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CN101222936A - 灭活的嵌合疫苗和相关的使用方法 - Google Patents

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CN101222936A CNA2006800261861A CN200680026186A CN101222936A CN 101222936 A CN101222936 A CN 101222936A CN A2006800261861 A CNA2006800261861 A CN A2006800261861A CN 200680026186 A CN200680026186 A CN 200680026186A CN 101222936 A CN101222936 A CN 101222936A
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Abstract

本发明的实施方案总地提供灭活的嵌合病毒疫苗和/或免疫原性组合物用来治疗或预防病毒感染。另外，本发明的多种其它实施方案总地涉及用所述灭活的疫苗和/或免疫原性组合物预防和治疗这些动物中的病毒感染的方法。其它实施方案包括制备用来治疗或预防这些动物中的病毒感染的疫苗或免疫原性组合物的方法。

Description

灭活的嵌合疫苗和相关的使用方法
交叉引用相关的申请
本申请依据35U.S.C.§119要求2005-06-24提交的美国临时申请60/693,629的权益，特此将其全部内容以参考方式并入本文。
发明领域
本发明涉及新的和改进的预防和治疗动物中黄病毒和其它密切相关病毒感染的方法。
发明背景
黄病毒是小的有包膜的正链RNA病毒，其在全世界涉及许多医学和兽医学问题。例如，黄病毒家族的一员-西尼罗病毒(WN，或WNV)，是WN脑炎的致病因子，所述WN脑炎是一种感染性的，非传染性的，节肢动物携带的病毒性疾病  (Virology，Fields(ed.)，Raven-Lippincott，New York，1996，pp.961-1034)。该病毒在非洲、西亚、中东、欧洲地中海地区以及最近在美国发现。蚊子在叮咬了受感染的野生鸟类后感染病毒，随后通过叮咬人类、鸟类和动物如马、羊、牛和猪来传播病毒。
西尼罗病毒是一种新出现的感染性疾病。西尼罗病毒于1937在乌干达首次分离。今天它最常见于非洲、西亚、欧洲和中东。不过，它在1999年第一次出现在美国。到2004年，该病毒已经在除了阿拉斯加和夏威夷外的每个州的鸟类和蚊子中发现。
由黄病毒引发的其它公知疾病包括黄热病，日本脑炎，登革热，和圣路易斯脑炎。黄病毒感染通常由蜱和/或蚊子传播。
西尼罗病毒的初感染宿主只是蚊子和鸟类。据信其它动物物种如人类和动物如马、羊、牛和猪等等只是当感染的雌蚊叮咬偶见的宿主时而被感染的偶见宿主。
感染西尼罗病毒的人通常只经历轻微症状，包括发热，头痛，身体疼痛，皮疹，和淋巴腺肿胀。不过，如果西尼罗病毒进入脑，它能够引发威胁生命的脑炎或脑膜炎。威胁生命的情况主要发生在老年人中。最近的研究显示西尼罗病毒可以通过输血和器官移植而传播。一些健康专家也相信西尼罗病毒可能从母亲传递到她的未出生孩子并通过母乳传播。
对于西尼罗病毒疫苗方法有许多开发项目，包括活的嵌合疫苗(其将来自一种以上病毒的基因合并到单一疫苗中)，裸DNA疫苗，和包含各西尼罗病毒蛋白的混合物的疫苗，等等。  不过，没有使用灭活的嵌合疫苗的方法。
通过翻译单一的，长的可读框以生成多蛋白来生产黄病毒蛋白质，所述多蛋白质经历由宿主和病毒蛋白酶的组合进行的复杂系列的翻译后蛋白水解剪切，以生成成熟的病毒蛋白质。在多蛋白中病毒结构蛋白质以C-prM-E的顺序排列，其中″C″是衣壳，″prM″是病毒包膜结合的M(膜)蛋白的前体，而″E″是包膜蛋白。这些蛋白质存在于多蛋白的N-末端区域，而非结构蛋白(NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B，和NS5)位于多肽的C-末端区域。
2003年，Acambis(Cambridge，MA)开始了西尼罗病毒的活减毒病毒疫苗的人类临床试验。Acambis的活减毒疫苗是基于已经用于预防黄热病的疫苗，所述黄热病是由不同的黄病毒引发的疾病。
一种Acambis活减毒疫苗包含来自两种不同病毒-黄热病毒和西尼罗病毒的基因，是嵌合病毒的实例。这种Acambis活减毒疫苗包含黄热病毒，其少数基因被西尼罗病毒的表面蛋白基因所替换。
在例如美国专利号6,962,708和6,696,281和Chambers等，J.Virol.73：3095-3101，1999中提供了制备这种活减毒嵌合Acambis疫苗的细节，将其各自全部以参考方式并入本文。在美国专利号6,682,883和6,878,372中提供了对于Acambis活减毒嵌合疫苗的其它使用方法和诊断学，将每一篇的全部内容以参考方式并入本文。
这种活减毒疫苗的结果已经证明是成功的并且试验继续进行。不过，活减毒疫苗的使用可能伴随着某些危险。对于免疫受损的受试者，老年受试者，孕妇受试者，和其它免疫系统削弱或应激的受试者来说，这些危险更加显著。经常地，活减毒病毒疫苗被证明减毒不足(引发疾病)或过度减毒(不能免疫)。对于最佳减毒的活病毒疫苗来说也有可能通过突变复原成毒性(引发疾病)的形式。不过，应当注意来自Acambis的YF-WN没有显示复原毒性迹象。对于活减毒疫苗有另外的忧虑。例如，活登革热病毒对于热也是敏感的，这使得在一些热带和亚热带国家保存疫苗困难并且成本高，而在这些国家可能最需要该疫苗。因此，该领域需要一种疫苗来安全治疗和/或预防在具有这些或其它类似危险的受试者中的黄病毒感染，如西尼罗病毒。特别是对于免疫受损的那些或其它最为处于风险的受试者。
