿假单胞菌xcs007及其在防治烟草黑胫病中的应用
CN101148649B (zh) 一种坚强芽孢杆菌及其菌剂和应用
CN112481160B (zh) 一株多粘类芽孢杆菌及其在梨树病害防治中的应用
CN115058358B (zh) 一株耐盐芽孢杆菌及其应用
CN116083289B (zh) 一株枯草芽孢杆菌菌株4-4及其应用、产品和方法
CN110358710A (zh) 一株侧孢芽孢杆菌及在制备抗病耐盐碱功能微生物制剂中的应用
CN104651260A (zh) 一种短短芽孢杆菌bbc-3及其应用与菌剂制备
LU103184B1 (en) A strain of bacillus amyloliquefaciens and applications thereof
WO2024227302A1 (zh) 一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用
CN107974427A (zh) 一株具有抑菌活性的海洋链霉菌
CN103667114A (zh) 一株防治猕猴桃溃疡病的菌株及其制备方法
CN110317747A (zh) 一种解淀粉芽孢杆菌jt68及其在防治茶炭疽病的应用
CN105950516B (zh) 一株降解无机磷、拮抗杨树腐烂病菌的细菌菌株及其应用
CN108865949B (zh) 枯草芽孢杆菌tkm-1及其应用
CN110699304B (zh) 一种生防链霉菌
CN103333844B (zh) 一株拮抗杨树炭疽病菌的菌株及其应用
CN114774301B (zh) 一株拮抗食用菌病原真菌的内生枯草芽孢杆菌jl-b16及其应用
CN118064296A (zh) 一种抑制平菇细菌性病害的复合菌剂
CN102206592B (zh) 一种防治油茶病害的生防放线菌菌株及其应用
CN113604376A (zh) 一株甘蔗内生枯草芽孢杆菌及其应用
CN104673720A (zh) 一种用于防治葡萄霜霉病的巨大芽孢杆菌及其悬浮剂
CN109810918B (zh) 一株对枸杞叶枯病有防效的萎缩芽孢杆菌、生物菌剂及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination