CN100497583C - 安全高效连续封闭式细胞培养病毒生产/灭活系统 - Google Patents
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Abstract
一种生物工程技术领域的安全高效连续封闭式细胞培养病毒生产/灭活系统。本发明中，细胞扩增单元分别与气体供应单元、蒸汽发生器、细胞生长培养基供应装置、初级灌注收集装置、热源供应装置和酸/碱液供应装置相接；病毒增殖单元分别与气体供应单元、基础培养基供应装置、细胞/载体分离装置、热源供应装置和酸/碱液供应装置相接；细胞/载体分离装置分别与病毒增殖单元、病毒收集装置和陈旧载体收集装置相接；陈旧载体收集装置和病毒收集装置相接。本系统将细胞扩增和病毒增殖两个过程关联起来，在连续封闭下进行细胞培养生产/灭活病毒，便于自动化控制，标准化生产，并降低了污染机会和提高了生产安全系数。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种生物工程技术领域的系统，具体是一种安全高效连续封闭式细胞培养病毒生产/灭活系统。
技术背景
传统培养细胞生产病毒的方式是采用转瓶方式培养。这种方式产量低，难以实现自动化控制，重复性不好，批次差异大。随着生物反应器的出现，大大解决了上述问题，一般细胞培养用生物反应器由反应器罐体、提供热量的夹套、气体分布器、机械搅拌装置、连有众多进样口、取样口、排气口、传感器接口的盖板和温度传感器、pH电极、溶氧电极等感应元件组成，很好地解决了混合、传质和供氧问题，为细胞培养和病毒增度增殖提供了适宜的环境，一般最大细胞密度可达107cell/ml以上，这样病毒的产量也相应得到提高。
经对现有技术的文献检索发现，刘建青等人在《山东医药》2005，45(23)：7～8上发表的“固定床生物反应器生产高滴度乙型脑炎病毒”一文中，提出了一种使用Fibra-Cel Disks为载体的固定床培养Vero细胞生产乙型脑炎病毒的系统，该系统由培养液输送管道、蠕动泵、生物反应器、供气装置等组成。该系统由培养液输送管道、蠕动泵、生物反应器、供气装置等组成。首先，用加有10％新生牛血清的199(Gibco)作为细胞扩增培养基进行灌注培养方式大量扩增Vero细胞，高密度培养，达到一定程度后，去除细胞培养液，用加有0.4％人血白蛋白的199(Gibco)作为细胞维持培养基，接种病毒，采用灌注培养方式大量增殖病毒。检索中还发现，Y.Z.Ghendon等在《Vaccine》2005，23：4678～4684上发表的“Development of cell culture(MDCK)live cold-adapted(CA)attenuated influenza vaccine”(细胞培养活耐寒减毒流感疫苗的发展，《疫苗》)一文中，提出了一种使用Cytodex-1微载体悬浮培养MDCK细胞生产流感病毒的系统，该系统由培养液输送管道、蠕动泵、生物反应器、细胞分离器、供气装置等组成。首先，用Axcevir-MDCK无血清培养基通过灌注培养方式大量扩增MDCK细胞，高密度培养，达到一定程度后，去除细胞培养液，换用加有2μg/ml胰酶的Axcevir-MDCK无血清培养基作为细胞维持液，接种病毒，采用分批培养方式大量增殖病毒。以上两种系统中，细胞培养和病毒增殖两个过程单独来看有连续生产的，但整个过程是间歇和不封闭进行的，是在前一个过程单元结束后才开始下一个过程单元的，不利于大规模、连续性、安全生产病毒疫苗。
发明内容
针对目前病毒疫苗生产中“不连续性和不封闭性”这一不足之处，本发明提供一种安全高效连续封闭式细胞培养病毒生产/灭活系统，使其用于细胞培养、病毒增殖、病毒灭活的连续封闭生产，首先采用灌注培养方式进行高密度细胞培养，然后流加新鲜培养基连续培养细胞，从反应器流出的细胞进入病毒增殖单元进行病毒增殖，病毒进入收集罐收集，封闭灭活，这样能够减少不断开、关反应器引起的染菌和病毒外泄的风险，同时整套系统便于自动化控制，能够安全、高效、大规模增殖病毒用于疫苗生产。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括：气体供应单元、蒸汽发生器、细胞生长培养基供应装置、细胞扩增单元、初级灌注收集装置、基础培养基供应装置、病毒增殖单元、细胞/载体分离装置、病毒收集装置、热源供应装置、酸/碱液供应装置和陈旧载体收集装置。连接方式为：气体供应单元分两路，出口端的一路与细胞扩增单元的进口端连接，满足细胞扩增所需的气体要求，另一路与病毒增殖单元的进口端连接，满足病毒增殖所需的气体要求；蒸汽发生器的出口端与细胞扩增单元的进口端连接，用于整个系统的在位灭菌；细胞生长培养基供应装置的出口端与细胞扩增单元的进口端连接，初级灌注收集装置的入口端与细胞扩增单元的出口端连接，实现细胞的初级灌注培养和连续培养；热源供应装置分别与细胞扩增单元和病毒增殖单元连接，满足所需温度要求；酸/碱液供应装置的出口端分别与细胞扩增单元和病毒增殖单元的进口端连接，满足所需pH值要求；细胞扩增单元的出口端与病毒增殖单元的进口端连接；基础培养基供应装置的出口端与病毒增殖单元的进口端连接；细胞/载体分离装置的进口端与病毒增殖单元的出口端相连接，三个出口端分别与病毒增殖单元、病毒收集装置和陈旧载体收集装置的进口端连接；陈旧载体收集装置的出口端和病毒收集装置的进口端连接。
