CN107746797B - 一种使用一次性袋子进行狂犬病毒灭活、灭活剂水解的装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种使用一次性袋子进行狂犬病毒灭活、灭活剂水解的装置及方法，其中灭活一次性袋子，开设有三个连接口，上部为充气口，连接充气组，底部分别为液体入口和液体出口，分别连接充液组和排液组，袋子中央设有内置搅拌器；其中充气组由囊式滤器、硅胶管、管道夹组成，囊式滤器外包裹有无菌袋；充液组分别由连接头B、硅胶管、管道夹、三通及EZD阀门依次连接，三通的另一开口连接硅胶管、管道夹及连接头A；优点为：对一次性袋子进行了改造及合理使用，使病毒液的灭活/水解方法得到了改进，降低了病毒灭活失败风险、减少了抗原损失，降低了生产成本。

Description

一种使用一次性袋子进行狂犬病毒灭活、灭活剂水解的装置 及方法

技术领域

本发明涉及病毒疫苗生产领域，尤其是涉及一种使用一次性袋子进行狂犬病毒灭活、灭活剂水解的装置及方法。

背景技术

当前疫苗生产车间病毒原液灭活时使用的容器主要为20L Nalgene塑料桶或不锈钢罐。一次性袋子主要用于生产中所需溶液的配制、储存、转移。使用20L桶或不锈钢罐进行狂犬病毒灭活前需要进行高压灭菌、清洁验证、检测清洁剂/消毒剂的残余等，一次性袋子有完整的厂家验证支持可以直接使用，用于规模化生产时可以减少清洁、灭菌环节，减少设备占用空间，成本相对较低。

使用20L桶或不锈钢罐需要使用磁力搅拌或摇床进行灭活剂与病毒原液的混匀，混合过程由于剧烈摇晃会产生大量泡沫，容易造成灭活不充分及抗原的损失。

发明内容

本发明的目的在于为解决现有技术的不足，而提供一种使用一次性袋子进行狂犬病毒灭活、灭活剂水解的装置及方法。

本发明新的技术方案是：一种使用一次性袋子进行狂犬病毒灭活、灭活剂水解方法，包括灭活一次性袋子、水解一次性袋子及硅胶管，灭活一次性袋子开设有三个连接口，上部为充气口A，连接充气组A，底部分别为液体入口和液体出口，分别连接充液组和排液组，袋子中央设有内置搅拌器A；其中充气组A由囊式滤器A、硅胶管A、管道夹A组成，囊式滤器A外包裹有无菌袋；充液组分别由连接头B、硅胶管、管道夹、三通及EZD阀门A依次连接，三通的另一开口连接硅胶管、管道夹及连接头A；排液组由连接头C、硅胶管及EZD阀门B依次连接；水解一次性袋子，开设有四个连接口，上部分别为连接充气组B的充气口B和连接灭活一次性袋子液体出口的进液口，底部分别为出液口和温度探头连接口，袋子中央设有内置搅拌器B；其中充气组B由囊式滤器B、硅胶管、管道夹组成，囊式滤器B外包裹有无菌袋；进液口通过进液组与灭活一次性袋子液体出口连接，进液组分别由连接头D、硅胶管、管道夹、三通及EZD阀门C依次连接，三通的另一开口连接硅胶管、管道夹及连接头E；出液口连接出液组，出液组由连接头F、硅胶管及EZD阀门D依次连接；

所述方法包括以下步骤：

①将生产细胞的复苏、传代，然后将传代的生产细胞置于微载体生物反应器中扩增培养；

②向微载体生物反应器中加入处理液，调整微载体生物反应器的灌流速度为0，清洗生产细胞表面，在清洗后的生产细胞上接种狂犬病病毒固定毒株；

③收获病毒液，进行过滤澄清，超滤浓缩；

④病毒浓缩液灭活：从灭活一次性袋子的顶部通过充气组A进行预充气，病毒浓缩液由连接头A口进入，灭活剂由连接头B进入，用PBS溶液由连接头B口进行顶洗，关闭EZD阀门A，置于2-8℃冷库中，持续搅拌灭活24h；

⑤病毒灭活液的转移：从水解一次性袋子的顶部通过充气组B进行预充气，然后置于具有TCU控温系统的水浴套筒中，将装有灭活病毒液的灭活一次性袋子的连接头C与水解一次性袋子的连接头E口相连接，进行病毒液的转移；

