MX2007016083A - Vacunas quimericas inactivadas y metodos relacionados de uso. - Google Patents

Abstract

Las modalidades de la presente invencion generalmente proporcionan una vacuna para virus quimerica inactivada y/o composicion inmunogenica para el tratamiento o prevencion de infeccion viral. Ademas, varias otras modalidades de la presente invencion generalmente se refieren a metodos de prevencion y tratamiento de infeccion viral en los animales con vacuna inactivada y/o composicion inmunogenica. Otras modalidades comprenden metodos de preparacion de una vacuna o composicion inmunogenica para el tratamiento o prevencion de infeccion viral en estos animales.

Description

VACUNAS QUIMÉRICAS INACTIVADAS Y MÉTODOS RELACIONADOS DE USO Campo de la Invención Esta invención se refiere a nuevos y mejorados métodos de prevenir y tratar flavivirus y otra infección viral estrechamente relacionada en animales. Antecedentes de la Invención Los flavivirus son virus de ARN de cepa positiva, pequeños, encapsulados que competen al ámbito médico y veterinario a través del mundo. El virus West Nile (WN, o WNV), por ejemplo, el cual es un miembro de la familia del flavivirus, es el agente causante de la encefalitis de WN, una enfermedad viral transmitida por el artrópodo, infecciosa, no-contagiosa, (In Virology, Fields (ed.), Raven-Lippincott, New York, 1996, pp. 961- 1034). El virus se ha encontrado en África, Asia Occidental, Medio Oriente, Región Mediterránea de Europa, y, recientemente, en Estados Unidos. Los mosquitos quedan infectados con el virus después de alimentarse de aves salvajes infectadas, y después transmiten el virus a través de mordeduras a humanos, aves, y animales, tales como caballos, ovejas, ganado, y cerdos. El virus West Nile es una enfermedad infecciosa que emerge. El virus West Nile primero fue aislado en Uganda en 1937. Ahora, se encuentra más comúnmente en África, Asia del Este, Europa, y Medio Oriente. Sin embargo, hizo su primera aparición reconocida en los Estados Unidos en 1999. Por 2004, el virus había sido encontrado en aves y mosquitos en cada estado excepto en Alaska y Hawaii. Otras enfermedades bien conocidas causadas por el flavivirus incluyen fiebre amarilla, encefalitis japonesa, dengue, y encefalitis de Saint Louis. Las infecciones de Flavivirus son transmitidas comúnmente por garrapatas y/o mosquitos. Los hospedadores primarios de West Nile son solamente mosquitos y pájaros. Otras especies de animales, tales como humanos, y animales, tales como caballos, ovejas, ganado, y cerdos, y similares se piensan que son únicamente hospedadores incidentales que quedan infectados cuando un mosquito hembra infectado muerde al hospedador incidental. La gente que contrae el virus West Nile usualmente experimenta síntomas leves que incluyen fiebre, dolor de cabeza, dolor de cuerpo, erupción cutánea, y glándulas linfáticas inflamadas. Si el virus entra al cerebro, sin embargo, éste puede causar encefalitis o meningitis que amenaza la vida. Los casos que amenazan la vida principalmente ocurren en los ancianos. Los estudios recientes han mostrado que el West Nile puede ser transmitido a través de trasplantes de órganos y transfusiones de sangre. Algunos expertos de la salud también creen que es posible que el virus West Nile es transmitido desde una madre a un niño aún no nacido de ella, y a través de la leche materna. Hay muchos proyectos de desarrollo para los métodos de vacunas del virus West Nile que incluyen, vacunas vivas quiméricas (que combinan genes de más de un virus en una sola vacuna), vacunas de ADN desprotegidas, y vacunas que contienen cocteles de proteínas individuales West Nile , y similares. Sin embargo, no hay un método que haga uso de una vacuna quimérica inactivada. Las proteínas de Flavivirus son producidas por la traducción de un solo, marco de lectura abierto, para generar una poliproteína, que experimenta una serie compleja de divisiones proteolíticas postraducción por una combinación del hospedador y proteasas virales que generan las proteínas virales maduras. El virus de las proteínas estructurales son acomodadas en la poliproteína en la orden C-prM-E, donde "C", es capside, "prM" es un precursor de la proteína de enlace-M (membrana) encapsulada viral, y "E" es la proteína encapsulada. Estas proteínas están presentes en la región N-terminal de la poliproteína, mientras que las proteínas no estructurales (NSI, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, y NS5) están localizadas en la región C-terminal del polipéptido. En 2003, las pruebas clínicas humanas de un West Nile vivo, virus atenuado de la vacuna fue comenzada por Acambis (Cambridge, MA). El Acambis vivo, vacuna atenuada, está basado en una vacuna ya usada para prevenir la fiebre amarilla, una enfermedad causada por un diferente flavivirus. Una vacuna atenuada, viva de Acambis contiene genes de dos diferentes virus, fiebre amarilla y West Nile, y es un ejemplo de un virus quimérico. Esta vacuna atenuada, viva de Acambis comprende un virus de la Fiebre Amarilla con unos pocos genes sustituidos con genes para las proteínas superficiales del virus West Nile. Los detalles de elaborar esta vacuna viva, atenuada, quimérica de Acambis, se proporcionan, por ejemplo, en la Patente Norteamericana No. 6.962.708 y 6.696.281 y Chambers y colaboradores, J. Virol. 73:3095-3101, 1999, que son cada uno incorporados por referencia en la presente en su totalidad. Los métodos adicionales de uso y diagnósticos para la vacuna viva Acamb'is atenuada quimérica, son proporcionados en la Patente Norteamericana No. 6.682.883 y 6.878.372, las cuales están incorporadas por referencia en la presente en su totalidad. Los resultados de tales vacunas vivas atenuadas, se han probado con éxito y las pruebas continúan. Sin embargo, ciertos riesgos pueden acompañar el uso de una vacuna de virus vivo atenuado. Estos riesgos son aún más pronunciados para sujetos inmunocomprometidos, los sujetos mayores, sujetos embarazados, y otros sujetos con un sistema inmune debilitado o estresado. Con mucha frecuencia, las vacunas del virus vivo atenuado, han mostrado que son cualquier atenuado bajo (causa de la enfermedad) atenuado alto (falla al inmunizar). Es también posible para una vacuna del virus vivo atenuada óptimamente, revertir en una forma virulenta (que causa enfermedad) a través de la mutación. Sin embargo, deberá observarse que el YF-WN de Acambis no ha demostrado una indicación de reversión a la virulencia. Hay preocupaciones adicionales con las vacunas vivas atenuadas. Por ejemplo, los virus vivos del Dengue son también sensibles al calor, haciéndolo difícil y costoso mantener la vacuna en países tropicales y subtropicales en donde la vacuna puede ser necesitada por la mayoría. Por consiguiente, una vacuna es necesaria en la técnica para el tratamiento y/o prevención de infecciones de flavivirus, tales como West Nile, en sujetos con éstos u otros riesgos similares. Particularmente para los que están más inmunocomprometidos u otros sujetos más en riesgo. Sin embargo, el estado de la técnica es que una vacuna de virus quimérico inactivado es indeseable y no sería efectivo. La Patente Norteamericana No. 6.432.411 describe que los esfuerzos de hacer vacunas de flavivirus inactivadas han cumplido con éxito limitado. Principalmente los estudios fueron limitados por la incapacidad de obtener rendimientos de virus adecuados del sistema de cultivo de la célula. Los rendimientos del virus de las células de insecto están generalmente en el intervalo de 104 a 105 pfu/ml, muy debajo de los niveles necesarios para generar una vacuna inactivada rentable. Los rendimientos de células mamíferas incluyendo LLC-MK2 y células Vero fueron más altas, pero los rendimientos pico, aproximadamente 108 pfu/ml de una línea celular Vero única, siguen siendo más bajos que los necesarios para alcanzar un costo verdaderamente efectivo del producto de la vacuna. Por consiguiente, la técnica se muestra lejos del uso de flavivirus inactivados, como candidatos de vacuna viables. Por otra parte, no hay enseñanza de una vacuna quimérica inactivada para tratar o prevenir cualquier infección de flavivirus. Breve Descripción de la Invención Las varias modalidades de la presente invención comprenden una composición inmunogénica o vacuna para el tratamiento o prevención de la infección de flavivirus en un animal. La invención también proporciona métodos para prevenir o tratar infecciones de flavivirus en animales susceptibles, que implican administrar a los sujetos flavivirus quiméricos inactivados. La invención también proporciona el uso de flaviviruses quiméricos inactivados en la preparación de medicamentos para el uso en tales métodos y vacunas y/o composiciones inmunogénicas. Eñ una modalidad de la invención, los flaviviruses quiméricos inactivados pueden incluir, por ejemplo, capside y proteínas no estructurales de un primer flavivirus, y el prM y proteínas encapsuladas de un segundo flavivirus. En una modalidad, la presente invención se refiere a un flavivirus quimérico inactivado, que comprende un primer flavivirus en el cual las secuencias del nucleótido codifican la pre-membrana y las proteínas encapsuladas son sustituidas por las secuencias del nucleótido que codifican la pre-membrana y las proteínas encapsuladas de un segundo flavivirus. El primer flavivirus puede ser un virus de fiebre amarilla, que incluye el virus de fiebre amarilla derivado de la cepa 17D. El virus quimérico puede comprender una secuencia señal en el término del aminoácido de la proteína de la pre-membrana, y la secuencia señal puede ser la del virus de fiebre amarilla. El segundo flavivirus puede ser un virus West Nile . En otra modalidad, la presente invención se refiere a una composición inmunogénica que comprende un flavivirus quimérico iriactivado, que comprende un primer flavivirus en' el cual las secuencias del nucleótido que codifican las proteínas encapsuladas y la pre-membrana, son sustituidas con las secuencias del nucleótido que codifican las proteínas encapsuladas y pre-membrana de un segundo flavivirus. En otra modalidad, la presente invención se refiere a una vacuna que comprende un flavivirus quimérico inactivado, que comprende un primer flavivirus en el cual las secuencias del nucleótido que codifican las proteínas encapsuladas y pre-membrana son sustituidas con las secuencias del nucleótido que codifican a las proteínas encapsuladas y pre-membrana de un segundo flavivirus. La vacuna puede además comprender i) uno o más virus vivos modificados; ii) uno o más virus inactivados; o iii) uno o más antígenos bacterianos. La vacuna puede además comprender uno o más virus de encefalomielitis del Este, virus de encefalomielitis de Oeste inactivado, virus de encefalomielitis Venezolano, virus de herpes equino inactivado tipo 1, virus de herpes equino inactivado tipo 4, virus de influenza equina inactivado cepa Kentucky 1993/A2, virus de influenza equina inactivado equina cepa Kentucky 2002/A2, virus de influenza equina