气体供应单元包括：气体钢瓶、粗过滤器、空气压缩机、三通、第一自控阀门、气体流量计、气体混合装置和气体增湿装置。其中，气体钢瓶有三个，即N2气体钢瓶、CO2气体钢瓶、O2气体钢瓶；气体混合装置由不锈钢材料制成，呈椭圆柱形，其椭圆顶部一侧是四个气体入口，另一侧是一个混合气体出口；气体增湿装置主体为圆柱型半球顶玻璃容器，其顶部整合有第一进气口和第一出气口，第一进气接口深入容器内近底部处，从第一出气口出来的气体通过第—0.2μm滤膜过滤供气。其连接方式为：粗过滤器与空气压缩机的入口相连，三个气体钢瓶、空气压缩机通过四条铜输气管道顺次连接第一自控阀门、气体流量计以及气体混合装置上的四个气体入口，混合气体出口和气体增湿装置的第一进气口相接，第一出气口与第一0.2μm滤膜相接。
气体供应单元将供气分为两个通路，可以使细胞扩增单元与病毒增殖单元得到不同的供气需求，有利于细胞扩增和病毒增殖过程的顺利进行，这个过程通过控制N2、CO2、O2和空气的流量来实现。
细胞扩增单元包括：第一热源输入口、第一热源输出口、第一夹套、细胞培养生物反应器罐体、第二进气口、蒸汽输入口、细胞接种口、细胞生长培养基输入口、第一酸/碱输入口、第二自控阀门、第一电动机和变速装置、第一传感器、初级灌注输出口、第一取样口、细胞混合液输出口、第二出气口、第二0.2μm滤膜、第一盖板、细胞截流装置、第一搅拌装置、第一气体分布器和第一控制器及执行器。其连接方式为：细胞扩增单元的主体由细胞培养生物反应器罐体和覆盖其上的第一盖板组成，细胞培养生物反应器罐体由耐腐蚀性高硼硅玻璃制成，它的周围是第一夹套，上面设有的第一热源输入口和第一热源输出口；第一盖板为圆形钢制材料，其上连有很多出入口，入口包括第二进气口、蒸汽输入口、细胞接种口、细胞生长培养基输入口和第一酸/碱输入口，出口包括第一传感器、初级灌注输出口、第一取样口、细胞混合液输出口和第二出气口；初级灌注输出口通过不锈钢管与细胞培养生物反应器罐体中的细胞截流装置连接；第二进气口通过硅橡胶管与第一气体分布器相连；第二出气口与第二0.2μm滤膜相连；第一电动机和变速装置位于第一盖板的上面，与第一搅拌装置相连；第一控制器及执行器通过数据线一端与第一传感器连接，另一端与第二自控阀门、第一电动机和变速装置和气体供应单元中的第一自控阀门连接，在线自动控制细胞扩增培养基输入口、第一酸/碱输入口、第一电动机和变速装置、细胞混合液输出口和气体供应单元中的第一自控阀门。
在细胞扩增反应单元中，蒸汽输入口与蒸汽发生器相连，可以用蒸汽对整个系统灭菌；第一热源在第一夹套内循环流动，维持细胞培养生物反应器罐体内培养介质的温度；第一取样口可用于离线取样测量；同时，第一控制器及执行器通过第一传感器包括测温元件、pH电极、溶氧电极和细胞密度测量电极，在线自动控制细胞生长培养基和第一酸/碱的输入量、第一搅拌装置的转速、细胞混合液的输出量和供气组成和流量，为细胞扩增提供适宜的温度、pH、溶氧等环境和适当的细胞生长培养基流率，使从细胞扩增单元中流出的细胞混合液密度适中，便于细胞培养生产病毒过程中病毒增殖步骤的顺利进行。
首先在细胞扩增单元中接种一定的细胞，通过细胞生长培养基输入口、初级灌注输出口、细胞截流装置和初级灌注收集装置的连接，进行初级灌注培养细胞，当细胞扩增至适当密度后停止初级灌注培养，由细胞生长培养基供应装置提供流加细胞生长培养基(若微载体悬浮培养时，还要向培养基中加入微载体并混合流加)，同时细胞混合液流入病毒增殖单元，实现细胞的连续培养。
病毒增殖单元包括：第二热源输入口、第二热源输出口、第二夹套、病毒增殖反应器罐体、第三进气口、细胞混合液输入口、细胞/载体回流输入口、基础培养基输入口、第二酸/碱输入口、第三自控阀门、第二电动机和变速装置、病毒接种口、二传感器、第二取样口、病毒混合液输出口、第三出气口、第三0.2μm滤膜、第二盖板、第二搅拌装置、第二气体分布器和第二控制器及执行器。其连接方式为：病毒增殖单元的主体由病毒增殖反应器罐体和覆盖其上的第二盖板组成，病毒增殖反应器罐体由耐腐蚀性高硼硅玻璃制成，它的周围是第二夹套，上面设有的第二热源输入口和第二热源输出口；第二夹套为圆形钢制材料，上连有很多出入口，入口包括第三进气口、细胞混合液输入口、细胞/载体回流输入口、基础培养基输入口、第二酸/碱输入口和病毒接种口，出口包括第二传感器、第二取样口、病毒混合液输出口和第三出气口；第三进气口；通过硅橡胶管与第二气体分布器；相连；第三出气口和第三0.2μm滤膜相连；第二电动机和变速装置位于第二盖板的上面，与第二搅拌装置相连；第二控制器及执行器通过数据线一端与第二传感器连接，另一端与第三自控阀门、第二电动机和变速装置、细胞扩增单元中的第二自控阀门和气体供应单元中的第一、二自控阀门连接，在线自动控制第一、二自控阀门、基础培养基输入口、第二酸/碱输入口、第二电动机和变速装置、细胞/载体回流输入口、病毒混合液输出口。