⑥水解去除灭活剂： 37℃水浴加热2h以使灭活剂完全水解，将NaOH溶液由连接头D进入水解一次性袋子，以调节病毒灭活液pH至7.4-7.8，水解后的病毒灭活液由连接头F排出；

所述生产细胞为Vero细胞、人二倍体细胞、地鼠肾细胞、鸡胚细胞、鸭胚细胞中的任一项，所述狂犬病病毒固定毒株为PV株、巴斯德株、Pitman-Moore、CVS、Flury LEP、FluryHEP、Kelev、ERA株中的任一株；

所述灭活剂水解时所用的水浴装置是TCU控温，冷媒/热媒双向控制；

所述病毒液的澄清方法是将狂犬病毒收获液经过0.8μm和0.65μm的过滤器进行澄清；

所述病毒液的浓缩方法是将澄清后的狂犬病病毒收获液使用300KD或750KD的超滤膜包或中空纤维柱进行超滤浓缩，浓缩倍数为20-30倍；

所用的灭活剂为β-丙内酯，先将β-丙内酯用注射用水1:40倍稀释，再以体积比1:100添加到病毒浓缩液中；

所述步骤④搅拌条件为2-8℃下，150-180rpm，持续搅拌24h。

本发明的有益效果是：对一次性袋子进行了改造及合理使用，使病毒液的灭活/水解方法得到了改进，降低了病毒灭活失败风险、减少了抗原损失，降低了生产成本。

一次性袋子所用的材料非常稳固且高度柔韧，损坏的风险小，材质透明，便于灭活/水解过程中溶液状态的观察。具有内置搅拌器，能使β-丙内酯与病毒原液充分混匀。浓缩液从底部进液，减少料液飞溅。独有的EZ-Drain阀门设计，无安全死角，能保证灭活充分。灭活/水解过程只需经过一次病毒液的转移，EZ-Drain排料，转移无残留，降低灭活失败风险。

一次性袋子较20L Nalgene塑料桶或不锈钢罐的壁薄，换热系数高，与之相匹配的TCU控温系统具有升温快速、控温精准的特点，可以很好地用于灭活剂的水解。

附图说明

图1为本发明的病毒灭活用一次性袋子的示意图。

图2为本发明的灭火剂水解用一次性袋子的示意图。

其中：1为充气组A，2为充液组，3为排液组，4为管道夹A，5为硅胶管A，6为充气口A，7为囊式滤器A，8为EZD阀门A，9为内置搅拌器A，10为灭活一次性袋子，11为液体入口，12为连接头B，13为液体出口，14为连接头A，15为EZD阀门B，16为连接头F，17为连接头C，18为充气组B，19为充气口B，20为水解一次性袋子，21为连接头E，22为进液组，23为连接头D，24为进液口，25为温度探头连接口， 26为出液口，27为出液组。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步说明。

一种使用一次性袋子进行狂犬病毒灭活、灭活剂水解方法，包括灭活一次性袋子10、水解一次性袋子20及硅胶管，灭活一次性袋子10开设有三个连接口，上部为充气口A6，连接充气组A1，底部分别为液体入口11和液体出口13，分别连接充液组2和排液组3，袋子中央设有内置搅拌器A9；其中充气组A1由囊式滤器A7、硅胶管A5、管道夹A4组成，囊式滤器A7外包裹有无菌袋；充液组2分别由连接头B12、硅胶管、管道夹、三通及EZD阀门A8依次连接，三通的另一开口连接硅胶管、管道夹及连接头A14；排液组3由连接头C17、硅胶管及EZD阀门B15依次连接；水解一次性袋子20，开设有四个连接口，上部分别为连接充气组B18的充气口B19和连接灭活一次性袋子10液体出口13的进液口24，底部分别为出液口26和温度探头连接口25，袋子中央设有内置搅拌器B；其中充气组B18由囊式滤器B、硅胶管、管道夹组成，囊式滤器B外包裹有无菌袋；进液口24通过进液组22与灭活一次性袋子10液体出口13连接，进液组22分别由连接头D23、硅胶管、管道夹、三通及EZD阀门C依次连接，三通的另一开口连接硅胶管、管道夹及连接头E21；出液口26连接出液组27，出液组27由连接头F16、硅胶管及EZD阀门D依次连接；

