CN107375288B

CN107375288B - 多臂的聚合靶向抗癌偶联物

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Publication number: CN107375288B
Application number: CN201610318195.3A
Authority: CN
Inventors: 袁建栋; 黄仰青; 宋云松; 袁芳
Original assignee: Borui Pharmaceutical (suzhou) Ltd By Share Ltd
Current assignee: Borui Pharmaceutical (suzhou) Ltd By Share Ltd
Priority date: 2016-05-16
Filing date: 2016-05-16
Publication date: 2019-08-23
Anticipated expiration: 2036-05-16
Also published as: KR102223479B1; EP3459546B1; KR20190007483A; US20200000797A1; JP6880073B2; CA3024371C; WO2017198124A1; EP3459546A4; JP2019519508A; CN107375288A; US10869863B2; CA3024371A1; AU2017265310A1; EP3459546A1; AU2017265310B2

Abstract

本发明公开了一种多臂的、由水溶性聚合物修饰的靶向药物偶联物。该药物偶联物具有如下结构式：

Description

多臂的聚合靶向抗癌偶联物

技术领域

本发明总体上涉及多臂的、水溶性的聚合物以及它们所对应的药物偶联物。具体地，本发明涉及多臂PEG修饰的靶向抗癌偶联物，更具体地说，本发明为将靶向分子通过多臂PEG与抗癌药物连接成偶联物。

背景技术

多年来，已经提出了用于改进生物活性剂的稳定性和递送的多种方法。与药用试剂的配制以及投递相关联的挑战可以包括：该药用试剂的差的水溶性、毒性、低的生物利用率、不稳定性、以及迅速的体内降解。尽管已经设计了许多办法来改进药用试剂的递送，但是没有一种单独的方法是没有其缺点的。例如，通常采用的药物递送方法的目标在于解决或至少改善一个或多个以下问题，包括如在一种脂质体、聚合物基质、或单分子胶束中的药物胶囊化、共价附接至一种水溶性聚合物如聚乙二醇上、基因靶向剂的使用、盐类的结构、等等。

WO2005028539、WO2010019233、WO2011063156、WO2011063158公开了一种处于临床三期的药物nktr 102，该药物主要用于转移性乳腺癌，由Nektar Therapeutics研发。该药物是一种水溶性的多支链聚合物药物前体，以提高药物的负载，结构如下：

该化合物是使用多臂PEG与伊立替康连接，以提高水溶性，增加载药量，在抗癌作用不变的情况下，降低副作用。但该药物仍具有缺点，比如，靶向性较差，不能作用于特定的癌细胞，在杀死癌细胞的同时，也会影响正常细胞的性能，而使不良反应发生率仍然比较高。

整合素(Integrins)是一类细胞黏附受体分子，在有核细胞表面均广泛表达，其中整合素α_γβ₃在神经胶质瘤、黑色素瘤、卵巢癌等多种肿瘤细胞及肿瘤相关的内皮细胞表面高度表达，与肿瘤的血管发生、肿瘤转移及肿瘤的抗放射治疗密切相关，因此整合素α_γβ₃常被用作肿瘤靶向的特异性靶点。已有研究表明，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)的三肽序列能够特异性地识别含α_γ亚基的整合素家族，具有高度亲和力。

传统的治疗肿瘤的药物普遍存在对肿瘤组织选择性差，毒副作用大等缺点，如何设计出良好的药物传递系统成为近年来的研究热点。随着“肿瘤生长依赖肿瘤血管学说”的提出，肿瘤新生血管靶向受体药物成为一种新型的、颇有潜力的提高肿瘤疗效的途径。整合素α_γβ₃是理想的肿瘤靶向治疗靶点,其配体RGD肽可以携带效应分子特异地与其结合，从而抑制肿瘤生长和新生血管的形成。

利用RGD肽与整合素的α_γβ₃特异结合，可以将治疗效应分子靶向性地导入肿瘤部位,有效地减少了肿瘤治疗中对正常组织细胞的损害。

虽然体内广泛存在线性RGD肽，但该肽在体内循环过程中的半衰期较短，对α_γβ₃受体的亲和力较低，易被蛋白酶降解。而环形RGD肽稳定性强，与受体的亲和力高，并且显示出肿瘤穿膜肽特性，因此在协助抗癌药物的靶向渗透以及降低药物对正常细胞毒副作用方面具有明显的优势。

iRGD披露于专利WO2009126349，其具体结构如下：

发明内容

本发明公开了一种全新的具有靶向性的多支链药物偶联物，该偶联物具有三个或更多的支链，该偶联物可表示为下式：

R为有机中心，POLY为聚合物，POLY和X共同构成聚合物支链。

该多支链药物偶联物的每一个支链和其他的支链是相互独立的。也就是说，每一个支链可以由不同的POLY、X构成。典型的情况是，一般结构对应于：

等，以此类推。每一个支链从有机中心“R”发出。然而，一般来说，该偶联物的每个支链都是相同的。

现在详细地描述结构式(Ⅰ)中的每一个变量部分。

有机中心，“R”

在结构式(Ⅰ)中，“R”是一个1-100个原子的有机核心基团。比较好地是，R含有3-50个原子，更好地是，R含有大约3-30个原子。R可以为全部为碳原子的核心，也可选择性的含有1个或多个杂原子，例如，O、S、N、P等，依赖于所使用的特殊中心分子。R可以是直链、支链或环状的，发出至少3个独立的聚合物支链。结构式(Ⅰ)中，“q”与从“R”发出的聚合物支链的数量相对应。

有机中心“R”，是从一个分子衍生而来的，该分子提供许多聚合物连接的位置，近似等于聚合物支链的数量。更好地是，多链聚合物结构的主要中心分子式至少带有适合作为聚合物支链的3个及3个以上的羟基、硫基或氨基的多羟基化合物、多硫化合物或多胺化合物的残基。一个“多羟基化合物”是一个由多个(大于2个)可利用的羟基基团组成的分子。一个“多硫化合物”是一个由多个(大于2个)可利用的硫基基团组成的分子。一个“多胺化合物”是一个由多个(大于2个)可利用的胺基基团组成的分子。依据聚合物支链的数量，多羟基化合物、多胺化合物或多硫化合物的母体(在POLY共价键结合前)典型地包括3-25个羟基、硫基或氨基，较好的是3-10个羟基、硫基或氨基，最好是包括从3到大约8个(如3、 4、5、6、7或8)适合与POLY共价键结合的羟基、硫基或氨基。

多羟基化合物或多胺化合物中心的母体在和聚合物作用之前典型地有一个结构式R-(OH)p或者R-(NH₂)p。在结构式(Ⅰ)中，p值和q值是相对应的，因为在母体有机分子中的每一个功能性基团，典型地有-OH和-NH₂，如果位置易受影响或易发生反应，它们就和聚合物支链的POLY共价键结合。结构式(Ⅰ)中，与POLY连接后，R母体的多羟基化合物的羟基都已经转换成了一个聚合物支链，所描述的R为连接后的残基。例如，如果有机中心分子是从季戊四醇衍生得来的，多羟基化合物的母体拥有结构式C(CH₂OH)₄，有机中心基R表示为：

优选的作为聚合物中心的说明性多羟基化合物包括含有1到10个碳原子和1到10个羟基基团的脂肪族多羟基化合物，例如，乙烯乙二醇、烷二醇、烃基乙二醇、亚烷基烃基二醇、烃基环烷基二醇、1,5-萘烷二醇、4,8-二(羟甲基)三环癸烷、环亚烷基二醇、二羟基烷烃、三羟基烷烃、四羟基烷烃等。环脂肪族多羟基化合物包括直链的或者闭环糖类和糖醇，如甘露醇、山梨糖醇、纤维醇、木糖醇、白雀醇、苏糖醇、阿拉伯糖醇、赤藻糖醇、己六醇、核糖、树胶醛糖、木糖、来苏糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、山梨糖、甘露糖、吡喃糖、阿卓糖、塔罗糖、塔格糖、吡喃糖苷、蔗糖、乳糖、麦芽糖等。也可采用芳香族多羟基化合物，如苯磷二酚、烃基苯磷二酚、焦酚、氟代甘氨酸酚、1,2,4-苯三酚、间苯二酚、烃基间苯二酚、二烃基间苯二酚、苔黑酚一水合物、橄榄酚、对苯二酚、烃基对苯二酚、苯基对苯二酚等。其他可能采用的多羟基化合物中心可能包括冠醚、环式糊精、糊精或其它碳水化合物。

在结构式(Ⅰ)中，q为对应“R”上连接的聚合物支链的个数，具体的数字可以为3～20。典型的，“q”的具体数字为3、4、5、6、7、8。具体来讲，以“R”为中心发出三、四、五、六、七、八个聚合物支链。

在一些具体的方案中，“R”具有三个聚合物支链，“R”优选为：

在一些具体的方案中，“R”具有四个聚合物支链，“R”优选为：

在一些具体的方案中，“R”具有六个聚合物支链，“R”优选为：

在一些具体的方案中，“R”具有八个聚合物支链，“R”优选为：

聚合物，“POLY”

在结构式(Ⅰ)中，“POLY”为聚合物，与X一起构成聚合物支链。每一个聚合物支链中的POLY是独立地选择出来的，较好的，每一个聚合物是相同的聚合物，更适宜地，每一个结构式(Ⅰ)中的聚合物支链是相同的。优选的聚合物为水溶性的，任意的水溶性聚合物可以用于形成本发明的偶联物，本发明所指聚合物可以是任意几何形态或形式的。代表性的聚合物包括但并不限于：聚乙二醇、聚丙二醇、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(羟烷基甲基丙烯酸胺)、聚(羟烷基甲基丙烯酸盐)、聚(糖类)、聚(α-羟基酸)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯乙酸)、聚膦嗪、聚唑啉、聚(N-丙烯酰吗啉)等。

在典型的化合物中，“POLY”为聚乙二醇，可为任意几何形态或形式，包括直链、支链、叉形链等，较好的，“POLY”为直线型的聚乙二醇，典型的结构为代表原子的连接处，标星号的氧原子为与有机中心“R”连接的原子。其中n的取值范围为大约5～500，最好为50～200，优选113。平均分子量约为1k～60kDa。n代表所述的聚合物的聚合度并取决于所述的聚合物的分子量。

所述的聚乙二醇结构通常还含有部分末端部分残基，类似于POLY的终端基团，可以为H、NH₂、OH、CO₂H、C_1-6烷基(例如，甲基、乙基、丙基)、C_1-6烷氧基(例如，甲氧基、乙氧基)、酰基或芳基来结束，例如，POLY可为：

一般市售多臂聚乙二醇都会带有这些末端部分，当POLY和X连接为聚合物支链时，末端部分基团被反应，例如羟基，表现的形式即为上述末端部分残基。

所述聚合物也可以为高支链的聚合物，典型的结构为树枝状聚合物(Dendrimer)，该种聚合物是指一个球形的、尺寸单枝分散的聚合物，其所有键均从中央焦点或者核心辐射而出，其支链形状规律并具有重复单元，每个单元分别贡献一个支点。树枝状聚合物展示某些枝状特性，如核心封装，使其具有其他类型聚合物所不具备的独特特点。

POLY可以为树枝状(Dendrimer)的聚乙二醇连接臂，典型的结构如下：

表示以相同方式呈树枝状扩散。

聚合物支链的组成部分，X

在结构式(Ⅰ)中，“X”与“POLY”一起构成聚合物支链。X可为以下四种形式：

①X是末端含有一个相对地不起化学反应的或未反应的基团。在这种情况下，即“X”不含任何活性剂，而是一个不容易发生反应的基团。通常为一个烷氧基(-OQ)，其中Q为一个一般含有1-20个碳原子的、最好是C_1-6的低级烷基或苯基的有机基团。“X”可以是饱和的，也可以是不饱和的，它包括芳基、杂芳基、环状化合物，杂环化合物和它们中任何一种的取代物。

②X可表示为(L)-(T)n’。L代表多价接头，T代表靶向分子，n’为大于或等于1的整数。接头L可含有相互共价连接的多个接头。例如，多价接头L可含有一个或多个间隔基接头Ls，和/或难分离接头Ln，各自互相连接，其中难分离接头Ln与T连接，可选择这些不同的接头，按任何顺序排列，构建多价接头L。例如，可由一个或多个以下二价接头构建多价接头L：

其中，a和b是整数，例如在0-5范围的整数。若干个Ls可按照直链、支链、末端支链等方式连接。Ls也可以不存在，由Ln直接将POLY与T连接。

应理解，多价接头结合POLY和T可按多种结构构型连接，包括但不限于以下示例性通式：

其中，Ls1、Ls2、Ls3、Ls4各自是间隔基接头，可相同，也可不尽相同。Ln1、Ln2、Ln3、Ln4各自是难分离接头，可相同，也可不尽相同。T1、T2、T3各自是靶向分子，可相同，也可不尽相同，较好的，T1、T2、T3为相同的靶向分子。

③X可表示为(L)-(D)n’。L代表多价接头，D代表活性剂，n’为大于或等于1的整数。多价接头L可含有相互共价连接的多个接头。例如，多价接头L可含有一个或多个间隔基接头Ls，和/或可分离接头Lr，各自互相连接，其中可分离接头Lr与D连接，可选择这些不同的接头，按任何顺序排列，构建多价接头L。例如，可由一个或多个以下二价接头构建多价接头L：

其中，a和b是整数，例如在0-5范围的整数。若干个Ls可按照直链、支链、末端支链等方式连接。Ls也可以不存在，由Lr将POLY与D连接。

应理解，多价接头结合POLY和D可按多种结构构型连接，包括但不限于以下示例性通式：

其中，Ls1、Ls2、Ls3、Ls4各自是间隔基接头，可相同，也可不尽相同。Lr1、Lr2、Lr3、Lr4各自是可分离接头，可相同，也可不尽相同。D1、D2、D3各自是活性剂，可相同，也可不尽相同，较好的，D1、D2、D3为相同的活性剂。