不过，现有技术是，灭活的嵌合病毒疫苗是不理想的并且不会有效。美国专利号6,432,411报道制备死黄病毒疫苗的尝试只获得了非常有限的成功。所述研究主要的局限在于不能从细胞培养系统中获得足够的病毒产量。来自昆虫细胞的病毒产量通常在104到105pfu/ml范围内，明显低于产生具有成本效益的死疫苗所必需的水平。来自哺乳动物细胞包括LLC-MK2和Vero细胞的产量较高，但峰产量-来自独特Vero细胞系的大约108pfu/ml，仍然低于获得真正具成本效益的疫苗产品所必需的。
因此，现有技术的教导背离使用灭活的黄病毒作为可行的疫苗候选物。另外，没有教导灭活的嵌合疫苗用于治疗或预防任何黄病毒感染。
发明概述
本发明的各种实施方案包括用于治疗或预防动物中的黄病毒感染的疫苗或免疫原性组合物。
本发明还提供预防或治疗易感动物中黄病毒感染的方法，其包括向受试者施用灭活的嵌合黄病毒。本发明还提供灭活的嵌合黄病毒在制备用在这些方法中的药物和疫苗和/或免疫原性组合物中的用途。在本发明的一个实施方案中，灭活的嵌合黄病毒可以包括，例如，第一种黄病毒的衣壳和非结构蛋白质，以及第二种黄病毒的prM和包膜蛋白。
在一个实施方案中，本发明涉及灭活的嵌合黄病毒，包含第一种黄病毒，其中编码前膜和包膜蛋白的核苷酸序列被第二种黄病毒的编码前膜和包膜蛋白的核苷酸序列所替换。第一种黄病毒可以是黄热病毒，包括源自17D株的黄热病毒。嵌合病毒可以在前膜蛋白的氨基酸末端包含信号序列，而该信号序列可以是黄热病毒的信号序列。第二种黄病毒可以是西尼罗病毒。
在另一个实施方案中，本发明涉及免疫原性组合物，包含灭活的嵌合黄病毒，其包含第一种黄病毒，其中编码前膜和包膜蛋白的核苷酸序列被第二种黄病毒的编码前膜和包膜蛋白的核苷酸序列所替换。
在另一个实施方案中，本发明涉及疫苗，包含灭活的嵌合黄病毒，其包含第一种黄病毒，其中编码前膜和包膜蛋白的核苷酸序列被第二种黄病毒的编码前膜和包膜蛋白的核苷酸序列所替换。疫苗可以进一步包括i)一种或多种经修饰的活病毒；ii)一种或多种失活的病毒；或iii)一种或多种细菌抗原。疫苗可以进一步包括失活的东方脑脊髓炎病毒，失活的西方脑脊髓炎病毒，失活的委内瑞拉脑脊髓炎病毒，失活的马疱疹病毒1型，失活的马疱疹病毒4型，失活的马流感病毒株Kentucky 1993/A2，失活的马流感病毒株Kentucky 2002/A2，失活的马流感病毒株New Market/2/93/A2和破伤风类毒素组分(fractions)中的一种或多种。
在另一个实施方案中，本发明涉及预防或治疗动物中黄病毒感染的方法，该方法包括向动物施用灭活的嵌合黄病毒(或其免疫原性组合物或疫苗)，其包含第一种黄病毒，其中编码前膜和包膜蛋白的核苷酸序列被第二种黄病毒的编码前膜和包膜蛋白的核苷酸序列所替换。第一种黄病毒可以是黄热病毒。黄热病毒可以源自17D株。第二种黄病毒可以是西尼罗病毒。
在本发明的任何实施方案中，灭活的嵌合病毒的浓度可以在102-108噬斑形成单位(pfu)之间。或者，可以106-107pfu之间的剂量施用嵌合黄病毒。或者，可以1-10相对抗原剂量单位之间的剂量施用嵌合黄病毒。
在本发明的任何实施方案中，灭活的嵌合病毒可以通过皮下、肌内、黏膜下、黏膜或皮内途径施用。在本发明的一个实施方案中，通过口服施用灭活的嵌合黄病毒。
由下面的说明书，本发明的其它特征和优点将是显而易见的。
详述
如本文所用的，术语″疫苗″意指一种产品，它的施用意在引起免疫应答，其能够预防和/或减轻一种或多种感染性疾病的严重性。疫苗可以包括下列的一种或多种：活的减毒的或灭活的细菌、病毒或寄生虫制品，灭活的(杀死的)完整生物，活的经辐照的细胞，粗制的组分或纯化的免疫原，包括源自宿主细胞中重组DNA的那些，通过组分的共价连接形成的缀合物，合成的抗原，多核苷酸(如质粒DNA疫苗)，表达特异性异源免疫原的活的含载体细胞，或用免疫原脉冲的细胞。
如本文所用的，″嵌合病毒″指这样一种病毒，它具有包含来自两种或多种不同病毒，包括不同病毒株的序列的基因组。除非另作说明，″嵌合体″指嵌合病毒。嵌合病毒的非限制性实例是YF/WN嵌合体，它是嵌合黄病毒。
如本文所用的，″嵌合黄病毒″指这样一种病毒，它具有包含来自两种或多种不同黄病毒，包括不同黄病毒株的序列的基因组。如上所述，嵌合黄病毒的非限制性实例是YF/WN嵌合体。
如本文所用的，″嵌合西尼罗病毒″，″西尼罗病毒嵌合体″，″YF/WN病毒″和″YF/WN嵌合体″指嵌合活减毒病毒，其包含黄热病毒(YFV)的17D疫苗株，其中编码前膜(prM)和包膜(E)蛋白的核苷酸序列被西尼罗病毒(WNV)的编码prM和E蛋白的核苷酸序列所替换，从而西尼罗病毒的prM和E蛋白得以表达，而嵌合病毒的衣壳蛋白来自黄热病毒。熟练的技术人员将会容易理解，除了本段所述的具体嵌合黄病毒之外，还可以制成包含黄热病毒和西尼罗病毒组分的嵌合黄病毒。
利用熟练的技术人员所公知的技术可以将嵌合西尼罗病毒(或，YF/WN病毒)灭活。例如，可以用化学灭活剂或其它物理手段如热来灭活嵌合西尼罗病毒(或，YF/WN病毒)。化学灭活剂的非限制性实例包括binary ethylenimine(BEI)或福尔马林(37％的甲醛溶液)。
可以通过首先将binary ethyleneamine(BEA)粉末与氢氧化钠溶液混合利用BEI来灭活活病毒。在碱性环境下生成BEI后，将BEI溶液加入到包含活病毒的溶液中，最终BEI浓度为0.5mM到10mM。随后可将此溶液于4-37℃孵育24-96小时。在病毒灭活后可随后加入硫代硫酸钠以中和任何残余的BEI。
还可以用福尔马林(37％的甲醛溶液)来灭活活病毒。在这里，将福尔马林加入到包含活病毒的溶液中，最终福尔马林浓度为0.05-2％v∶v(福尔马林∶活病毒溶液)。随后可将此溶液于4-37℃孵育24-96小时。
如本文所用的，术语″抗原″意指作用于刺激动物的免疫系统的病毒，细菌，病毒或细菌的部分，或异种蛋白质。可以刺激免疫系统来引起白细胞攻击和破坏抗原或产生蛋白质分子，其附着到抗原上并杀死抗原或使它失活。如本文所用的，术语″抗体″意指动物免疫系统制造的包含蛋白质的分子，其与抗原反应来使它失活。