inactivado cepa New Market/2/93/A2 y una fracción toxoide de tétanos. En otra modalidad, la presente invención se refiere a un método de prevenir o tratar una infección de flavivirus en un animal, el método comprende administrar al animal un flavivirus quimérico inactivado (o composición o vacuna inmunogénica de la misma) que comprende un primer flavivirus en el cual las secuencias del nucleótido que codifican las proteínas encapsuladas y pre-membrana son sustituidas con las secuencias del nucleótido que codifican las proteínas encapsuladas y pre-membrana de un segundo flavivirus. El primer flavivirus puede ser un virus de fiebre amarilla. El virus de fiebre amarilla puede ser derivado de la cepa 17D. El segundo flavivirus puede ser un virus West Nile . En cualquiera de las modalidades de la presente invención, el virus quimérico inactivado puede estar presente en una concentración que tiene un intervalo entre 102 y 108 unidades de la placa de formación (pfu). Alternativamente, el flavivirus quimérico puede administrarse en una dosis que tiene un intervalo entre 106 y 107 pfu. Alternativamente, el flavivirus quimérico puede administrarse en una dosis que tiene un intervalo entre 1-10 con relación a las unidades de dosis de antígeno. En cualquiera de las modalidades de la presente invención, el virus quimérico ¡nactivado puede ser administrado por una ruta subcutánea, intramuscular, submucosal, mucosal, o intradérmica. En una modalidad de la presente invención, el flavivirus quimérico inactivado es administrado oralmente. Otras características y ventajas de la invención serán evidentes de la siguiente descripción. Descripción Detallada de la Invención Según lo utilizado en la presente, el término "vacuna (s)" significa y se refiere a un producto, cuya administración es deseada para producir una respuesta (s) inmune que pueda prevenir y/o disminuir la severidad de una o más enfermedades infecciosas. Las vacunas pueden incluir uno o más de lo siguiente: una preparación inactivada o atenuada viva de las bacterias, virus o parásitos, organismos completos inactivados (muertos), células irradiadas vivas, fracciones de ¡nmunogenes crudos o purificados, que incluyen los derivados del ADN recombinante en una célula hospedadora, conjugaciones formadas por la ligadura covalente de los componentes, antígenos sintéticos, polinucleótidos (tales como vacunas plasmídicas de ADN), que viven en células vectorizadas que expresan inmunogenes heterólogos específicos, o células pulsadas con inmunogen. Según lo utilizado en la presente, el "virus quimérico" se refiere a un virus que tiene un genoma que contiene secuencias de dos o más diferentes virus, que incluyen diferentes cepas virales. A menos que esté indicado de otra manera, la "quimera" se refiere a un virus quimérico. Un ejemplo no limitante de un virus quimérico es la quimera YFAVN, que es un flavivirus quimérico. Según lo utilizado en la presente, el "flavivirus quimérico" se refiere a un virus que tiene un genoma que contiene secuencias desde dos o más flavivirus diferentes, que ¡ncluyen diferentes cepas de flavivirus. Según lo descrito arriba, un ejemplo no limitante de un flavivirus quimérico es la quimera YFAVN. Según lo utilizado en la presente, el "virus quimérico West Nile ", "quimera West Nile " y "quimera YFAVN" se refieren a un quimérico vivo, virus atenuado, que comprende la cepa de la vacuna 17D del virus de la fiebre amarilla (YFV) en la cual las secuencias del nucleótido que codifican la pre-membrana (prM) y las proteínas encapsuladas (E) son sustituidas por las secuencias del nucleótido que codifican el prM y las proteínas E del virus West Nile (WNV), de modo que las proteínas prM y E del virus West Nile son expresadas, y la proteína capside del virus quimérico es del virus de la fiebre amarilla. El experto en la técnica apreciará fácilmente que los flavivirus quiméricos que comprenden componentes del virus de la fiebre amarilla y del virus West Nile pueden hacerse además del flavivirus quimérico específico descrito en este párrafo. El virus quimérico West Nile (o, virus YF/WN) puede hacerse ¡nactivado usando técnicas bien conocidas para los expertos en la técnica. Por ejemplo, el virus quimérico West Nile (o, virus YFAVN) puede ser inactivado con agentes químicos inactivos u otros medios físicos tales como calor. Los ejemplos no limitantes de los agentes químicos inactivos incluyen etilenimina binaria (BEI) o formalina (una solución al 37 % de formaldehído). El virus vivo puede inactivarse usando BEI primero mezclando el polvo de etilenimina binaria (BEA) con una solución de hidróxido de sodio. Después de que BEI es generado en el ambiente básico, la solución BEI es agregada a una solución que contiene el virus vivo para dar una concentración final de BEI de 0.5 mM a 10 mM. Esta solución puede entonces incubarse desde 4-37°C por 24-96 horas. El tiosulfato de sodio puede entonces agregarse después de que el virus es inactivado para neutralizar cualquier BEI restante. El virus vivo puede también hacerse inactivado con formalina (solución al 37 % de formaldehído). Aquí, la formalina es agregada a una solución que contiene el virus vivo para dar una concentración final de formalina de 0.05-2 % v:v (solución viral de: formalina). Esta solución puede entonces incubarse desde 4-37°C por 24-96 horas. Según lo utilizado en la presente, el término "antígeno" significa y se refiere a un virus, una bacteria, partes de un virus o bacterias o una proteína extranjera que actúa para estimular el sistema inmune en un animal. El sistema inmune puede estimularse para hacer que las células de sangre blanca ataquen y destruyan el antígeno o para producir una molécula de la proteína, que une al antígeno y que mata al antígeno o lo hace inactivo. Según lo utilizado en la presente, el término "anticuerpo " significa y se refiere a una molécula que contiene proteínas que un sistema inmune animal hace reaccionar con un antígeno para hacerlo inactivo. Según lo utilizado en la presente, el término "animal" significa y se refiere a animales humanos y no humanos. Según lo utilizado en la presente, el término "cepa de vacuna" significa y se refiere a una cepa viral conveniente para el uso en una composición o vacuna inmunogénica. Una "cepa de vacuna" puede comprender, pero no necesariamente limitarse a, una cepa no patógena o cepa relativamente no patógena, una cepa muerta, y/o una cepa atenuada. Según lo utilizado en la presente, el término "liofilizar" y las conjugaciones del mismo, significan y se refieren a la liofilización. Como es utilizado en la presente, el término "origen animal" significa y se refiere a animales de origen. Asimismo, el término "origen no animal" significa y se refiere a no directamente o indirectamente de anímales de origen. Según lo utilizado en la presente, el término "estabilizar," y las conjugaciones del mismo, significa y se refiere a hacer o mantener estable, firme, inalterable y a mantenerse en aproximadamente un nivel sustancialmente influctuante o dado, con respecto a una calidad dada o sustancialmente influctuante y con una cantidad dada o sustancialmente influctuante. Sin embargo, se entiende que puede encontrarse cierta fluctuación en el nivel, calidad, y/o cantidad de la composición estabilizada. Las modalidades de la presente invención se desean para comprender estabilizadores que permiten tales fluctuaciones. Sin limitación, los estabilizadores incluyen estabilizadores secos, estabilizadores a granel, crioprotectantes, termo-estabilizadores, osmoprotectantes, protectantes de desecación, y similares. Tales términos están significados específicamente para ser incluidos dentro de los estabilizadores de la presente invención. Según lo utilizado en la presente, el término "proteína" significa y se refiere a una cadena molecular de aminoácidos. Una proteína no es de una longitud específica y puede, si es requerido, ser modificado in vivo o in vitro, por, por ejemplo glicosilación, amidación, carboxilacíón o fosforilación. Entre otros, los péptidos, oligopéptidos y polipéptidos son incluidos dentro de la definición de la proteína. Una proteína o un péptido puede ser de origen biológico y/o sintético. Como es utilizado en la presente, el término "ácido nucleico" significa y se refiere a una cadena molecular de ácidos ribonucleicos o de ácidos deoxiribonucleicos. Un ácido nucleico no es de una longitud específica, por lo tanto los polinucleótidos, genes, marcos abiertos de lectura (ORF's), pruebas, cebadores, ligadores, espaciadores y adaptadores son incluidos dentro de la definición. Un ácido nucleico puede ser de origen biológico y/o sintético. El ácido nucleico puede ser en una cadena sola o bicatenarío. La cadena sola puede ser en el sentido o contra el sentido de orientación. También incluido dentro de la definición están los ARNs o ADNs modificados. Las modificaciones en las bases del ácido nucleico pueden ser hechas, y las bases tales como inosina pueden incorporarse. Otras modificaciones pueden implicar, por ejemplo, modificaciones de la espina dorsal. Como es utilizado en la presente, un portador farmacéuticamente aceptable se entiende para ser un compuesto que no afecta adversamente la salud del animal u organismo que es vacunado, por lo menos no hasta el punto en que el efecto adverso es peor que los efectos considerados cuando el animal no es vacunado. Los ejemplos no limitantes de portadores farmacéuticamente aceptables incluyen agua estéril o una solución de sal fisiológica estéril. En una forma más compleja el portador puede ser un tampón. Según lo utilizado en la presente, el término "carbohidrato" significa y se refiere a mono-, di-, oligo-, y a polisacáridos. Según lo utilizado en la presente, el término "felino" significa y se refiere a cualquier animal de o que pertenece al género Felis, o familia Felidae, familia del gato, por ejemplo, no limitado a, un gato, un león, un tigre, un león de montaña, un puma, un jaguar, un gato montes, un ocelote y similares. Como es utilizado en la presente, el término "canino" significa y se refiere a cualquier animal de o que pertenece al género Canis, a la familia del perro, por ejemplo, pero no limitado a, un perro, lobo, y similares. Según lo utilizado en la presente, el término "equino" significa y se refiere a cualquier animal de o que pertenece al género Equis, o familia Équidos, familia del caballo, por ejemplo, pero no limitado a, un caballo, muía, burro, cebra, y similares. La presente invención se refiere generalmente a composiciones para y métodos de prevenir y tratar la infección de flavivirus en animales. Los métodos de la invención implican la vacunación de los animales que están en riesgo de desarrollar o tener infección de flavivirus con un flavivirus quimérico inactivado. Otros aspectos de la invención se refieren a los métodos de preparar una vacuna o una composición inmunogénica que comprende un flavivirus quimérico inactivado para el tratamiento o prevención de la infección de flavivirus en animales.