④X由多价接头L、靶向分子T、活性剂D组成，该方式为本发明的最佳方式。

在这种方式下，X可表示为(T)n’-(L)-(D)n’。L代表多价接头，D代表活性剂，n’为大于或等于1的整数。多价接头L可含有相互共价连接的多个接头。例如，多价接头L可含有一个或多个间隔基接头Ls，难分离接头Ln，可分离接头Lr，各自互相连接，其中难分离接头Ln与T连接，可分离接头Lr与D连接，可选择这些不同的接头，按任何顺序排列。若干个Ls可按照直链、支链、末端支链等方式连接。Ls也可以不存在，POLY直接通过Ln或Lr与T和D连接。

应理解，多价接头结合POLY、T和D可按多种结构构型连接，包括但不限于以下示例性通式：

其中，Ls1、Ls2各自是间隔基接头，可相同，也可不尽相同。Lr1、Lr2各自是可分离接头，可相同，也可不尽相同。D1、D2各自是活性剂，可相同，也可不尽相同，较好的，D1、D2为相同的活性剂。T1、T2各自是靶向分子，可相同，也可不尽相同，较好的，T1、T2为相同的靶向分子。在X中可含有1-30个靶向分子T，更适宜地为1-5个靶向分子T。另外可含有1-30个活性剂D，更适宜地为1-5个活性剂D。T和D个数的比例可为1-5:5-1，例如可为1:1、1:2、1:3、2:1、3:1等，较好的，T和D个数的比例为1:1。

在以上多价接头结合POLY、T和D的连接方式中，最优的方案为：

在这种方案中，T和D个数的比例为1:1。

也即，本发明最优的药物偶联物可表示为下式：

现在以最优方案式(III)为例，详细介绍本发明药物偶联物。

在式(III)中，Ls、Ln、Lr连接在一起形成多价接头L，例如，为多价3-硫基或3-联硫基芳基烷氧基羰基；3-硫基或3-联硫基芳基烷基氨基羰基；多价3-硫基或3-联硫基烷氧基羰基或多价3-硫基或3-联硫基烷基氨基羰基等，其中L与D形成可断裂键，L与T形成对水解较为稳定的化学键。

以下为典型的多价接头L：

符号“*”在这里代表多价接头L与靶向分子T的连接点，“#”代表多价接头L与活性剂D的连接点，“％”代表多价接头L与POLY的连接点。其中，m、m'分别为1-20之间的任一整数，l、k分别为1-10之间的任一整数。

需要指出的是，上述典型多价接头中的“难分离接头”中较难水解的S-C键是由靶向分子T和难分离接头共价键反应形成的，在典型的化合物中，原子S是由靶向分子T所带来的。

以上举例仅作为“难分离接头”的典型例子，并不限制本发明化合物对难分离接头的选择。

以上举例仅作为“L”的典型例子，并不限制本发明化合物对“L”的选择。在一些具体的优选方案中，“L”为：

本发明所称间隔基接头Ls是指一系列用于连接可分离接头Lr和难分离接头 Ln的互连的原子，并用于连接POLY。

在一个实施方案中，多价接头L包含至少一个由氨基酸形成的肽间隔基接头，所述的氨基酸独立的选自天然氨基酸和非天然α-氨基酸。在另一个实施方案中，所述多价接头L包括含有1～40个氨基酸形成的肽间隔基接头，所述氨基酸优选天然氨基酸，进一步的，所述多价接头L包括含有1～20个氨基酸形成的肽间隔基接头；更进一步的，所述L优选包括含有10～15个氨基酸形成的肽间隔基接头。更进一步的，L包括至少1个选自下组的氨基酸：天冬氨酸、精氨酸、甘氨酸、鸟氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、精氨酸、苏氨酸、谷氨酸、丝氨酸、瓜氨酸、缬氨酸和谷氨酰胺。

更进一步的，所述L优选包括一个或多个由选自天冬氨酸、精氨酸、甘氨酸、鸟氨酸、半胱氨酸、瓜氨酸、缬氨酸和赖氨酸及其组合的氨基酸形成的二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、十肽、十一肽及十二肽的间隔基接头。

本发明中所称的“可分离接头”又称为可断裂接头，是指包含至少一个可在生理条件下断裂的键(例如pH不稳定、酸不稳定、易氧化或酶不稳定的键)的接头。导致键断裂的此类生理条件包括，例如在生理pH下发生的标准化学水解反应，或由于区室化到细胞器例如具有比胞质pH低的pH的核内体中所致，被体内蛋白水解酶、脂酶、胆碱酯酶、磷酸单酯酶、核酸酶、硫酸酯酶等水解。

应当理解，本文中所述的可断裂键并不是单一存在于可分离接头中的，而是可分离接头与活性剂D共价连接后，连接部分为可断裂键，可断裂键将可分离接头和活性剂D的相邻原子连接起来，键断裂后，可分离接头断裂为两个或多个片段，当可断裂键断裂后，活性剂D被释放出来，与母体分离，发挥生理活性。

应当理解，本文中所指的活性剂D为一个含有适合与可分离接头发生共价键结合形成一个可断裂键的活性剂部分，这样，当可断裂键断裂后，活性剂D以它未经改进，即未形成共价键的形式被释放出来。关于D的选择和在偶联物中与可分离接头形成可断裂键将在后面的内容中进行详述。

可断裂键是指一个相对较弱的键，它在生理环境下能与水发生反应(即被水解)。一个键在水中水解的趋势不仅取决于两个中心原子连接的类型，还与连接在这些中心原子上的取代基有关。典型的水解作用不稳定的连接基包括羧酸酯、磷酸酯、酐、乙缩醛、缩酮、酰氧烷基酯、亚胺、原酯、缩氨酸、低聚核苷酸等。

本发明所指的活性剂“D”指的是非改性母体活性剂的一部分或由药物与本发明的多价接头共价连接所产生的共价链(或者是它的活化的或化学改性的形式)之前的未改性母体活性剂的残基。活性剂部分与多价接头之间的连接基水解或酶解时，活性剂本身就得到释放。

根据本发明的目的，术语“残基”应该理解为化合物的一部分，它是指经历了与另一个化合物取代反应后的剩余物。

本发明所指的活性剂，活性剂“D”为喜树碱类抗癌剂，喜树碱类药物是用于临床的拓扑异构酶Ⅰ抑制剂，在高活性的同时，具有水溶性差、对正常机体组织毒副作用大等缺点，极大的限制了喜树碱类抗癌剂的临床应用。

D可为如下式所示的喜树碱类药物：

其中，R1-R5相互独立地选自于以下基团：氢、卤素、酰基、烷基、取代烷基、烷氧基、取代烷氧基、烯基、炔基、环烷基、羟基、氰基、硝基、叠氮基、酰胺基、肼、胺基、取代胺基、羟基羰基、烷氧羰基、烷氧羰氧基、氨基甲酰氧基、芳基磺酰氧基、烷基磺酰氧基等。R6为H或OR8，R8为烷基、烯基、环烷基、卤代烷基或羟烷基。R7为与可分离接头共价键结合的位置，优选为羟基。

对于适合本文内容的喜树碱类抗癌剂的唯一限制是具有至少一个可用于化学反应的功能基团(即与多价接头共价连接)，如氨基、羟基、或硫醇连接到结构式(I)的化合物并且偶联到本文描述的结构式(I)的化合物没有重大的生物活性损失。

其中，活性剂“D”为喜树碱类抗癌剂，优选伊立替康、SN-38、10-羟基喜树碱、鲁比替康。

其中，伊立替康结构如下：

SN-38的结构如下：

10-羟基喜树碱的结构如下：

鲁比替康的结构如下：

羟基可与可分离接头形成可断裂的脂键。

本发明中所称的“难分离接头”是指包含至少一个在生理条件下对水解较为稳定的化学键，特别是共价键，这就是说，在生理状态下它在长期内不会发生任何明显的水解。水解作用稳定的连接基的实例包括，但不限于下述情况：碳-碳键(如在脂肪链中)、碳-硫键、二硫键、酯键、酰胺键、聚氨酯及其类似物等。一般来说，水解作用稳定的键在生理状态下的水解速度小于约1-2％。

本发明中，“T”为靶向分子，具有或不具有药用作用，该靶向分子的作用是增加靶向性，使得该偶联物在目标组织的浓度更高，提高生理活性或药用作用。“T”可为单功能的靶向分子，也可为多功能的靶向分子，在一些可选择的方案中， “T”还可为两个或两个以上靶向分子组成的靶向部分。在一些具体的方案中，“T”可为含有“精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸”序列的RGD肽，RGD肽是整合素与其配体蛋白相互作用的识别位点。优选的RGD肽包括iRGD和cRGD等。

iRGD结构如下：

cRGD是一系列化合物，典型的化合物包括：

其他优选的靶向分子包括tLyp-1、Lyp-1、RPARPAR、Angiopep2、GE11或叶酸。

tLyp-1的结构如下：

Lyp-1的结构如下：

RPARPAR的多肽序列为精氨酸-脯氨酸-丙氨酸-精氨酸-脯氨酸-丙氨酸-精氨酸。这里需要说明的是，由于需要和多价接头L连接，因此在制备中，需要用半胱氨酸将RPARPAR和L连接，因此在具体化合物中，表现为CRPARPAR。

Angiopep2的多肽序列为：TFFYGGSRGKRNNFKTEEY，其结构如下：

GE11的多肽序列为：YHWYGYTPQNVI，其结构为：

叶酸的结构如下：

本发明优选的方案中，“POLY”为线状的聚乙二醇连接臂，即本发明偶联物包括以下几种类型的化合物：

三臂：

四臂：

需要说明的是，在以上优选方案中，线状聚乙二醇为：

而该线状聚乙二醇并非为本发明的限制，可被其他线状聚乙二醇替代，例如：

等。

在本发明优选的方案中，R为5个碳原子的即本发明偶联物为：

在式(IV)的基础上，n为5～500，优选50-200，最优选113。在更优选的方案中，本发明偶联物的靶向部分“T”选自iRGD、tLyp-1、Lyp-1、RPARPAR、cRGD、Angiopep2、GE11或叶酸中的一种，活性剂“D”选自伊立替康、SN-38、10-羟基喜树碱、鲁比替康的一种。

本发明偶联物的任何形状应包括在本发明中，这些形状由其中活性剂、靶向分子和各种多价接头连接的方式决定。在一个方面，本发明偶联物的总体三维形状是线性的。另一方面，本文所述偶联物优选为三维形状是“X”形或十字形。

在本发明另一种优选的方案中，R为4个碳原子的即本发明偶联物为：

在式(Ⅴ)的基础上，n为5～500，优选50-200，最优选113。在更优选的方案中，本发明偶联物的靶向部分“T”选自iRGD、tLyp-1、Lyp-1、RPARPAR、cRGD、Angiopep2、GE11或叶酸中的一种，活性剂“D”选自伊立替康、SN-38、10-羟基喜树碱、鲁比替康的一种。

在本发明第三种优选的方案中，本发明偶联物为：

基于式(IV)、(Ⅴ)、(VI)，在一些具体的方案中，本发明化合物如下：化合物1：D为伊立替康，T为iRGD

化合物2：D为伊立替康，T为tLyp-1

化合物3：D为伊立替康，T为Lyp-1

化合物4：D为伊立替康，T为RPARPAR

化合物5：D为伊立替康，T为cRGD

化合物6：D为SN-38，T为iRGD

化合物7：D为SN-38，T为tLyp-1

化合物8：D为SN-38，T为Lyp-1

化合物9：D为SN-38，T为RPARPAR

化合物10：D为SN-38，T为cRGD

化合物11：D为10-羟基喜树碱，T为iRGD

化合物12：D为10-羟基喜树碱，T为tLyp-1

化合物13：D为10-羟基喜树碱，T为Lyp-1

化合物14：D为10-羟基喜树碱，T为RPARPAR

化合物15：D为10-羟基喜树碱，T为cRGD

化合物16：D为鲁比替康，T为iRGD

化合物17：D为鲁比替康，T为tLyp-1

化合物18：D为鲁比替康，T为Lyp-1

化合物19：D为鲁比替康，T为RPARPAR

化合物20：D为鲁比替康，T为cRGD

化合物21：

化合物22：

化合物23：

R为

化合物24：

R为

化合物25：

R为

化合物26：

R为

化合物27：

R为

化合物28：

R为

化合物29：

R为

化合物30：

R为

化合物31：

R为

化合物32：

R为

化合物33：

R为

化合物34：

R为

化合物35：

R为

化合物36：

R为

化合物37：

R为

化合物38：

R为

化合物39：

R为

化合物40：

R为

化合物41：

R为

化合物42：

R为

以化合物1为例，进一步解释本发明。

在化合物1中，R为5个碳原子的POLY为 POLY和R共同构成了活性剂的载体：

多价接头L与T、D连接后，为：

里的酯键为本发明上述可分离接头与活性剂D共价形成的可断裂键，当本发明偶联物到达靶细胞后，可断裂键在生理条件下被水解或酶解后，偶联物释放出活性剂伊立替康，伊立替康在靶细胞发挥抗癌作用。

里的碳硫键为本发明上述难分离接头和靶向分子T形成的在生理条件下对水解较为稳定的化学键，其中原子S由iRGD带来。由于靶向分子的靶向性，可使本发明偶联物到达特定的靶细胞，而靶向分子和母体不易分离。

“-----”代表与POLY连接。

另一方面，本发明提供了所述偶联物的制备方法。在这种方法中，带有羟基的活性剂D先与氨基酸或氨基酸形成的肽反应，形成可分离接头，活性剂D的羟基与氨基酸的羧基形成可断裂键-酯键。难分离接头与间隔基接头共同形成多价接头的剩余部分，该剩余部分含有可反应的羧基，与可分离接头的氨基反应，形成D-L部分。