在病毒增殖单元中，第二热源在第二夹套内循环流动，维持病毒增殖反应器罐体内培养介质的温度；基础培养基中含有病毒增殖所需的外源因子，与细胞混合液按一定比例混合流加，一同组成病毒增殖培养基，起到稀释血清和提供营养物质的作用；第二取样口可用于离线取样测量；同时，第二控制器及执行器通过第二传感器包括测温元件、pH电极、溶氧电极和营养物质测量电极，在线自动控制第一自控阀门、基础培养基和第二酸/碱的输入量、第二搅拌装置的转速、病毒混合液的输出量和供气组成和流量，为细胞扩增病毒增殖提供适宜的温度、pH、溶氧等环境和适当的病毒混合液输出流率，维持系统稳定和病毒生产的顺利进行。
在病毒增殖单元中，当细胞混合液和基础培养基按一定比例混合流加，组成病毒增殖培养基最先流入病毒增殖反应器罐体时，从病毒接种口接种病毒进行微分式病毒初级增殖，当液体体积达到病毒增殖反应器罐体的有效体积时，抽出病毒混合液，维持系统平衡，进行病毒的连续增殖过程。
细胞/载体分离装置包括：细胞/载体回流输出口、病毒混合液输入口、第四自控阀门、外框体、病毒上清液输出口、第三传感器、沉积板、第三取样口、陈旧载体输出口、载体输出阀门和第三控制器及执行器。
细胞/载体分离装置是利用密度差异，沉降分离细胞/载体、病毒上清夜和陈旧载体的，横截面是“倒L”形状，与垂直方向呈15°～45°，上部分长宽比在3～5之间，用于病毒上清液的分离；下部分长宽比在5～10之间，用于细胞/载体的回流和陈旧载体的回收。其中，外框体构成细胞/载体分离装置的外壳；沉积板平行分布在细胞/载体分离装置内部，间距在0.5～1.5cm之间，硅渗处理；中间部位是病毒混合液输入口，上端是病毒上清液输出口和第三传感器，下端是细胞/载体回流输出口、第三取样口和陈旧载体输出口；陈旧载体输出口通过装有载体输出阀门的硅橡胶管线与陈旧载体收集装置相连；第三控制器及执行器通过数据线一端与第三传感器连接，另一端与第四自控阀门、病毒增殖单元的第三自控阀门、细胞扩增单元中的第二自控阀门和气体供应单元中的第一自控阀门连接，在线自动控制第一、二、三自控阀门、病毒混合液输入口、细胞/载体回流输出口和病毒上清液输出口。
通过细胞/载体分离装置，将病毒上清液抽至病毒收集装置以维持整个操作系统的平衡，沉降下来的细胞/载体通过回流输出口回流到病毒增殖单元，达到充分利用病毒宿主细胞、提高病毒产量的目的，同时，可以根据系统运作情况，将在反应器中停留时间过长的细胞已大量脱落的陈旧载体间歇排放到陈旧载体收集装置，减少对病毒增殖的影响，其中含有的少量病毒上清液并入病毒收集装置。
病毒收集装置包括：液体分配器入口、液体分配器、液体分配器出口、液位自控开关阀门、病毒液输入口、液位传感器、病毒液输出口、灭活剂输入口、第四0.2μm滤膜、第四出气口、病毒罐、和第四控制器及执行器。其中，液体分配器的一端通过液体分配器入口与细胞/载体分离装置中的病毒上清液输出口相连，另一端液体分配器出口通过液位自控开关阀门与病毒罐上的病毒液输入口相连；病毒罐与病毒液输入口、液位传感器、病毒液输出口、灭活剂输入口和第四出气口相连；第四出气口与第四0.2μm滤膜相连；第四控制器及执行器通过数据线一端与液位传感器连接，另一端与液位自控开关阀门连接，在线自动控制病毒液的收集。
在病毒收集装置中，病毒收集是通过一系列带有液位自控开关阀门控制的病毒罐完成的，每一个病毒罐收集满病毒后，通过液位自控开关阀门在关闭该病毒罐的同时打开其它病毒罐继续收集病毒，然后把满的病毒罐取下，换上空的病毒罐，如此反复循环，实现病毒的连续收集。而且，根据病毒生产能力的多少，可以将一组病毒罐和另一组病毒罐分开，通过液位自控开关阀门的控制，实现大规模连续生产时连续收集病毒的目的。
将收集满病毒的病毒罐取下后，可以通过采用常规的病毒灭活剂如β丙内酯、福尔马林等灭活病毒，然后再通过离心、超滤、层析等纯化方法和加入佐剂和稳定剂等程序制备病毒疫苗。