如本文所用的，术语″动物″意指人和非人动物。
如本文所用的，术语″疫苗株″意指适用于免疫原性组合物或疫苗中的病毒株。″疫苗株″可以包含，但不一定限于，非病原性株或相对非病原性株，杀死的株，和/或减毒株。
如本文所用的，术语″冻干″及其变化形式，意指冷冻干燥。如本文所用的，术语″动物来源″意指来源于动物。同样地，术语″非物来源″意指不直接或间接来源于动物。
如本文所用的，术语″使...稳定″及其变化形式，意指使之稳定或保持稳定，稳固，固定不变并维持在大约给定的或基本上不变的水平，大约给定的或基本上不变的质量和大约给定的或基本上不变的数量。不过，应理解稳定化的组合物的水平、质量，和/或数量可能会遇到一些波动。本发明的实施方案意欲包括允许这种波动的稳定剂。非限制性地，稳定剂包括干稳定剂，体积(bulk)稳定剂，冷冻保护剂，热稳定剂，渗透保护剂(osmoprotectants)，脱水保护剂，等等。特别意将这些术语包括在本发明的稳定剂中。
如本文所用的，术语″蛋白质″意指氨基酸的分子链。蛋白质并无特定长度，如果需要，可以在体内或体外通过例如糖基化、酰胺化、羧基化或磷酸化来进行修饰。肽，寡肽和多肽等包括在蛋白质的定义内。蛋白质或肽可以是生物和/或合成来源的。
如本文所用的，术语″核酸″意指核糖核酸或脱氧核糖核酸的分子链。核酸并无特定长度，所以多核苷酸、基因、可读框(ORF)、探针、引物、联结子、间隔区和接头包括在定义中。核酸可以是生物和/或合成来源的。核酸可以是单链或双链形式。单链可以是有义或反义方向。经修饰的RNA或DNA也包括在定义中。可以进行核酸的碱基修饰，并且可以掺入诸如次黄嘌呤核苷的碱基。其它修饰可以包括，例如，主链的修饰。
如本文所用的，可药用的载体被理解为这样的化合物，其不会不利地影响待接种疫苗的动物或生物的健康，至少不利影响的程度不会比当动物未接种疫苗时所见到的影响更坏。可药用的载体的非限制性实例包括无菌水或无菌生理盐溶液。在更加复杂的形式中所述载体可以是缓冲剂。
如本文所用的，术语″糖类″意指单糖、二糖、寡糖和多糖。
如本文所用的，术语″猫科动物″意指属于猫属(Felis)或猫科(Felidae)的任何动物，如，但不限于，猫、狮、虎、美洲狮(mountainlion)、美洲狮(puma)、美洲虎、美洲野猫、虎猫等等。
如本文所用的，术语″犬科动物″意指属于犬科犬属(Canis)的任何动物，如，但不限于，狗、狼等等。
如本文所用的，术语″马科动物″意指属于马属(Equis)或马科(Equidae)的任何动物，如，但不限于，马、骡、驴、斑马等等。
本发明总地涉及预防和治疗动物中黄病毒感染的组合物和方法。本发明的方法包括用灭活的嵌合黄病毒对处于发生黄病毒感染危险或患有黄病毒感染的动物进行疫苗接种。本发明的其它方面涉及制备用来治疗或预防动物中的黄病毒感染的疫苗或免疫原性组合物的方法，所述疫苗或免疫原性组合物包含灭活的嵌合黄病毒。
不过，熟练的技术人员将会容易理解，有其它充分表征的黄病毒和与黄病毒密切相关的病毒可以利用本发明所述的灭活嵌合病毒来进行治疗或预防。因此，本发明还涉及灭活的嵌合病毒用来治疗或预防与黄病毒科或披膜病毒科的病毒相关联或由其引发的疾病。落入这些科的病毒属的非限制性实例包括属于黄病毒属，瘟病毒属(Pestivirus)，丙型肝炎病毒属(Hepacivirus)或α病毒属的病毒。属于这些科或属的病毒或由这些病毒引发的疾病的非限制性实例包括脑炎病毒，东方马脑炎，西方马脑炎，委内瑞拉马脑炎，库京病毒(Kunjin)，墨累山谷脑炎，羊跳跃病病毒，日本脑炎，登革热(血清型1-4)，黄热病，墨累山谷脑炎，圣路易斯脑炎，罗氏脑炎，韦塞尔斯布朗病毒，巴西脑炎病毒；蜱传播的黄病毒，如中欧脑炎，西伯利亚脑炎，俄罗斯春夏型脑炎，基亚萨努森林病，鄂木斯克出血热，波瓦桑病毒，勒几西病毒，阿布塞塔罗夫病毒，Hansalova病毒，阿波衣病毒，和Hypr病毒；以及来自丙型肝炎病毒属的病毒(例如，丙型肝炎病毒)。可以利用本发明的灭活嵌合病毒治疗或预防的其它病毒包括属于瘟病毒属的那些病毒(例如，牛腹泻病毒)，和其它病毒，如拉沙病毒、埃博拉病毒和马尔堡病毒或其它RNA病毒，其具有适于掺入嵌合体的基因组构成。
用本文所述的灭活的嵌合病毒可以预防或治疗上述任何病毒的感染(或由其所引发的疾病)，特别是用灭活的嵌合病毒，其包含第一种病毒，其中第一种病毒的一种或多种结构蛋白质已经被第二种病毒的相应的结构蛋白质所替换，针对所述第二种病毒寻求保护或治疗。
本发明的优选方面涉及灭活的嵌合黄病毒，制备灭活的嵌合黄病毒的方法，包含灭活的嵌合黄病毒的疫苗，以及使用这些疫苗的方法。本发明的这一方面涉及灭活的嵌合黄病毒，其包含黄病毒，其中第一种黄病毒的一种或多种结构蛋白质已经被第二种黄病毒的一种或多种相应的结构蛋白质所替换，针对所述第二种病毒寻求免疫力。在本发明的一个实施方案中，嵌合体由第一种黄病毒的骨架(backbone)组成，其中prM和E蛋白已经被第二种黄病毒的prM和E蛋白所替换。
用在本发明中的灭活的嵌合病毒可以由病毒的任意组合组成，条件是，如上所述，希望对其获得免疫力的病毒是插入的结构蛋白的来源。例如，为了对动物如马接种疫苗以对抗西尼罗病毒感染，可以使用由黄病毒骨架如黄热(YF)病毒的骨架组成的嵌合黄病毒，向其中插入西尼罗病毒结构蛋白质，如prM和E蛋白。在此嵌合体中，YF prM和E蛋白被WN的prM和E蛋白所替换。类似地，如果希望获得针对日本脑炎(JE)病毒的免疫力，那么可以将JE病毒的prM和E蛋白插入骨架黄病毒如黄热病毒中，替换相应的骨架蛋白。可以引发马中疾病且对其可以使用嵌合病毒来诱导保护的其它黄病毒，包括库京病毒，墨累山谷脑炎病毒，和羊跳跃病病毒。在本发明的所有实施方案中，随后灭活嵌合病毒。可以用本发明的灭活的嵌合病毒进行疫苗接种和/或治疗的动物的实例包括人、马、猪、羊、牛、家养动物如猫和狗，以及家养鸟类。不过，通常可以对任何易于感染黄病毒(对于所述黄病毒寻求保护免受损害)的动物进行疫苗接种。