POLY和有机中心R组成的活性剂载体的制备：POLY和有机中心R实际上组成了多臂聚合物，在本发明优选的实施例中，该多臂聚合物为多臂聚乙二醇，能够从商业可利用的原材料中获得，例如，可从北京键凯科技有限公司购得多种类型的四臂、八臂聚乙二醇衍生物。市售的这些多臂PEG可直接与上述D-L部分反应。

可供选择地，制备本发明多臂聚乙二醇可以通过合成来制备。例如，任何一定数量的合适的多醇核心材料都可以从化学品供应商购得。多醇上的终端羟基首先转化为它们的阴离子形式，例如，用一种强碱提供一个适合激发聚合反应的合适的位子，接下来单分子(如，乙烯氧)直接在中心上聚合。链的建立会一直进行，直到每一个支链都达到预期的长度，接下来终止反应，例如以淬火的方式来终止。

在另一个可供选择的方法中，本发明中的多臂聚乙二醇可以通过下列方法合成制备：首先提供一个需要的多醇中心材料，接下来让多醇在合适的条件下与合适长度的杂原子双官能团的PEG甲磺酰化反应，其中的非甲磺酰化的PEG被选择性的保护起来，以防止与多醇发生反应。

本发明所提供的适合作为活性剂载体的多臂聚乙二醇特别含有一个终端官能团，如：N-琥珀酰亚胺碳酸盐(见US5281698、US5468478)、琥珀酰亚胺丙酸酯和琥珀酰亚胺丁酸酯(见US5672662)、琥珀酰亚胺琥珀酸酯、琥珀酰亚胺酯(见US5650234)等。

如上所述，本发明偶联物载体(R和POLY组成)与至少1个靶向分子和1个活性剂连接。在较为典型和优选的化合物中，本发明偶联物载体至少与3个靶向分子和3个活性剂连接，优选与至少4个靶向分子和4个活性剂连接，以保证高载荷能力。

本发明偶联物是典型的药物前体，通过水解作用或酶解作用，活性剂D被释放出来，与母体分离，发挥生理活性。

本发明偶联物呈现出高载荷能力，这样就可以降低总剂量来治疗一种特殊的疾病，例如癌症等。也就是说，本发明偶联物活性剂载体能够有效地和多种活性剂分子以共价键结合，允许每一定的偶联物量可以服用更多量的治疗剂型(也就是活性剂部分)。本发明偶联物通过水溶性聚合物的修饰，本质上是偶联物也是亲水的，特别是活性剂为水难溶药物时，提高偶联物的生物利用度。

相比未偶联的药物，本发明偶联物能够表现出更强的作用，在人体或其他动物体内组织更加富集。

本发明中偶联物药物前体含有许多独特的性质，尤其是在活性剂为一个抗癌化合物的情况下。这种药物前体能以较高效率来抑制肿瘤的生长。我们使用的这种小分子是一种已知具有抗癌特性的小分子。然而，通过如上所述与多支链聚合物结合，其疗效和药物代谢动力学与该小分子(例如，抗癌化合物本身)相比，有了很大的改进。适合的实体肿瘤类型包括结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、脑胶质瘤及乳房、卵巢、结肠、肾、胆管、肺和脑的恶性肉瘤、癌和淋巴瘤。

综上，本发明为一个多臂聚合物修饰的靶向抗癌偶联物，其中，水溶性的聚合物修饰可增强该偶联物的水溶性，从而提高载药量；靶向分子增加靶向性，使得该偶联物在目标组织的浓度更高；L为任意的连接接头，其作用是首先将靶向分子与抗癌药物连接起来，再将“靶向分子、抗癌药物与聚合物臂连接起来，使得整个偶联物形成一个有机的整体。

本发明化合物1-42，药学上可接受的盐优选为盐酸盐，可用药物化学领域的常规手段成盐，还可为三氟乙酸盐、硫酸盐、磷酸盐、醋酸盐等。

具体实施例

在下面将对本发明进行详细描述。然而，本发明可能具体体现为许多不同的形式，而且它不应该被局限于此处所描述的实施例中，提供这些实施例中的目的是使所披露内容更完整与全面。所用试剂和原料，除了提供制备方法的除外，其余均为市售。

实施例1化合物1的制备

iRGD的制备

10.0g Fmoc-Rink MBHA Amide Resin，脱除Fmoc。偶联试剂采用HOBT/DIC，DMF为反应溶剂，反应监控采用茚三酮检测法，依次将下列保护氨基酸连接到树脂上：Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、DMF洗涤后加入三氟乙酸铊(2.0eq)搅拌18小时后DMF洗涤，脱除Fmoc，缩合Fmoc-Cys(Trt)-OH，DMF洗涤、脱除Fmoc，加入醋酐吡啶反应20min，DMF洗涤、DCM洗涤、甲醇洗涤后干燥，加入裂解试剂82.5％TFA/5％苯酚/5％水/2.5％EDT/5％苯甲硫醚，冰的MTBE沉淀、洗涤，粗品经反相HPLC纯化、冻干，得白色絮状物iRGD 1.56g。

L部分的制备

1.BP103a01的制备

氮气保护下，向1000ml三口瓶中加入200mL吡啶，120g 1(1.0eq)，搅拌降温至0℃，分批加入151.8g TsCl(1.0eq)，搅拌1h，然后缓慢升至室温，继续搅拌3-4h。反应结束后，将反应液倒入冰的稀盐酸溶液，加EA萃取，EA层用稀盐酸洗一次，饱和碳酸氢钠洗涤，饱和食盐水洗，无水Na2SO4干燥，减压蒸除溶剂，硅胶柱层析得BP103a01纯品55g。

2.BP103a02的制备

向1000mL三口瓶中加入55g BP103a01(1.0eq)和160mL DMSO，搅拌均匀，然后加入NaN3 23.52g(2.0eq)，加热至50℃反应3小时，降温至室温，将反应液倒入水中，用EA萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩得BP103a02无色液体29.2g。

3.BP103a03的制备

向1L氢化反应釜中加入29g化合物3，甲醇360mL，钯碳5.0g，搅拌，氮气置换，通入氢气反应3-4h，TLC监控反应完毕后，过滤反应液，将滤液浓缩得到BP103a03的油状物23.5g。

4.BP103a04的制备

向1L三口瓶中加入23.5g化合物BP103a03(1.0eq)，68.6g(Boc)2O(2.0eq)，甲醇：三乙胺(9：1)的混合溶液500ml，搅拌升温至回流，反应1h，TLC监控反应完毕后，蒸去甲醇三乙胺，加水溶解，二氯甲烷萃取3次，合并有机层水洗一次，无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂，干燥，得到固体BP103a04的34.8g。

5.BP103a05的制备

向1000mL三口瓶中加入34.8g化合物BP103a04(1.0eq)，甲苯和THF各150ml，溴乙酸58.2g(3eq)，搅拌，加热至45～50℃，再加入氢氧化钠33.5g(6eq)，反应过夜，TLC监控反应完毕后，蒸除反应液，加水和EA萃取，水相调节pH为3，水相用二氯甲烷萃取，合并二氯甲烷层，无水硫酸钠干燥后浓缩得BP103a05油状物化合物18g。

6.BP103a的制备

向250mL三口瓶中加入18g化合物BP103a05，100mlEA，搅拌溶解后降温至0℃，加入150ml EA/HCl(3.5M)，保温0℃，TLC监控反应完毕，过滤，滤饼用TBME洗涤得白色固体BP103a 10.4g。

2的制备

向100mL烧瓶加入3.0g BP103a(1.0eq)，化合物1 4.0g(1.0eq)，40mlDCM，4.0mlDIEA(2.0eq)，室温搅拌，TLC监控反应完毕，蒸去有机溶剂，柱层析得6.4g类油状物2 5.2g

3的制备

向200mL三口瓶中加入9.00g化合物2(1.0eq),3.96gHOSU(1.53eq)，90ml DCM，6.60g EDC.HCl(1.53eq)，室温反应2h，TLC监控反应完毕后，DCM稀释后用pH＝6.0的50mmol/L的磷酸二氢钾水溶液洗涤2次，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩得无色油状物5.9g化合物3。

4的制备

向200mL烧瓶加入2.93g化合物Boc-Lys-OH(1.0eq)，60ml水，2.00g NaHCO3(2.0eq)，搅拌，滴加5.9g化合物3(1.0eq)溶于60ml DME(乙二醇二甲醚)的溶液，补加60mlTHF,搅拌过夜，TLC监控反应完毕，蒸去有机溶剂，用醋酸调节PH＝4，EA萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩，得4.50g无色油状物化合物4

5的制备

向100mL烧瓶加入3.81g化合物4(1.0eq)，40mlDCM，1.07gHOSU，1.78g EDC.HCl，搅拌，室温反应4h，TLC监控反应完毕，DCM稀释后，50mM的磷酸二氢钾水溶液洗涤两次，纯化水洗涤一次，饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸钠干燥，浓缩，得4.1g无色油状物化合物5。

偶联物的制备

7的制备

向250mL圆底烧瓶中加入3.50g化合物6(1.0eq),52.5mlDMF,加热至60℃溶解，5-10min后减压蒸去DMF,加入300ml正庚烷减压蒸馏，重复三次，旋干后加入105mlDCM,1.08gBoc-Gly-OH(1.2eq)，63mg DMAP(0.1eq)，滴加1.59gDCC(1.5eq)溶于10mlDCM的溶液，20℃反应4小时，TLC监控反应完毕后，过滤，浓缩至剩余25％体积时加入120ml IPA,蒸去75％的溶剂，加入150ml正庚烷，室温搅拌1小时，过滤，正庚烷洗涤2次，干燥得淡黄色固体4.02g化合物7。

8的制备

向100mL三口瓶中加入4.02g化合物7，50mlDCM，搅拌溶解后滴加11.6mlTFA,室温反应2h，TLC监控反应完毕后加入150ml乙腈，减压蒸馏120ml溶剂后倒入320mlTBME溶液中，搅拌30min，过滤，滤饼用TBME洗涤得淡黄色固体8 4.00g。

9的制备

向200mL三口瓶中加入2.95g化合物8，80mlDCM，2.57g(1.05eq)化合物4,2.16mlDIEA(3.0eq),0.96ml DEPC(1.5eq),室温反应4h，TLC监控反应完毕后,DCM稀释后，水洗两次，饱和食盐水洗涤一次，干燥，浓缩，HPLC纯化后冻干得到淡黄色固体9 1.48g。

10的制备

向50mL圆底烧瓶中加入260mg化合物9，10ml的20％TFA/DCM，室温反应4h，TLC监控反应完毕后,倒入TBME中，离心，干燥得淡黄色固体10 210mg。

11的制备

向10mL圆底烧瓶中加入51mg化合物10(4.0eq)，2ml DCM，11ulTEA(8.0eq)，201mg4armPEG20K-SCM(1.0eq)，室温反应过夜后,浓缩，加入TBME中，离心，干燥得类白色固体11240mg。

12的制备

向10mL圆底烧瓶中加入50mg化合物11(1.0eq)，1.5ml pH＝7、0.01M的PBS,溶清后加入10.6mg iRGD溶于1ml pH＝7、0.01M的PBS的溶液，室温反应4小时后透析，浓缩，甲醇溶解粗品，加入HCl/EA溶液，浓缩，加入TBME中，离心，干燥得黄色固体12 50mg。

¹HNMR(DMSO+D₂O)：δ0.902(t,CH₂CH ₃),3.5(br m PEG),5.328(s,2H),

5.480(s,2H),7.0-8.5(m NH)

实施例2化合物2的制备

10.0g 2Cl-Trt Resin，偶联试剂采用HOBT/DIC，DMF为反应溶剂，反应监控采用茚三酮检测法，依次将下列保护氨基酸连接到树脂上：Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH，裂解试剂82.5％TFA/5％苯酚/5％水/2.5％EDT/5％苯甲硫醚，冰的MTBE沉淀、洗涤，粗品经反相HPLC纯化、冻干，得白色絮状物5.5g。

L部分的制备如实施例1

偶联物的制备

14的制备

向100mL圆底烧瓶中加入1.0g化合物11(1.0eq)，20ml pH＝7、0.01M的PBS,溶清后加入139mg tLyP-1溶于10ml pH＝7、0.01M的PBS的溶液，室温反应4小时后透析，浓缩，甲醇溶解粗品，加入HCl/EA溶液，浓缩，加入TBME中，离心，干燥得黄色固体14 1.0g。

¹HNMR(DMSO+D₂O)：δ0.903(t,CH₂CH ₃),3.5(br m PEG),5.332(s,2H),5.484(s,2H),7.0-8.5(m NH)

实施例3化合物3的制备

Lyp-1的制备

10.0g Fmoc-Rink MBHA Amide Resin，脱除Fmoc。偶联试剂采用HOBT/DIC，DMF为反应溶剂，反应监控采用茚三酮检测法，依次将下列保护氨基酸连接到树脂上：Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH，DMF洗涤后加入三氟乙酸铊(2.0eq)搅拌18小时后DMF洗涤，脱除Fmoc，缩合Fmoc-Cys(Trt)-OH，DMF洗涤、脱除Fmoc后干燥，加入裂解试剂82.5％TFA/5％苯酚/5％水/2.5％EDT/5％苯甲硫醚，冰的MTBE沉淀、洗涤，粗品经反相HPLC纯化、冻干，得白色絮状物LyP-1 765mg。

L部分的制备如实施例1

偶联物的制备

13的制备

向100mL圆底烧瓶中加入1.0g化合物11(1.0eq)，20ml pH＝7、0.01M的PBS,溶清后加入182mg LyP-1溶于10ml pH＝7、0.01M的PBS的溶液，室温反应4小时后透析，浓缩，甲醇溶解粗品，加入HCl/EA溶液，浓缩，加入TBME中，离心，干燥得黄色固体13 1.05g。