本发明工作时，首先用蒸汽发生器对系统进行一体化灭菌。供气包括N2、CO2、O2和空气，通过粗过滤器、气体增湿装置和0.2μm滤膜进行预处理，气体供应单元将供气分为两个通路，调节N2、CO2、O2和空气四种气体的流量，可以使细胞扩增单元与病毒增殖单元得到不同的供气需求；酸/碱液供应装置为细胞扩增单元和病毒增殖单元添加酸/碱，调节pH值；热源供应装置为细胞扩增单元和病毒增殖单元提供热源，调节温度；细胞生长培养基供应装置和基础培养基供应装置分别为细胞扩增单元和病毒增殖单元提供细胞培养和病毒增殖阶段所需的培养基；传感器、控制器及执行器在线检测和控制细胞扩增单元与病毒增殖单元的温度、pH、溶氧、搅拌转速和培养基的流加速率，使系统中各项参数达到设定值，维持系统的稳定。首先在细胞扩增单元中接种一定的细胞，初级灌注培养，细胞扩增至适当密度后由细胞生长培养基供应装置提供流加细胞生长培养基(微载体悬浮培养时，培养基中还要混有微载体)，连续培养细胞，细胞混合液流入病毒增殖单元，同时通过基础培养基供应装置向病毒增殖单元中流加基础培养基，二者按一定比例混合共同组成病毒增殖培养基，从病毒接种口接种病毒，进行微分式病毒初级增殖，当液体体积达到病毒增殖反应器罐体的有效体积时，从病毒增殖单元中流出的病毒混合液进入细胞/载体分离装置，进行病毒的连续增殖过程，通过细胞/载体分离装置的沉降分离，细胞/载体回流进入病毒增殖单元，病毒上清液进入病毒收集装置进行灭活，实现连续封闭式细胞培养病毒和灭活，而且可依据系统运行情况间歇收集陈旧载体至陈旧载体收集装置，可减少陈旧载体对病毒增殖的影响，其中含有的少量病毒上清液并入病毒收集装置一同灭活。
通过以上说明，可见，本发明系统将细胞扩增和病毒增殖两个过程关联起来，在连续封闭下进行细胞培养生产/灭活病毒，一方面，便于自动化控制，标准化生产，另一方面，降低了污染机会和提高了生产安全系数，是十分适于大规模高效连续生产病毒的新系统。
附图说明
图1为本发明结构示意图
图2为本发明气体供应单元结构示意图
图3为本发明细胞扩增单元结构示意图
图4为本发明病毒增殖单元结构示意图
图5为本发明细胞/载体分离装置结构示意图
图6为本发明病毒收集装置结构示意图
图中，1.气体供应单元 2.蒸汽发生器 3.细胞生长培养基供应装置 4.细胞扩增单元 5.初级灌注收集装置 6.基础培养基供应装置 7.病毒增殖单元8.细胞/载体分离装置 9.病毒收集装置 10.热源供应装置 11.酸/碱液供应装置12.陈旧载体收集装置 13.气体钢瓶 14.粗过滤器 15.空气压缩机 16.三通 17.第一自控阀门 18.气体流量计 19.气体混合装置 20.气体增湿装置 21.气体入口22.混合气体出口 23.第一进气口 24第一出气口 25.第一0.2μm滤膜 26.第一热源输入口 27.第一热源输出口 28.第一夹套 29.细胞培养生物反应器罐体30.第二进气口 31.蒸汽输入口 32.细胞接种口 33.细胞生长培养基输入口34.第一酸/碱输入口 35.第二自控阀门 36.第一电动机和变速装置 37.第一传感器38.初级灌注输出口 39.第一取样口 40.细胞混合液输出口 41.第二出气口42.第二0.2μm滤膜 43.第一盖板 44.细胞截流装置 45.第一搅拌装置 46.第一气体分布器 47.第一控制器及执行器 48.第二热源输入口 49.第二热源输出口 50.第二夹套 51.病毒增殖反应器罐体 52.第三进气口 53.细胞混合液输入口 54.细胞/载体回流输入口 55.基础培养基输入口 56.第二酸/碱输入口57.第三自控阀门 58.第二电动机和变速装置59.病毒接种口60.第二传感器61.第二取样口 62.病毒混合液输出口 63.第三出气口 64.第三0.2μm滤膜65.第二盖板 66.第二搅拌装置 67.第二气体分布器 68.第二控制器及执行器 69.细胞/载体回流输出口 70.病毒混合液输入口 71.第四自控阀门 72.外框体 73.病毒上清液输出口 74.第三传感器 75.沉积板 76.第三取样口 77.陈旧载体输出口 78.载体输出阀门 79.第三控制器及执行器 80.液体分配器入口 81.液体分配器 82.液体分配器出口 83.液位自控开关阀门 84.病毒液输入口 85.液位传感器 86.病毒液输出口 87.灭活剂输入口 88.第四0.2μm滤膜 89.第四出气口 90.病毒罐 91.第四控制器及执行器。
具体实施方式
如图1所示，本发明包括：气体供应单元1、蒸汽发生器2、细胞生长培养基供应装置3、细胞扩增单元4、初级灌注收集装置5、基础培养基供应装置6、病毒增殖单元7、细胞/载体分离装置8、病毒收集装置9、热源供应装置10、酸/碱液供应装置11、陈旧载体收集装置12。连接方式为：气体供应单元1分两路，出口端的一路与细胞扩增单元4的进口端连接，满足细胞扩增所需的气体要求，另一路与病毒增殖单元7的进口端连接，满足病毒增殖所需的气体要求；蒸汽发生器2的出口端与细胞扩增单元4的进口端连接，用于整个系统的在位灭菌；细胞生长培养基供应装置3的出口端与细胞扩增单元4的进口端连接、初级灌注收集装置5的入口端与细胞扩增单元4的出口端连接，实现细胞的初级灌注培养和连续培养；热源供应装置10分别与细胞扩增单元4和病毒增殖单元7连接，满足所需温度要求；酸/碱液供应装置11的出口端分别与细胞扩增单元4和病毒增殖单元7的进口端连接，满足所需pH值要求；细胞扩增单元4的出口端与病毒增殖单元7的进口端连接；基础培养基供应装置6的出口端与病毒增殖单元7的进口端连接；细胞/载体分离装置8的进口端与病毒增殖单元7的出口端相连接，三个出口端分别与病毒增殖单元7、病毒收集装置9和陈旧载体收集装置12的进口端连接；陈旧载体收集装置12的出口端和病毒收集装置9的进口端连接。