所述方法包括以下步骤：

①将生产细胞的复苏、传代，然后将传代的生产细胞置于微载体生物反应器中扩增培养；

②向微载体生物反应器中加入处理液，调整微载体生物反应器的灌流速度为0，清洗生产细胞表面，在清洗后的生产细胞上接种狂犬病病毒固定毒株；

③收获病毒液，进行过滤澄清，超滤浓缩；

④病毒浓缩液灭活：从灭活一次性袋子10的顶部通过充气组A1进行预充气，病毒浓缩液由连接头A14口进入，灭活剂由连接头B12进入，用PBS溶液由连接头B12口进行顶洗，关闭EZD阀门A8，置于2-8℃冷库中，持续搅拌灭活24h；

⑤病毒灭活液的转移：从水解一次性袋子20的顶部通过充气组B18进行预充气，然后置于具有TCU控温系统的水浴套筒中，将装有灭活病毒液的灭活一次性袋子10的连接头C17与水解一次性袋子20的连接头E21口相连接，进行病毒液的转移；

⑥水解去除灭活剂： 37℃水浴加热2h以使灭活剂完全水解，将NaOH溶液由连接头D23进入水解一次性袋子20，以调节病毒灭活液pH至7.4-7.8，水解后的病毒灭活液由连接头F16排出；

所述生产细胞为Vero细胞、人二倍体细胞、地鼠肾细胞、鸡胚细胞、鸭胚细胞中的任一项，所述狂犬病病毒固定毒株为PV株、巴斯德株、Pitman-Moore、CVS、Flury LEP、FluryHEP、Kelev、ERA株中的任一株；

所述灭活剂水解时所用的水浴装置是TCU控温，冷媒/热媒双向控制；

所述病毒液的澄清方法是将狂犬病毒收获液经过0.8μm和0.65μm的过滤器进行澄清；

所述病毒液的浓缩方法是将澄清后的狂犬病病毒收获液使用300KD或750KD的超滤膜包或中空纤维柱进行超滤浓缩，浓缩倍数为20-30倍；

所用的灭活剂为β-丙内酯，先将β-丙内酯用注射用水1:40倍稀释，再以体积比1:100添加到病毒浓缩液中；

所述步骤④搅拌条件为2-8℃下，150-180rpm，持续搅拌24h。

实施例1 狂犬病疫苗病毒液的规模化灭活方法：

取制备好的Vero细胞狂犬病毒收获液先经0.8μm和0.45μm微孔滤器过滤，澄清过滤后用Millipore的300KD超滤膜包超滤,超滤浓缩前，先用不含人血白蛋白的冲洗液（BME液，含质量百分比0.02%谷氨酰胺，24.63%碳酸氢钠）来平衡膜包，检测回流液的pH值，pH值为6.0，符合要求后进行浓缩，浓缩倍数25倍。从A口转移病毒合并液至灭活一次性袋子10中。将β-丙内酯首先用灭菌注射用水1:40倍稀释，再按照1:100的体积比从袋子B口加到病毒浓缩合并液中，用PBS溶液由B口进行顶洗。关闭EZD阀门A8，置于2-8℃冷库中，持续搅拌灭活12h，转速为150rpm。将一个水解一次性袋子20从连接头E21口进行预充气，然后置于TCU水浴套筒中。将灭活病毒液从连接头F16口转移到该袋子中。37℃水浴加热2h以使灭活剂完全水解。将NaOH溶液由G口进入以调节病毒灭活液pH至7.4-7.8。H口为水解后的病毒灭活液出口。

实施例2 灭活剂水解情况：

通过气相色谱的分析方法监测β-丙内酯在37℃水解情况。β-丙内酯水解情况分析。通过检测结果分析，β-丙内酯在水解150min时其浓度由未水解时的299.4ppm降至34.4ppm，低于该方法定量限以下，说明β-丙内酯在37℃水解150min可完全达到水解效果。

实施例3细胞法验证灭活效果：

按实施例的灭活方法，取病毒原液按照每3cm²细胞接种1ml的比例将灭活后的狂犬病毒液接种于MRC-5细胞，培养7天后传代，继续培养至21天，将细胞悬液接种Lab-tek腔室载玻片（购自Thermo公司），于3-4天后对Lab-tek用免疫荧光法观察是否存在狂犬病毒。其中14天和21天分别更换细胞维持液（MEM液含4%的胎牛血清），并收集细胞上清进行小鼠脑腔功毒，观察小鼠21天。实验同时设立细胞阴性对照和病毒阳性对照，以确定试验的有效性。

