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BRPI0611581A2 - flavivìrus quimérico inativado, composição imunogênica, vacina, e, método de prevenção ou de tratamento de uma infecção por flavivìrus em um animal - Google Patents

flavivìrus quimérico inativado, composição imunogênica, vacina, e, método de prevenção ou de tratamento de uma infecção por flavivìrus em um animal Download PDF

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BRPI0611581A2
BRPI0611581A2 BRPI0611581-0A BRPI0611581A BRPI0611581A2 BR PI0611581 A2 BRPI0611581 A2 BR PI0611581A2 BR PI0611581 A BRPI0611581 A BR PI0611581A BR PI0611581 A2 BRPI0611581 A2 BR PI0611581A2
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BR
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inactivated
flavivirus
chimeric
vaccine
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BRPI0611581-0A
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Frank Jay Sterner
Daniel Ghislena Emiel Gooovaerts
Melissa Anne Lum
Mark William Mellencamp
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Intervet Int Bv
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Publication date
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Abstract

FLAVIVìRUS QUIMéRICO INATIVADO, COMPOSIçãO IMUNOGêNICA, VACINA, E, MéTODO DE PREVENçãO OU DE TRATAMENTO DE UMA INFECçãO POR FLAVIVìRUS EM UM ANIMAL. Modalidades da presente invenção geralmente proporcionam uma composição imunogénica e/ou vacina de vírus quimérico inativada para o tratamento ou a prevenção de infecção viral. Em adição, várias outras modalidades da presente invenção geralmente se referem aos métodos de prevenção e de tratamento de infecção viral em tais animais com a composição imunogênica e/ou vacina inativada. Outras modalidades compreendem métodos de preparação de uma vacina ou composição imunogênica para o tratamento ou a prevenção de infecção viral em tais animais.

Description

"FLAVIVIRUS VÍRUS QUIMÉR1CO INATIV ADO, COMPOSIÇÃOIMUNOGÊNICA, VACINA, E, MÉTODO DE PREVENÇÃO OU DETRATAMENTO DE UMA INFECÇÃO POR FLAVIVÍRUS EM UMANIMAL"
REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS
Este pedido reivindica o benefício sob 35 U.S. C. § 119 doPedido U.S. Provisório 60/693,629, depositado aos 24 de junho de 2005, queé por meio deste aqui incorporado em sua totalidade como referência.
CAMPO DA INVENÇÃO
Esta invenção é referida aos métodos novos e melhorados deprevenção e tratamento de flavivírus e outra infecção viral relacionada emanimais.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Flavivírus são vírus de RNA de fita positiva, envelopados,pequenos, que são preocupantes em ambientes médico e veterinário em todo omundo. Vírus do Nilo Ocidental (WN, ou WNV), por exemplo, que é ummembro da família de flavivírus, é o agente causador de encefalite WN, umadoença viral proveniente de artrópode, não-contagiosa, infecciosa (InVirology, Fields (ed.), Raven-Lippincott, New York, 1996, pp. 961-1034). Ovírus tem sido encontrado em África, Asia Ocidental, Oriente Médio, e regiãodo Mediterrâneo da Europa, e, recentemente, nos Estados Unidos. Mosquitostornam-se infectados com o vírus após se alimentarem sobre aves selvagensinfectadas, e então transmitem o vírus através de picadas em humanos, aves, eanimais, tais como cavalos, ovelhas, gado bovino, e porcos.
Vírus do Nilo Ocidental é uma doença infecciosa emergente.
Vírus do Nilo Ocidental foi primeiro isolado em Uganda em 1937. Hoje ele émais comumente encontrado na África, Asia Ocidental, Europa, e OrienteMédio. Contudo, ele fez seu primeiro surgimento reconhecido nos EstadosUnidos em 1999. Em 2004, o vírus havia sido encontrado em aves emosquitos em cada estado exceto Alaska e Hawaii.
Outras doenças bem conhecidas causadas pelos flavivírusincluem febre amarela, encefalite japonesa, Dengue, e encefalite de São Luís.Infecções de flavivírus são comumente transmitidas por carrapatos e/oumosquitos.
Os hospedeiros primários para o vírus do Nilo Ocidental sãoapenas mosquitos e aves. Outras espécies animais, tais como humanos, eanimais, tais como cavalos, ovelhas, gado bovino, e porcos, e semelhantes sãoconsideradas apenas hospedeiros incidentais que se tornam infectados quandoum mosquito fêmea infectado pica o hospedeiro incidental.
Pessoas que contraem o vírus do Nilo Ocidental normalmenteexperimentam apenas sintomas brandos incluindo febre, dor de cabeça, dorescorporais, erupção de pele, e glândulas linfáticas inchadas. Se o vírus do NiloOcidental entra no cérebro, contudo, ele pode causar meningite ou encefaliteameaçadora da vida. Caso ameaçadores da vida primariamente ocorrem empessoas idosas. Estudos recentes têm mostrado que o vírus do Nilo Ocidentalpode ser transmitido através de transfusões de sangue e de transplantes deórgão. Alguns peritos de saúde também crêem que é possível que o vírus doNilo Ocidental seja transmitido de uma mãe para o seu filho não-nascido, eatravés do leite da mama.
Há muitos projetos em desenvolvimento para abordagens devacina de vírus do Nilo Ocidental, incluindo vacinas quiméricas vivas (quecombinam genes de mais do que um vírus em uma vacina única), vacinas deDNA nu, e vacinas contendo coquetéis de proteínas do Nilo Ocidentalindividuais, e semelhantes. Contudo, não há abordagem fazendo uso de umavacina quimérica inativada.
Proteínas de flavivírus são produzidas por tradução de umaúnica matriz de leitura aberta longa para gerar uma poliproteína, que sofreuma série complexa de clivagens proteolíticas após tradução por umacombinação de proteases virais e de hospedeiro para gerar proteínas viraismaduras. As proteínas estruturais de vírus estão arranjadas na poliproteína naordem de C-prM-E, onde "C" é capsídeo, "prM" é um precursor da proteínaM (membrana) ligada em envelope viral, e "E" é a proteína de envelope. Estasproteínas estão presentes na região N-terminal da poliproteína, enquanto queproteínas não-estruturais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, e NS5) estão localizadas na região C-terminal do polipeptídeo.
Em 2003, testes clínicos em humano de uma vacina de vírusatenuado, vivo do Nilo Ocidental foram iniciados por Acambis (Cambridge,MA). A vacina atenuada, viva de Acambis é baseada em uma vacina já usadapara prevenir febre amarela, uma doença causada por um flavivírus diferente.
Uma vacina atenuada, viva de Acambis contém genes de doisvírus diferentes, vírus de febre amarela e vírus do Nilo Ocidental, e é umexemplo de um vírus quimérico. Esta vacina atenuada, viva de Acambiscompreende vírus da Febre Amarela com uns poucos genes substituídos porgenes para proteínas de superfície de vírus do Nilo Ocidental.
Detalhes de preparação desta vacina quimérica, atenuada, vivade Acambis são proporcionados, por exemplo, em Patentes U.S. de Nos.6.962.708 e 6.696.281 e Chambers et al., J. Virol. 73:3095-3101, 1999, quesão cada uma aqui inteiramente incorporadas em suas totalidades comoreferências. Outros métodos de uso e de diagnóstico para a vacina quiméricaatenuada, viva de Acambis são proporcionados em Patentes US de Nos.6.682.883 e 6.878.372, que são aqui incorporadas em suas totalidades comoreferências.