如图2所示，气体供应单元1包括：气体钢瓶13、粗过滤器14、空气压缩机15、三通16、第一自控阀门17、气体流量计18、气体混合装置19和气体增湿装置20。其中，气体钢瓶13有三个，即N2气体钢瓶、CO2气体钢瓶、O2气体钢瓶；气体混合装置19由不锈钢材料制成，呈椭圆柱形，其椭圆顶部一侧是四个气体入口21，另一侧是一个混合气体出口22；气体增湿装置20主体为圆柱型半球顶玻璃容器，其顶部整合有第一进气口23和第一出气口24，第一进气接口23深入容器内近底部处，从第一出气口24出来的气体通过第一0.2μm滤膜25过滤供气。连接方式为：粗过滤器14与空气压缩机15的入口相连，三个气体钢瓶13、空气压缩机15通过四条铜输气管道顺次连接第一自控阀门17、气体流量计18以及气体混合装置19上的四个气体入口21，混合气体出口22和气体增湿装置的第一进气口23相接，第一出气口24与第一0.2μm滤膜25相接。气体供应单元将供气分为两个通路，可以使细胞扩增单元与病毒增殖单元得到不同的供气需求，这个过程通过控制N2、CO2、O2和空气的流量来实现。
如图3所示，细胞扩增单元4包括：第一热源输入口26、第一热源输出口27、第一夹套28、细胞培养生物反应器罐体29、第二进气口30、蒸汽输入口31、细胞接种口32、细胞生长培养基输入口33、第一酸/碱输入口34、第二自控阀门35、第一电动机和变速装置36、第一传感器37、初级灌注输出口38、第一取样口39、细胞混合液输出口40、第二出气口41、第二0.2μm滤膜42、第一盖板43、细胞截流装置44、第一搅拌装置45、第一气体分布器46、第一控制器及执行器47。连接方式为：细胞扩增单元4的主体由细胞培养生物反应器罐体29和覆盖其上的第一盖板43组成，细胞培养生物反应器罐体29由耐腐蚀性高硼硅玻璃制成，它的周围是第一夹套28，上面设有的第一热源输入口26和第一热源输出口27；第一盖板43为圆形钢制材料，其上连有很多出入口，提供适宜细胞增殖培养环境。第一盖板43的入口包括第二进气口30、蒸汽输入口31、细胞接种口32、细胞生长培养基输入口33和第一酸/碱输入口34，出口包括第一传感器37、初级灌注输出口38、第一取样口39、细胞混合液输出口40和第二出气口41。其中，蒸汽输入口31与蒸汽发生器2相连；初级灌注输出口39通过不锈钢管与细胞截流装置44连接，用于初级灌注培养；第二进气口30通过硅橡胶管与第一气体分布器46相连；第二出气口41与第二0.2μm滤膜42相连。第一电动机和变速装置36位于第一盖板43的上面，与第一搅拌装置45相连。第一控制器及执行器47通过数据线一端与第一传感器37连接，另一端与第二自控阀门35、第一电动机和变速装置36和气体供应单元1中的第一自控阀门17连接，在线自动控制细胞生长培养基输入口33、第一酸/碱输入口34、第一电动机和变速装置36、细胞混合液输出口40和第一自控阀门17。
如图4所示，病毒增殖单元7包括：第二热源输入口48、第二热源输出口49、第二夹套50、病毒增殖反应器罐体51、第三进气口52、细胞混合液输入口53、细胞/载体回流输入口54、基础培养基输入口55、第二酸/碱输入口56、第三自控阀门57、第二电动机和变速装置58、病毒接种口59、第二传感器60、第二取样口61、病毒混合液输出口62、第三出气口63、第三0.2μm滤膜64、第二盖板65、第二搅拌装置66、第二气体分布器67、第二控制器及执行器68。连接方式为：病毒增殖单元7的主体由病毒增殖反应器罐体51和覆盖其上的第二盖板65组成，病毒增殖反应器罐体51由耐腐蚀性高硼硅玻璃制成，它的周围是第二夹套50，通过设有的第二热源输入口48和第二热源输出口49提供给病毒增殖单元7适宜温度；第二盖板65为圆形钢制材料，其上连有很多出入口，提供适宜病毒增殖培养环境。第二盖板65的入口包括第三进气口52、细胞混合液输入口53、细胞/载体回流输入口54、基础培养基输入口55、第二酸/碱输入口56和病毒接种口59，出口包括第二传感器60、第二取样口61、病毒混合液输出口62和第三出气口63。其中，第三进气口52通过硅橡胶管与第二气体分布器67相连；第三出气口63和第三0.2μm滤膜64相连。第二电动机和变速装置58位于第二盖板65的上面，与第二搅拌装置66相连。第二控制器及执行器68通过数据线一端与第二传感器60连接，另一端与第三自控阀门57、第二电动机和变速装置58、细胞扩增单元4中的第二自控阀门35和气体供应单元1中的第一自控阀门17连接，在线自动控制第一自控阀门17、第二自控阀门35、基础培养基输入口55、第二酸/碱输入口56、第二电动机和变速装置58、细胞/载体回流输入口54和病毒混合液输出口62。