¹HNMR(DMSO+D₂O)：δ0.901(t,CH₂CH ₃),3.5(br m PEG),5.328(s,2H),5.481(s,2H),7.0-8.5(m NH)

实施例4化合物4的制备

CPARPAR的制备

10.0g 2Cl-Trt Resin，偶联试剂采用HOBT/DIC，DMF为反应溶剂，反应监控采用茚三酮检测法，依次将下列保护氨基酸连接到树脂上：Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH，裂解试剂82.5％TFA/5％苯酚/5％水/2.5％EDT/5％苯甲硫醚，冰的MTBE沉淀、洗涤，粗品经反相HPLC纯化、冻干，得白色絮状物CRPARPAR 6.1g。

L部分的制备如实施例1

偶联物的制备

15的制备

向100mL圆底烧瓶中加入1.0g化合物11(1.0eq)，20l pH＝7、0.01M的PBS,溶清后加入154mg CRPARPAR溶于10ml pH＝7、0.01M的PBS的溶液，室温反应4小时后透析，浓缩，甲醇溶解粗品，加入HCl/EA溶液，浓缩，加入TBME中，离心，干燥得黄色固体15 1.09g。

¹HNMR(DMSO+D₂O):δ0.905(t,CH₂CH ₃),3.5(br m PEG),5.335(s,2H),5.486(s,2H),7.0-8.5(m NH)

实施例5化合物5的制备

cRGD的制备

本发明所用cRGD系外购所得。

L部分的制备如实施例1

16的制备

向100mL圆底烧瓶中加入1.0g化合物11(1.0eq)，20ml pH＝7、0.01M的PBS,溶清后加入96.4g cRGD溶于4ml pH＝7、0.01M的PBS与6ml甲醇的混合溶液，室温反应4小时后透析，浓缩，甲醇溶解粗品，加入HCl/EA溶液，浓缩，加入TBME中，离心，干燥得黄色固体161.06g。

¹HNMR(DMSO+D₂O):δ0.902(t,CH₂CH ₃),3.5(br m PEG),5.326(s,2H),5.480(s,2H),7.0-8.5(m NH)

实施例6化合物6的制备

iRGD的制备如实施例1

L部分的制备如实施例1

偶联物的制备

1. 21的制备

向250mL圆底烧瓶中加入5.00g化合物20(1.0eq),100mlDCM,3.89gTEA (3.0eq)，滴加3.50gTBDPS-Cl(1.0eq)溶于20mlDCM的溶液，TLC监控反应完毕后，水洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后柱层析，得淡黄色固体3.62g化合物21。

2. 22的制备

向250mL圆底烧瓶中加入4.80g化合物21(1.0eq),145mlDCM,1.64gBoc-Gly-OH(1.2eq)，95mg DMAP(0.1eq)，滴加2.41gDCC(1.5eq)溶于10mlDCM的溶液，20℃反应4小时，TLC监控反应完毕后，过滤，浓缩至剩余25％体积时加入130ml IPA,蒸去75％的溶剂，加入160ml正庚烷，室温搅拌1小时，过滤，正庚烷洗涤2次，干燥得淡黄色固体4.65g化合物22。

3. 23的制备

向100mL三口瓶中加入4.65g化合物22，50mlDCM，搅拌溶解后滴加11.6mlTFA,室温反应2h，TLC监控反应完毕后加入150ml乙腈，减压蒸馏120ml溶剂后倒入320mlTBME溶液中，搅拌30min，过滤，滤饼用TBME洗涤得淡黄色固体23 2.48g。

4. 24的制备

向200mL三口瓶中加入2.3g化合物23，45mlDCM，3.196g(1.05eq)化合物5，1.75mlTEA(3.0eq),室温反应4h，TLC监控反应完毕后,DCM稀释后，水洗两次，饱和食盐水洗涤一次，干燥，浓缩，HPLC纯化后冻干得到淡黄色固体24 2.20g。

5. 25的制备

向200mL圆底烧瓶中加入2.0g化合物24，60ml的20％TFA/DCM，室温反应4h，TLC监控反应完毕后,倒入TBME中，离心，干燥得淡黄色固体251.75g。

6. 26的制备

向500mL圆底烧瓶中加入1.51g化合物25(4.0eq)，140ml DCM，390ulTEA(8.0eq)，7.0g 4armPEG20K-SCM(1.0eq)，室温反应过夜后,浓缩，加入TBME中，离心，干燥得类白色固体26 7.9g。

261的制备

向100mL圆底烧瓶中加入1.0g化合物26(1.0eq)，20ml pH＝7、0.01M的PBS,溶清后加入188mg iRGD溶于10ml pH＝7、0.01M的PBS的溶液，室温反应4小时后透析，浓缩，甲醇溶解粗品，加入HCl/EA溶液，浓缩，加入TBME中，离心，干燥得黄色固体261 980mg。

¹HNMR(DMSO+D₂O):δ0.905(t,CH₂CH ₃),3.5(br m PEG),5.333(s,2H),5.487(s,2H),7.0-8.5(m NH)

实施例7化合物7的制备

tLyp-1的制备如实施例2

L部分的制备如实施例1

偶联物的制备

263的制备

向100mL圆底烧瓶中加入1.0g化合物26(1.0eq)，20ml pH＝7、0.01M的PBS,溶清后加入144mg tLyP-1溶于10ml pH＝7、0.01M的PBS的溶液，室温反应4小时后透析，浓缩，甲醇溶解粗品，加入HCl/EA溶液，浓缩，加入TBME中，离心，干燥得黄色固体263 1.01g。

¹HNMR(DMSO+D₂O):δ0.904(t,CH₂CH ₃),3.5(br m PEG),5.335(s,2H),5.488(s,2H),7.0-8.5(m NH)

实施例8化合物8的制备

Lyp-1的制备如实施例3

L部分的制备如实施例1

偶联物的制备

262的制备

向100mL圆底烧瓶中加入1.0g化合物26(1.0eq)，20ml pH＝7、0.01M的PBS,溶清后加入188mg LyP-1溶于10ml pH＝7、0.01M的PBS的溶液，室温反应4小时后透析，浓缩，甲醇溶解粗品，加入HCl/EA溶液，浓缩，加入TBME中，离心，干燥得黄色固体262 1.04g。

¹HNMR(DMSO+D₂O):δ0.902(t,CH₂CH ₃),3.5(br m PEG),5.328(s,2H),5.481(s,2H),7.0-8.5(m NH)

实施例9化合物9的制备

CRPARPAR的制备如实施例4

L部分的制备如实施例1

偶联物的制备

264的制备

向100mL圆底烧瓶中加入1.0g化合物26(1.0eq)，20ml pH＝7、0.01M的PBS,溶清后加入159mg CRPARPAR溶于10ml pH＝7、0.01M的PBS的溶液，室温反应4小时后透析，浓缩，甲醇溶解粗品，加入HCl/EA溶液，浓缩，加入TBME中，离心，干燥得黄色固体264 1.04g。

¹HNMR(DMSO+D₂O):δ0.910(t,CH₂CH ₃),3.5(br m PEG),5.328(s,2H),5.480(s,2H),7.0-8.5(m NH)

实施例10化合物10的制备

cRGD的制备如实施例5

L部分的制备如实施例1

偶联物的制备

265的制备

向100mL圆底烧瓶中加入1.0g化合物26(1.0eq)，20ml pH＝7、0.01M的PBS,溶清后加入99.5mg cRGD溶于4ml pH＝7、0.01M的PBS与6ml甲醇的混合溶液，室温反应4小时后透析，浓缩，甲醇溶解粗品，加入HCl/EA溶液，浓缩，加入TBME中，离心，干燥得黄色固体2651.03g。

¹HNMR(DMSO+D₂O):δ0.915(t,CH₂CH ₃),3.5(br m PEG),5.337(s,2H),5.484(s,2H),7.0-8.5(m NH)

实施例11化合物11的制备

iRGD的制备如实施例1

L部分的制备如实施例1

偶联物的制备

31的制备

向250mL圆底烧瓶中加入6.00g化合物30(1.0eq),120mlDCM,5.00gTEA(3.0eq)，滴加4.53gTBDPS-Cl(1.0eq)溶于20mlDCM的溶液，TLC监控反应完毕后，水洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后柱层析，得淡黄色固体4.32g化合物31。

32的制备

向250mL圆底烧瓶中加入5.0g化合物31(1.0eq),150mlDCM,1.73gBoc-Gly-OH(1.2eq)，101mg DMAP(0.1eq)，滴加2.55gDCC(1.5eq)溶于10mlDCM的溶液，20℃反应4小时，TLC监控反应完毕后，过滤，浓缩至剩余25％体积时加入130ml IPA,蒸去75％的溶剂，加入160ml正庚烷，室温搅拌1小时，过滤，正庚烷洗涤2次，干燥得淡黄色固体4.52g化合物32。

33的制备

向100mL三口瓶中加入4.40g化合物22，50mlDCM，搅拌溶解后滴加11.6mlTFA,室温反应2h，TLC监控反应完毕后加入150ml乙腈，减压蒸馏120ml溶剂后倒入320mlTBME溶液中，搅拌30min，过滤，滤饼用TBME洗涤得淡黄色固体23 2.32g。

34的制备

向200mL三口瓶中加入2.3g化合物33，45mlDCM，2.77g(1.05eq)化合物5，1.1g TEA(3.0eq),室温反应4h，TLC监控反应完毕后,DCM稀释后，水洗两次，饱和食盐水洗涤一次，干燥，浓缩，HPLC纯化后冻干得到淡黄色固体34 2.02g。

35的制备

向200mL圆底烧瓶中加入2.0g化合物34，60ml的20％TFA/DCM，室温反应4h，TLC监控反应完毕后,倒入TBME中，离心，干燥得淡黄色固体351.69g。

36的制备

向500mL圆底烧瓶中加入1.50g化合物25(4.0eq)，140ml DCM，390ulTEA(8.0eq)，7.0g 4armPEG20K-SCM(1.0eq)，室温反应过夜后,浓缩，加入TBME中，离心，干燥得类白色固体36 7.64g。

361的制备

向100mL圆底烧瓶中加入1.0g化合物36(1.0eq)，20ml pH＝7、0.01M的PBS,溶清后加入189mg iRGD溶于10ml pH＝7、0.01M的PBS的溶液，室温反应4小时后透析，浓缩，甲醇溶解粗品，加入HCl/EA溶液，浓缩，加入TBME中，离心，干燥得黄色固体361 1.08g。

¹HNMR(DMSO+D₂O):δ0.909(t,CH₂CH ₃),3.5(br m PEG),5.333(s,2H),5.481(s,2H),7.0-8.5(m NH)

实施例12化合物12的制备

tLyp-1的制备如实施例2

L部分的制备如实施例1

偶联物的制备

363的制备

向100mL圆底烧瓶中加入1.0g化合物36(1.0eq)，20ml pH＝7、0.01M的PBS,溶清后加入144mg tLyP-1溶于10ml pH＝7、0.01M的PBS的溶液，室温反应4小时后透析，浓缩，甲醇溶解粗品，加入HCl/EA溶液，浓缩，加入TBME中，离心，干燥得黄色固体363 0.99g。

¹HNMR(DMSO+D₂O):δ0.915(t,CH₂CH ₃),3.5(br m PEG),5.340(s,2H),5.487(s,2H),7.0-8.5(m NH)

实施例13化合物13的制备

Lyp-1的制备如实施例3

L部分的制备如实施例1

偶联物的制备

362的制备

向100mL圆底烧瓶中加入1.0g化合物36(1.0eq)，20ml pH＝7、0.01M的PBS,溶清后加入189mg LyP-1溶于10ml pH＝7、0.01M的PBS的溶液，室温反应4小时后透析，浓缩，甲醇溶解粗品，加入HCl/EA溶液，浓缩，加入TBME中，离心，干燥得黄色固体362 1.06g。

¹HNMR(DMSO+D₂O):δ0.908(t,CH₂CH ₃),3.5(br m PEG),5.335(s,2H),5.484(s,2H),7.0-8.5(m NH)

实施例14化合物14的制备

CRPARPAR的制备如实施例4

L部分的制备如实施例1

偶联物的制备

364的制备

向100mL圆底烧瓶中加入1.0g化合物36(1.0eq)，20ml pH＝7、0.01M的PBS,溶清后加入160mg CRPARPAR溶于10ml pH＝7、0.01M的PBS的溶液，室温反应4小时后透析，浓缩，甲醇溶解粗品，加入HCl/EA溶液，浓缩，加入TBME中，离心，干燥得黄色固体364 1.01g。

¹HNMR(DMSO+D₂O):δ0.910(t,CH₂CH ₃),3.5(br m PEG),5.336(s,2H),5.485(s,2H),7.0-8.5(m NH)

实施例15化合物15的制备

cRGD的制备如实施例5

L部分的制备如实施例1

偶联物的制备

365的制备

向100mL圆底烧瓶中加入1.0g化合物36(1.0eq)，20ml pH＝7、0.01M的PBS,溶清后加入100mg cRGD溶于4ml pH＝7、0.01M的PBS与6ml甲醇的混合溶液，室温反应4小时后透析，浓缩，甲醇溶解粗品，加入HCl/EA溶液，浓缩，加入TBME中，离心，干燥得黄色固体3651.05g。

¹HNMR(DMSO+D₂O):δ0.914(t,CH₂CH ₃),3.5(br m PEG),5.340(s,2H),5.489(s,2H),7.0-8.5(m NH)

实施例16化合物16的制备

iRGD的制备如实施例1

L部分的制备如实施例1

偶联物的制备

1.41的制备

向250mL圆底烧瓶中加入5.0g化合物40(1.0eq),150mlDCM,2.67gBoc-Gly-OH(1.2eq)，155mg DMAP(0.1eq)，滴加3.93gDCC(1.5eq)溶于15mlDCM的溶液，20℃反应4小时，TLC监控反应完毕后，过滤，浓缩至剩余25％体积时加入130ml IPA,蒸去75％的溶剂，加入160ml正庚烷，室温搅拌1小时，过滤，正庚烷洗涤2次，干燥得淡黄色固体6.85g化合物41。