El experto en la técnica apreciará fácilmente, sin embargo, que hay otros flavivirus bien caracterizados y virus estrechamente relacionados con los flavivirus que pueden tratarse, o evitar el uso de virus quiméricos inactivados descritos por la presente -invención. Por lo tanto, la invención también se refiere a los virus quiméricos inactivados para tratar o prevenir enfermedades o padecimientos asociadas con o causadas por los virus de la familia Flaviviridae o Togaviridae. Los ejemplos no limitantes de géneros de virus que caen dentro de estas familias incluyen virus que pertenecen a los géneros Flavivirus, Pestivirus, Hepacivirus o Alfavirus. Los ejemplos no limitantes de los virus o enfermedades causadas por los virus que pertenecen a estas familias o géneros incluyen virus de encefalitis, Encefalitis Equina del Este, Encefalitis Equina del Oeste, Encefalitis Equina de Venezuela, Kunjin, Encefalitis del Valle de Murray, virus del mal de Louping, Encefalitis Japonesa, Dengue (serotipos 1-4), Fiebre Amaplla, encefalitis del Valle de Murray, encefalitis de St. Louis, encefalitis de Roció, Wesselsbron, virus de llheus; flavivirus vector garra patas tales como encefalitis de Europea Central, encefalitis Siberiana, encefalitis Rusa de Primavera-Verano, enfermedad de la selva de Kyasanur, fiebre Hemorrágica Omsk, Powassan, Negishi, Absettarov, Hansalova, Apoi, y virus Hypr; así como virus del género de Hepacivirus (por ejemplo, virus de la Hepatitis C). Los virus adicionales que pueden tratarse o prevenirse usando virus quiméricos inactivados de la presente invención incluyen los que pertenecen al género de Pestívirus (por ejemplo, virus de la diarrea de Bovinos), y otros virus, tales como virus de Lassa, Ebola, y Marburg u otros virus de ARN con una construcción genómica que sería compatible con la incorporación en la quimera. La infección por cualquiera de los virus arriba descritos (o de tal modo causada por las enfermedades) puede prevenirse o tratarse con los virus quiméricos inactivados descritos en la presente. En particular, con los virus quiméricos inactivados que comprenden un primer virus en el cual una o más proteína estructural (o proteínas) del primer virus se ha sustituido por una proteína estructural correspondiente (o proteínas) de un segundo virus contra el cual se busca la protección o tratamiento. Un aspecto preferido de la invención se refiere a los flavivirus quiméricos ¡nactivados, métodos de hacer flavivirus quiméricos inactivados, vacunas que' comprenden flavivirus quiméricos inactivados, y métodos para usar tales vacunas. Este aspecto de la invención se refiere a los flavivirus quiméricos inactivados que comprenden un flavivirus en el cual una o más proteínas estructurales de un primer flavivirus se han sustituido con una o más proteínas estructurales correspondientes de un segundo flavivirus, en donde se busca la inmunidad. En una modalidad de la presente invención, las quimeras consisten en la espina dorsal de un primer flavivirus en el cual los prM y las proteínas E se han sustituido con el prM y las proteínas E de un segundo flavivirus. Los virus quiméricos inactivados que se utilizan en la invención pueden consistir de cualquier combinación de virus, a condición de que, como se menciona arriba, el virus en donde se desea la inmunidad sea la fuente de la proteína (s) estructural insertada. Por ejemplo, para vacunar un animal, tal como un caballo, contra la infección del virus West Nile, puede usarse un flavivirus quimérico que consiste de un flavivirus de espina dorsal, de modo que el virus de fiebre amarilla (YF), en el cual las proteínas estructurales del virus West Nile , tales como prM y proteínas E, son insertadas. En esta quimera, las proteínas YF prM y E son sustituidas con las de WN. Similarmente, si la inmunidad contra el virus de la encefalitis Japonesa (JE) es deseada, entonces el prM y las proteínas E del virus JE pueden insertarse en un flavivírus de espina dorsal, tal como un virus de fiebre amarilla, en' lugar de las proteínas de espina dorsal correspondientes. Otros flavivirus que causan la enfermedad en caballos, y para los cuales los virus quiméricos pueden utilizarse para inducir la protección, incluyen Kunjin, encefalitis del Valle de Murray, y los virus del mal de Louping. En todas las modalidades de la presente invención, el virus quimérico es después inactivado. Los ejemplos de los animales que pueden ser vacunados y/o tratados con los virus quiméricos inactivados de la presente invención comprenden humanos, caballos, cerdos, ovejas, ganados, animales domésticos, tales como gatos y perros, y pájaros domésticos. Sin embargo, en general cualquier animal susceptible a la infección del flavivirus para el cual se busca la protección puede ser vacunado. Así, los ejemplos no limitantes de flavivirus que pueden utilizarse en la invención, como fuentes de virus de la espina dorsal o injertos de la proteína estructural, incluyen flavivirus transmitidos por mosquito, tales como encefalitis Japonesa, Dengue (serotipos 1-4), Fiebre Amarilla, encefalitis del Valle de Murray, encefalitis de St. Louis, West Nile , Kunjin, encefalitis de Roció, Wesselsbron, y virus de llheus; flavivirus vector garrapatas, tales como encefalitis Europea Central, encefalitis Siberiana, encefalitis Rusa de Primavera-Verano, fiebre de la enfermedad de la selva de Kyasanur, fiebre Hemorrágica Omsk, mal de Louping, Powassan, Negishi, Absettarov, Hansalova, Apoi, y virus Hypr; así como los virus del género Hepacivirus (por • ejemplo, virus de la Hepatitis C). Los virus adicionales que pueden utilizarse como la fuente de proteínas estructurales insertadas incluyen virus del género Pestivirus (por ejemplo, virus de la diarrea bovina), y otros virus, tales como virus de Lassa, Ebola, y Marburg. En general, como se describe en la Patente Norteamericana No. 6.962.708 y 6.696.281, en una modalidad para la prevención o tratamiento de la infección de flavivirus West Nile, tales métodos implican sustituir genes que codifican dos proteínas estructurales [prM y E] del virus de la vacuna 17D de fiebre amarilla con los genes correspondientes del virus West Nile y que inactiva el virus quimérico. El virión inactivado resultante tiene el encapsulado West Nile , que contiene las estructuras implicadas en la unión de la célula-virus e internalización de la unión, todos los determinantes antigénicos para la neutralización, y epitope (s) para los linfocitos T citotóxicos. La proteína nucleocapside (C), proteínas no estructurales, y el responsable terminal no trasladado por la respuesta del virus que permanece en los virus 17D de la Fiebre Amarilla original. Uno modalidad preferida de la presente invención se refiere a una vacuna quimérica inactivada y/o a una composición inmunogénica para el tratamiento o prevención de la infección West Nile, en un animal susceptible a la infección de West Nile. Se proporcionan los detalles para hacer virus quiméricos que incluyen un virus quimérico WN/YF que puede después hacerse inactivado y utilizado en varias modalidades de la invención, por ejemplo, en las Patentes Norteamericanas No. 6.962.708 y 6.696.281 y Chambers y colaboradores, J. Virol. 73:3095-3101, 1999, que están todas incorporadas por referencia en su totalidad en la presente. Las Patentes Norteamericanas No. 6.962.708 y 6.696.281 son limitadas, no obstante, los virus vivos quiméricos atenuados, vacunas y métodos de uso relacionados. No hay enseñanza o sugerencia de usar un virus quimérico inactivado, uso de un virus quimérico inactivado en una vacuna, o uso de un virus quimérico inactivado en cualquier método relacionado. En contraste con estas patentes, todas las modalidades de la presente invención se refieren a los virus quiméricos inactivados.