如图5所示，细胞/载体分离装置8包括：细胞/载体回流输出口69、病毒混合液输入口70、第四自控阀门71、外框体72、病毒上清液输出口73、第三传感器74、沉积板75、第三取样口76、陈旧载体输出口77、载体输出阀门78、第三控制器及执行器79。细胞/载体分离装置8的横截面是“倒L”形状，与垂直方向呈15°～45°，上部分长宽比在3～5之间，用于病毒上清液的分离；下部分长宽比在5～10之间，用于细胞/载体的回流和陈旧载体的回收。连接方式为：外框体72构成细胞/载体分离装置8的外壳，沉积板75平行分布在细胞/载体分离装置8内部，间距在0.5～1.5cm之间，细胞/载体分离装置8的中间部位是病毒混合液输入口70，上端是病毒上清液输出口73和第三传感器74，下端是细胞/载体回流输出口69、第三取样口76和陈旧载体输出口77；陈旧载体输出口77通过载体输出阀门78控制的硅橡胶管线与陈旧载体收集装置12相连；第三控制器及执行器79通过数据线一端与第三传感器74连接，另一端与第四自控阀门71、病毒增殖单元7中的第三自控阀门57、细胞扩增单元4中的第二自控阀门35和气体供应单元1中的第一自控阀门17连接，在线自动控制第一自控阀门17、第二自控阀门35、第三自控阀门57、病毒混合液输入口70、细胞/载体回流输出口69和病毒上清液输出口73。
如图6所示，病毒收集装置9包括：液体分配器入口80、液体分配器81、液体分配器出口82、液位自控开关阀门83，病毒液输入口84、液位传感器85、病毒液输出口86、灭活剂输入口87、第四0.2μm滤膜88、第四出气口89、病毒罐90和第四控制器及执行器91。连接方式为：液体分配器81的一端通过液体分配器入口80与细胞/载体分离装置8中的病毒上清液输出口73相连，另一端液体分配器出口82通过液位自控开关阀门83与病毒罐90上的病毒液输入口84相连；病毒罐90与病毒液输入口84、液位传感器85、病毒液输出口86、灭活剂输入口87和第四出气口89相连；第四出气口89与第四0.2μm滤膜88相连；第四控制器及执行器91通过数据线一端与液位传感器85连接，另一端与液位自控开关阀门83连接，在线自动控制病毒液的收集、每一罐收集满后、用灭活剂封闭灭活病毒。
本系统固定安装好后，开启蒸汽发生器2，使蒸汽充分进入细胞扩增单元4、细胞生长培养基供应装置3、初级灌注收集装置5、病毒增殖单元7、基础培养基供应装置6、细胞/载体分离装置8、病毒收集装置9、酸/碱液供应装置11和陈旧载体收集装置12，对整个系统进行灭菌。灭菌后，关闭蒸汽发生器2，开启气体供应单元1的空气压缩机15，将系统中残留的蒸汽和水分吹干。然后，打开热源供应装置10，使热源在第一夹套28和第二夹套50循环流动，确保细胞培养生物反应器罐体29和病毒增殖反应器罐体51的温度。将灭过菌的细胞扩增培养基、基础培养基、酸/碱分别注入细胞生长培养基供应装置3、基础培养基供应装置6和酸/碱液供应装置11，然后将细胞生长培养基泵入细胞培养生物反应器罐体29。气体供应单元1供应的气体依次经三通17、第一自控阀门18、气体流量计19、气体混合装置20、气体增湿装置21和第一0.2μm滤膜25过滤灭菌后进入细胞培养生物反应器罐体29，为细胞扩增过程提供适宜供气组成和流量。调节第一搅拌装置45和使气体和细胞生长培养基均匀混合。然后，从细胞接种口32接种细胞，初级灌注培养，细胞扩增至适当密度后停止初级灌注培养，由细胞生长培养基供应装置3提供流加细胞生长培养基(若微载体悬浮培养时，还要向培养基中加入微载体并混合流加)，连续培养细胞。细胞混合液流入病毒增殖反应器罐体51，同时通过基础培养基供应装置6流加基础培养基，二者按一定比例混合共同组成病毒增殖培养基，从病毒接种口59接种病毒，再按照与细胞扩增过程相同的步骤开启气体供应单元1和第二搅拌装置66，进行微分式病毒初级增殖，当液体体积达到病毒增殖反应器罐体51的有效体积时，从病毒增殖单元7中流出的病毒混合液进入细胞/载体分离装置8，进行病毒的连续增殖过程。通过细胞/载体分离装置8的沉降分离，细胞/载体回流进入病毒增殖反应器罐体51，病毒上清液进入病毒收集装置9进行收集，封闭灭活，实现连续封闭式细胞培养病毒和灭活，而且可依据系统运行情况间歇收集陈旧载体至陈旧载体收集装置12，可减少陈旧载体对病毒增殖的影响，其中含有的少量病毒上清液并入病毒收集装置9一同收集、封闭灭活。
在系统运行过程中，感应器包括测温元件、pH电极、溶氧电极和营养物质测量电极、细胞密度测量电极和液位传感器与控制器及执行器连接，在线自动监测控制，调节热源、酸/碱、培养基的流量与供气组成和流量，维持系统稳定和细胞培养病毒生产/灭活过程的顺利进行。同时，也可以通过取样口进行取样分析。