2.42的制备

向100mL三口瓶中加入4.00g化合物41，50mlDCM，搅拌溶解后滴加11.6mlTFA,室温反应2h，TLC监控反应完毕后加入150ml乙腈，减压蒸馏120ml溶剂后倒入320mlTBME溶液中，搅拌30min，过滤，滤饼用TBME洗涤得淡黄色固体42 3.54g。

1. 43的制备

向200mL三口瓶中加入3.00g化合物42，45mlDCM，3.46g(1.05eq)化合物5，1.38gTEA(3.0eq),室温反应4h，TLC监控反应完毕后,DCM稀释后，水洗两次，饱和食盐水洗涤一次，干燥，浓缩，HPLC纯化后冻干得到淡黄色固体43 2.68g。

2. 44的制备

向200mL圆底烧瓶中加入2.0g化合物43，60ml的20％TFA/DCM，室温反应4h，TLC监控反应完毕后,倒入TBME中，离心，干燥得淡黄色固体441.61g。

3. 45的制备

向500mL圆底烧瓶中加入1.50g化合物44(4.0eq)，140ml DCM，391ulTEA(8.0eq)，7.0g 4armPEG20K-SCM(1.0eq)，室温反应过夜后,浓缩，加入TBME中，离心，干燥得类白色固体45 7.61g。

451的制备

向100mL圆底烧瓶中加入1.0g化合物45(1.0eq)，20ml pH＝7、0.01M的PBS,溶清后加入188mg iRGD于10ml pH＝7、0.01M的PBS的溶液，室温反应4小时后透析，浓缩，甲醇溶解粗品，加入HCl/EA溶液，浓缩，加入TBME中，离心，干燥得黄色固体451 1.09g。

¹HNMR(DMSO+D₂O):δ0.909(t,CH₂CH ₃),3.5(br m PEG),5.335(s,2H),5.482(s,2H),7.0-8.5(m NH)

实施例17化合物17的制备

tLyp-1的制备如实施例2

L部分的制备如实施例1

偶联物的制备

453的制备

向100mL圆底烧瓶中加入1.0g化合物45(1.0eq)，20ml pH＝7、0.01M的PBS,溶清后加入144mg tLyP-1于10ml pH＝7、0.01M的PBS的溶液，室温反应4小时后透析，浓缩，甲醇溶解粗品，加入HCl/EA溶液，浓缩，加入TBME中，离心，干燥得黄色固体453 1.02g。

¹HNMR(DMSO+D₂O):δ0.912(t,CH₂CH ₃),3.5(br m PEG),5.336(s,2H),5.485(s,2H),7.0-8.5(m NH)

实施例18化合物18的制备

Lyp-1的制备如实施例3

L部分的制备如实施例1

偶联物的制备

452的制备

向100mL圆底烧瓶中加入1.0g化合物45(1.0eq)，20ml pH＝7、0.01M的PBS,溶清后加入188mg LyP-1于10ml pH＝7、0.01M的PBS的溶液，室温反应4小时后透析，浓缩，甲醇溶解粗品，加入HCl/EA溶液，浓缩，加入TBME中，离心，干燥得黄色固体452 1.06g。

¹HNMR(DMSO+D₂O):δ0.917(t,CH₂CH ₃),3.5(br m PEG),5.340(s,2H),5.491(s,2H),7.0-8.5(m NH)

实施例19化合物19的制备

CRPARPAR的制备如实施例4

L部分的制备如实施例1

偶联物的制备

454的制备

向100mL圆底烧瓶中加入1.0g化合物45(1.0eq)，20ml pH＝7、0.01M的PBS,溶清后加入159mg CRPARPAR于10ml pH＝7、0.01M的PBS的溶液，室温反应4小时后透析，浓缩，甲醇溶解粗品，加入HCl/EA溶液，浓缩，加入TBME中，离心，干燥得黄色固体454 1.07g。

¹HNMR(DMSO+D₂O):δ0.911(t,CH₂CH ₃),3.5(br m PEG),5.332(s,2H),5.480(s,2H),7.0-8.5(m NH)

实施例20化合物20的制备

cRGD的制备如实施例5

L部分的制备如实施例1

偶联物的制备

455的制备

向100mL圆底烧瓶中加入1.0g化合物45(1.0eq)，20ml pH＝7、0.01M的PBS,溶清后加入99.5mg cRGD溶于4ml pH＝7、0.01M的PBS与6ml甲醇的混合溶液，室温反应4小时后透析，浓缩，甲醇溶解粗品，加入HCl/EA溶液，浓缩，加入TBME中，离心，干燥得黄色固体4551.03g。

¹HNMR(DMSO+D₂O):δ0.909(t,CH₂CH ₃),3.5(br m PEG),5.331(s,2H),5.478(s,2H),7.0-8.5(m NH)

实施例21化合物21的制备

iRGD的制备如实施例1

L部分的制备如实施例1

50的制备

向10mL圆底烧瓶中加入52mg化合物10(3.0eq)，2ml DCM，11ulTEA(6.0eq)，273mg3armPEG20K-SCM(1.0eq)，室温反应过夜后,浓缩，加入TBME中，离心，干燥得类白色固体50310mg。

51的制备

向10mL圆底烧瓶中加入50mg化合物50(1.0eq)，1.5ml pH＝7、0.01M的PBS,溶清后加入7.2mg iRGD溶于1ml pH＝7、0.01M的PBS的溶液，室温反应4小时后透析，浓缩，甲醇溶解粗品，加入HCl/EA溶液，浓缩，加入TBME中，离心，干燥得黄色固体51 49mg。

¹HNMR(DMSO+D₂O):δ0.901(t,CH₂CH ₃),3.5(br m PEG),5.328(s,2H),5.480(s,2H),7.0-8.5(m NH)

实施例22化合物22的制备

L部分的制备如实施例1

52的制备

向10mL圆底烧瓶中加入55mg化合物50(1.0eq)，1.5ml pH＝7、0.01M的PBS,溶清后加入4.2mg cRGD溶于1ml pH＝7、0.01M的PBS与1.5ml甲醇的混合溶液，室温反应4小时后透析，浓缩，甲醇溶解粗品，加入HCl/EA溶液，浓缩，加入TBME中，离心，干燥得黄色固体5250mg。

¹HNMR(DMSO+D₂O):δ0.901(t,CH₂CH ₃),3.5(br m PEG),5.333(s,2H),5.487(s,2H),7.0-8.5(m NH)

实施例23化合物23的制备

iRGD的制备如实施例1

L部分的制备如实施例1

偶联物的制备

60的制备

向100mL圆底烧瓶中加入476mg化合物10(8.0eq)，15ml DCM，105ulTEA(16.0eq)，1.0g 8armPEG20K-SCM(1.0eq)，室温反应过夜后,浓缩，加入TBME中，离心，干燥得类白色固体60 1.37g。

61的制备

向10mL圆底烧瓶中加入50mg化合物60(1.0eq)，1.5ml pH＝7、0.01M的PBS,溶清后加入14.5mg iRGD溶于1ml pH＝7、0.01M的PBS的溶液，室温反应4小时后透析，浓缩，甲醇溶解粗品，加入HCl/EA溶液，浓缩，加入TBME中，离心，干燥得黄色固体61 54mg。

实施例24化合物24的制备

Lyp-1的制备如实施例3

L部分的制备如实施例1

偶联物的制备

62的制备

向10mL圆底烧瓶中加入60mg化合物60(1.0eq)，1.5ml pH＝7、0.01M的PBS,溶清后加入17.4mg LyP-1溶于1ml pH＝7、0.01M的PBS的溶液，室温反应4小时后透析，浓缩，甲醇溶解粗品，加入HCl/EA溶液，浓缩，加入TBME中，离心，干燥得黄色固体62 68mg。

¹HNMR(DMSO+D₂O):δ0.901(t,CH₂CH ₃),3.5(br m PEG),5.329(s,2H),5.481(s,2H),7.0-8.5(m NH)

实施例25化合物25的制备

63的制备

向10mL圆底烧瓶中加入45mg化合物60(1.0eq)，1.5ml pH＝7、0.01M的PBS,溶清后加入10.0mg tLyP-1溶于1ml pH＝7、0.01M的PBS的溶液，室温反应4小时后透析，浓缩，甲醇溶解粗品，加入HCl/EA溶液，浓缩，加入TBME中，离心，干燥得黄色固体63 45mg。

¹HNMR(DMSO+D₂O):δ0.901(t,CH₂CH ₃),3.5(br m PEG),5.330(s,2H),5.482(s,2H),7.0-8.5(m NH)

实施例26化合物26的制备

64的制备

向10mL圆底烧瓶中加入55mg化合物60(1.0eq)，1.5ml pH＝7、0.01M的PBS,溶清后加入13.5mg CRPARPAR溶于1ml pH＝7、0.01M的PBS的溶液，室温反应4小时后透析，浓缩，甲醇溶解粗品，加入HCl/EA溶液，浓缩，加入TBME中，离心，干燥得黄色固体64 62mg。

¹HNMR(DMSO+D₂O):δ0.901(t,CH₂CH ₃),3.5(br m PEG),5.331(s,2H),5.480(s,2H),7.0-8.5(m NH)

实施例27化合物27的制备

65的制备

向10mL圆底烧瓶中加入50mg化合物60(1.0eq)，1.5ml pH＝7、0.01M的PBS,溶清后加入7.7mg cRGD溶于1ml pH＝7、0.01M的PBS与1.5ml甲醇的混合溶液，室温反应4小时后透析，浓缩，甲醇溶解粗品，加入HCl/EA溶液，浓缩，加入TBME中，离心，干燥得黄色固体6550mg。

实施例28化合物28的制备

iRGD的制备如实施例1

L部分的制备如实施例1

偶联物的制备

21的制备

向250mL圆底烧瓶中加入5.00g化合物20(1.0eq),100mlDCM,3.87gTEA(3.0eq)，滴加3.49gTBDPS-Cl(1.0eq)溶于20mlDCM的溶液，TLC监控反应完毕后，水洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后柱层析，得淡黄色固体 3.52g化合物21。

22的制备

向250mL圆底烧瓶中加入4.50g化合物21(1.0eq),135mlDCM,1.5gBoc-Gly-OH(1.2eq)，87mg DMAP(0.1eq)，滴加2.21gDCC(1.5eq)溶于10mlDCM的溶液，20℃反应4小时，TLC监控反应完毕后，过滤，浓缩至剩余25％体积时加入120ml IPA,蒸去75％的溶剂，加入150ml正庚烷，室温搅拌1小时，过滤，正庚烷洗涤2次，干燥得淡黄色固体4.95g化合物22。

23的制备

向100mL三口瓶中加入4.95g化合物22，55mlDCM，搅拌溶解后滴加13.7mlTFA,室温反应2h，TLC监控反应完毕后加入150ml乙腈，减压蒸馏120ml溶剂后倒入320mlTBME溶液中，搅拌30min，过滤，滤饼用TBME洗涤得淡黄色固体23 2.5g。

24的制备

向200mL三口瓶中加入2.3g化合物23，45mlDCM，3.9g(1.05eq)化合物5，2.14mlTEA(3.0eq),室温反应4h，TLC监控反应完毕后,DCM稀释后，水洗两次，饱和食盐水洗涤一次，干燥，浓缩，HPLC纯化后冻干得到淡黄色固体24 2.45g。

25的制备

向200mL圆底烧瓶中加入2.2g化合物24，65ml的20％TFA/DCM，室温反应4h，TLC监控反应完毕后,倒入TBME中，离心，干燥得淡黄色固体251.7g。

70的制备

向100mL圆底烧瓶中加入1.21g化合物25(8.0eq)，60ml DCM，314ulTEA(16.0eq)，3.0g 4armPEG20K-SCM(1.0eq)，室温反应过夜后,浓缩，加入TBME中，离心，干燥得类白色固体70 3.9g。

71的制备

向10mL圆底烧瓶中加入50mg化合物70(1.0eq)，1.5ml pH＝7、0.01M的PBS,溶清后加入15.3mg iRGD溶于1ml pH＝7、0.01M的PBS的溶液，室温反应4小时后透析，浓缩，甲醇溶解粗品，加入HCl/EA溶液，浓缩，加入TBME中，离心，干燥得黄色固体71 55mg。

¹HNMR(DMSO+D₂O):δ0.901(t,CH₂CH ₃),3.5(br m PEG),5.335(s,2H),5.487(s,2H),7.0-8.5(m NH)

实施例29化合物29的制备

72的制备

向10mL圆底烧瓶中加入60mg化合物70(1.0eq)，1.5ml pH＝7、0.01M的PBS,溶清后加入18.3mg LyP-1溶于1ml pH＝7、0.01M的PBS的溶液，室温反应4小时后透析，浓缩，甲醇溶解粗品，加入HCl/EA溶液，浓缩，加入TBME中，离心，干燥得黄色固体72 68mg。

¹HNMR(DMSO+D₂O):δ0.902(t,CH₂CH ₃),3.5(br m PEG),5.333(s,2H),5.486(s,2H),7.0-8.5(m NH)

实施例30化合物30的制备

73的制备

向10mL圆底烧瓶中加入55mg化合物70(1.0eq)，1.5ml pH＝7、0.01M的PBS,溶清后加入12.8mg tLyP-1溶于1ml pH＝7、0.01M的PBS的溶液，室温反应4小时后透析，浓缩，甲醇溶解粗品，加入HCl/EA溶液，浓缩，加入TBME中，离心，干燥得黄色固体73 55mg。

¹HNMR(DMSO+D₂O):δ0.901(t,CH₂CH ₃),3.5(br m PEG),5.335(s,2H),5.488(s,2H),7.0-8.5(m NH)