实施例4抗原含量分析验证灭活效果：

按实施例的方法，在单次浓缩液及原液取样检测狂犬病毒抗原含量，采用双抗夹心法测定抗原含量。在测定时，把样品（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的 深浅定性或定量分析。

Claims (1)

1.一种使用一次性袋子进行狂犬病毒灭活、灭活剂水解方法，包括灭活一次性袋子（10）、水解一次性袋子（20）及硅胶管，其特征在于：灭活一次性袋子（10）开设有三个连接口，上部为充气口A（6），连接充气组A（1），底部分别为液体入口（11）和液体出口（13），分别连接充液组（2）和排液组（3），袋子中央设有内置搅拌器A（9）；其中充气组A（1）由囊式滤器A（7）、硅胶管A（5）、管道夹A（4）组成，囊式滤器A（7）外包裹有无菌袋；充液组（2）分别由连接头B（12）、硅胶管、管道夹、三通及EZD阀门A（8）依次连接，三通的另一开口连接硅胶管、管道夹及连接头A（14）；排液组（3）由连接头C（17）、硅胶管及EZD阀门B（15）依次连接；水解一次性袋子（20），开设有四个连接口，上部分别为连接充气组B（18）的充气口B（19）和连接灭活一次性袋子（10）液体出口（13）的进液口（24），底部分别为出液口（26）和温度探头连接口（25），袋子中央设有内置搅拌器B；其中充气组B（18）由囊式滤器B、硅胶管、管道夹组成，囊式滤器B外包裹有无菌袋；进液口（24）通过进液组（22）与灭活一次性袋子（10）液体出口（13）连接，进液组（22）分别由连接头D（23）、硅胶管、管道夹、三通及EZD阀门C依次连接，三通的另一开口连接硅胶管、管道夹及连接头E（21）；出液口（26）连接出液组（27），出液组（27）由连接头F（16）、硅胶管及EZD阀门D依次连接；

所述方法包括以下步骤：

①将生产细胞的复苏、传代，然后将传代的生产细胞置于微载体生物反应器中扩增培养；

②向微载体生物反应器中加入处理液，调整微载体生物反应器的灌流速度为0，清洗生产细胞表面，在清洗后的生产细胞上接种狂犬病病毒固定毒株；

③收获病毒液，进行过滤澄清，超滤浓缩；

④病毒浓缩液灭活：从灭活一次性袋子（10）的顶部通过充气组A（1）进行预充气，病毒浓缩液由连接头A（14）口进入，灭活剂由连接头B（12）进入，用PBS溶液由连接头B（12）口进行顶洗，关闭EZD阀门A（8），置于2-8℃冷库中，持续搅拌灭活24h；

⑤病毒灭活液的转移：从水解一次性袋子（20）的顶部通过充气组B（18）进行预充气，然后置于具有TCU控温系统的水浴套筒中，将装有灭活病毒液的灭活一次性袋子（10）的连接头C（17）与水解一次性袋子（20）的连接头E（21）口相连接，进行病毒液的转移；

⑥水解去除灭活剂： 37℃水浴加热2h以使灭活剂完全水解，将NaOH溶液由连接头D（23）进入水解一次性袋子（20），以调节病毒灭活液pH至7.4-7.8，水解后的病毒灭活液由连接头F（16）排出；

所述生产细胞为Vero细胞、人二倍体细胞、地鼠肾细胞、鸡胚细胞、鸭胚细胞中的任一项，所述狂犬病病毒固定毒株为PV株、巴斯德株、Pitman-Moore、CVS、Flury LEP、FluryHEP、Kelev、ERA株中的任一株；

所述灭活剂水解时所用的水浴装置是TCU控温，冷媒/热媒双向控制；

所述病毒液的澄清方法是将狂犬病毒收获液经过0.8μm和0.65μm的过滤器进行澄清；

所述病毒液的浓缩方法是将澄清后的狂犬病病毒收获液使用300KD或750KD的超滤膜包或中空纤维柱进行超滤浓缩，浓缩倍数为20-30倍；

所用的灭活剂为β-丙内酯，先将β-丙内酯用注射用水1:40倍稀释，再以体积比1:100添加到病毒浓缩液中；

所述步骤④搅拌条件为2-8℃下，150-180rpm，持续搅拌24h。