因而，可以作为骨架病毒或结构蛋白插入物来源而用在本发明中的黄病毒的非限制性实例，包括蚊传播的黄病毒，如日本脑炎病毒，登革热病毒(血清型1-4)，黄热病毒，墨累山谷脑炎病毒，圣路易斯脑炎病毒，西尼罗病毒，库京病毒，罗氏脑炎病毒，韦塞尔斯布朗病毒和巴西脑炎病毒；蜱传播的黄病毒，如中欧脑炎病毒，西伯利亚脑炎病毒，俄罗斯春夏型脑炎病毒，基亚萨努森林病病毒，鄂木斯克出血热病毒，羊跳跃病病毒，波瓦桑病毒，勒几西病毒，阿布塞塔罗夫病毒，Hansalova病毒，阿波衣病毒，和Hypr病毒；以及来自丙型肝炎病毒属的病毒(例如，丙型肝炎病毒)。可以用作插入结构蛋白来源的其它病毒包括来自瘟病毒属的病毒(例如，牛腹泻病毒)，以及其它病毒，如拉沙病毒，埃博拉病毒和马尔堡病毒。
一般而言，如在美国专利号6,962,708和6,696,281中所述地，在预防或治疗西尼罗黄病毒感染的实施方案中，这些方法需要将17D疫苗黄热病毒的编码两种结构蛋白[prM和E]的基因替换为西尼罗病毒的相应基因，并灭活嵌合病毒。得到的灭活病毒粒子具有西尼罗病毒的包膜，包含涉及病毒-细胞附着和病毒内化的结构，进行中和作用的所有抗原决定簇，以及针对细胞毒性T淋巴细胞的表位。负责病毒复制的核衣壳(C)蛋白质，非结构蛋白质，和非翻译末端仍然是原始黄热病毒17D的那些。
本发明的的一个优选的实施方案涉及灭活的嵌合疫苗和/或免疫原性组合物，用于治疗或预防动物中的西尼罗病毒感染，所述动物易于发生西尼罗病毒感染。在例如美国专利号6,962,708和6,696,281和Chambers等，J.Virol.73：3095-3101，1999中提供了制备嵌合病毒的细节，所述嵌合病毒包括WN/YF嵌合病毒，随后可以将其灭活并用在本发明的各种实施方案中，特此将上述文献的全部内容以参考方式并入本文。不过，美国专利号6,962,708和6,696,281限于活减毒嵌合病毒，疫苗和相关的使用方法。没有教导或提示使用灭活的嵌合病毒，灭活的嵌合病毒在疫苗中的应用，或灭活的嵌合病毒在任何相关方法中的应用。与这些专利相反，本发明的所有实施方案都涉及灭活的嵌合病毒。
根据本发明的各种实施方案的疫苗和免疫原性组合物可以液体、冷冻混悬液或以冻干形式制备和/或上市。通常，根据本发明制备的疫苗和/或免疫原性组合物包含可药用的载体或通常用于这些组合物的稀释剂。载体包括，但不限于，稳定剂，防腐剂和缓冲剂。合适的稳定剂是，例如SPGA，Tween组合物(如可获自A.G.Scientific，Inc.，San Diego，CA)，糖类(如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，葡聚糖，谷氨酸或葡萄糖)，蛋白质(如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解产物。合适缓冲剂的非限制性实例包括碱金属磷酸盐。合适的防腐剂是硫柳汞(thimerosal)，硫柳汞(merthiolate)和庆大霉素。稀释剂包括水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)。
如果需要，根据本发明的灭活的疫苗可以包含佐剂。为此目的的合适的化合物或组合物包括HAVLOGEN(基于丙烯酸聚合物的佐剂，Intervet Inc.，Millsboro，DE)，聚丙烯酸，氢氧化铝，磷酸铝或氧化铝，水包油或油包水乳剂，其基于例如矿物油，如BAYOLTM或MARCOLTM(Esso Imperial Oil Limited，Canada)，或植物油如乙酸维生素E，和皂苷。不过，具有佐剂活性的组分是广为人知的，通常，可以利用不会不利地干扰疫苗和/或免疫原性组合物的效力或安全性的任何佐剂。
通常，可以皮下、皮内、黏膜下或肌内施用有效量的疫苗以预防目标黄病毒感染和/或治疗该黄病毒的感染。有效量被定义为免疫灭活嵌合物质的量，其将在接种动物中诱导针对毒性病毒攻击的免疫力。在多个其它实施方案中，有效量将在接种动物或它们的后代中诱导针对毒性病毒攻击的免疫力。在本文中免疫力被定义为与未接种疫苗组相比，接种疫苗后在动物群体中诱导显著更高水平的保护。
另外，在本发明的灭活疫苗和/或免疫原性组合物的各种制剂中，可以添加合适的赋形剂，稳定剂等等。
可以将灭活的嵌合病毒配制成包含102到1012感染单位(灭活前所测定的)的无菌水溶液。在一个实施方案中，可以将灭活的嵌合病毒配制成包含107到1010感染单位(灭活前所测定的)的无菌水溶液。感染单位包括噬斑形成单位(pfu)或组织培养感染剂量(tcid)。或者，可以将灭活的嵌合病毒配制成包含1-10相对抗原剂量单位的无菌水溶液。可以0.1-1.0ml的剂量体积来提供配制的灭活嵌合病毒，通过，例如，皮下、肌内、黏膜下或皮内途径来施用。其它实施方案可以通过黏膜途径，如口服途径来施用。本领域技术人员可以确定待施用的合适量的嵌合体的选择，并且这种量可以由于多种因素而变化，包括但不限于，待施用嵌合体的动物的大小、类型和一般健康状况。
为了更充分地理解本发明，应当参照下列实施例和权利要求书。
实施例1
实验设计：
动物：
将对西尼罗病毒(WNV)血清反应阴性的六(6)匹混种一岁马，雄性和雌性都有，用组合疫苗进行疫苗接种，所述组合疫苗包含PRESTIGEV+VEE疫苗(可获自Intervet Inc，Millsboro，DE)的灭活病毒组分和灭活的黄热病毒-西尼罗病毒(YF-WN)嵌合体，所有组分都组合以聚丙烯酸佐剂。PRESTIGEV+VEE疫苗包含灭活的东方脑脊髓炎病毒，灭活的西方脑脊髓炎病毒，灭活的委内瑞拉脑脊髓炎病毒，灭活的马疱疹病毒1和4型(鼻肺炎)，灭活的流感病毒(Kentucky株1993，Kentucky株2002，和New Market-2-93)，和破伤风类毒素组分。
YF-WN活减毒嵌合体获自Acambis(Cambridge，MA)，并用binaryethyleneimine(BBI)灭活。通过首先将binary ethyleneamine(BEA)粉末与氢氧化钠溶液混合来实现灭活。混合后，BEA转变成BEI。将这种BEI液体溶液添加到活嵌合病毒溶液中以给出最终BEI浓度2mM。将BEI/嵌合体溶液于大约18-25℃孵育大约3天。