实施例31化合物31的制备

74的制备

向10mL圆底烧瓶中加入55mg化合物70(1.0eq)，1.5ml pH＝7、0.01M的PBS,溶清后加入14.2mg CRPARPAR溶于1ml pH＝7、0.01M的PBS的溶液，室温反应4小时后透析，浓缩，甲醇溶解粗品，加入HCl/EA溶液，浓缩，加入TBME中，离心，干燥得黄色固体74 60mg。

¹HNMR(DMSO+D₂O):δ0.902(t,CH₂CH ₃),3.5(br m PEG),5.332(s,2H),5.487(s,2H),7.0-8.5(m NH)

实施例32化合物32的制备

75的制备

向10mL圆底烧瓶中加入60mg化合物70(1.0eq)，1.5ml pH＝7、0.01M的PBS,溶清后加入9.7mg cRGD溶于1ml pH＝7、0.01M的PBS与1.5ml甲醇的混合溶液，室温反应4小时后透析，浓缩，甲醇溶解粗品，加入HCl/EA溶液，浓缩，加入TBME中，离心，干燥得黄色固体7562mg。

¹HNMR(DMSO+D₂O):δ0.900(t,CH₂CH ₃),3.5(br m PEG),5.333(s,2H),5.487(s,2H),7.0-8.5(m NH)

实施例33化合物33的制备

31的制备

32的制备

33的制备

34的制备

35的制备

80的制备

向500mL圆底烧瓶中加入2.75g化合物35(8.0eq)，140ml DCM， 730ulTEA(16.0eq)，7.0g 8armPEG20K-SCM(1.0eq)，室温反应过夜后,浓缩，加入TBME中，离心，干燥得类白色固体80 8.64g。

81的制备

向100mL圆底烧瓶中加入1.0g化合物80(1.0eq)，20ml pH＝7、0.01M的PBS,溶清后加入307mg iRGD溶于15ml pH＝7、0.01M的PBS的溶液，室温反应4小时后透析，浓缩，甲醇溶解粗品，加入HCl/EA溶液，浓缩，加入TBME中，离心，干燥得黄色固体81 1.18g。

¹HNMR(DMSO+D₂O):δ0.903(t,CH₂CH ₃),3.5(br m PEG),5.334(s,2H),5.487(s,2H),7.0-8.5(m NH)

实施例34化合物34的制备

实施例35化合物35的制备

83的制备

向100mL圆底烧瓶中加入1.0g化合物80(1.0eq)，20ml pH＝7、0.01M的PBS,溶清后加入235mg tLyP-1溶于15ml pH＝7、0.01M的PBS的溶液，室温反应4小时后透析，浓缩，甲醇溶解粗品，加入HCl/EA溶液，浓缩，加入TBME中，离心，干燥得黄色固体83 1.05g。

¹HNMR(DMSO+D₂O):δ0.904(t,CH₂CH ₃),3.5(br m PEG),5.334(s,2H),5.489(s,2H),7.0-8.5(m NH)

实施例36化合物36的制备

实施例37化合物37的制备

85的制备

向100mL圆底烧瓶中加入1.0g化合物80(1.0eq)，20ml pH＝7、0.01M的PBS,溶清后加入163mg cRGD溶于6ml pH＝7、0.01M的PBS与10ml甲醇的混合溶液，室温反应4小时后透析，浓缩，甲醇溶解粗品，加入HCl/EA溶液，浓缩，加入TBME中，离心，干燥得黄色固体851.00g。

实施例38化合物38的制备

41的制备

42的制备

43的制备

44的制备

90的制备

向250mL圆底烧瓶中加入1.61g化合物44(8.0eq)，80ml DCM，418ulTEA(16.0eq)，4.0g 8armPEG20K-SCM(1.0eq)，室温反应过夜后,浓缩，加入TBME中，离心，干燥得类白色固体90 5.15g。

91的制备

向50mL圆底烧瓶中加入0.5g化合物90(1.0eq)，10ml pH＝7、0.01M的PBS,溶清后加入152mg iRGD于5ml pH＝7、0.01M的PBS的溶液，室温反应4小时后透析，浓缩，甲醇溶解粗品，加入HCl/EA溶液，浓缩，加入TBME中，离心，干燥得黄色固体91 0.53g。

¹HNMR(DMSO+D₂O):δ0.902(t,CH₂CH ₃),3.5(br m PEG),5.333(s,2H),5.488(s,2H),7.0-8.5(m NH)

实施例39化合物39的制备

92的制备

向50mL圆底烧瓶中加入0.5g化合物90(1.0eq)，10ml pH＝7、0.01M的PBS,溶清后加入153mg LyP-1于5ml pH＝7、0.01M的PBS的溶液，室温反应4小时后透析，浓缩，甲醇溶解粗品，加入HCl/EA溶液，浓缩，加入TBME中，离心，干燥得黄色固体92 0.57g。

¹HNMR(DMSO+D₂O):δ0.900(t,CH₂CH ₃),3.5(br m PEG),5.332(s,2H),5.487(s,2H),7.0-8.5(m NH)

实施例40化合物40的制备

实施例41化合物41的制备

94的制备

向50mL圆底烧瓶中加入0.5g化合物90(1.0eq)，10ml pH＝7、0.01M的PBS,溶清后加入129mg CRPARPAR于5ml pH＝7、0.01M的PBS的溶液，室温反应4小时后透析，浓缩，甲醇溶解粗品，加入HCl/EA溶液，浓缩，加入TBME 中，离心，干燥得黄色固体94 0.55g。

¹HNMR(DMSO+D₂O):δ0.901(t,CH₂CH ₃),3.5(br m PEG),5.331(s,2H),5.487(s,2H),7.0-8.5(m NH)

实施例42化合物42的制备

95的制备

向50mL圆底烧瓶中加入0.5g化合物90(1.0eq)，10ml pH＝7、0.01M的PBS,溶清后加入80.8mg cRGD溶于4ml pH＝7、0.01M的PBS与6ml甲醇的混合溶液，室温反应4小时后透析，浓缩，甲醇溶解粗品，加入HCl/EA溶液，浓缩，加入TBME中，离心，干燥得黄色固体950.50g。

¹HNMR(DMSO+D₂O):δ0.903(t,CH₂CH ₃),3.5(br m PEG),5.330(s,2H),5.487(s,2H),7.0-8.5(m NH)

实施例43对人结肠癌HT-29裸鼠移植瘤模型肿瘤体内生长的抑制作用。

1.实验目的

测试化合物1-42对人结肠癌HT-29裸鼠移植瘤模型肿瘤体内生长的抑制作用。

2.实验材料

2.1供试品

伊立替康(原料药)、nktr-102(原料药)系购买所得，化合物1-42均由博瑞生物医药(苏州)股份有限公司提供。

2.2试剂

McCoy’s 5A培养液，胎牛血清(FBS)，胰蛋白酶，青-链双抗，注射用水，乳酸，山梨糖醇。

2.3实验动物

雌性BALB/c裸小鼠(只数：300只；周龄：5～7周)从北京维通利华实验动物技术有限公司购买，饲养于SPF动物房，温度20～25℃，相对湿度40％～70％，明暗照明各12小时；动物自由饮水及采食。正常喂养约1周后，经兽医检验，体征状况良好小鼠可入选本实验。分组前使用记号笔于动物尾根部进行标识，分组后每只动物均用耳部剪缺方式标识。

2.4移植性肿瘤瘤株

人结肠癌细胞HT-29，来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(CAS，本实验室液氮冻存)。

3实验方法

3.1HT-29细胞培养

在5％CO₂、37℃培养条件下，HT-29细胞在含10％胎牛血清McCoy’s 5A培养液中进行常规细胞培养；以0.25％胰酶消化传代；根据细胞生长情况，每周传代2到3次，传代比例为1:3到1:8。

3.2动物模型制备

收取对数生长期HT-29细胞，细胞计数后重悬于无血清McCoy’s 5A培养基中，调整细胞浓度至6×10⁷细胞/mL；用移液器吹打细胞使其分散均匀后装入50mL离心管中，将离心管置于冰盒中；用1mL注射器吸取细胞悬液，注射到裸鼠前右肢腋窝皮下，每只动物接种100μL(6×10⁶细胞/只)，建立HT-29裸鼠移植瘤模型。接种后定期观察动物状态及肿瘤生长情况，使用电子游标卡尺测量瘤径，数据直接输入Excel电子表格，计算肿瘤体积。待肿瘤体积达到100～300mm³，挑选健康状况良好、肿瘤体积相近的动物225只，采用随机区组法分为45组(n＝5)。实验开始后每周测量2次瘤径，计算肿瘤体积，同时称量动物体重并记录。

肿瘤体积(TV)计算公式如下：

TV(mm³)＝l×w²/2

其中，l表示肿瘤长径(mm)；w表示肿瘤短径(mm)。

3.3溶剂配制

称取0.5g山梨糖醇装入50mL离心管中，在离心管中加入50mL注射用水，涡旋振荡使固体物质完全溶解，配制成浓度1％的山梨糖醇水溶液(w/v)，保存于4℃冰箱备用。

3.4给药制剂配制

3..4.1伊立替康给药制剂配制

称取12.0mg的伊立替康，加入0.15mL的1％乳酸，涡旋振荡使药物完全溶解，再分别加入2.85mL的1％山梨糖醇水溶液，涡旋振荡混合均匀，溶液中1％乳酸、1％山梨糖醇水溶液的比例约为5:95(v/v)。溶液中伊立替康游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。

3.4.2nktr-102给药制剂配制

每次给药前，准确称量88.55mg的nktr-102，加入2.3mL的生理盐水，涡旋振荡使药物完全溶解，溶液中伊立替康游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。

3.4.3化合物1-5给药制剂配制

每次给药前，准确称量113.85mg的化合物1，加入2.3mL的生理盐水，涡旋振荡使药物完全溶解，溶液中伊立替康游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。

每次给药前，准确称量109.80mg的化合物2，加入2.3mL的生理盐水，涡旋振荡使药物完全溶解，溶液中伊立替康游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。

每次给药前，准确称量113.88mg的化合物3，加入2.3mL的生理盐水，涡旋振荡使药物完全溶解，溶液中伊立替康游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。

每次给药前，准确称量111.24mg的化合物4，加入2.3mL的生理盐水，涡旋振荡使药物完全溶解，溶液中伊立替康游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。

每次给药前，准确称量105.78mg的化合物5，加入2.3mL的生理盐水，涡旋振荡使药物完全溶解，溶液中伊立替康游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。

3.4.4化合物6-10给药制剂配制

每次给药前，准确称量113.09mg的化合物6，加入2.3mL的生理盐水，涡旋振荡使药物完全溶解，溶液中SN-38游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。

每次给药前，准确称量109.05mg的化合物7，加入2.3mL的生理盐水，涡旋振荡使药物完全溶解，溶液中SN-38游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。

每次给药前，准确称量113.12mg的化合物8，加入2.3mL的生理盐水，涡旋振荡使药物完全溶解，溶液中SN-38游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。

每次给药前，准确称量110.48mg的化合物9，加入2.3mL的生理盐水，涡旋振荡使药物完全溶解，溶液中SN-38游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。

每次给药前，准确称量105.02mg的化合物10，加入2.3mL的生理盐水，涡旋振荡使药物完全溶解，溶液中SN-38游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。

3.4.5化合物11-15给药制剂配制

每次给药前，准确称量112.98mg的化合物11，加入2.3mL的生理盐水，涡旋振荡使药物完全溶解，溶液中10-羟基喜树碱游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。

每次给药前，准确称量108.94mg的化合物12，加入2.3mL的生理盐水，涡旋振荡使药物完全溶解，溶液中10-羟基喜树碱游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。

每次给药前，准确称量113.01mg的化合物13，加入2.3mL的生理盐水，涡旋振荡使药物完全溶解，溶液中10-羟基喜树碱游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。

每次给药前，准确称量110.37mg的化合物14，加入2.3mL的生理盐水，涡旋振荡使药物完全溶解，溶液中10-羟基喜树碱游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。

每次给药前，准确称量104.91mg的化合物15，加入2.3mL的生理盐水，涡旋振荡使药物完全溶解，溶液中10-羟基喜树碱游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。

3.4.6化合物16-20给药制剂配制

每次给药前，准确称量113.09mg的化合物11，加入2.3mL的生理盐水，涡旋振荡使药物完全溶解，溶液中鲁比替康游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。

每次给药前，准确称量109.05mg的化合物12，加入2.3mL的生理盐水，涡旋振荡使药物完全溶解，溶液中鲁比替康游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。

每次给药前，准确称量113.12mg的化合物13，加入2.3mL的生理盐水，涡旋振荡使药物完全溶解，溶液中鲁比替康游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。

每次给药前，准确称量110.48mg的化合物14，加入2.3mL的生理盐水，涡旋振荡使药物完全溶解，溶液中鲁比替康游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。

每次给药前，准确称量105.02mg的化合物15，加入2.3mL的生理盐水，涡旋振荡使药物完全溶解，溶液中鲁比替康游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。

3.4.7化合物21-42给药制剂配制

配制方法如上，使溶液中活性剂的游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。

3.5动物分组及给药

动物分组及给药方案见表1。

活性剂为伊立替康的组(组1-8)。于分组当天开始第一次给药，21天后结束实验，给药体积均为10mL·kg^-1。第1组为溶剂对照组，尾静脉注射给予空白溶剂，每4天1次，共给药3次(Q4D×3)。第2-8组分别尾静脉注射给予受试样品伊立替康、nktr-102、化合物1-5，给药剂量均为40mg·kg^-1(以伊立替康含量计算)，Q4D×3。

活性剂为SN-38的组(组9-13)。于分组当天开始第一次给药，21天后结束实验，给药体积均为10mL·kg^-1。第9-13组分别尾静脉注射给予受试样品化合物6-10，给药剂量均为40mg·kg^-1(以SN-38含量计算)，Q4D×3。