Os resultados de tais vacinas atenuadas, vivas têm se mostradobem sucedidas e testes continuam. Contudo, certos riscos podem acompanharo uso de uma vacina de vírus atenuada, viva. Estes riscos são até mesmopronunciados para indivíduos imunocomprometidos, os indivíduos idosos,indivíduos grávidos, e outros indivíduos com um sistema imune estressado ouenfraquecido. Bastante freqüentemente, tem sido demonstrado que vacinas devírus atenuadas, vivas estão quer infra-atenuadas (causam doença), quersupra-atenuadas (falham em imunizar). Também é possível que uma vacinade vírus viva otimamente atenuada reverta para uma forma virulenta(causadora de doença) através de mutação. Contudo, o YF-WN de Acambisnão tem mostrado indicação de reversão para virulência. Há preocupaçõesadicionais com as vacinas vivas atenuadas. Por exemplo, os vírus vivos daDengue também são sensíveis ao calor, tornando difícil e custoso manter avacina em alguns países tropicais e subtropicais onde a vacina pode ser maisnecessária. Conseqüentemente, uma vacina é necessária na técnica para tratare/ou prevenir com segurança infecções de flavivírus, tal como vírus do NiloOcidental, em indivíduos com estes e outros riscos similares. Particularmentepara aqueles que estão imune comprometidos ou outros indivíduos mais sobrisco.
Contudo, o estado da técnica é que uma vacina de vírusquimérica inativada é indesejável e não seria efetiva. Patente US de No.6.432.411 relatou que os esforços para preparar vacinas de flavivírus mortastêm encontrado sucesso limitado. Primariamente os estudos eram limitadospela incapacidade. Primariamente os estudos eram limitados pelaincapacidade de obter rendimentos de vírus adequados dos sistemas de culturacelular. Rendimentos de vírus de células de inseto estão geralmente dentro dafaixa de 104 a 105 pfu/mL, bem abaixo dos níveis necessários para gerar umavacina morta custo-efetiva. Rendimentos de células de mamífero incluindocélulas Vero e LLC-MK2 foram mais altos, mas os rendimentos de pico, deaproximadamente 10 pfu/mL de uma linhagem de célula Vero única, aindasão muito menores do que o necessário para alcançar um produto de vacinaverdadeiramente custo-efetiva.
Conseqüentemente, a técnica ensina modo de uso de flavivírusinativados como candidatos de vacinas viáveis. Além disso, não háensinamento de uma vacina quimérica inativada para tratar ou prevenirqualquer infecção por flavivírus.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Várias modalidades da invenção da presente invençãocompreendem uma vacina ou composição imunogênica para o tratamento ou aprevenção de infecção por flavivírus em um animal.
A invenção também proporciona métodos para prevenir outratar infecções de flavivírus em animais suscetíveis, que envolvemadministrar aos indivíduos flavivírus quiméricos inativados. A invençãotambém proporciona o uso de flavivírus quiméricos inativados na preparaçãode medicamentos para uso em tais métodos e vacinas e/ou composiçõesimunogênicas. Em uma modalidade da invenção, os flavivírus quiméricosinativados pode incluir, por exemplo, as proteínas não-estruturais e decapsídeo de um primeiro flavivírus, e as proteínas prM e de envelope de umsegundo flavivírus.
Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a umflavivírus inativado, compreendendo um primeiro flavivírus no qual asseqüências de nucleotídeos codificadoras das proteínas de pré-membrana e deenvelope são substituídas por seqüências de nucleotídeos codificadoras deproteínas de pré-membrana e de envelope de um segundo flavivírus. Oprimeiro flavivírus pode ser vírus de febre amarela, incluindo vírus de febreamarela derivado de cepa 17D. O vírus quimérico pode compreender umaseqüência de sinal na terminação de aminoácido da proteína de pré-membrana, e a seqüência de sinal pode ser aquela do vírus da febre amarela.
O segundo flavivírus pode ser vírus do Nilo Ocidental.
Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a umacomposição imunogênica compreendendo um flavivírus quimérico inativado,compreendendo um primeiro flavivírus no qual as seqüências de nucleotídeoscodificadoras das proteínas de pré-membrana e de envelope são substituídaspor seqüências de nucleotídeos codificadoras de proteínas de pré-membrana ede envelope de um segundo flavivírus.
Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a umavacina compreendendo um flavivírus quimérico inativado, compreendendoum primeiro flavivírus no qual as seqüências de nucleotídeos codificadorasdas proteínas de pré-membrana e de envelope são substituídas por seqüênciasde nucleotídeos codificadoras de proteínas de pré-membrana e de envelope deum segundo flavivírus. A vacina pode adicionalmente compreender i) um oumais vírus vivos modificados; ii) um ou mais vírus inativados; ou iii) um oumais antígenos bacterianos. A vacina pode adicionalmente compreender umou mais de vírus inativado de encefalomielite oriental, vírus inativado deencefalomielite ocidental, vírus inativado de encefalomielite venezuelana,vírus de tipo 1 inativado do herpes eqüino, vírus de tipo 4 inativado do herpeseqüino, vírus inativado da influenza eqüina de cepa Kentucky 1993/A2, vírusinativado da influenza eqüina de cepa Kentucky 2002/A2, vírus inativado dainfluenza eqüina de cepa New Market/2/93/A2 e uma fração de toxóide do tétano.
Em outra modalidade, a presente invenção refere-se ummétodo de prevenção ou de tratamento de uma infecção de uma infecção porflavivírus em um animal, o método compreendendo administrar ao animal umflavivírus quimérico inativado (ou sua vacina ou composição imunogênica)compreendendo um primeiro flavivírus no qual as seqüências de nucleotídeoscodificadoras das proteínas de pré-membrana e de envelope são substituídaspor seqüências de nucleotídeos codificadoras de proteínas de pré-membrana ede envelope de um segundo flavivírus. O primeiro flavivírus pode ser umvírus da febre amarela. O vírus da febre amarela pode ser derivado da cepa17D. O segundo flavivírus pode ser vírus do Nilo Ocidental.
Em quaisquer modalidades da presente invenção, o vírusquimérico inativado pode estar presente em uma concentração variando entre10 e 10 unidades formadoras de placa (pfu). Alternativamente, o flavivírusquimérico pode ser administrado em uma dose variando entre IO6 e IO7 pfu.Alternativamente, o flavivírus quimérico pode ser administrado em uma dosevariando entre 1 e 10 unidades de dose de antígeno relativas.
Em quaisquer modalidades da presente invenção, o vírusquimérico inativado pode ser administrado por uma rota subcutânea,intramuscular, submucosal, mucosal, ou intradermal. em uma modalidade dapresente invenção, o flavivírus quimérico inativado é oralmente administrado.
Outras características e vantagens da invenção serão evidentesa partir da seguinte descrição.
DESCRIÇÃO DETALHADA
Como aqui usado, o termo "vacina(s)" significa e refere-se aum produto, cuja administração é intencionada para gerar uma resposta(s)imune(s) que pode prevenir e/ou minorar a severidade de uma ou maisdoenças infecciosas. Vacinas podem incluir um ou mais dos seguintes: umapreparação de bactérias inativada ou atenuada viva, vírus ou parasitas,organismos inteiros inativados (mortos), células irradiadas vivas, fraçõesbrutas ou imunógenos purificados, incluindo aqueles derivados de DNArecombinante em uma célula hospedeira, conjugados formados por ligaçãocovalente de componentes, antígenos sintéticos, polinucleotídeos (tais comovacinas de DNA plasmídeo), células vivas contendo vetor expressandoimunógenos heterólogos específicos, ou células pulsadas com imunógeno.
Como aqui usado, "vírus quimérico" refere-se a um víruspossuindo um genoma contendo seqüências de dois ou mais vírus diferentes,incluindo cepas virais diferentes. A não ser que seja enunciado de outromodo, "quimera" refere-se a um vírus quimérico. Um exemplo não-limitantede um vírus quimérico é a quimera YF/WN, que é um flavivírus quimérico.
Como aqui usado, "flavivírus quimérico" refere-se a um víruspossuindo um genoma contendo seqüências de dois ou mais flavivírusdiferentes, incluindo cepas diferentes de flavivírus. Como descrito acima, umexemplo não-limitante de um flavivírus quimérico é a quimera YF/WN.