将另外的六(6)匹对西尼罗病毒(WNV)血清反应阴性的混种一岁马，雄性和雌性都有，用组合疫苗进行疫苗接种，所述组合疫苗包含PRESTIGEV+VEE疫苗(可获自Intervet Inc，Millsboro，DE)的灭活病毒组分和福尔马林灭活的黄热病-西尼罗病毒(YF-WN)嵌合体。
YF-WN活减毒嵌合体获自Acambis(Cambridge，MA)，并用福尔马林(37％的甲醛溶液)灭活。通过将福尔马林溶液混合到活嵌合病毒溶液中以给出相对于活嵌合病毒溶液0.1％v∶v的最终福尔马林浓度来实现灭活。将福尔马林/嵌合体溶液于大约18-25℃孵育大约3天。
将另外的六(6)匹对西尼罗病毒(WNV)血清反应阴性的混种一岁马，雄性和雌性都有，不接种疫苗并用作对照。
疫苗接种：
马通过肌内接受2x1mL剂量的疫苗，间隔3-4周给药。
攻击病毒：
在第二次接种疫苗后4周时通过鞘内途径对每匹马施用西尼罗病毒(WNV)5log10PFU/1ml剂量。
结果：
疫苗 马数/组 用WNV攻击后的结果：
≥102.5  临床体征  病毒血症  组织学
BEI灭活的YF/WN病毒 6 0/6  0/6  0/6  0/6
福尔马林灭活的YF/WN病毒 6 0/6  0/6  0/6  1/6
未接种疫苗的对照 6 4/6  5/6  5/6  5/6
来自实施例1的血清学结果如下：
在接种了两剂灭活YF-WN或一剂活YF-WN嵌合体(来自Acambis，Cambride，MA)的马中针对WNV的病毒中和性(VN)抗体效价
在疫苗接种和攻击后不同天数的VN效价(50％噬斑减少)a
接种疫苗后 攻击后(天)
 疫苗b 接种疫苗前 第1次后  第二次后 7 14  21
 BEI灭活的YF-WN病毒 阴性 80  80 160 ＞1280  1280
阴性 40  40 80 640  640
阴性 5  20 80 ＞1280  ＞2560
阴性 5  5 5 1280  1280
阴性 5  80 160 10240  2560
阴性 5  5 320 5120  2560
 福尔马林灭活的YF-WN病毒 阴性 160  160 640 ＞1280  1280
阴性 160  160 ＞1280 640  1280
阴性 160  160 320 ＞1280  1280
阴性 阴性  40 320 5120  2560
阴性 5  20 20 640  320
阴性 40  40 320 2560  2560
 活YF-WN病毒 阴性 160  N/A 320 ＞1208  1280
阴性 160  N/A 80 ＞1280  640
阴性 160  N/A 80 ＞1280  320
阴性 40  N/A 1280 5120  2560
阴性 5  N/A 80 5120  2560
阴性 640 N/A 1280 20480 5120
对照 阴性 阴性 阴性 320 死亡 死亡
阴性 阴性 阴性 80 ＞1280 ＞2560
阴性 阴性 阴性 5 640 640
阴性 阴性 阴性 320 2560 1280
阴性 阴性 阴性 320 死亡 死亡
阴性 阴性 阴性 320 死亡 死亡
a效价值是代表相对于对照观察到50％噬斑减少时的血清最大稀释度的稀释倍数。“阴性”表示没有观察到噬斑减少；″80″代表80-倍的稀释；″160″代表160-倍的稀释，等等；″N/A″表示未施用第二次疫苗接种；″死亡″指马。
bBEI或福尔马林灭活的YF-WN嵌合体与PRESTIGEV+VEE疫苗相组合。
结果：
来自实施例1的血清学结果说明了本发明的灭活的西尼罗病毒嵌合体疫苗的意想不到的结果。已知活病毒，如Acambis活减毒YF-WN嵌合体，产生细胞介导的应答和体液应答(抗体应答)。不过，一般认为灭活的病毒只产生体液应答。在这里，从血清学数据明显看出灭活的YF-WN产生了高的体液应答。因此，并且意想不到地，灭活的YF-WN与活YF-WN在引发体液应答方面表现一样好。除了使用灭活的疫苗而非活疫苗的上述优点之外，本发明的灭活疫苗的优点是意想不到的。
实施例2
实验设计：
动物：马
将对西尼罗病毒(WNV)血清反应阴性的六(6)匹混种一岁马，雄性和雌性都有，用组合疫苗进行疫苗接种，所述组合疫苗包含PRESTIGEV+VEE疫苗(可获自Intervet Inc，Millsboro，DE)的灭活病毒组分和灭活的黄热病毒-西尼罗病毒(YF-WN)嵌合体。所述疫苗还包含聚丙烯酸佐剂。PRESTIGEV+VEE疫苗包含灭活的东方脑脊髓炎病毒，灭活的西方脑脊髓炎病毒，灭活的委内瑞拉脑脊髓炎病毒，灭活的马疱疹病毒1和4型(鼻肺炎)，灭活的流感病毒(Kentucky株1993，Kentucky株2002，和New Market-2-93)，和破伤风类毒素组分。
YF-WN活减毒嵌合体获自Acambis(Cambridge，MA)。如上面实施例1中所述用BEI灭活嵌合病毒并加入到PRESTIGEV+VEE疫苗中。
将另外六(6)匹对西尼罗病毒(WNV)血清反应阴性的混种一岁马，雄性和雌性都有，不接种疫苗并用作对照。
疫苗接种：
马通过肌内接受2x1mL剂量的疫苗，间隔3-4周给药。
攻击病毒：
通过在每匹马上放置8-17只感染了WNV的蚊子并让蚊子吸食10-15分钟来攻击马。
结果：
疫苗 马数/组 用WNV攻击后的结果：
≥102.5  临床体征  病毒血症  组织学
灭活的YF/WN 6 0/6  0/6  0/6  0/6
未接种疫苗的对照 6 0/6  0/6  5/6  1/6
实施例3
I.实验概述