Las composiciones inmunogénicas y vacunas de acuerdo a varias modalidades de la presente invención pueden prepararse y/o marcarse en forma de una suspensión líquida, congelada o en forma liofilizada. Normalmente, las vacunas y/o composiciones inmunogénicas preparadas de acuerdo a la presente invención contienen un portador o un diluyente farmacéuticamente aceptable usado comúnmente para tales composiciones. Los portadores ¡ncluyen, pero no se limitan a, estabilizadores, preservativos y tampones. Los estabilizadores convenientes son, por ejemplo SPGA, composiciones Tween (por ejemplo están disponible de A.G. Scientific, Inc., San Diego, CA), carbohidratos (tales como sorbitol, manitol, almidón, sucrosa, dextran, glutamato o glucosa), proteínas (tales como suero, albúmina o caseína, suero'de leche en polvo) o productos de degradación de los mismos. Los ejemplos no limitantes de tampones convenientes incluyen fosfatos alcalinos-metálicos. Los preservativos convenientes son timerosal, mertiolate y gentamicina. Los diluyentes ¡ncluyen agua, tampón acuoso (tal como tampón salino), alcoholes y polioles (tales como glicerol). Si es deseado, las vacunas inactivadas de acuerdo a la invención pueden contener un adyuvante. Los compuestos o composiciones convenientes para este propósito incluyen HAVLOGEN® (un adyuvante de ácido acrílico basado en polímero, Intervet Inc., Millsboro, DE), ácidos poliacrílicos, hidróxido de aluminio, fosfato u óxido, emulsión basada en aceite en agua o agua en aceite, tal como BAYOL™ o MARCOL™ (Esso Imperial Oil Limited, Canadá), o un aceite vegetal tal como acetato de vitamina E, y saponinas. Sin embargo, los componentes con actividad adyuvante son extensamente conocidos y, generalmente, cualquier adyuvante puede utilizarse para que no interfiera con la eficacia o seguridad de la composición inmunogénica y/o vacuna. Generalmente, la vacuna puede administrarse subcutáneamente, intradérmicamente, submucosalmente, o intramuscularmente en una cantidad eficaz para prevenir la infección de flavivirus de interés y/o tratar una infección de flavivirus. Una cantidad eficaz es definida como una cantidad de inmunización de material quimérico inactivado que inducirá la inmunidad en los animales vacunados, contra el desafío de un virus virulento. En otras varias modalidades, una cantidad eficaz inducirá inmunidad en los animales vacunados o su progenie, contra el desafío por un virus virulento. La inmunidad es definida en la presente como la inducción de un nivel más alto significativo de protección en una población de animales después de la vacunación comparada a un grupo sin vacunar. Además, en varias formulaciones de vacunas inactivadas y/o composiciones inmunogénicas de la presente invención, los excipientes convenientes, estabilizadores y similares pueden agregarse. El virus quimérico inactivado puede formularse como solución acuosa estéril que contiene entre 102 y 1012 unidades infecciosas (según lo determinado antes de la inactivación). En una modalidad, el virus quimérico inactivado puede formularse como una solución acuosa estéril que contiene entre 107 y 1010 unidades infecciosas (según lo determinado antes de la inactivación). Las unidades infecciosas incluyen las unidades que forman la placa (pfu) o dosis infecciosas del cultivo del tejido (tcid). Alternativamente, el virus quimérico inactivado puede formularse como una solución acuosa estéril que contiene entre 1-10 unidades de dosis de antígeno relativo. El virus quimérico inactivado formulado puede proporcionarse en un volumen de dosis de 0.1 a 1.0 ml, para administrarse, por, por ejemplo, rutas subcutáneas, intramusculares, submucosales o intradérmicas. Otras modalidades pueden administrarse por una ruta mucosal, tal como una ruta oral. La selección de una cantidad apropiada de quimera para administrar puede ser determinada por los expertos en la técnica, y esta cantidad puede variar debido a los factores numerosos, que incluyen sin limitación tamaño, tipo, y salud general del animal al cual la quimera es administrada. Para un mayor entendimiento de la invención, deberá hacerse referencia a los ejemplos y reivindicaciones siguientes. Ejemplo 1 Diseño experimental: Animales: Seis (6) caballos un año de edad, macho y hembra, y seronegativo al virus West Nile (WNV) fueron vacunados con una vacuna de combinación que contiene los componentes virales inactivados de la vacuna PRESTIGE® V+VEE (disponible de Intervet Inc., Millsboro, DE) y de la quimera West Nile de Fiebre Amarilla (YF-WN), todo combinado con un adyuvante de ácido poliacrílico. La vacuna PRESTIGE® V+VEE contiene el virus Encefalomielitis del Este inactivado, virus Encefalomielitis Occidental inactivado, virus Encefalomielitis Venezolano inactivado, Herpes Equino inactivado tipos 1 y 4 (Rinopneumonitis), virus Influenza inactivada (cepa Kentucky 1993, cepa Kentucky 2002, New Market-2-93), y fracciones de tétanos toxoid. La quimera viva atenuada YF-WN fue obtenida de Acambis en Cambridge, MA, e inactivada con etilenoimina binaria (BEI)'. La inactivación fue lograda primero mezclando el polvo etilenoimina binaria (BEA) con una solución de hidróxido de sodio. Hasta la mezcla, BEA se convierte a BELIO. Esta solución líquida BEI es agregada a una solución de virus quimérico vivo para dar una concentración final BEI de 2 mM. La solución BEI/quimera fue incubada en aproximadamente 18 -25°C por aproximadamente 3 días. Otros seis (6) caballos de un año de edad, macho y hembra, y seronegativo al virus West Nile (WNV) fueron vacunados con una vacuna de combinación que contiene los componentes virales inactivados de la vacuna PRESTIGE® V+VEE (disponible de Intervet Inc., Millsboro, DE) y quimera de West Nile de Fiebre Amarilla (YF-WN) ¡nactivada con formalina.