活性剂为10-羟基喜树碱的组(组14-18)。于分组当天开始第一次给药，21天后结束实验，给药体积均为10mL·kg^-1。第14-18组分别尾静脉注射给予受试样品化合物11-15，给药剂量均为40mg·kg^-1(以10-羟基喜树碱含量计算)，Q4D×3。

活性剂为鲁比替康的组(组19-23)。于分组当天开始第一次给药，21天后结束实验，给药体积均为10mL·kg^-1。第19-23组分别尾静脉注射给予受试样品化合物16-20，给药剂量均为40mg·kg^-1(以鲁比替康含量计算)，Q4D×3。

组24-45给药方式如上。

表1.裸鼠移植瘤模型药效实验给药方案

3.6实验结束

实验最后一天，称量体重、测量瘤径后动物安乐死(CO₂)。剥取肿瘤组织、称重并拍照(拍照时按下列组合分别拍摄)，计算瘤重抑瘤率。对动物进行大体解剖，肉眼观察内脏器官有无异常。

4数据记录、计算公式

相对肿瘤体积(RTV)的计算公式为：

RTV＝TV_t/TV_initial

其中，TV_initial为分组给药时测量到的肿瘤体积；TV_t为给药期间每一次测量时的肿瘤体积。

相对肿瘤增殖率(％T/C)的计算公式为：

％T/C＝100％×(RTV_T/RTV_C)

其中，RTV_T表示治疗组RTV；RTV_C表示溶剂对照组RTV。

肿瘤生长抑制率TGI(％)的计算公式为：

TGI＝100％×[1－(TV_t(T)－TV_initial(T))/(TV_t(C)－TV_initial(C))]

其中，TV_t(T)表示治疗组每次测量的肿瘤体积；TV_initial(T)表示分组给药时治疗组的肿瘤体积；TV_t(C)表示溶剂对照组每次测量的肿瘤体积；TV_initial(C)表示分组给药时溶剂对照组的肿瘤体积。

动物体重下降率的计算公式为：

动物体重下降率＝100％×(BW_initial－BW_t)/BW_initial

其中，BW_t表示给药期间每次测量的动物体重；BW_initial表示分组给药时的动物体重。

瘤重抑瘤率IR(％)的计算公式为：

IR(％)＝100％×(W_C－W_T)/W_C

其中，W_C表示对照组瘤重；W_T表示治疗组瘤重。

5统计分析方法

试验数据用Microsoft Office Excel 2007软件进行计算和相关统计学处理。数据除特别说明外，用均数±标准误(Mean±SE)表示，两组间比较采用t检验。

6实验观察

在实验过程中，实验人员和兽医需对实验动物的体征和健康状况进行持续观察。动物的任何异常表现，例如疼痛、抑郁、活动减少等，需记录在实验原始记录中。如果实验动物的异常表现超过IACUC相关动物福利的文件规定，可经由兽医判断是否中止实验，并通报实验项目负责人。

7结果

针对人癌异体移植瘤模型，推荐采用相对肿瘤增殖率T/C(％)作为试验评价指标，增殖率越低，说明抑制肿瘤效果越良好，见表2。

表2对肿瘤增殖率T/C(％)

*与空白溶剂、伊立替康和nktr-102组的RTV相比，P＜0.05

#与空白溶剂、伊立替康和nktr-102组的％T/C相比，P＜0.05

实验结果显示，本发明化合物对人结肠癌HT-29裸鼠移植瘤模型肿瘤体内生长有良好抑制作用，且优于伊立替康和nktr-102。

实施例44人乳腺癌MDA-MB-231裸鼠异种移植模型的抑制作用

1.实验目的

本研究用人乳腺癌MDA-MB-231裸鼠移植瘤模型对化合物1-42的体内抗肿瘤活性进行评价。

2.实验动物

2.1动物种类

小鼠。

2.2品种

BALB/c裸鼠。

2.3性别

雌性。

2.4数量

接种320只，实验用225只。

2.5年龄

6-8周。

2.6体重

20-22g±20％体重均值。

2.7动物来源(供应商)

上海西普尔-必凯实验动物有限公司(BK)，许可证号SCXK(沪)2008-0016。

2.8实验动物管理

所有实验动物均饲养在SPF级别实验室。实验人员负责日常护理和实验研究。

2.8.1动物身份鉴定方法

每个鼠笼均佩挂有实验编号、实验组别、实验人员姓名、小鼠品种和性别等信息的身份卡片，小鼠用耳钉标记。

2.8.2随机分组

当肿瘤体积达到150-200mm³后用随机区组法分组，每组5只小鼠，保证各组间肿瘤体积和小鼠体重均一。各组肿瘤体积的均值与所有实验动物肿瘤体积的均值差异不超过±10％。

2.8.3操作管理规范

所有实验动物的操作和管理均严格遵守动物使用和管理指导原则。

2.8.4饲养条件

居住条件：IVC系统，每笼5只

温度：20℃-26℃

湿度：40％±70％

光照：12小时昼夜交替

2.8.5饲料

辐照大小鼠饲料，购自北京科澳协力饲料有限公司。自由进食。

2.8.6饮水

城市自来水，经过滤高压灭菌后饮用。

2.8.7垫料

玉米芯，上海茂生衍生物科技有限公司，高压灭菌后使用。每周换两次垫料。

2.8.8适应期

实验前给予小鼠最短一周环境适应期。

3.实验材料

3.1测试药品

3.2其他化学试剂和材料

3.2.1生理盐水

生理盐水购自上海华源长富药业(集团)有限公司。

3.2.2无菌注射器

1ml无菌注射器购自上海康德莱企业发展集团股份有限公司(上海，中国)。

3.2.3细胞株

人乳腺癌MDA-MB-231购于上海中科院细胞生物研究所。

MDA-MB-231培养于DMEM培养基(GIBCO,美国)，含10％胎牛血清FBS(GIBCO，美国)，培养于含5％CO₂的37℃培养箱。

3.2.4基质胶(BD Matrigel)

基质胶Matrigel购自美国BD公司

3.3仪器

生物安全柜(型号：AC2-6E1)，购自ESCO；

CO₂隔水细胞培养箱(型号：3111)，购自Thermo Scientific Forma；

倒置显微镜(型号：CKX41SF)，购自Olympus；

电动吸引器(型号YX930D)，购自上海医疗器械工业(集团)有限公司；

天平(梅特勒-托利多AB135-S)，购自梅特勒-托利多；

低速离心机(型号LD5-2A)，购自北京雷勃尔离心机有限公司；

电子数显卡尺(型号：SF2000)，购自桂林广陆数字测控股份有限公司。

4.实验设计

建立人乳腺癌MDA-MB-231裸鼠皮下移植瘤模型，每只接种1×10⁶个细胞。

本次试验设计如下(表3)给药剂量和给药方案。

表3：人乳腺癌MDA-MB-231裸鼠移植瘤模型中的抗肿瘤作用

5.化合物配制

配制方法由博瑞生物医药技术(苏州)有限公司提供

单次给药需要的体积：

20g(body weight)x10(animals)x10mL/kg/1000x1.5＝3mL

5.1伊立替康给药制剂配制

5.2nktr-102给药制剂配制

5.3化合物1-5给药制剂配制

5.4化合物6-10给药制剂配制

5.4化合物11-15给药制剂配制

每次给药前，准确称量104.91mg的化合物15，加入2.3mL的生理盐水，涡旋振荡使药物完全溶解，溶液中10-羟基喜树碱游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。5.5化合物16-20给药制剂配制

每次给药前，准确称量113.09mg的化合物11，加入2.3mL的生理盐水，涡旋振荡使药物完全溶解，溶液中10-羟基喜树碱游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。

每次给药前，准确称量109.05mg的化合物12，加入2.3mL的生理盐水，涡旋振荡使药物完全溶解，溶液中10-羟基喜树碱游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。

每次给药前，准确称量113.12mg的化合物13，加入2.3mL的生理盐水，涡旋振荡使药物完全溶解，溶液中10-羟基喜树碱游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。

每次给药前，准确称量110.48mg的化合物14，加入2.3mL的生理盐水，涡旋振荡使药物完全溶解，溶液中10-羟基喜树碱游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。

每次给药前，准确称量105.02mg的化合物15，加入2.3mL的生理盐水，涡旋振荡使药物完全溶解，溶液中10-羟基喜树碱游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。5.6化合物21-42给药制剂配制

6.实验方法

MDA-MB-231细胞培养于DMEM，含10％胎牛血清FBS(GIBCO，美国)。细胞放置于5％CO₂培养箱37℃培养。

细胞接种法建立肿瘤裸鼠皮下移植模型：收集对数生长期的肿瘤细胞，计数后重悬于1×PBS，调整细胞悬液浓度至1×10⁷/ml。用1ml注射器(4号针头)在裸鼠右侧背部皮下接种肿瘤细胞，1×10⁶/0.1ml/鼠。

在肿瘤体积达到100-200mm³时，将动物按随机区组法进行随机分组，使各组肿瘤差异小于均值的10％，每组5只，分组当日作为Day0，分组当天给药。

实验周期进行3周，实验期间每周测定两次动物体重和肿瘤大小。每日观察记录临床症状。实验最后一天处死动物，称量体重，剥离肿瘤，称重并拍照记录。

所有动物实验操作严格遵守动物使用和管理规范。肿瘤相关参数的计算参考中国CFDA《细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则》。

肿瘤体积(Tumor volume，TV)的计算公式为：TV＝a×b²/2。其中a、b分别代表肿瘤测量长和宽。相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)计算公式为：RTV＝Vt/V₀。其中V₀为分组给药时的肿瘤体积，Vt为测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增值率T/C(％)和抑瘤率(％)，计算公式分别为：T/C(％)＝(T_RTV/C_RTV)×100％。T_RTV为治疗组RTV，C_RTV为阴性对照组RTV；抑瘤率(％)＝(阴性对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/阴性对照组平均瘤重×100％。

荷瘤动物的体重变化(％)计算如下：(测量时体重-分组时体重)/分组时体重×100。

7.数据分析

8.结果和报告

根据中国CFDA《细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则》(2006年11月)，T/C(％)≤40％并经统计学分析p<0.05为有效，见表4。

表4对肿瘤增殖率T/C(％)

*与空白溶剂、伊立替康和nktr-102组的RTV相比，P＜0.05

#与空白溶剂、伊立替康和nktr-102组的％T/C相比，P＜0.05

实验结果显示，本发明化合物对人乳腺癌MDA-MB-231裸鼠移植瘤有良好抑制作用，且优于伊立替康和nktr-102。

实施例45对人胰腺癌MIA Paca-2裸鼠异种移植模型的抑制作用

1.实验目的

本研究用人胰腺癌MIA Paca-2裸鼠移植瘤模型对化合物1-42的体内抗肿瘤活性进行评价。

2.实验动物

2.1动物种类

小鼠。

2.2品种

BALB/c-nu/nu裸鼠。

2.3性别

雌性。

2.4数量

300。

2.5.年龄

6-8周。

2.6.体重

20-22g±20％体重均值。

2.7.动物来源(供应商)

2.8.实验动物管理

所有实验动物均饲养在SPF级别实验室。

2.8.1动物身份鉴定方法

2.8.2随机分组

2.8.3操作管理规范

所有实验动物的操作和管理均严格遵守实验动物使用和管理指导原则。

2.8.4饲养条件

居住条件：IVC系统，每笼5只

温度：25℃±1℃

湿度：65％±10％

光照：12小时昼夜交替

2.8.5饲料

2.8.6饮水

城市自来水，经过滤高压灭菌后饮用。

2.8.7垫料

2.8.8适应期

实验前给予小鼠最短一周环境适应期。

3.实验材料

3.1测试药品

3.2其他化学试剂和材料

3.2.1生理盐水

生理盐水购自上海华源长富药业(集团)有限公司(上海，中国)。

3.2.2无菌注射器

3.2.3细胞株

人胰腺癌MIA Paca-2购于上海中科院细胞生物研究所。

MIA Paca-2培养于DMEM培养基(GIBCO，美国)，含10％胎牛血清FBS(GIBCO，美国)和2.5％HS，培养于含5％CO₂的37℃培养箱。

3.2.4基质胶(BD Matrigel)

基质胶Matrigel购自美国BD公司

3.3仪器

生物安全柜(型号：AC2-6E1)，购自ESCO；

CO₂隔水细胞培养箱(型号：3111)，购自Thermo Scientific Forma；

倒置显微镜(型号：CKX41SF)，购自Olympus；

天平(梅特勒-托利多AB135-S)，购自梅特勒-托利多；

低速离心机(型号LD5-2A)，购自北京雷勃尔离心机有限公司；

4.实验设计

建立人胰腺癌MIA Paca-2裸鼠皮下移植瘤模型，每只接种3×10⁶个细胞。

本次试验设计如下(表6)给药剂量和给药方案。

表5：在人胰腺癌MIA Paca-2裸鼠移植瘤模型中的抗肿瘤作用

瘤株：MIA Paca-2；共接种225只

5.化合物配制

配制方法由博瑞生物医药技术(苏州)有限公司提供

单次给药需要的体积：

20g(body weight)x10(animals)x10mL/kg/1000x1.5＝3mL

5.1伊立替康给药制剂配制

5.2nktr-102给药制剂配制

每次给药前，准确称量88.55mg的nktr-102，加入2.3mL的生理盐水，涡旋振荡使药物完全溶解，溶液中伊立替康游离形式浓度为4.0mg·mL-1。

5.3化合物1-5给药制剂配制

5.4化合物6-10给药制剂配制

5.5化合物11-15给药制剂配制

5.6化合物16-20给药制剂配制

每次给药前，准确称量105.02mg的化合物15，加入2.3mL的生理盐水，涡旋振荡使药物完全溶解，溶液中10-羟基喜树碱游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。