本实验的目的是确证包含在组合疫苗中的灭活的嵌合西尼罗病毒的免疫原性，所述组合疫苗包含PRESTIGEV+VEE疫苗的抗原性组分(可获自Intervet Inc，Millsboro，DE；即，灭活的东方脑脊髓炎病毒，灭活的西方脑脊髓炎病毒，灭活的委内瑞拉脑脊髓炎病毒，灭活的马疱疹病毒1和4型(鼻肺炎)，灭活的流感病毒(Kentucky株1993，Kentucky株2002，和New Market-2-93株)，和破伤风类毒素)，全部都组合以聚丙烯酸佐剂。
具体地，本实验的一个目的是确证其它疫苗组分不干扰灭活的嵌合西尼罗病毒。
用1.0ml剂量的组合疫苗通过肌内(IM)途径间隔三到四周对二十(20)匹雄性和雌性马接种疫苗两次，所述组合疫苗包含灭活的嵌合西尼罗病毒，灭活的东方脑脊髓炎病毒，灭活的西方脑脊髓炎病毒，灭活的委内瑞拉脑脊髓炎病毒，灭活的马疱疹病毒1和4型(鼻肺炎)，灭活的流感病毒(Kentucky株1993，Kentucky株2002，和NewMarket-2-93株)，和破伤风类毒素，全部都组合以聚丙烯酸佐剂。十匹另外的马充当未接种疫苗的对照。在第二次接种疫苗后21天时，通过鞘内(IT)途径用毒性WNV攻击接种疫苗的马和未接种疫苗的对照马。按顺序对分别两组10匹接种马和5匹对照马进行疫苗接种和攻击。在接种疫苗前、接种疫苗后和攻击后采集血液样本用于血清学评估并测试对WNV的病毒中和(VN)抗体效价。攻击后采集血液样本来分离WNV。在尸体剖检时采集神经组织用于组织学检查。
通过IT途径用毒性WNV攻击马导致神经疾病的体征，与在天然野外条件下感染的马中观察到的体征一致。攻击后，接种疫苗的马与未接种疫苗的对照相比在由WNV引发的神经疾病的临床体征上显示出统计学上显著的减轻，并且在接种组和对照组之间显示统计学上显著的病毒脱落减少。这些结果确证了其它疫苗组分对杀灭的黄病毒嵌合体组分无干扰。其它数据确证了杀灭的黄病毒嵌合体组分对其它疫苗组分无干扰。
II.材料和方法
动物
使用三十(30)匹混合性别和品种的马，六到九个月龄。通过冷冻烙印来鉴别马。只使用通过50％噬斑减少中和试验测定病毒中和性(VN)抗体效价≤5的马。疫苗接种期间将接种疫苗的马和对照马一起圈养在防昆虫和啮齿类动物的圈舍中，并转移到另一处圈舍来用毒性WNV进行攻击。
B.疫苗
疫苗包含YF/WN嵌合体组合以东方脑脊髓炎(EE)病毒，西方脑脊髓炎(WE)病毒，委内瑞拉脑脊髓炎(VE)病毒，马疱疹病毒1型(EHV-1)，马疱疹病毒4型(EHV-4)，马流感病毒(EIV)株Kentucky 1993/A2，EIV株Kentucky 2002/A2，和EIV株New Market/2/93/A2，和破伤风类毒素组分。该疫苗包含聚丙烯酸佐剂。
使用两种疫苗来说明无干扰。一种疫苗包含最小免疫剂量的灭活YF/WN嵌合体和标准释放剂量的其余灭活病毒或破伤风类毒素组分。另一种疫苗包含标准释放剂量的灭活YF/WN嵌合体和最小免疫剂量的其余灭活病毒或破伤风类毒素组分。在每种情况下，以标准释放剂量存在的组分并不干扰以最小免疫剂量水平存在的组分。
C.接种疫苗
在首次接种疫苗时马为6到9月龄。使用随机号码生成器将马随机分组并适应环境最少七天。在颈部用两个1ml剂量的疫苗(间隔三周)对二十匹马进行IM疫苗接种。使用十匹马作为未接种疫苗的对照。按序对两组马(每组包含10匹接种疫苗马和5匹对照)接种疫苗。
D.盲法
观察临床体征和对临床样本进行实验室检测的项目人员并不知道马属于哪个组。
F.接种疫苗后观察和采集样本
在接种疫苗后-1到10天测量直肠体温并观察注射部位反应。体温≥102.5被认为是升高的温度。根据评分方法对注射部位反应评分。记录任何全身性反应或异常健康状况的观察结果。在第一次接种疫苗后第0，7，和21天并在第二次接种疫苗后第21天采集血液制备血清。通过利用50％噬斑减少中和测试来确定来自马的血清样本中针对WNV的中和抗体效价。
G.用毒性WNV攻击马
在第二次接种疫苗后第21天，通过IT施用1ml包含毒性WNV株NY99来攻击马。五次重复滴定攻击物质的结果对于攻击组1和2分别为5.0，5.1，5.1，5.0和5.0(平均值5.0)，和5.1，5.1，5.0，5.0和5.1(平均值5.1)log10PFU/ml剂量。在攻击后-1到21天记录直肠体温。通过IT途径用WNV攻击未接种疫苗的对照马导致疾病的临床体征，其是在野外条件下天然感染了WNV的马中所观察到的体征。在攻击后的21天期间对马观察下列类别的神经疾病临床体征：精神活动的变化，轻瘫，肌束震颤，和共济失调/卧躺。对于每种类别，将临床体征评分为0＝无，1＝非常轻微并可不被注意到，2＝中度而3＝严重。
确认为严重的临床疾病后，尝试在24小时内使动物安乐死。由于持久的西尼罗病体征，或伴随着卧躺的突发急性体征和/或在没有帮助的情况下不能移动，按照2004年4月1日的兽医生物学中心通告04-09号，出于人道主义的原因，对马进行安乐死。记录任何其它异常的健康情况观察结果。在攻击时和攻击后第7，14和21天取血液样本用于血清学。在攻击后-1到10天取血液样本用于病毒分离。在尸体剖检时取血液用于血清学，病毒分离，并取组织用于组织病理学。将神经组织中的组织病理学损伤评分为0＝无，1＝非常轻度/轻度，2＝中度，而3＝严重。
III.结果
A.动物和接种疫苗
在第一次接种疫苗后对三匹接种疫苗的马记录到体温≥102.5持续一天并对一匹对照马记录到体温≥102.5持续两天。在第二次疫苗接种后对任何接种疫苗的马或对照马都未记录到体温≥102.5。在研究开始时所有马都处于良好的总体健康状况。根据评分方法来评估疫苗接种部位反应(0(无反应)到5(全身性反应))。第一次接种疫苗后，对三匹马在一或两天记录到轻度注射部位反应，评分为2或更少。另一匹接种疫苗的马具有轻度反应，在第一次接种疫苗后持续了10天，但并未引发任何疼痛或导致不愿移动。在第二次接种疫苗后也观察到了轻度注射部位反应，评分为2或更少，在接种疫苗后持续1到6天。在第一次或第二次接种疫苗后的注射部位反应都未记录为痛苦。在第一次或第二次接种疫苗后在任何马中都没观察到全身性反应。
B.接种疫苗后和用WNV攻击后的血清学
在下表中总结了接种疫苗的马和对照马的血清学数据。