La quimera viva atenuada de YF-WN fue obtenida de Acambis en Cambridge, MA, e inactivada con formalina (solución al 37 % de formaldehído). La inactivación fue logrado mezclando la solución de formalina en una solución del virus vivo quimérico para dar una concentración final de formalina de 0.1 % de v:v con respecto a la solución del virus quimérico vivo. La solución de formalina/quimera fue incubada en aproximadamente 18-25°C aproximadamente 3 días. Otros seis (6) caballos de un año de edad, ambos de raza mezclada, macho y hembra, y seronegativo al virus West Nile (WNV) no fueron vacunados y se utilizaron como controles. Vacunación: Los caballos recibieron 2 x 1 mL dosis de vacuna, intramuscular, administrada 3-4 semanas aparte. Virus específico: El virus West Nile (WNV), 5 log10 dosis PFU/1 ml, administrado por caballo por ruta intratecal en 4 semanas posteriores a la segunda vacunación. Resultados: Los resultados serológicos del ejemplo # 1 son como sigue: El virus que neutraliza los títulos del anticuerpo (VN) en WNV en caballos vacunados con dos dosis de YF-WN inactivado o una dosis de quimera viva de YF-WN (de Acambis, Cambride, MA) a Los valores de título son el número de veces que representa la dilución más grande de suero en el cual la reducción de la placía al 50 % se observa con relación al controlado. "Negativo" indica la no reducción observada de la placa; "80" representa una dilución de 80 veces; "160" representa una dilución de 160 veces, etc.; "N/A" está indicado donde no fue administrado una segunda vacunación; "Muerte" se refiere a los caballos. b BEI o quimera YF-WN inactivada con formalina fue en combinación con la vacuna PRESTIGE® V+VEE. Resultados: Los resultados serológicos del ejemplo # 1 ilustran los resultados inesperados de la vacuna quimera inactivada West Nile de la presente invención. Se conoce que los virus vivos, tales como quimera YF-WN viva atenuada de Acambis, producen las respuestas mediante la célula y las respuestas humorales (respuesta del anticuerpo). Sin embargo, se considera generalmente que los virus inactivados producen únicamente respuestas humorales. Aquí, el YF-WN inactivado produce una alta respuesta humoral, como es evidente de los datos serológicos. Por consiguiente, e inesperadamente, YF-WN inactivado realiza, así como el YF-WN vivo, la producción de una respuesta humoral. En adición a las ventajas descritas arriba del uso de una vacuna inactivada en vez de una vacuna viva, las ventajas de las vacunas inactivadas de la presente invención son inesperadas. Experimento 2 Diseño experimental: Animales: Caballos Seis (6) caballos de un año de edad de raza mezclada, macho y hembra, y seronegativo del virus West Nile (WNV) fueron vacunados con una vacuna de combinación que contiene los componentes virales inactivados de la vacuna PRESTIGE® V + VEE (disponible de Intervet Inc., Millsboro, DE) y la quimera de West Nile-Fiebre Amarilla inactivada (YF-WN). La vacuna también contenía un adyuvante de ácido poliacrílico. La vacuna PRESTIGE® V+VEE contiene el virus de Encefalomielitis del Este inactivado, el virus de Encefalomielitis del Oeste inactivado, el virus de Encefalomielitis Venezolano inactivado, virus del Herpes Equino tipos 1 y 4 (Rinopneumonitis), virus de influenza inactivado (cepa Kentucky 1993, cepa Kentucky 2002, y New Market-2-93), y fracciones de tétanos toxoid. La quimera YF-WN viva atenuada fue obtenida de Acambis en Cambridge, MA. El virus quimérico fue hecho inactivado con BEI y agregado a la vacuna PRESTIGE® V+VEE según lo descrito arriba en el ejemplo 1. Otros seis (6) caballos de un año de edad de raza mezclada, varón y hembra, y seronegativo al virus West Nile (WNV) no fueron vacunados y utilizados como controles. Vacunación Los caballos recibieron 2 x 1 mL de la vacuna, intramuscular, administrada 3-4 semanas después. Virus desafío Los caballos fueron desafiados colocando 8-17 mosquitos infectados con WNV en cada caballo y dejando que los mosquitos se alimenten por 10-15 minutos.