Claims (10)
1、一种安全高效连续封闭式细胞培养病毒生产/灭活系统，包括：气体供应单元(1)、蒸汽发生器(2)、细胞生长培养基供应装置(3)、细胞扩增单元(4)、初级灌注收集装置(5)、基础培养基供应装置(6)、病毒增殖单元(7)、细胞/载体分离装置(8)、病毒收集装置(9)、热源供应装置(10)、酸/碱液供应装置(11)、陈旧载体收集装置(12)，其特征在于，气体供应单元(1)分两路，出口端的一路与细胞扩增单元(4)的进口端连接，另一路与病毒增殖单元(7)的进口端连接，蒸汽发生器(2)的出口端与细胞扩增单元(4)的进口端连接，细胞生长培养基供应装置(3)的出口端与细胞扩增单元(4)的进口端连接，初级灌注收集装置(5)的入口端与细胞扩增单元(4)的出口端连接，热源供应装置(10)分别与细胞扩增单元(4)和病毒增殖单元(7)连接，酸/碱液供应装置(11)的出口端分别与细胞扩增单元(4)和病毒增殖单元(7)的进口端连接，细胞扩增单元(4)的出口端与病毒增殖单元(7)的进口端连接，基础培养基供应装置(6)的出口端与病毒增殖单元(7)的进口端连接，细胞/载体分离装置(8)的进口端与病毒增殖单元(7)的出口端相连接，三个出口端分别与病毒增殖单元(7)、病毒收集装置(9)和陈旧载体收集装置(12)的进口端连接，陈旧载体收集装置(12)的出口端和病毒收集装置(9)的进口端连接。
2、根据权利要求1所述的安全高效连续封闭式细胞培养病毒生产/灭活系统，其特征是，气体供应单元(1)包括：气体钢瓶(13)、粗过滤器(14)、空气压缩机(15)、三通(16)、第一自控阀门(17)、气体流量计(18)、气体混合装置(19)和气体增湿装置(20)，其中，气体混合装置(19)顶部一侧是四个气体入口(21)，另一侧是一个混合气体出口(22)；气体增湿装置(20)顶部整合有第一进气口(23)和第一出气口(24)，第一进气接口(23)深入容器内近底部处；粗过滤器(14)与空气压缩机(15)的入口相连，气体钢瓶(13)、空气压缩机(15)通过铜输气管道顺次连接第一自控阀门(17)、气体流量计(18)、气体混合装置(19)和气体增湿装置(20)的第一进气口(23)、第一出气口(24)与第一0.2μm滤膜(25)相接。
3、根据权利要求2所述的安全高效连续封闭式细胞培养病毒生产/灭活系统，其特征是，气体钢瓶(13)有三个，为：N2气体钢瓶、CO2气体钢瓶、O2气体钢瓶。
4、根据权利要求2所述的安全高效连续封闭式细胞培养病毒生产/灭活系统，其特征是，气体混合装置(19)呈椭圆柱形，其椭圆顶部一侧是四个气体入口(21)；气体增湿装置(20)主体为圆柱型半球顶玻璃容器。
5、根据权利要求1所述的安全高效连续封闭式细胞培养病毒生产/灭活系统，其特征是，细胞扩增单元(4)包括：第一热源输入口(26)、第一热源输出口(27)、第一夹套(28)、细胞培养生物反应器罐体(29)、第二进气口(30)、蒸汽输入口(31)、细胞接种口(32)、细胞生长培养基输入口(33)、第一酸/碱输入口(34)、第二自控阀门(35)、第一电动机和变速装置(36)、第一传感器(37)、初级灌注输出口(38)、第一取样口(39)、细胞混合液输出口(40)、第二出气口(41)、第二0.2μm滤膜(42)、第一盖板(43)、细胞截流装置(44)、第一搅拌装置(45)、第一气体分布器(46)和第一控制器及执行器(47)，其中，细胞扩增单元(4)的主体由细胞培养生物反应器罐体(29)和覆盖其上的第一盖板(43)组成，细胞培养生物反应器罐体(29)的周围是第一夹套(28)，上面设有的第一热源输入口(26)和第一热源输出口(27)；第一盖板(43)上连出入口，入口包括第二进气口(30)、蒸汽输入口(31)、细胞接种口(32)、细胞生长培养基输入口(33)和第一酸/碱输入口(34)，出口包括第一传感器(37)、初级灌注输出口(38)、第一取样口(39)、细胞混合液输出口(40)和第二出气口(41)；蒸汽输入口(31)与蒸汽发生器(2)相连；初级灌注输出口(38)通过不锈钢管与细胞截流装置(44)连接；第二进气口(30)通过硅橡胶管与第一气体分布器(46)相连；第二出气口(41)与第二0.2μm滤膜(42)相连；第一电动机和变速装置(36)位于第一盖板(43)的上面，与第一搅拌装置(45)相连；第一控制器及执行器(47)通过数据线一端与第一传感器(37)连接，另一端与第二自控阀门(35)、第一电动机和变速装置(36)和气体供应单元(1)中的第一自控阀门(17)连接，在线自动控制细胞生长培养基输入口(33)、第一酸/碱输入口(34)、第一电动机和变速装置(36)、细胞混合液输出口(40)和气体供应单元(1)中的第一自控阀门(17)。