5.7化合物21-42给药制剂配制

6.实验方法

MIA Paca-2细胞培养于DMEM，含10％胎牛血清FBS(GIBCO，美国)和2.5％HS。细胞放置于5％CO₂培养箱37℃培养。

细胞接种法建立肿瘤裸鼠皮下移植模型：收集对数生长期的肿瘤细胞，计数后重悬于1×PBS，调整细胞悬液浓度至3×10⁷/ml。用1ml注射器(4号针头)在裸鼠右侧背部皮下接种肿瘤细胞，3×10⁶/0.1ml/鼠。

在肿瘤体积达到100-200mm³时，将动物按随机区组法进行随机分组，使各组肿瘤差异小于均值的10％，每组5只，分组当日作为Day1，分组当天给药。

所有动物实验操作严格遵守动物使用和管理规范。肿瘤相关参数的计算参考中国SFDA《细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则》。

根据中国SFDA《细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则》(2006年11月)，T/C(％)≤40％并经统计学分析P<0.05为有效。

7.数据分析

试验数据用Microsoft Office Excel 2007软件进行计算和相关统计学处理。数据除特别说明外，用均数±标准误(Mean±SE)表示，组间比较采用t-检验，P<0.05为显著性差异。

8.结果和报告

根据中国CFDA《细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则》(2006年11月)，T/C(％)≤40％并经统计学分析P<0.05为有效，见表6。

表6对肿瘤增殖率T/C(％)

*与空白溶剂、伊立替康和nktr-102组的RTV相比，P＜0.05

#与空白溶剂、伊立替康和nktr-102组的％T/C相比，P＜0.05

实验结果显示，本发明化合物对人胰腺癌MIA Paca-2裸鼠移植瘤有良好抑制作用，且优于伊立替康和nktr-102。

实施例46对人胃癌NCI-N87细胞株裸鼠移植瘤模型肿瘤体内生长的抑制作用。

1.实验目的

评价受试药化合物1-42对人胃癌NCI-N87细胞株裸鼠移植瘤模型肿瘤体内生长的抑制作用。

2.实验材料

2.1供试品

伊立替康(原料药)、SN-38、10-羟基喜树碱、鲁比替康、nktr-102系购买所得，化合物1-42均由博瑞生物医药(苏州)股份有限公司提供。

2.2试剂

RPMI-1640培养液，胎牛血清(FBS)，胰蛋白酶，青-链双抗，生理盐水。2.3实验动物

雌性BALB/c裸小鼠(只数：150只；周龄：6～8周)从北京维通利华实验动物技术有限公司购买，饲养于苏州圣苏新药开发有限公司SPF动物房，温度20～25℃，相对湿度40％～70％，明暗照明各12小时；动物自由饮水及采食。正常喂养约1周后，经兽医检验，体征状况良好小鼠可入选本实验。分组前使用记号笔于动物尾根部进行标识，分组后每只动物均用耳部剪缺方式标识。

2.4移植性肿瘤瘤株

人胃癌细胞NCI-N87，来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(CAS，本实验室液氮冻存)。

3实验方法

3.1NCI-N87细胞培养

在5％CO₂、37℃培养条件下，NCI-N87细胞在含10％胎牛血清RPMI-1640培养液中进行常规细胞培养；以0.25％胰酶消化传代；根据细胞生长情况，每周传代1到2次，传代比例为1:2到1:6。

3.2动物模型制备

收取对数生长期NCI-N87细胞，细胞计数后重悬于无血清的RPMI-1640培养基中，调整细胞浓度至5×10⁷细胞/mL；用移液器吹打细胞使其分散均匀后装入50mL离心管中，将离心管置于冰盒中；用1mL注射器吸取细胞悬液，注射到裸鼠前右肢腋窝皮下，每只动物接种100μL(5×10⁶细胞/只)，建立NCI-N87裸鼠移植瘤模型。接种后定期观察动物状态及肿瘤生长情况，使用电子游标卡尺测量瘤径，数据直接输入Excel电子表格，计算肿瘤体积。待肿瘤体积达到100～300mm³，挑选健康状况良好、肿瘤体积相近的动物225只，采用随机区组法分为45组(n＝5)。实验开始后每周测量2次瘤径，计算肿瘤体积，同时称量动物体重并记录。

肿瘤体积(TV)计算公式如下：

TV(mm³)＝l×w²/2

其中，l表示肿瘤长径(mm)；w表示肿瘤短径(mm)。

3.3溶剂配制

3.4给药制剂配制

3..4.1伊立替康给药制剂配制

3.4.2nktr-102给药制剂配制

3.4.3化合物1-5给药制剂配制

3.4.4化合物6-10给药制剂配制

3.4.5化合物11-15给药制剂配制

3.4.6化合物16-20给药制剂配制

3.4.7化合物21-42给药制剂配制

3.5动物分组及给药

动物分组及给药方案见表7。

组24-45给药方式如上。

表7.裸鼠移植瘤模型药效实验给药方案

3.6实验结束

实验结束后，称量体重、测量瘤径后动物安乐死(CO₂)。剥取肿瘤组织并称重，计算瘤重抑瘤率。肿瘤组织称重后转移至低于-70℃冰箱中保存，以供后续分析。

4.数据记录、计算公式

相对肿瘤体积(RTV)的计算公式为：

RTV＝TV_t/TV_initial

相对肿瘤增殖率(％T/C)的计算公式为：

％T/C＝100％×(RTV_T/RTV_C)

其中，RTV_T表示治疗组RTV；RTV_C表示溶剂对照组RTV。

肿瘤生长抑制率TGI(％)的计算公式为：

TGI＝100％×[1－(TV_t(T)－TV_initial(T))/(TV_t(C)－TV_initial(C))]

动物体重下降率的计算公式为：

动物体重下降率＝100％×(BW_initial－BW_t)/BW_initial

瘤重抑瘤率IR(％)的计算公式为：

IR(％)＝100％×(W_C－W_T)/W_C

其中，W_C表示对照组瘤重；W_T表示治疗组瘤重。

5.统计分析方法

试验数据用Microsoft Office Excel 2007软件进行计算和相关统计学处理。数据除特别说明外，用均数±标准误(Mean±SE)表示，两组间比较采用t-检验。

6.实验观察

7.结果

针对人癌异体移植瘤模型，推荐采用相对肿瘤增殖率T/C(％)作为试验评价指标，增殖率越低，说明抑制肿瘤效果越良好，见表8。

表8对肿瘤增殖率T/C(％)

*与空白溶剂、伊立替康和nktr-102组的RTV相比，P＜0.05

#与空白溶剂、伊立替康和nktr-102组的％T/C相比，P＜0.05

实验结果显示，本发明化合物对人胃癌NCI-N87细胞株裸鼠移植瘤模型肿瘤生长有良好抑制作用，且优于伊立替康和nktr-102。

实施例47对U87MG裸鼠脑原位模型生存率的影响。

1.实验目的

评价受试药化合物1-42对U87MG裸鼠脑原位模型生存率的影响。

2.实验材料

2.1供试品

2.2试剂

RPMI-1640培养液，胰蛋白酶，青-链双抗，生理盐水。

2.3实验动物

雌性BALB/c裸小鼠(只数：300只；周龄：6～8周)从北京维通利华实验动物技术有限公司购买，饲养于SPF动物房，温度20～25℃，相对湿度40％～70％，明暗照明各12小时；动物自由饮水及采食。正常喂养约1周后，经兽医检验，体征状况良好小鼠可入选本实验。分组前使用记号笔于动物尾根部进行标识，分组后每只动物均用耳部剪缺方式标识。

2.4移植性肿瘤瘤株

脑胶质瘤细胞U87MG，来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(CAS，本实验室液氮冻存)。

3.实验方法

NCI-N87细胞培养

在5％CO₂、37℃培养条件下，NCI-N87细胞在RPMI-1640培养液中进行常规细胞培养；以0.25％胰酶消化传代；根据细胞生长情况，每周传代1到2次，传代比例为1:2到1:6。

3.1动物模型制备

收取对数生长期NCI-N87细胞，细胞计数后重悬于无血清的RPMI-1640培养基中，调整细胞浓度至1×10⁸细胞/mL；用移液器吹打细胞使其分散均匀后装入50mL离心管中，将离心管置于冰盒中；用1mL注射器吸取细胞悬液，借助动物立体定向仪的引导，采用微注射方法将体外培养人脑胶质瘤细胞U87MG细胞1μL(1×10⁵细胞/只)，建立U87MG脑胶质瘤原位模型，接种后定期观察动物状态。接种后第12天，挑选动物225只，采用随机区组法分为45组(n＝5)。

3.2给药制剂配制

3.2.1伊立替康给药制剂配制

3.2.2nktr-102给药制剂配制

3.2.3化合物1-5给药制剂配制

3.2.4化合物6-10给药制剂配制

3.2.5化合物11-15给药制剂配制

3.2.6化合物16-20给药制剂配制

3.2.7化合物21-42给药制剂配制

3.3动物分组及给药

动物分组及给药方案见表9。

组24-45给药方式如上。

表9.裸鼠移植瘤模型药效实验给药方案

4.数据记录、计算公式

记录动物生存时间。

5.统计分析方法

试验数据用Microsoft Office Excel 2007软件进行计算和相关统计学处理。两组间比较采用t检验。

6.结果

见表10

表10动物生存时间(天)

*与空白溶剂、伊立替康和nktr-102组的中位生存时间相比，P＜0.05

实验结果显示，本发明化合物对脑胶质瘤有良好抑制作用，且优于伊立替康和nktr-102。

Claims

1.具有如下结构式(Ⅲ)的多支链药物偶联物或其药学上可接受的盐：

其中，R为有机中心，POLY为聚合物，L为多价接头，T为靶向分子，D为活性剂，q为3，4,6或8，其中，D为如下式所示的喜树碱类药物：

其中，R1-R5相互独立地选自于以下基团：氢、卤素、酰基、烷基、取代烷基、烷氧基、取代烷氧基、烯基、炔基、环烷基、羟基、氰基、硝基、叠氮基、酰胺基、肼、胺基、取代胺基、羟基羰基、烷氧羰基、烷氧羰氧基、氨基甲酰氧基、芳基磺酰氧基、烷基磺酰氧基；R6为H或OR8，R8为烷基、烯基、环烷基、卤代烷基或羟烷基；R7为羟基；

POLY为聚乙二醇；

T为含有“精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸”序列的RGD肽、tLyp-1、Lyp-1、RPARPAR、Angiopep2、GE11或叶酸；

多价接头L选自：

符号“*”代表多价接头L与靶向分子T的连接点，“#”代表多价接头L与活性剂D的连接点，“％”代表多价接头L与POLY的连接点，其中，m、m'分别为1-20之间的任一整数，l、k分别为1-10之间的任一整数；

有机中心R选自：

2.如权利要求1所述的多支链药物偶联物或其药学上可接受的盐，D为伊立替康、SN-38、10-羟基喜树碱或鲁比替康。

3.如权利要求1所述的多支链药物偶联物或其药学上可接受的盐，POLY为

n为5～500。

4.如权利要求3所述的多支链药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中n为50-200。

5.根据权利要求3所述的多支链药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中n为113。

6.如权利要求1～5任一项所述的多支链药物偶联物或其药学上可接受的盐，多价接头L为

7.如权利要求1～5任一项所述的多支链药物偶联物或其药学上可接受的盐，T为iRGD或cRGD。

8.如权利要求1～5或7任一项所述的多支链药物偶联物或其药学上可接受的盐，其为结构式(Ⅳ)、(Ⅴ)或(Ⅵ)所示：

n为5～500。

9.如权利要求8所述的多支链药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中n为50-200。

10.如权利要求8所述的多支链药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中n为113。

11.如权利要求1～5或7任一项所述的多支链药物偶联物，其为：

化合物1

化合物2：

化合物3：

化合物4：

化合物5：

化合物6：

化合物7：

化合物8：

化合物9：

化合物10：

化合物11：

化合物12：

化合物13：

化合物14：

化合物15：

化合物16：

化合物17：

化合物18：

化合物19：

化合物20：

化合物21：

化合物22：

化合物23：

R为

化合物24：

R为

化合物25：

R为

化合物26：

R为

化合物27：

R为

化合物28：

R为

化合物29：

R为

化合物30：

R为

化合物31：

R为

化合物32：

R为

化合物33：

R为

化合物34：

R为

化合物35：

R为

化合物36：

R为

化合物37：

R为

化合物38：

R为

化合物39：

R为

化合物40：

R为

化合物41：

R为

化合物42：

R为。

12.如权利要求1～5任一项所述的多支链药物偶联物在制备用于治疗乳房、卵巢、结肠、肾、胆管、肺和脑的癌和淋巴瘤的药物中的应用。

13.如权利要求1～5任一项所述的多支链药物偶联物在制备用于治疗结肠癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌和脑胶质瘤的药物中的应用。

14.如权利要求10任一所述的多支链药物偶联物在制备用于治疗乳房、卵巢、结肠、肾、胆管、肺和脑的癌和淋巴瘤的药物中的应用。

15.如权利要求10所述的多支链药物偶联物在制备用于治疗结肠癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、脑胶质瘤的药物中的应用。

16.多支链药物偶联物或其药学上可接受的盐的制备方法，包括：

其中，R，POLY，L，T，D和q的定义如权利要求1；

(1)活性剂D与多价接头L进行连接，得到D-L部分；

(2)D-L部分与多臂聚合物连接，得到

(3)将上一步得到的与靶向分子T连接。

17.如权利要求16所述的多支链药物偶联物或其药学上可接受的盐的制备方法，

其中，D为伊立替康、SN-38、10-羟基喜树碱或鲁比替康；

多臂聚合物为3armPEG20K-SCM、4armPEG20K-SCM或8armPEG20K-SCM；

L为符号“*”代表多价接头L与靶向分子T的连接点，“#”代表多价接头L与活性剂D的连接点，“％”代表多价接头L与POLY的连接点；

T为iRGD、cRGD、tLyp-1、Lyp-1、RPARPAR、Angiopep2、GE11或叶酸。