接种疫苗组：在第一次和第二次接种疫苗后和攻击后对WNV的噬斑减少中和抗体效价50％(PRNT50％)
在疫苗接种和攻击后不同天数对WNV的PRNT50％效价a：
接种疫苗后  攻击后
马编号  第0天 第7天 第21天a 第42天b  第7天 第14天 第21天
201  Neg. Neg. Neg. Neg.  ≥1280 ≥1280 ≥1280
205  Neg. Neg. Neg. 40  640 ≥1280 ≥1 28 0
209  Neg. Neg. Neg. 5  5 NS  NS
211  Neg. Neg. Neg. 5  80 ≥1280 ≥1 28 0
212  Neg. Neg. Neg. 10  640 ≥1280 ≥1280
214  Neg. Neg. Neg. 20  640 ≥1280 ≥1280
217  Neg. Neg. Neg. 10  ≥1280 ≥1280 ≥1280
218  Neg. Neg. Neg. 20  ≥1280 ≥1280 ≥1280
220  Neg. Neg. Neg. Neg.  20 ≥1280 ≥1280
223  Neg. Neg. Neg. Neg.  320 ≥1280 ≥1280
227  Neg. Neg. Neg. Neg.  640 ≥1280 ≥1280
229  Neg. Neg. Neg. Neg.  20 ≥1280 ≥1280
230  Neg. Neg. Neg. 5  160 ≥1280 ≥1280
232  Neg. Neg. Neg. 20  10 ≥1280 ≥1280
233  Neg. Neg. 20 20  20 ≥1280 ≥1280
234  Neg. Neg. Neg. 10  20 ≥1280 ≥1280
235  Neg. Neg. Neg. 5  80 ≥1280 ≥1280
238  Neg. Neg. Neg. 10  40 ≥1280 ≥1280
248  Neg. Neg. Neg. 160  160 ≥1280 ≥1280
254  Neg. Neg. Neg. Neg.  320 ≥1280 ≥1280
a效价值是代表相对于对照观察到50％噬斑减少时的血清最大稀释度的稀释倍数。
b＝第21天是第二次接种疫苗的日子，c＝第42天是第二次接种疫苗后21天和攻击的日子。
Neg.＝阴性，NS＝无样本，安乐死
对照组：在第一次和第二次接种疫苗后和攻击后对WNV的噬斑减少中和抗体效价50％(PRNT50％)
在疫苗接种和攻击后不同天数对WNV的PRNT50％效价a：
 接种疫苗后 攻击后
马编号  第0天 第7天 第21天b 第42天c 第7天 第14天 第21天
202  Neg. Neg. Neg. Neg. ≥1280 NS NS
204  Neg. Neg. Neg. Neg. 640 ≥1280 ≥1280
206  Neg. Neg. Neg. Neg. 40 NS NS
  208   Neg.   Neg.   Neg.   Neg.   20   640   ≥1280
  216   Neg.   Neg.   Neg.   Neg.   20   ≥1280   ≥1280
  219   Neg.   Neg.   Neg.   Neg.   ≥1280   NS   NS
  221   Neg.   Neg.   Neg.   Neg.   320   NS   NS
  225   Neg.   Neg.   Neg.   Neg.   40   ≥1280   ≥1280
  231   Neg.   Neg.   Neg.   Neg.   40   ≥1280   ≥1280
  239   Neg.   Neg.   Neg.   Neg.   ≥1280   ≥1280   ≥1280
a效价值是代表相对于对照观察到50％噬斑减少时的血清最大稀释度的稀释倍数。
b＝第21天是第二次接种疫苗的日子，c＝第42天是第二次接种疫苗后21天和攻击的日子。
Neg.＝阴性，NS＝无样本，安乐死
所有接种疫苗的马和对照马在接种疫苗时和第一次接种后7天时对于WNV都是血清反应阴性的。在第一接种后接种疫苗的马缺乏对WNV的回忆应答表明之前没有接触过WNV。第一次接种后在一匹接种疫苗的马中检测到针对WNV的噬斑减少病毒中和抗体效价，并在第二次接种后21天在20匹接种疫苗的马中的14匹中检测到。所有未接种疫苗的对照马在第一次和第二次接种期间都保持血清反应阴性。这些结果表明对照马在接种疫苗期间未接触WNV，这证明了研究的有效性。攻击后在接种疫苗的马和对照马中都检测到针对WNV的高水平病毒中和抗体。
C.用毒性WNV攻击后马的直肠体温和神经学体征
观察攻击后马的个体温度。攻击后20匹接种疫苗的马中的六匹显示体温≥102.5一天或单独两天，并且这六匹接种疫苗的马中的三匹显示体温≥102.5持续连续两天或更多天。10匹未接种的对照马中的七匹在攻击后的任何日子显示体温≥102.5并且这七匹对照马全部都显示体温≥102.5持续连续两天或更多天。利用模型通过重复测量值方差分析比较攻击后的温度，所述模型包括处理效果、天数，以及处理和天数的相互作用。在攻击后8-10天在接种疫苗的马和对照马之间在体温上有显著差异(P＜0.05)。由于疾病临床体征的严重性，到攻击后10天，对10匹对照中的四匹实施安乐死。
通过鞘内(IT)途径用WNV攻击未接种疫苗的对照马导致疾病的临床体征，与在野外条件下天然感染了WNV的马中观察到的体征一致。还观察到包括精神活动的变化，轻瘫，肌束震颤，和共济失调/卧躺在内的临床体征。攻击后，10匹未接种的对照马中的七匹(70％)显示中度或严重的WNV神经疾病体征持续连续两天或更多天，或显示由于WNV感染而导致的严重的整体健康状况，从而出于人道主义的原因认为安乐死是正当的。因为持久的西尼罗病体征，或伴随着卧躺的突发急性体征和/或在没有帮助的情况下不能移动，出于人道主义的原因对马实施安乐死。