Como aqui usado, "vírus quimérico do Nilo Ocidental","quimera do Nilo Ocidental", "vírus YF/WN" e "quimera YF/WN" referem-se a um vírus atenuado, vivo quimérico, compreendendo a cepa de vacina17D de vírus da febre amarela (YFV) no qual a seqüência de nucleotídeoscodificadora das proteínas de pré-membrana (prM) e de envelope (E) sãosubstituídas pelas seqüências de nucleotídeos codificadoras de proteínas prMe E de Vírus do Nilo Ocidental (WNV), de modo que as proteínas prM e E doVírus do Nilo Ocidental sejam expressadas, e a proteína de capsídeo do vírusquimérico seja do vírus da febre amarela. O técnico experiente prontamentereconhecerá que flavivírus quiméricos compreendendo componentes de vírusda febre amarela e do vírus do Nilo podem ser preparados de outros flavivírusquiméricos específicos descritos neste parágrafo.
Vírus quimérico do Nilo Ocidental (ou, vírus YF/WN) podeser inativado usando técnicas bem conhecidas pelo técnico experiente. Porexemplo, o vírus quimérico do Nilo Ocidental (ou, vírus YF/WN) pode serinativado com agentes químicos inativadores ou outro meio físico tal comocalor. Exemplos não limitantes de agentes químicos inativadores incluemetileno-imina binária (BEI) ou formalina (uma solução 37% de formaldeído).
Vírus vivo pode ser inativado usando BEI primeiro pormisturação de pó de etileno-amina binária (BEA) com uma solução dehidróxido de sódio. Após geração de BEI no ambiente básico, a solução deBEI é adicionada em uma solução contendo o vírus vivo para dar umaconcentração final de BEI de 0,5 mM a 10 mM. Esta solução pode ser entãoincubada a de 4-37°C por 24-96 horas. Tiossulfeto de sódio pode ser entãoadicionado após o vírus ser inativado para neutralizar qualquer BEIremanescente.
Vírus vivo também pode ser inativado com formalina (solução37% de formaldeído). Aqui, formalina é adicionada em uma solução contendovírus vivo para dar uma concentração final de formalina de 0,05 - 2% v:v(formalina: solução viral viva). Esta solução pode ser então incubada a de A-37°C por 24-96 horas.
Como aqui usado, o termo "antígeno" significa e refere-se aum vírus, uma bactéria, partes de um vírus ou de uma bactéria ou umaproteína estranha que atua para estimular o sistema imune em um animal. Osistema imune pode ser estimulado para fazer com que células brancas dosangue ataquem e destruam o antígeno ou para produzir uma molécula deproteína, que ataca o antígeno e quer mata o antígeno quer torna-o inativo.Como aqui usado o termo "anticorpo" significa e refere-se a uma moléculacontendo proteína que um sistema imune de animal produz que reage com umantígeno para torná-lo inativo.
Como aqui usado, o termo "animal" significa e refere-se aambos animais humano e não-humano.
Como aqui usado, o termo "cepa de vacina" significa e refere-se a uma cepa viral adequada para uso em uma vacina ou composiçãoimunogênica. Uma "cepa de vacina" pode compreender, mas não énecessariamente limitada a, uma cepa não-patogênica ou cepa relativamentenão-patogênica, uma cepa morta, e/ou uma cepa atenuada.
Como aqui usado, o termo "liofilizar," e suas conjugações,significa e refere-se à secagem por congelamento. Como aqui usado, o termo"origem animal " significa e refere-se à origem de animais. Igualmente, otermo "origem não-animal" significa e refere-se à não-origem direta ouindiretamente de animais.
Como aqui usado, o termo "estabilizar," e suas conjugações,significa e refere-se a tornar ou manter estável, firme, constante, e manter àcerca de um dado nível ou nível substancialmente não flutuante, à cerca deuma dada qualidade ou qualidade substancialmente não-flutuante e à cerca deuma dada quantidade ou quantidade substancialmente não-flutuante. Contudo,é entendido que alguma flutuação no nível, na qualidade, e/ou na quantidadeda composição estabilizada pode se encontrada. Modalidades da presenteinvenção são intencionadas para incluírem estabilizadores que permitem taisflutuações. Sem limitação, estabilizadores incluem estabilizadores secos,estabilizadores volumosos, crioprotetores, termoestabilizadores,osmoprotetores, protetores de dessecação, e semelhantes. Tais termosespecialmente significam estarem incluídos dentro de estabilizadores dapresente invenção.
Como aqui usado, o termo "proteína" significa e refere-se auma cadeia molecular de aminoácidos. Uma proteína não é de umcomprimento específico e pode, ser requerido, ser modificada in vivo ou invitro, por, e.g. glicosilação, amidação, carboxilação ou fosforilação. Inter alia,peptídeos, oligopeptídeos e polipeptídeos estão incluídos dentro da definiçãode proteína. Uma proteína ou um peptídeo pode ser de origem biológica e/ousintética.
Como aqui usado, o termo "ácido nucleico" significa e refere-se a uma cadeia molecular de ácidos ribonucleicos ou ácidosdesoxirribonucleicos. Um ácido nucleico não é de um comprimentoespecífico, portanto polinucleotídeos, genes, matrizes de leitura aberta(ORFs), sondas, iniciadores, ligantes, espaçadores e adaptadores estãoincluídos dentro da definição. Um ácido nucleico pode ser de origembiológica e/ou sintética. O ácido nucleico pode estar na forma de fita única oude fita dupla. A fita única pode estar na orientação de senso ou de anti-senso.
Também estão incluídos dentro da definição DNAs ou RNAs modificados.Modificações nas bases do ácido nucleico podem ser feitas, e bases tal comoinosina podem ser incorporadas. Outras modificações podem envolver, porexemplo, modificações da estrutura principal.
Como aqui usado, um veículo farmaceuticamente aceitável éentendido para ser um composto que não afeta adversamente a saúde doanimal ou organismo a ser vacinado, pelo menos não na extensão na qual oefeito adverso é pior do que os efeitos vistos quando o animal não estávacinado. Exemplos não limitantes de veículos farmaceuticamente aceitáveisincluem água estéril ou uma solução salina fisiológica estéril. Em uma formamais complexa o veículo pode ser um tampão.
Como aqui usado, o termo "carboidrato" significa e refere-se amono-, di-, oligo-, e polissacarídeos.
Como aqui usado, o termo "felino" significa e refere-se aqualquer animal de ou pertencente ao gênero Felis, ou à família Felidae,família de gatos, tais como, mas não limitados a, um gato, um leão, um tigre,um leão da montanha, um puma, um jaguar, um lince, um ocelote esemelhante.
Como aqui usado, o termo "canino" significa e refere-se aqualquer animal de ou pertencente ao gênero Canis, família de cães, tal como,mas não limitados a, um cão, um lobo, e semelhantes.
Como aqui usado, o termo "eqüino" significa e refere-se aqualquer animal de ou pertencente ao gênero Equis, ou à família Equidae,família de cavalos, tais como, mas não limitados a, um cavalo, uma mula, umjumento, uma zebra, e semelhantes.
A presente invenção geralmente refere-se às composições parae aos métodos de prevenção e tratamento de infecção por flavivírus emanimais. Os métodos da invenção envolvem vacinação de animais que estãosob risco de desenvolvimento de ou possuem infecção por flavivírus com umflavivírus quimérico inativado. Outros aspectos da invenção são direcionadosaos métodos de preparação de uma vacina ou composição imunogênicacompreendendo um flavivírus quimérico inativado para o tratamento ou aprevenção de infecção por flavivírus em animais.