Resultados: Ejemplo 3 I. Revisión Experimental El propósito de este experimento fue establecer la inmunogeneticidad del virus quimérico West Nile inactivado del contenido en una vacuna de combinación que comprende los componentes antigénicios de la vacuna PRESTIGE® V+VEE (disponible de Intervet Inc., Millsboro, DE; es decir, virus de Encefalomielitis Este ¡nactivado, virus de Encefalomielitis Oeste inactivado, virus Encefalomielitis Venezolano ¡nactivado, virus del Herpes Equino tipos 1 y 4 (Rinopneumonitis), virus de influenza inactivado (cepa Kentucky 1993, cepa Kentucky 2002, y New Market-2-93), y fracciones de tétanos toxoid), todo combinado con un adyuvante de ácido poliacrílico. En particular, un propósito de este experimento fue establecer la no interferencia de las otras fracciones de la vacuna con el virus quimérico West Nile inactivado. Veinte (20) caballos machos y hembras fueron vacunados dos veces por la ruta intramuscular (IM) tres a cuatro semanas después con una dosis de 1.0 ml de una vacuna de combinación que comprende el virus quimérico West Nile inactivado, virus de Encefalomielitis Este inactivado, virus de Encefalomielitis Oeste inactivado, virus Encefalomielitis Venezolano inactivado, virus del Herpes Equino tipos 1 y 4 (Rinopneumonitis), virus de influenza ¡nactivado (cepa Kentucky 1993, cepa Kentucky 2002, y New Market-2-93), y fracciones de tétanos toxoid), todo combinado con un adyuvante de ácido poliacrílico. Diez caballos adicionales sirvieron como controles sin vacunar. En 21 días posteriores a la segunda vacunación, los caballos de control no vacunados y vacunados fueron desafiados por la ruta intratecal (IT) con el vurilento WNV. Los dos grupos separados de 10 vacunas y 5 caballos de control fueron vacunados y desafiados secuencialmente. Las muestras de sangre' para la evaluación serológica fueron recogidas antes de la vacunación, después de la vacunación y después del desafío y probadas por el virus que neutraliza los títulos del anticuerpo (VN) en WNV. Las muestras de sangre fueron recogidas post-desafío para el aislamiento de WNV. Los tejidos neuronales fueron recogidos al momento de la necropsia para la examinación histológica. El desafío de los caballos con WNV virulento por la ruta IT resultó en señales de enfermedad neurológica que son consistentes con las observadas en caballos infectados bajo condiciones naturales de campo. Post-desafío, los caballos vacunados mostraron una reducción significativa estadísticamente en las señales clínicas de la enfermedad neurológica causadas por WNV comparado a los controlados sin vacunar y una reducción significativa estadísticamente en el virus liberado entre vacunas y controlados. Estos resultados establecieron la no interferencia de las otras fracciones de vacunas en la fracción de Muerte de Quimera de Flavivírus. Los datos adicionales establecieron la no interferencia de la fracción de Muerte de Quimera de Flavivirus en las otras fracciones de la vacuna. II. Materiales y Métodos A. Animales Treinta (30) caballos de sexo y raza mezclada de seis a nueve meses de edad fueron utilizados. Los caballos fueron identificados por una marca congelada. Únicamente los caballos con virus que neutraliza' los títulos del anticuerpo (VN) de < 5 en WNV como es determinado por una prueba de neutralización de reducción de placa al 50 % fueron utilizados. La vacuna y los caballos de control fueron alojados juntos en instalaciones de prueba de insecto y roedor durante el período de vacunación y movidos a otra instalación para el desafío con el virulento WNV.

B. Vacunas La vacuna contuvo quimera YFAVN en combinación con el virus de encefalomielitis Este (EE), virus Occidental encephalomyelitis (NOSOTROS), virus encefalomielitis Venezolano (VE), virus de herpes equino tipo 1 (EHV-I), virus de herpes equino tipo 4 (EHV-4) virus de influenza equina (EIV) cepa EIV Kentucky 1993/A2, cepa EIV Kentucky 2002/A2, y cepa EIV New Market/2/93/A2, y fracciones de tétanos toxoid. La vacuna contenía un adyuvante ácido poliacrílico. Dos vacunas fueron utilizadas para demostrar la no interferencia. Una vacuna contuvo una dosis mínima de inmunización de la quimera YF/VN inactivada y una dosis de liberación estándar de los virus inactívados restantes o de las fracciones de tétanos toxoid. La otra vacuna contuvo una dosis de liberación estándar de la quimera YF/WN inactivada y una dosis de inmunización mínima de los virus inactivados restantes o de las fracciones de tétanos toxoid. En cada caso, el componente (s) presente en la dosis de liberación estándar no interfirió con el componente (s) presente en el nivel de la dosis de inmunización mínima. C. Vacunación Los caballos tenían de 6 a 9 meses de edad en el momento de la primera vacunación. Los caballos fueron grupos aleatorios por uso de un número generador aleatorio y aclimatados por un mínimo de siete días. Veinte caballos fueron vacunados IM en el cuello con dos dosis de 1 ml de la vacuna en tres semanas después. Diez caballos fueron utilizados como controles sin vacunar. Dos grupos de caballos (cada uno conteniendo 10 vacunas y 5 controles) fueron vacunados secuencialmente. D. Cegamiento El personal del proyecto que observó las señales clínicas y prueba de laboratorio realizada en muestras clínicas fueron desapercibidos en el grupo que pertenecía a los caballos.