6、根据权利要求1所述的安全高效连续封闭式细胞培养病毒生产/灭活系统，其特征是，病毒增殖单元(7)包括：第二热源输入口(48)、第二热源输出口(49)、第二夹套(50)、病毒增殖反应器罐体(51)、第三进气口(52)、细胞混合液输入口(53)、细胞/载体回流输入口(54)、基础培养基输入口(55)、第二酸/碱输入口(56)、第三自控阀门(57)、第二电动机和变速装置(58)、病毒接种口(59)、第二传感器(60)、第二取样口(61)、病毒混合液输出口(62)、第三出气口(63)、第三0.2μm滤膜(64)、第二盖板(65)、第二搅拌装置(66)、第二气体分布器(67)、第二控制器及执行器(68)，其中，病毒增殖单元(7)的主体由病毒增殖反应器罐体(51)和覆盖其上的第二盖板(65)组成，病毒增殖反应器罐体(51)的周围是第二夹套(50)，上面设有的第二热源输入口(48)和第二热源输出口(49)；第二盖板(65)上连有出入口，入口包括第三进气口(52)、细胞混合液输入口(53)、细胞/载体回流输入口(54)、基础培养基输入口(55)、第二酸/碱输入口(56)和病毒接种口(59)，出口包括第二传感器(60)、第二取样口(61)、病毒混合液输出口(62)和第三出气口(63)；第三进气口(52)通过硅橡胶管与第二气体分布器(67)相连；第三出气口(63)和第三0.2μm滤膜(64)相连；第二电动机和变速装置(58)位于第二盖板(65)的上面，与第二搅拌装置(66)相连；第二控制器及执行器(68)一端与第二传感器(60)连接，另一端与第三自控阀门(57)、第二电动机和变速装置(58)、细胞扩增单元(4)中的第二自控阀门(35)和气体供应单元(1)中的第一自控阀门(17)连接，在线自动控制第一自控阀门(17)、第二自控阀门(35)、基础培养基输入口(55)、第二酸/碱输入口(56)、第二电动机和变速装置(58)、细胞/载体回流输入口(54)和病毒混合液输出口(62)。
7、根据权利要求1所述的安全高效连续封闭式细胞培养病毒生产/灭活系统，其特征是，细胞/载体分离装置(8)包括：细胞/载体回流输出口(69)、病毒混合液输入口(70)、第四自控阀门(71)、外框体(72)、病毒上清液输出口(73)、第三传感器(74)、沉积板(75)、第三取样口(76)、陈旧载体输出口(77)、载体输出阀门(78)、第三控制器及执行器(79)，其中，外框体(72)构成细胞/载体分离装置(8)的外壳，沉积板(75)设在细胞/载体分离装置(8)内部，细胞/载体分离装置(8)的中间部位是病毒混合液输入口(70)，上端是病毒上清液输出口(73)和第三传感器(74)，下端是细胞/载体回流输出口(69)、第三取样口(76)和陈旧载体输出口(77)；陈旧载体输出口(77)通过载体输出阀门(78)控制的硅橡胶管线与陈旧载体收集装置(12)相连；第三控制器及执行器(79)一端与第三传感器(74)连接，另一端与第四自控阀门(71)、病毒增殖单元(7)中的第三自控阀门(57)、细胞扩增单元(4)中的第二自控阀门(35)和气体供应单元(1)中的第一自控阀门(17)连接，在线自动控制第一自控阀门(17)、第二自控阀门(35)、第三自控阀门(57)、病毒混合液输入口(70)、细胞/载体回流输出口(69)和病毒上清液输出口(73)。
8、根据权利要求1或者7所述的安全高效连续封闭式细胞培养病毒生产/灭活系统，其特征是，细胞/载体分离装置(8)横截面是倒L形状，与垂直方向呈15°～45°，上部分长宽比在3～5之间，下部分长宽比在5～10之间。
9、根据权利要求7所述的安全高效连续封闭式细胞培养病毒生产/灭活系统，其特征是，沉积板(75)平行分布在细胞/载体分离装置(8)内部，间距在0.5～1.5cm之间，硅渗处理。
10、根据权利要求1所述的安全高效连续封闭式细胞培养病毒生产/灭活系统，其特征是，病毒收集装置(9)包括：液体分配器入口(80)、液体分配器(81)、液体分配器出口(82)、液位自控开关阀门(83)、病毒液输入口(84)、液位传感器(85)、病毒液输出口(86)、灭活剂输入口(87)、第四0.2μm滤膜(88)、第四出气口(89)、病毒罐(90)和第四控制器及执行器(91)，其中，液体分配器(81)的一端通过液体分配器入口(80)与细胞/载体分离装置(8)中的病毒上清液输出口(73)相连，另一端液体分配器出口(82)通过液位自控开关阀门(83)与病毒罐(90)上的病毒液输入口(84)相连，病毒罐(90)与病毒液输入口(84)、液位传感器(85)、病毒液输出口(86)、灭活剂输入口(87)和第四出气口(89)相连，第四出气口(89)与第四0.2μm滤膜(88)相连，第四控制器及执行器(91)一端与液位传感器(85)连接，另一端与液位自控开关阀门(83)连接。
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