感染WNV的病例定义和证明由WNV引发疾病的主要结果被定义为具有下列任何类别的中度或严重疾病体征持续连续两天或更多天的马：精神活动的变化，轻瘫，肌束震颤，和共济失调/卧躺，或由于WNV感染而导致动物整体严重的健康状况需要实施安乐死的任何动物。这些标准必须得到满足以便使主要结果为失败；否则，认为马是成功的。
与10匹对照中的7匹(70％)相比，20匹接种疫苗的马中只有5匹(25％)在攻击后显示中度或严重的WNV神经疾病体征持续连续两天。用FREQ方法在SAS中进行主要结果的分析。对符合病例定义的马的比例的分析显示在接种组和对照组之间有显著的(P＜0.02)差异。优势比表明接种疫苗的马为六倍更有可能受到保护对抗WNV疾病的神经学体征。与对照相比，由于WNV疾病的体征，统计学意义上(P＜0.05)更高比例的对照被实施安乐死。
D.用毒性WNV攻击后由血清中分离病毒
还观察了攻击后由马血清中分离WNV的结果。在攻击后1-4天从20匹接种疫苗马中的6匹和10匹对照马中的10匹的血清中回收到WNV。与接种组相比显著(P＜0.05)更多的对照有病毒血症，并且与接种组相比，对照马病毒血症持续显著(P＜0.01)更多的天数。
E.用毒性WNV攻击后在接种组和对照组中神经组织的组织病理学
在尸体剖检时，从脑桥、延髓和下丘脑/丘脑中采集神经组织并分析由于病毒性脑炎造成的组织病理学。总体而言，与对照相比在接种组中的组织病理学减轻，但没有统计学上显著的差异。
IV.结论
通过IT途径用毒性WNV攻击马导致神经疾病的体征，与在天然野外条件下感染的马中观察到的体征一致，并且与用针对WNV的单价疫苗进行的研究中观察到的神经疾病一致。攻击后，与未接种的对照相比，接种的马显示统计学上显著的由WNV引发的神经疾病的临床体征的减轻，以及在接种组和对照组之间统计学上显著减少的病毒脱落。这些结果符合标准来令人满意地证明包含在组合疫苗中的西尼罗病毒，杀灭的黄病毒嵌合体组分的免疫原性，所述组合疫苗包含PRESTIGEV+VEE疫苗的组分(可获自Intervet Inc，Millsboro，DE；即，东方脑脊髓炎(EE)病毒，西方脑脊髓炎(WE)病毒，委内瑞拉脑脊髓炎(VE)病毒，马疱疹病毒1型(EHV-I)，马疱疹病毒4型(EHV-4)，马流感病毒(EIV)株Kentucky 1993/A2，EIV株Kentucky 2002/A2，和EIV株New Market/2/93/A2，以及破伤风类毒素组分)。这些结果确证了其它疫苗组分对杀灭的黄病毒嵌合体组分没有干扰。
*  *  *  *  *  *  *
尽管结合具体的实施方案及其实施例对本发明进行了描述，但要理解的是本发明能够作进一步改进，并且随附的权利要求意在覆盖总地按照本发明的原理作出的本发明的任何变异、应用或调整，包括本发明所属领域内公知或惯例实践范围内的这些自本说明书公开内容的偏离，并可应用到上文提到的基本特征，无论是现存的还是以后出现的。另外，尽管用具体维度的特征和/或测量和/或组分描述了本发明的实施方案，但要理解的是所述实施方案能够是不同的维度特征和/或测量和/或组分，而不会背离本发明的原理，并且随附的权利要求书意欲覆盖这些差异。另外，特此将本文提到的所有专利、印刷出版物等等以参考方式并入本文。

Claims (20)

1.灭活的嵌合黄病毒，包含第一种黄病毒，其中编码前膜和包膜蛋白的核苷酸序列被第二种黄病毒的编码前膜和包膜蛋白的核苷酸序列所替换。
2.权利要求1的灭活的嵌合病毒，其中第一种黄病毒是黄热病毒。
3.权利要求2的灭活的嵌合病毒，其中黄热病毒源自17D株。
4.权利要求1的灭活的嵌合病毒，其中嵌合病毒在前膜蛋白的氨基酸末端包含信号序列，而该信号序列是黄热病毒的信号序列。
5.权利要求1的灭活的嵌合病毒，其中第二种黄病毒是西尼罗病毒。
6.包含权利要求1的灭活的嵌合病毒的免疫原性组合物。
7.权利要求1的灭活的嵌合病毒，其中灭活的嵌合病毒以102-108噬斑形成单位(pfu)之间的浓度存在。
8.包含权利要求1的灭活的嵌合病毒的疫苗。
9.权利要求8的疫苗，其中灭活的嵌合病毒以102-108噬斑形成单位(pfu)之间的浓度存在。
10.预防或治疗动物中黄病毒感染的方法，该方法包括向动物施用灭活的嵌合黄病毒，其包含第一种黄病毒，其中编码前膜和包膜蛋白的核苷酸序列被第二种黄病毒的编码前膜和包膜蛋白的核苷酸序列所替换。
11.权利要求10的方法，其中第一种黄病毒是黄热病毒。
12.权利要求11的方法，其中黄热病毒源自17D株。
13.权利要求10的方法，其中第二种黄病毒是西尼罗病毒。
14.权利要求10的方法，其中以102-108噬斑形成单位(pfu)的剂量来施用嵌合黄病毒。
15.权利要求14的方法，其中以106-107pfu的剂量来施用嵌合黄病毒。
16.权利要求10的方法，其中通过皮下、肌内、黏膜下、黏膜，或皮内途径来施用灭活的嵌合黄病毒。
17.权利要求10的方法，其中口服施用灭活的嵌合黄病毒。
18.根据权利要求8的疫苗，进一步包含i)一种或多种经修饰的活病毒；ii)一种或多种失活的病毒；或iii)一种或多种细菌抗原。
19.根据权利要求8的疫苗，进一步包含失活的东方脑脊髓炎病毒，失活的西方脑脊髓炎病毒，失活的委内瑞拉脑脊髓炎病毒，失活的马疱疹病毒1型，失活的马疱疹病毒4型，失活的马流感病毒株KY93/A2，失活的马流感病毒株KY02/A2，失活的马流感病毒株NM/2/93/A2和破伤风类毒素组分中的一种或多种。
20.权利要求10的方法，其中失活的嵌合黄病毒存在于疫苗中，所述疫苗还包括失活的东方脑脊髓炎病毒，失活的西方脑脊髓炎病毒，失活的委内瑞拉脑脊髓炎病毒，失活的马疱疹病毒1型，失活的马疱疹病毒4型，失活的马流感病毒株KY93/A2，失活的马流感病毒株KY02/A2，失活的马流感病毒株NM/2/93/A2和破伤风类毒素组分中的一种或多种。
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