F. Observaciones y Colección de Muestras Post-Vacunación Las temperaturas corporales rectales fueron tomadas y las reacciones del sitio de inyección fueron observadas de 1 a 10 días post-vacunación. Las temperaturas corporales de 02.5°F se consideran ser una temperatura elevada. Las reacciones del sitio de inyección fueron anotadas de acuerdo a un método de anotación. Cualquiera de las reacciones u observaciones sistémicas de salud anormal fueron registradas. La sangre para el suero fue recogido en los días 0, 7, y 21 la primera post-vacunación y en el día 21 la segunda post-vacunación. Los títulos del anticuerpo de neutralización en WNV en muestras de suero de caballos fueron determinados por el uso de una prueba de neutralización de reducción de placa al 50 %. G. Desafío de Caballos con WNV virulento En el día 21 de la segunda post-vacunación, los caballos fueron desafiados por la administración IT de 1 ml que contiene la cerpa virulenta WNV NY99. Los resultados de las cinco titulaciones reproducidas del material de desafío fueron 5.0, 5.1, 5.1, 5.0, y 5.0 y 5.0 por un medio de 5.0 y 5.1, 5.1, 5.0, 5.0, y 5.1 para un medio de 5.1 de la dosis log10 PFU/ml, para los grupos del desafío 1 y 2, respectivamente. Las temperaturas corporales rectales fueron registradas en los días -1 a 21 post-desafío. El desafío de los caballos de control no vacunados con WNV por la ruta IT resultó en señales clínicas de enfermedad que son observadas en caballos infectados naturalmente con WNV bajo condiciones de campo. Los caballos fueron observados durante los 21 días del período post-desafío por la señales clínicas de enfermedad neurológica, en las categorías siguientes: Cambios en la actividad mental, parálisis motorizada parcial, formación de haces de espigas, y ataxia/posición yacente. Para cada categoría, las señales clínicas fueron anotadas como 0 = ninguna, 1=muy suave y podrían ir inadvertidas, 2 = moderada y 3=severa. Hasta la confirmación de la enfermedad clínica severa, las tentativas fueron hechas para eutanizar al animal dentro de las 24 horas. Los caballos se eutanízaron por razones humanas debido a las señales persistentes de la enfermedad de West Nile, o las muestras agudas repentinas acopladas con la posición yacente y/o inhabilidad locomotora sin asistencia según el Center for Veterinary Biologics Notice No. 04-09, fechado el 1 de abril, 2004. Cualquiera de otras observaciones anormales de salud fueron registradas. Las muestras de sangre para la serología fueron tomadas al momento del desafío y en 7, 14, y 21 días postdesafío. Las muestras de sangre para el aislamiento del virus fueron tomadas de 1 a 10 días post-desafío. La sangre para serología, aislamiento de virus, y tejidos para la histopatología fueron tomados al momento de la necropsia. Las lesiones histopatológicas en tejidos neuronales fueron anotadas como 0=ninguna, 1=muy suave/suave, 2 = moderada, y 3=severa. lll. Resultados A. Animales y Vacunación Las temperaturas del cuerpo de >_102.5°F fueron registradas para un día de la primera post-vacunación de tres caballos vacunados y por dos días para un caballo de control. Las temperaturas corporales de >_102.5°F no fueron registradas por cualquier vacuna o caballo de control después de la segunda vacunación. Todos los caballos estaban en buena salud general en el comienzo del estudio. Las reacciones del sitio de vacunación fueron evaluadas según un método de anotación (0 (ninguna reacción) a 5 (reacción sistémica)). La primera postvacunación, las reacciones suaves del sitio de inyección, de anotaciones de 2 o menos, fueron registradas en uno o dos días para tres caballos. Otra vacuna de caballo tuvo una reacción suave que persistió durante 10 días post primera vacunación, pero no causo ningún dolor o resultado de resistencia al moverse. Las reacciones suaves del sitio de inyección, de anotaciones de 2 o menos, fueron también observadas post-segunda vacunación que persistió de 1 a 6 días post-vacunación. No se observaron reacciones en el sitio de inyección post-primera o segunda vacunación como dolorosa. No se observaron reacciones sistémicas en cualquiera de los caballos post-primera o segunda vacunación. B. Serología Post-Vacunación y Post-Desafío con WNV Los datos serológicos para los caballos controlados y vacunados se resumen en las tablas siguientes.

Grupo Vacunado: Neutralización de reducción de placa de títulos de anticuerpo al 50 % (PRNT50 %) post-1ra y 2da Vacunación y post-desafío. a Los valores del título son el número de veces de la dilución que representa la dilución más grande del suero en el cual 50 % es la reducción de placa observada con relación al controlado. b = Día 21 es el día de la 2da vacunación, c = el día 42 es 21 días post-2da vacunación y día del desafío Neg. = Negativo, NS = ninguna muestra, en eutanasia Grupo de Control: 50 % de la neutralización de reducción de placa de los títulos de anticuerpo (PRNT 50 %) en WNV y 2da vacunación y post-desafío. a Los valores del título son el número de veces de la dilución que representa la dilución más grande del suero en el cual 50 % es la reducción de la placa observada con relación al controlado. b = día 21 es el día de la 2da vacunación, c = día 42 es 21 días post-2da vacunación y día del desafío Neg. = Negativo, NS = Ninguna muestra en eutanasia Todas las vacunas y caballos de control fueron seronegativos en WNV en el momento de la vacunación y 7 días post-primera vacunación La carencia de una respuesta anamnésica en WNV en vacunas post-primera vacunación indicó que no se hubo exposición previa a WNV. Los virus de reducción de placa que neutralizan los títulos del anticuerpo en WNV fueron detectados en una vacuna post-primera vacunación y fueron detectados en 14 de 20 vacuna en 21 días póst-segunda vacunación. Todos los caballos de control sin vacunar permanecieron seronegativos a través del primero y segundo período de vacunación. Estos resultados demuestran que los caballos de control no fueron expuestos a WNV durante el período de vacunación, el cual establece la validez del estudio. Los altos niveles de virus que neutralizan el anticuerpo en WNV fueron detectados en ambos, vacunas y caballos de control post-desafío. C. Temperaturas Corporales Rectales y Señales Neurológicas en caballos Post-Desafío con WNV virulento Las temperaturas corporales individuales de caballos postdesafío fueron observadas. Seis de los 20 caballos vacunados exhibieron temperaturas corporales de > 02.5°F por uno o dos días individuales post-desafío y tres de estos seis vacunados exhibieron temperaturas corporales de >_102.5°F por dos o más días consecutivos. Siete de 10 caballos de control no vacunados exhibieron temperaturas corporales de >_102.5°F en cualquier día post-desafío y siete de estos controles exhibieron temperaturas corporales de >_102.5°F por dos o más días consecutivos. Las temperaturas post-desafío fueron comparadas por medidas repetidas de análisis de variación usando un modelo que incluyó los efectos del tratamiento, días, y la interacción del tratamiento y días. Hubo una diferencia significativa (P<0.05) en temperaturas corporales entre vacunas y caballos de control en 8 a 10 días post-desafío. Cuatro de los 10 controlados fueron eutanizados por el día 10 post-desafío debido a la severidad de las señales clínicas de la enfermedad. El desafío de los caballos de control sin vacunar con WNV por la ruta intratecal (IT) resultó en señales clínicas de enfermedad que son constantes con las observadas en los caballos infectados naturalmente con WNV bajo condiciones de campo. Las señales clínicas que incluyeron cambios en la actividad mental, parálisis motorizada parcial, formación de haces de espigas, y ataxia/posición yacente. El post-desafío, de 7 de 10 (70 %) caballos de control sin vacunar mostraron señales moderadas o severas de la enfermedad neurológica WNV por dos o más días consecutivos o mostraron una condición global severa de salud debido a la infección por WNV de modo que la eutanasia fue requerida por razones humanas. Los caballos fueron eutanízados por razones humanas debido a las muestras persistentes de la enfermedad de West Nile, o las muestras agudas repentinas acopladas con la posición yacente y/o inhabilidad locomotora sin asistencia. La definición del caso de infección con WNV y el resultado primario para la demostración de la enfermedad causada por WNV fue definida como caballos que tienen señales de la enfermedad moderada o severa por dos o más días consecutivos en cualquiera de las categorías de: Cambios en la actividad mental, parálisis motorizada parcial, formación de haces de espigas, y ataxia/posición yacente o cualquier animal en el cual la eutanasia fuera requerida debido a la condición severa global de la salud del animal como resultado de la infección por WNV. Estos criterios tuvieron que ser satisfechos para que el resultado primario sea una falla; de otra forma, el caballo fue considerado un éxito. Únicamente 5 de 20 (25 %) de los caballos vacunados demostraron señales severas o moderadas de la enfermedad neurológica WNV por dos días consecutivos post-desafío o fueron eutanizados comparados a 7 de 10 (70 %) de los controlados. El análisis para el resultado primario fue realizado en SAS con el Procedimiento FREQ. El análisis de la proporción de caballos que resolvían la definición del caso mostraron que hay una diferencia significativa (P<0.02) entre los vacunados y controlados. El odds ratio indicó que los caballos vacunados fueron 6 veces más similares a los protegidos contra señales neurológicas de la enfermedad de WNV. Una proporción más alta estadísticamente (P<0.05) de controlados fueron eutanizados debido a las señales de la enfermedad de WNV comparada a los controlados. D. Aislamiento del Virus del Suero Post-Desafío con WNV Virulento Los resultados de WNV aislado del suero de caballos postdesafío también fueron observados. El WNV fue recuperado del suero a partir de 6 de 20 vacunas y a partir de 10 de 10 caballos de control en 1 a 4 días post-desafío. Significativamente (P<0.05) más controlados fueron viméricos comparados a vacunados y controlados que fueron viméricos (P<0.01) más días significativamente comparados a los vacunados. E. Histopatología de Tejidos Neuronales en Vacunas y Controlados Post-Desafío con WNV virulento En el momento de la necropsia, el tejido neuronal del Puente de Varolio, médula, e hipotalamus/talamus fueron recogidos y analizados para histopatología debido a la encefalitis viral. En general, había histopatología reducida en vacunas comparado a los controlados pero no había una diferencia estadísticamente significativa. IV. Conclusión Desafío de caballos con WNV virulento por la ruta IT resulto en señales de enfermedad neurológica que son consistentes con las observadas en los caballos infectados bajo condiciones naturales de campo y son constantes con la enfermedad neurológica observada en estudios con una vacuna monovalente a WNV. En post-desafío, los caballos vacunados mostraron una reducción estadísticamente significativa en las señales clínicas de enfermedad neurológica causadas por WNV comparadas a los controlados sin vacunar y una reducción estadísticamente significativa en el virus que se libera entre vacunas y controlados. Estos resultados resuelven los criterios para la demostración satisfactoria de la inmunogenicidad del virus de West Nile, fracción Quimera de Flavivirus Muerto contenida en una vacuna de combinación que comprende los componentes de la vacuna PRESTIGE® V+VEE (disponible de Intervet inc, Millsboro, DE; es decir, virus de encefalomielitis del Este (EE), virus de encefalomielitis Occidental (WE), virus de encefalomielitis Venezolano (VE), virus de herpes equino tipo 1 (EHV-I), virus de herpes equino tipo 4 (EHV-4), virus de influenza equina (EIV) cepa Kentucky 1993/A2, cepa EIV Kentucky 2002/A2, y cepa New Market/2/93/A2, y fracciones toxoides de tétanos). Estos resultados establecieron la no interferencia de las otras fracciones de la vacuna en la fracción Quimera de Flavivirus Muerto. Mientras que la invención ha sido descrita en conexión con modalidades específicas y ejemplos de la misma, será entendido que es capaz de modificaciones adicionales y las reivindicaciones anexas están deseadas para cubrir cualquier variación, usos, o adaptaciones de la invención que siguen, en general, los principios de la invención e incluyen tales salidas de la presente descripción según viene dentro de la práctica conocida o acostumbrada dentro de la técnica a la cual la invención pertenece y como puede ser aplicada a las características esenciales arriba establecidas si existen ahora o después de presentada. Además, mientras que las modalidades de la invención se han descrito con características y/o medidas y/o componentes dimensionales específicos, será entendido que las modalidades son capaces de diferentes características dimensionales y/o medidas y/o componentes sin salirse de los principios de la invención y de las reivindicaciones anexas que están deseadas para cubrir tales diferencias. Además, todas las patentes, publicaciones impresas, y similares mencionadas en la presente están incorporadas en la presente por referencia.