O técnico experiente prontamente reconhecerá, contudo, quehá outros flavivírus e vírus bem caracterizados proximamente relacionadoscom os flavivírus que podem ser tratados ou prevenidos usando vírusquiméricos inativados descritos pela presente invenção. Aqui, a invençãotambém é direcionada aos vírus quiméricos inativados descritos pela presenteinvenção. Conseqüentemente, a invenção também é direcionada aos vírusquiméricos inativados para tratamento ou prevenção de doenças ouenfermidades associadas com ou causadas por vírus da família Flaviviridaeou Togaviridae. Exemplos não limitantes de gêneros de vírus caindo dentrodestas famílias incluem vírus pertencentes aos gêneros Flavivírus, Pestivirus,Hepacivirus ou Alphavirus. Exemplos não limitantes de vírus ou doençascausadas por vírus pertencentes a estas famílias ou gêneros incluem vírus daencefalite, Encefalite Eqüina Oriental, Encefalite Eqüina Ocidental, EncefaliteEqüina Venezuelana, Kunj in, Encefalite do Vale Murray, vírus da doençaLouping, encefalite japonesa, Dengue (sorotipos 1-4), Febre Amarela,Encefalite do Vale Murray, Encefalite de São Luis, Encefalite de Rocio,Wesselsbron, vírus de Ilhéus; flavivírus de carrapatos, tais como encefalite deEuropa Central, encefalite siberiana, encefalite russa da primavera-verão,Doença da Floresta de Kyasanur, Febre hemorrágica de Omsk, vírusPowassan, Negishi, Absettarov, Hansalova, Apoi, e Hypr; bem como vírus dogênero Hepacivirus (e.g., vírus da Hepatite C). Vírus adicionais que podemser tratados ou prevenidos usando vírus quiméricos inativados da presenteinvenção incluem aqueles pertencentes ao gênero Pestivirus (e.g., vírus dadiarréia Bovina), e outros vírus, tais como vírus Lassa, Ebola, e Marburg ououtros vírus de RNA com uma construção genômica que seria compatívelcom a incorporação na quimera.
Infecção por qualquer um dos vírus acima descritos (oudoenças causadas pelos mesmos) pode ser prevenida ou tratada com os vírusquiméricos inativados aqui descritos. Em particular, com vírus quiméricosinativados que compreendem um primeiro vírus no qual uma ou maisproteína(s) estrutural(ais) do primeiro vírus têm sido substituída(s) por umaproteína (ou proteínas) estrutural correspondente de um segundo vírus contrao qual é almejada(o) proteção ou tratamento.
Um aspecto preferido da invenção é direcionado aos flavivírusquiméricos inativados, métodos de preparação de flavivírus quiméricosinativados, vacinas compreendendo flavivírus quiméricos inativados, emétodos usando tais vacinas. Este aspecto da invenção é direcionado aosflavivírus quiméricos inativados que compreendem um flavivírus no qual umaou mais proteínas estruturais de um primeiro flavivírus têm sido substituídaspor uma ou mais proteínas estruturais correspondentes de um segundoflavivírus, ao qual imunidade é desejada. Em uma modalidade da presenteinvenção, quimeras consistem da estrutura principal de um primeiro flavivírusna qual as proteínas prM e E têm sido substituídas por proteínas prM e E dosegundo flavivírus.
Os vírus quiméricos inativados que são usados na invençãopodem consistir de qualquer combinação de vírus, desde que, como émencionado acima, o vírus contra o qual imunidade é desejada seja a fonteda(s) proteína(s) estrutural(ais) mencionada(s). Por exemplo, para vacinar umanimal, tal como um cavalo, contra infecção do vírus do Nilo Ocidental, umflavivírus quimérico consistindo de uma estrutura principal de flavivírus, talcomo o vírus da febre amarela (YF), no qual as proteínas estruturais do vírusdo Nilo Ocidental, tais como as proteínas prM e E, são inseridas pode serusado. Nesta quimera, as proteínas YF prM e E são substituídas por aquelasde WN. Similarmente, se imunidade contra o vírus da encefalite japonesa (JE)for desejada, então as proteínas prM e E do vírus JE podem ser inseridas emum flavivírus de estrutura principal, tal como vírus da febre amarela, no lugardas proteínas de estrutura principal correspondentes. Outros flavivírus quecausam doença em cavalos, e para os quais vírus quiméricos podem serusados para induzir proteção, incluem vírus Kunjin, de encefalite do ValeMurray, e de doença Louping. Em todas as modalidades da presente invenção,o vírus quimérico é então inativado. Exemplos de animais que podem servacinados e/ou tratados com os vírus quiméricos inativados da presenteinvenção compreendem humanos, cavalos, porcos, ovelhas, gado bovino,animais domésticos, tais como cães e gatos, e aves domésticas. Contudo, emgeral qualquer animal suscetível à infecção do flavivírus para a qual proteçãoé almejada pode ser vacinado.
Assim, exemplos não limitantes de flavivírus que podem serusados na invenção, como fontes de vírus de estrutura principal ou insertos deproteína estrutural, incluem flavivírus provenientes de mosquito, tais comovírus de encefalite japonesa, Dengue (sorotipos 1-4), Febre Amarela,Encefalite do Vale Murray, Encefalite de São Luis,, Nilo Ocidental, Kunjin,Encefalite de Rocio, Wesselsbron, vírus de Ilhéus; flavivírus de carrapatos,tais como encefalite de encefalite de Europa Central, encefalite siberiana,encefalite russa da primavera-verão, Doença da Floresta de Kyasanur, Febrehemorrágica de Omsk, doença Louping, Powassan, Negishi, Absettarov,Hansalova, Apoi, e Hypr; bem como vírus do gênero Hepacivirus (e.g., vírusda Hepatite C). Vírus adicionais que podem ser usados como a fonte deproteínas estruturais inseridas incluem os vírus do gênero Pestivirus (e.g.,vírus da diarréia Bovina), e outros vírus, tais como vírus Lassa, Ebola, eMarburg.
Em geral, como descrito nas Patentes U.S. de Nos. 6.962.708 e6.696.281, em uma modalidade para a prevenção ou o tratamento de infecçãopor flavivírus do Nilo Ocidental, tais métodos requerem substituição de genescodificadores de duas proteínas estruturais [prM e E e vírus da vacina 17D defebre amarela com os genes correspondentes do vírus do Nilo Ocidental einativação do vírus quimérico. O virion inativado resultante possui o envelopedo Nilo Ocidental, contendo estruturas envolvidas em fixação de vírus-célulae internalização de vírus, todos os determinantes antigênicos paraneutralização, e epítopo(s) para linfócitos T citotóxicos. A proteína denucleocapsídeo (C), proteínas não estruturais, e terminações não traduzidasresponsáveis pela replicação de vírus permanecem aquelas do vírus 17D defebre amarela original.
Uma modalidade preferida da presente invenção refere-se auma composição imunogênica e/ou vacina quimérica inativada para otratamento ou a prevenção de infecção do Nilo Ocidental, em um animalsuscetível à infecção do Nilo Ocidental. Detalhes de preparação de vírusquiméricos incluindo o vírus quimérico WNArF que pode ser então inativadoe usado em várias modalidades da invenção são proporcionados, por exemplo,em Patentes U.S. de Nos. 6.962.708 e 6.696.281 e Chambers et al, J. Virol.73:3095-3101, 1999, que são por meio deste aqui incorporados em suatotalidade como referências. Patentes U.S. de Nos. 6.962.708 e 6.696.281 sãolimitadas, contudo, aos vírus quiméricos atenuados, às vacinas e aos métodosde uso relacionados. Não há ensinamento ou sugestão de uso de um vírusquimérico inativado, de uso de um vírus quimérico inativado em uma vacina,ou de uso de um vírus quimérico inativado em qualquer método relacionado.Em contraste a estas patentes, todas as modalidades da presente invenção sãodirecionadas para os vírus quiméricos inativados.
Vacina e composições imunogênicas de acordo com as váriasmodalidades da presente invenção podem ser preparadas e/ou comercializadasna forma de um líquido, uma suspensão congelada ou uma forma liofilizada.Tipicamente, vacinas e/ou composições imunogênicas preparadas de acordocom a presente invenção contêm um diluente ou veículo farmaceuticamenteaceitável costumeiramente usados para tais composições. Veículos incluem,mas não são limitados a, estabilizadores, conservantes e tampões.Estabilizadores adequados são, por exemplo SPGA, composições Tween (taiscomo as disponíveis em A.G. Scientific, Inc., San Diego, CA), carboidratos(tais como sorbitol, manitol, amido, sacarose, dextrana, glutamato ou glicose),proteínas (tais como soro de leite em pó, albumina ou caseína) ou seusprodutos de degradação. Exemplos não limitantes de tampões adequadosincluem fosfatos de metal alcalino. Conservantes adequados são timerosal,mertiolato e gentamicina. Diluentes incluem água, tampão aquoso (tal comosolução salina tamponada), alcoóis e polióis (tal como glicerol).
Se desejado, as vacinas inativadas de acordo com a invençãopodem conter um adjuvante. Compostos ou composições adequados para estepropósito incluem HAVLOGEN® (um adjuvante baseado em polímero deácido acrílico, Intervet Inc., Millsboro, DE), poli(ácidos acrílicos), hidróxido,fosfato e óxido de alumínio, emulsão de óleo-em-água ou de água-em-óleobaseada em, por exemplo um óleo mineral, tal como BAYOL™ ouMARCOL™ (Esso Imperial Oil Limited, Canadá), ou um óleo vegetal talcomo acetato de vitamina E, e saponinas. Entretanto, componentes comatividade adjuvante são amplamente conhecidos e, geralmente, pode serutilizado qualquer adjuvante que não interfira com a eficácia ou a segurançada vacina e/ou composição imunogênica.
Geralmente, a vacina pode ser administrada subcutânea,intradermal, submucosal, ou intramuscularmente em uma quantidade efetivapara prevenir infecção do flavivírus de interesse e/ou tratar uma infecção doflavivírus. Uma quantidade efetiva é definida como uma quantidade dematerial quimérico inativado imunizador que induzirá imunidade nos animaisvacinados, contra desafio por um vírus virulento. Em várias outrasmodalidades, uma quantidade efetiva induzirá imunidade nos animaisvacinados ou em sua progênie, contra desafio por um vírus virulento.Imunidade é aqui definida como a introdução de um nível mais altosignificativo de proteção em uma população do animal após vacinaçãocomparado com um grupo não vacinado.
Além disso, em várias formulações das composiçõesimunogênicas e/ou vacinas inativadas da presente invenção, excipientes,estabilizadores e semelhantes adequados podem ser igualmente adicionados.
O vírus quimérico inativado pode ser formulado como umasolução aquosa estéril contendo entre 10^2 e 10^12 de unidades infecciosas(como determinado antes da inativação). Em uma modalidade, o vírusquimérico inativado pode ser formulado como uma solução aquosa estérilcontendo entre 10^7 e 10^0 unidades infecciosas (conforme determinado antesda inativação). Unidades infecciosas incluem unidades formadoras de placa(pfu) ou doses infecciosas de cultura de tecido (tcid). Alternativamente, ovírus quimérico inativado pode ser formulado como uma solução aquosaestéril contendo entre IelO unidades de dose de antígeno relativas. O vírusquimérico inativado formulado pode ser proporcionado em um volume dedose de 0,1 a 1,0 ml, a ser administrado, por exemplo, por rotas subcutânea,intramuscular, submucosal ou intradermal. Outras modalidades podem seradministradas por uma rota mucosal, tal como uma rota oral. Seleção de umaquantidade apropriada de quimera a administrar pode ser determinada poraquelas pessoas experientes na técnica, e esta quantidade pode variar devido anumerosos fatores, incluindo sem limitação o tamanho, o tipo, e a saúde geraldo animal no qual a quimera é para ser administrada.
Para um entendimento maior da invenção, referência deve serfeita aos seguintes exemplos e reivindicações.
Exemplo 1
Planejamento experimental
Animais:
Seis (6) cavalos mestiços de um ano de idade, ambos machos efêmeas, e soronegativos para o vírus do Nilo Ocidental (WNV) foramvacinados com uma vacina de combinação contendo os componentes viraisinativados de vacina PRESTIGE® V+VEE (disponível na Intervet Inc,Millsboro, DE) e quimera inativada de Febre Amarela - Nilo Ocidental (YF-WN), todas combinadas com um adjuvante de poli(ácido acrílico). A vacinaPRESTIGE® V+VEE contém vírus inativado da Encefalomielite Oriental,vírus inativado da Encefalomielite Ocidental, vírus inativado daEncefalomielite Venezuelana, vírus inativado do Herpes Eqüino de tipos 1 e 4(Rinopneumonite), vírus inativado da Influenza (cepa Kentucky 1993, cepaKentucky 2002, e New Market-2-93), e frações de toxicóide do tétano.
A quimera atenuada viva YF-WN foi obtida de Acambis emCambridge, MA, e inativada com etileno-imina binária (BEI). Inativação foirealizada primeiro por misturação do pó de etileno-amina binária (BEA) comuma solução de hidróxido de sódio. Sob misturação, a BEA se converte emBEI. Esta solução líquida de BEI é adicionada em uma solução de vírusquimérico vivo para dar uma concentração final de BEI de 2 mM. A soluçãode quimera / BEI foi incubada a cerca de 18-25°C por cerca de 3 dias.
Outros seis (6) cavalos mestiços de um ano de idade, ambosmachos e fêmeas, e soronegativos para o vírus do Nilo Ocidental (WNV)foram vacinados com uma vacina de combinação contendo os componentesvirais inativados de vacina PRESTIGE® V+VEE (disponível na Intervet Inc,Millsboro, DE) e quimera Febre Amarela - Nilo Ocidental (YF-WN)inativada com formalina.
A quimera YF-WN viva atenuada foi obtida de Acambis emCambridge, MA, e inativada com formalina (solução 37% de formaldeído).Inativação foi realizada por misturação de solução de formalina com umasolução de vírus quimérico vivo para dar uma concentração final de formalinade 0,1% v:v com respeito à solução de vírus quimérico vivo. A solução dequimera / formalina foi incubada a cerca de 18-25°C por cerca de 3 dias.
Outros seis (6) cavados mestiços de um ano de idade, ambosmachos e fêmeas, e soronegativos para o vírus do Nilo Ocidental (WNV) nãoforam vacinados mas usados como controle.Vacinação:
Cavalos receberam 2 χ dose de 1 mL de vacina, intramuscular,administradas 3-4 semanas à parte.
Vírus de desafio:
Vírus do Nilo Ocidental (WNV), 5 Iogi0 PFU/dose de 1 mL,administrado por cavalo pela rota intratecal em 4 semanas após segundavacinação.
Resultados:
<table>table see original document page 20</column></row><table>
Os resultados sorológicos do Exemplo #1 seguem:
Títulos de anticorpo neutralizador de vírus (VN) para WNVem cavalos vacinados com duas doses de YF-WN inativado e uma dose dequimera YF-WN viva (de Acambis, Cambridge, MA)
<table>table see original document page 20</column></row><table>
Valores de título são diluição de número de vezes representando a diluição mais alta desoro na qual redução de placa de 50% é observada em relação ao controle. "Negativo"indica que não foi observada redução de placa; "80" representa uma diluição de 80 vezes,"160" representa uma diluição de 160 vezes, etc., "N/A" é indicado onde não foiadministrada segunda vacinação; "Morto" refere-se aos cavalos.
b Quimera YF-WN inativada por BEI ou por formalina foi em combinação com vacinaPRESTIGE® V + VEE.
Resultados:
Os resultados sorológicos do Exemplo #1 ilustram osresultados inesperados da vacina de quimera de Nilo Ocidental inativada dapresente invenção. É sabido que vírus vivos, tal como quimera YP-WNatenuada viva de Acambis, produzem ambas repostas humorais (resposta deanticorpo) e respostas mediadas por célula. Contudo, é geralmenteconsiderado que vírus inativados apenas produzem respostas humorais. Aqui,YF-WN inativado produz uma resposta humoral alta, como é evidenciado dosdados sorológicos. Conseqüentemente, e inesperadamente, YF-WN inativadodesempenha tão bem quando YF-WN vivo na geração de uma respostahumoral. Em adição às vantagens descritas acima de uso de uma vacinainativada em vez de uma vacina viva, as vantagens das vacinas inativadas dapresente invenção são inesperadas.