Claims (20)

REIVINDICACIONES

1. Flavivirus quimérico inactivado, que comprende un primer flavivirus en el cual las secuencias del nucleótido que codifican las proteínas encapsuladas y pre-membrana son sustituidas por las secuencias de nucle?tido que codifican las proteínas encapsuladas y pre-membrana de un segundo flavivirus.

2. Virus quimérico inactivado de conformidad con la reivindicación 1, en donde el primer flavivirus es un virus de fiebre amarilla.

3. Virus quimérico inactivado de conformidad con la reivindicación 2, en donde el virus de fiebre amarilla es derivado de la cepa 17D.

4. Virus quimérico inactivado de conformidad con la reivindicación 1, en donde el virus quimérico comprende una secuencia señal en la terminal del aminoácido de la proteína de la pre-membrana, y la secuencia señal es la del virus de fiebre amarilla.

5. Virus quimérico inactivado de conformidad con la reivindicación 1, en donde el segundo flavivirus es un virus de West Nile.

6. Composición inmunogénica que comprende el virus quimérico inactivado de la reivindicación 1.

7. Virus quimérico inactivado de conformidad con la reivindicación 1, en donde el virus quimérico inactivado está presente en una concentración que tiene un intervalo entre 102 y 108 unidades que forman la placa (pfu).

8. Vacuna que comprende el virus quimérico ¡nactivado de la reivindicación 1.

9. Vacuna de conformidad con la reivindicación 8, en donde el virus quimérico inactivado está presente en una concentración que tiene un intervalo entre 102 y 108 unidades que forman la placa (pfu).

10. Método de prevenir o tratar una infección de flavivirus en un animal, que comprende administrar al animal un flavivirus quimérico inactivado que comprende un primer flavivirus en el cual las secuencias del nucleótido que codifican a las proteínas encapsuladas y pre-membrana son sustituidas con las secuencias del nucleótido que codifican a las proteínas encapsuladas y pre-membrana de un segundo flavivirus.

11. Método de conformidad con la reivindicación 10, en donde el primer flavivirus es virus de fiebre amarilla.

12. Método de conformidad con la reivindicación 11, en donde el virus de fiebre amarilla es derivado de la cepa 17D.

13. Método de conformidad con la reivindicación 10, en donde el segundo flavivirus es virus de West Nile.

14. Método de conformidad con la reivindicación 10, en donde el flavivirus quimérico es administrado en una dosis que tiene un intervalo entre 102 y 108 unidades que forman la placa (pfu).

15. Método de conformidad con la reivindicación 14, en donde el flavívirus quimérico es administrado en una dosis que tiene un intervalo entre 1 O6 y 1 O7 pfu.

16. Método de conformidad con la reivindicación 10, en donde el flavivirus quimérico ¡nactivado es administrado por una ruta subcutánea, intramuscular, submucosal, mucosal, o intradérmica.

17. Método de conformidad con la reivindicación 10, en donde el flavivirus quimérico ¡nactivado es administrado oralmente.

18. Vacuna de conformidad con la reivindicación 8, que además comprende i) uno o más virus vivos modificados; ii) uno o más virus inactivados; o iii) uno o más antígenos bacterianos.

19. Vacuna de conformidad con la reivindicación 8, que además comprende uno o más virus de encefalomielitis del Este inactivado, virus de encefalomielitis Occidental inactivado, virus de encefalomielitis Venezolano inactivado, virus del herpes equino inactivado tipo 1, virus del herpes equino inactivado tipo 4, virus de influenza equina inactivada cepa KY93/A2, virus de influenza equina inactivada cepa KY02/A2, virus de influenza equina inactivada cepa NM/2/93/A2 y una fracción toxoide de tétanos.

20. Método de conformidad con la reivindicación 10, en donde el flavivirus quimérico inactivado es presentado en una vacuna" que también incluye uno o más de los virus de encefalomielitis del Este inactivado, virus de encefalomielitis Occidental inactivado, virus de encefalomielitis Venezolano inactivado, virus del herpes equino inactivado tipo 1, virus del herpes equino inactivado tipo 4, virus de influenza equina inactivada cepa KY93/A2, virus de influenza equina inactivada cepa KY02/A2, virus de influenza equina inactivada cepa NM/2/93/A2 y una fracción toxoide de tétanos.