Exemplo 2
Planejamento experimental:
Animais: cavalos
Seis (6) cavalos mestiços de um ano de idade, ambos machos efêmeas, e soronegativos para o vírus do Nilo Ocidental (WNV) foramvacinados com uma vacina de combinação contendo os componentes virais davacina PRESTIGE® V+VEE (disponível na Intervet Inc, Millsboro, DE) equimera inativada de Febre Amarela - Nilo Ocidental (YF-WN). A vacinatambém continha um adjuvante de poli(ácido acrílico). Vacina PRESTIGE®V+VEE contém vírus inativado da Encefalomielite Oriental, vírus inativadoda Encefalomielite Ocidental, vírus inativado da EncefalomieliteVenezuelana, vírus inativado do Herpes Eqüino de tipos 1 e 4(Rinopneumonite), vírus inativado da Influenza (cepa Kentucky 1993, cepaKentucky 2002, e New Market-2-93), e frações de toxicóide do tétano.
A quimera YF-WN atenuada viva foi obtida de Acambis emCambridge, MA. O vírus quimérico foi inativado com BEI e adicionado navacina PRESTIGE® V+VEE como descrito acima em Exemplo 1.
Outros seis (6) cavalos mestiços de um ano de idade,, ambosmachos e fêmeas, e soronegativos para o vírus do Nilo Ocidental (WNV) nãoforam vacinados mas usados como controle.
Vacinação
Cavalos receberam 2 χ dose de 1 mL de vacina, intramuscular,administradas 3-4 semanas à parte.
Vírus de desafio
Cavalos foram desafiados pelo posicionamento de 8-17mosquitos infectados com WNV sobre cada cavalo e permitindo que osmosquitos se alimentassem por 10-15 minutos.
Resultados:
<table>table see original document page 22</column></row><table>
Exemplo 3
I. Visão geral experimental
O propósito deste experimento foi estabelecer aimunogenicidade do vírus quimérico inativado do Nilo Ocidental contido emuma vacina de combinação compreendendo os componentes antigênicos davacina PRESTIGE® V+VEE (disponível na Intervet Inc, Millsboro, DE; i.e.,vírus inativado da Encefalomielite Oriental, vírus inativado daEncefalomielite Ocidental, vírus inativado da Encefalomielite Venezuelana,vírus inativado do Herpes Eqüino de tipos 1 e 4 (Rinopneumonite), vírusinativado da Influenza (cepa Kentucky 1993, cepa Kentucky 2002, e NewMarket-2-93), e toxicóide do tétano, todos combinados com um adjuvante depoli(ácido acrílico).Em particular, um propósito deste experimento foi paraestabelecer a não-interferência das outras frações de vacina com o vírus doNilo Ocidental inativado.
Vinte (20) cavalos machos e fêmeas foram vacinados duasvezes pela rota intramuscular (IM) três a quatro semanas à parte com umadose de 1,0 mL de uma vacina de combinação compreendendo vírus inativadoda Encefalomielite Oriental, vírus inativado da Encefalomielite Ocidental,vírus inativado da Encefalomielite Venezuelana, vírus inativado do HerpesEqüino de tipos 1 e 4 (Rinopneumonite), vírus inativado da Influenza (cepaKentucky 1993, cepa Kentucky 2002, e New Market-2-93), e toxicóide dotétano, todos combinados com um adjuvante de poli(ácido acrílico). Dezcavalos adicionais serviram como cavalos de controle não vacinados. 21 Diasapós a 2a vacinação, os cavalos vacinados e não-vacinados de controle foramdesafiados pela rota intratecal com WNV virulento. Dois grupos separados de10 cavalos vacinados e 5 cavalos de controle foram seqüencialmentevacinados e desafiados. Amostras de sangue para avaliação sorológica foramcolhidas antes da vacinação, após a vacinação, e após o desafio e testadas paratítulos de anticorpo neutralizador de vírus (VN) para WNV. Amostras desangue foram colhidas após o desafio para isolamento de WNV. Títulosneurais foram colhidos no momento da necropsia para exame histológico.
Desafio dos cavalos com WNV virulento pela rota IT resultouem sinais de doença neurológica que são consistentes com aqueles observadosem cavalos infectados sob condições naturais de campo. Após desafio,cavalos vacinados mostraram uma redução estatisticamente significativa emsinais clínicos de doença neurológica causada por WNV comparado comcontroles não vacinados e uma redução estatisticamente significativa depresença de vírus em fluidos corporais entre cavalos vacinados e cavalos decontrole. Estes resultados estabeleceram a não-interferência das outras fraçõesde vacina sobre a fração de Quimera de Flavivírus Morta. Dados adicionaisestabeleceram a não-interferência da fração de Quimera de Flavivírus Mortasobre as outras frações de vacina.
II. Materiais e Métodos
A. Animais
Trinta (30) cavalos mestiços e de sexo misto e de seis a novemeses de idade foram usados. Cavalos foram identificados por uma marcaextremamente fria. Foram usados apenas cavalos com títulos de anticorponeutralizador de vírus (VN) de < 5 para WNV conforme determinado por umteste de neutralização de redução de placa de 50%. Cavalos vacinados e decontrole foram alojados juntos em instalações à prova de insetos e de roedoresdurante o período de vacinação e movidos para outra instalação para desafiocom WNV virulento.
B. Vacinas
A vacina continha quimera YF/WN em combinação com vírusda Encefalomielite Oriental (EE), vírus da Encefalomielite Ocidental (WE)5vírus da Encefalomielite Venezuelana (VE), vírus do herpes eqüino de tipo 1(EHV-I), vírus do herpes eqüino de tipo 4 (EHV-4), cepa Kentucky 1993/A2de vírus da influenza eqüina (EIV), cepa Kentucky 2002/A2 de EIV, e cepaNew Market/2/93/A2 de EIV, e frações de toxóide de tétano, a vacinacontinha adjuvante de poli(ácido acrílico).
Duas vacinas foram usadas para demonstrar não-interferência.Uma vacina continha uma dose imunizadora de quimera inativada YF/WN euma dose de liberação padrão dos vírus inativados restantes ou das frações detoxóide de tétano. A outra vacina continha uma dose de liberação padrão dequimera inativada YF/WN e uma dose imunizadora mínima dos vírusinativados restantes ou das frações de toxóide de tétano. Em cada caso, o(s)componente(s) presente(s) na dose de liberação padrão não interferiu com o(s)componente(s) presente(s) no nível de dose imunizadora mínima.
C. VacinaçãoOs cavalos eram de 6 a 9 meses de idade no momento daprimeira vacinação. Cavalos foram aleatoriamente separados em grupos pelouso de um gerador de números aleatórios e aclimatizados por um mínimo desete dias. Vinte cavalos foram vacinados IM no pescoço com duas doses de 1mL da vacina três semanas à parte. Dez cavalos foram usados como controlesnão vacinados. Dois grupos (cada um contendo 10 vacinados e 5 controles)foram seqüencialmente vacinados.
D. Teste cego
Pessoal do projeto que observaram os sinais clínicos erealizaram o teste de laboratório nas amostras clínicas não sabiam qual grupoos cavalos pertenciam.
F. Observações e retirada de amostras após a vacinação
Temperaturas corporais retais foram medidas e reações no sítiode injeção foram observadas nos dias IalO após a vacinação. Temperaturascorporais de > 39,2°C são consideradas uma temperatura elevada. Reações nosítio de injeção foram classificadas de acordo com um método declassificação. Quaisquer observações ou reações sistêmicas de saúde anormalforam registradas. Sangue para soro foi retirado nos dias 0, 7, e 21 dias após avacinação e 21 dias após a segunda vacinação. Títulos de anticorponeutralizador para WNV em amostras de soro foram determinados pelo usode um teste de neutralização de redução de placa de 50%.
G. Desafio de cavalos com WNY virulento
21 Dias após a segunda vacinação, cavalos foram desafiadospor administração IT de 1 mL de cepa NY99 de WNY virulento. Resultadoscinco titulações repetidas do material de desafio foram 5,0, 5,1, 5,1, 5,0, e 5,0para uma média de 5,0 e 5,1, 5,1, 5,0, 5,0, e 5,1 para uma média de 5,1 Iogi0PFU/mL de dose, para grupos de desafio 1 e 2, respectivamente.Temperaturas corporais retais foram registradas nos dias 1 a 21 após odesafio. Desafio de cavalos de controle não vacinados com WNV pela rota ITresultou em sinais clínicos de doença que são observados em cavalosnaturalmente infectados com WNV sob condições de campo. Cavalos foramobservados durante período de pós-desafio de 21 dias para sinais clínicos dedoença neurológica, nas seguintes categorias: mudanças em atividade mental,paresia, fasciculação, e ataxia / recúbito. Para cada categoria, sinais clínicosforam classificados como 0 = nenhum, 1 = muito suave e poderia estar nãonotado, 2 = moderado e 3 = severo.
Sob confirmação de doença clínica severa, foram feitastentativas para matar os animais dentro de 24 horas. Cavalos foramsubmetidos à eutanásia por razões humanitárias devidos aos sinaispersistentes de doença do Nilo Ocidental, ou sinais agudos súbitos juntamentecom recúbito e/ou incapacidade de locomoção sem auxílio como de acordocom Center for Veterinary Biologies Notice No. 04-09, datado de 1 de abrilde 2004. Quaisquer outras observações de saúde anormais foram registradas.Amostras de sangue para sorologia foram retiradas no momento do desafio eem 7, 14, e 21 dias após o desafio. Amostras de sangue para isolamento devírus foram retiradas dias 1 a 10 após o desafio. Sangue para sorologia,isolamento de vírus, e tecidos para histopatologia foi tirado no momento danecropsia. Lesões histopatológicas em tecidos neurais foram classificadascomo 0 - nenhuma, 1 = muito suave / suave, 2 = moderada, e 3 = severa.
III. Resultados
A. Animais e vacinação
Temperaturas corporais de 39,2°C foram registradas para umdia após a primeira vacinação para três cavalos vacinados e para dois diaspara um animal de controle. Temperaturas corporais > 39,2°C não foramregistradas para qualquer cavalo vacinado ou de controle após a segundavacinação. Todos os cavalos estavam com saúde geral boa no início doestudo. Reações no sítio de vacinação foram avaliadas de acordo com ummétodo de classificação (0 (sem reação) a 5 (reação sistêmica)). Após aprimeira vacinação, reações suaves no sítio de injeção, de classificações de 2ou menores, foram registradas em um ou dois dias para três cavalos. Outrocavalo vacinado teve uma reação suave que persistiu durante 10 dias após aprimeira vacinação mas não causou qualquer dor ou resultou em relutânciapara movimento. Reações suaves no sítio de injeção, de classificações de 2 oumenores, também foram observadas após a segunda vacinação que persistiupor 1 a 6 dias após a vacinação. Nenhuma das reações no sítio de injeção apósa primeira ou a segunda vacinação foram observadas como dolorosas. Nãoforam observadas reações sistêmicas em qualquer um dos cavalos após aprimeira ou segunda vacinação.
B. SoroIogia após a vacinação e após o desafio com WNV
Dados sorológicos para cavalos vacinados e de controle sãoresumidos nas seguintes tabelas.
Grupo de vacinados: títulos de anticorpo neutralizador de redução de placa de50% (PRNT50%) para WNV após Ia e 2a vacinações e após desafio.
<table>table see original document page 27</column></row><table>b = Dia 21 é o dia de 2a vacinação,c = Dia 42 é 21 dias após a 2a vacinação e dia de desafioNeg. = Negativo, NS = Sem amostra, submetido à eutanásia
Grupo de controle: títulos de anticorpo neutralizador de redução de placa de50% (PRNT50%) para WNV após Ia e 2a vacinações e após desafio.
<table>table see original document page 28</column></row><table>
a Valores de título são diluição de número de vezes representando a diluição mais alta desoro na qual redução de placa de 50% é observada em relação ao controle.
b = Dia 21 é o dia de 2a vacinação,c = Dia 42 é 21 dias após a 2a vacinação e dia de desafioNeg. = Negativo, NS = Sem amostra, submetido à eutanásia
Todos os cavalos vacinados e de controle foram soronegativospara WNV no momento da vacinação e 7 dias após a primeira vacinação. Afalta de uma resposta anamnésica para WNV em cavalos vacinados após aprimeira vacinação indicou nenhuma exposição prévia ao WNV. Títulos deanticorpo neutralizador de vírus de redução de placa para WNV foramdetectados em um cavalo vacinado após a primeira vacinação e foramdetectados em 14 de 20 cavalos vacinados 21 dias após a segunda vacinação.
Todos os cavalos de controle não vacinados permaneceramsoronegativos durante todo o período de primeira e segunda vacinações. Estesresultados demonstraram que os cavalos de controle não foram expostos aoWNV durante o período de vacinação, que estabelece a validade do estudo.
Níveis altos de anticorpo neutralizador de vírus para WNV foram detectadosem ambos os cavalos vacinados e de controle após desafio.
C. Temperaturas corporais retais e sinais neurológicos em cavalos apósdesafio com WNV virulento
Temperaturas corporais individuais de cavalos após desafioforam observadas. Seis dos 20 cavalos vacinados exibiram temperaturascorporais de > 39,2°C por um ou dois dias individuais após o desafio e trêsdestes seis cavalos vacinados exibiram temperaturas corporais de > 39,2°Cpor dois ou mais dias consecutivos. Sete de 10 cavalos de controle nãovacinados exibiram temperaturas corporais > 39,2°C em qualquer dia apósdesafio e todos os sete destes cavalos de controle exibiram temperaturas >39,2°C por dois ou mais dias consecutivos. Temperaturas após desafio foramcomparadas por uma análise de variância de medidas repetidas usando ummodelo que incluiu os efeitos de tratamento, dias, e a interação de tratamentoe dias. Houve uma diferença significativa (P<0,05) em temperaturas corporaisentre cavalos vacinados e cavalos e controle nos dias 8 a 10 após desafio.
Quatro de 10 cavalos de controle foram submetidos à eutanásia no dia 10 apósdesafio devido à severidade dos sinais clínicos de doença.
Desafio de cavalos de controle não vacinados com WNV pelarota intratecal (IT) resultou em sinais clínicos de doença que estãoconsistentes com aqueles observados em cavalos naturalmente infectados comWNV sob condições de campo. Sinais clínicos que incluíram mudanças ematividade mental, paresia, fasciculação, e ataxia / recúbito também foramobservados. Após desafio, 7 de 10 (70%) cavalos de controle não vacinadosdemonstraram sinais moderados a severos de doença neurológica de WNVpor dois ou mais dias consecutivos ou demonstraram uma condição de saúdetotal severa devido à infecção de WNV de tal modo que eutanásia foiautorizada por razões humanitárias. Cavalos foram submetidos à eutanásia porrações humanitárias devido aos sinais persistentes de doença do NiloOcidental, ou sinais agudos súbitos juntamente com recúbito e/ouincapacidade para locomoção sem auxílio.
A definição de caso de infecção com WNV e resultadoprimário para demonstração de doença causada por WNV foi definida comocavalos possuindo sinais moderados ou severos de doença por dois ou maisdias consecutivos em qualquer uma das categorias de: mudanças em atividademental, paresia, fasciculação, e ataxia / recúbito ou qualquer animal no qualeutanásia foi requerida devido à condição de saúde geral severa do animalcomo um resultado da infecção de WNV. Estes critérios tiveram que sersatisfeitos com o objetivo de o resultado primário ser uma falha; casocontrário, o cavalo foi considerado um sucesso.
Apenas 5 de 20 (25%) dos cavalos vacinados demonstraramsinais moderados ou severos de doença neurológica de WNV por dois diasconsecutivos após desafio ou foram submetidos à eutanásia comparados com7 de 10 (70%) dos cavalos de controle. Análise para o resultado primário foirealizada em SAS com o Procedimento FREQ. Análise da proporção decavalos atendendo à definição de caso mostrou que houve uma diferençasignificativa (P<0,02) entre os cavalos vacinados e de controle. A razão ímparindicou que os cavalos vacinados foram 6 vezes mais propensos para seremprotegidos contra sinais neurológicos de doença de WNV. Uma proporçãoestatisticamente maior (P<0,95) de cavalos de controle foi submetida àeutanásia devido aos sinais de doença de WNV em comparação com oscavalos de controle.
D. Isolamento de vírus do soro após desafio com WNV virulento
Resultados de WNV isolado de soro de cavalos após desafiotambém foram observados. WNV foi recuperado do soro de 6 de 20 cavalosvacinados e de 10 de 10 cavalos de controle nos dias 1 a 4 após desafio.Significativamente (P<0,05) mais controles foram mais virêmicos emcomparação com os cavalos vacinados e os cavalos de controle foramsignificativamente (P<0,01) virêmicos mais dias em comparação com oscavalos vacinados.
E. Histopatologia de tecidos neurais em cavalos vacinados e cavalos decontrole após desafio com WNV virulento
No momento de necropsia, tecido neural de ponte, medula, ehipotálamo / tálamo foram colhidos e analisados para histopatologia devido àencefalite viral. Em geral, houve histopatologia reduzida em cavalosvacinados em comparação com cavalos de controle mas não houve umadiferença estatisticamente significativa.
IV. Conclusão
Desafios de cavalos com WNV virulento pela rota IT resultouem sinais de doença neurológica que estão consistentes com aquelesobservados em cavalos infectados sob condições naturais de campo e estãoconsistentes com doença neurológica observada em estudos com uma vacinamonovalente para WNV. Após desafio, cavalos vacinados mostraram umaredução estatisticamente significativa em sinais clínicos de doençaneurológica causada por WNV em comparação com cavalos de controle nãovacinados e uma redução estatisticamente significativa de presença de vírusem fluidos corporais entre cavalos vacinados e cavalos de controle. Estesresultados atendem aos critérios para demonstração satisfatória daimunogenicidade de fração de Quimera de Flavivírus Morta, Vírus do NiloOcidental contida em uma vacina compreendendo os componentes dePRESTIGE® V+VEE vacina (disponível na Intervet Inc, Millsboro, DE; i.e.,vírus da Encefalomielite Oriental (EE), vírus da encefalomielite ocidental(WE), vírus de encefalomielite venezuelana (VE), vírus do herpes eqüino detipo 1 (EHV-I), vírus do herpes eqüino de tipo 4 (EHV-4), cepa Kentucky1993/A2 de vírus da influenza eqüina (EIV), cepa Kentucky 2002/A2 de EIV5e cepa New Market/2/93/A2 de EIV, e frações de toxóide de tétano. Estesresultados estabeleceram a não-interferência de outras frações de vacina sobrea fração de Quimera de Flavivírus Morta.
Embora a invenção tenha sido descrita em conexão commodalidades específicas e seus exemplos, será entendido que ela é capaz deoutras modificações e as reivindicações apendidas são intencionadas paracobrirem quaisquer variações, usos, ou adaptações da invenção seguindo, emgeral, os princípios da invenção e incluindo tais desvios da presente descriçãocomo provenientes dentro do conhecimento ou da prática costumeiros dentroda técnica à qual a invenção pertence e como pode ser aplicado àscaracterísticas essenciais descritas aqui acima sejam quer agora existentesquer posteriormente ocorrentes. Além disso, embora as modalidades dainvenção tenham sido descritas com características dimensionais e/oumedições e/ou componentes específicos, será entendido que as modalidadessão capazes de características dimensionais e/ou medições e/ou componentesdiferentes sem se desviarem dos princípios da invenção e as reivindicaçõesapendidas são intencionadas para cobrirem tais diferenças. Ainda mais, todasas patentes, publicações impressas, e semelhantes aqui mencionadas são pormeio desta aqui incorporadas como referências.

Claims (20)

1. Flavivírus quimérico inativado, caracterizado pelo fato decompreender um primeiro flavivírus no qual as seqüências de nucleotídeoscodificadoras das proteínas de pré-membrana e de envelope são substituídaspor seqüências de nucleotídeos codificadoras de proteínas de pré-membrana ede envelope de um segundo flavivírus.
2. Flavivírus quimérico inativado de acordo com areivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro flavivírus é vírus dafebre amarela.
3. Flavivírus quimérico inativado de acordo com areivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o vírus da febre amarela éderivado da cepa 17D.
4. Flavivírus quimérico inativado de acordo com areivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o vírus quimérico compreendeuma seqüência de sinal na terminação de aminoácido da proteína de pré-membrana, e a seqüência de sinal é aquela do vírus da febre amarela.
5. Flavivírus quimérico inativado de acordo com areivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o segundo flavivírus é vírus doNilo Ocidental.
6. Composição imunogênica, caracterizado pelo fato decompreender o vírus quimérico inativado como definido na reivindicação 1.
7. Flavivírus quimérico inativado de acordo com areivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o vírus quimérico inativadoestá presente em uma concentração variando entre IO2 e IO8 unidadesformadoras de placa (pfu).
8. Vacina, caracterizada pelo fato de compreender o vírusquimérico inativado como definido na reivindicação 1.
9. Vacina de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelofato de que o vírus quimérico inativado está presente em uma concentraçãovariando entre 10 e 10 unidades formadoras de placa (pfu).
10. Método de prevenção ou de tratamento de uma infecçãopor flavivírus em um animal, caracterizado pelo fato de compreenderadministrar ao animal um flavivírus quimérico inativado compreendendo umprimeiro flavivírus no qual as seqüências de nucleotídeos codificadoras dasproteínas de pré-membrana e de envelope são substituídas por seqüências denucleotídeos codificadoras de proteínas de pré-membrana e de envelope deum segundo flavivírus.
11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelo fato de que o primeiro flavivírus é vírus da febre amarela.
12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que o vírus da febre amarela é derivado da cepa 17D.
13. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelo fato de que o segundo flavivírus é vírus do Nilo Ocidental.
14. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelo fato de que o flavivírus quimérico é administrado em uma dose variandoentre IO2 e IO8 unidades formadoras de placa (pfu).
15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que o flavivírus quimérico é administrado em uma dose variandoentre IO6 e IO7 pfu.
16. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelo fato de que o flavivírus quimérico inativado é administrado por uma rotasubcutânea, intramuscular, submucosal, mucosal, ou intradermal.
17. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelo fato de que o flavivírus quimérico inativado é oralmente administrado.
18. Vacina de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelofato de adicionalmente compreenderi) um ou mais vírus vivos modificados;ii) um ou mais vírus inativados; ouiii) um ou mais antígenos bacterianos.
19. Vacina de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelofato de adicionalmente compreender um ou mais de vírus inativado deencefalomielite oriental, vírus inativado de encefalomielite ocidental, vírusinativado de encefalomielite venezuelana, vírus do herpes eqüino inativado detipo 1, vírus do herpes eqüino inativado de tipo 4, cepa KY93/A2 do vírus dainfluenza eqüina inativo, cepa KY02/A2 do vírus da influenza eqüina inativo,cepa NM/2/93/A2 do vírus da influenza eqüina inativo e uma fração detoxóide de tétano.
20. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelo fato de que o flavivírus quimérico inativo está presente em uma vacinaque também inclui um ou mais de vírus inativado de encefalomielite oriental,vírus inativado de encefalomielite ocidental, vírus inativado deencefalomielite venezuelana, vírus do herpes eqüino inativado de tipo 1, vírusdo herpes eqüino inativado de tipo 4, cepa KY93/A2 do vírus da influenzaeqüina inativo, cepa KY02/A2 do vírus da influenza eqüina inativo, cepaNM/2/93/A2 do vírus da influenza eqüina inativo e uma fração de toxóide detétano.
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