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KR20240098237A - 키다리병 저항성 벼 품종 판별을 위한 테트라 프라이머 arms-pcr용 분자마커 및 이의 용도 - Google Patents

키다리병 저항성 벼 품종 판별을 위한 테트라 프라이머 arms-pcr용 분자마커 및 이의 용도 Download PDF

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KR20240098237A
KR20240098237A KR1020220179312A KR20220179312A KR20240098237A KR 20240098237 A KR20240098237 A KR 20240098237A KR 1020220179312 A KR1020220179312 A KR 1020220179312A KR 20220179312 A KR20220179312 A KR 20220179312A KR 20240098237 A KR20240098237 A KR 20240098237A
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KR
South Korea
Prior art keywords
rice
seq
disease
pcr
primer
Prior art date
Application number
KR1020220179312A
Other languages
English (en)
Inventor
권순욱
장성규
이아림
Original Assignee
부산대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 부산대학교 산학협력단 filed Critical 부산대학교 산학협력단
Priority to KR1020220179312A priority Critical patent/KR20240098237A/ko
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Abstract

본 발명은 키다리병 저항성 벼 품종 판별을 위한 테트라 프라이머 ARMS-PCR용 분자마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 13의 염기서열 중 203, 2,092 및 2,320번째 염기에 위치한 SNP (single nucleotide polymorphism)를 각각 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벼의 키다리병 저항성 판별을 위한 SNP 마커 조성물, 서열번호 1 내지 4로 표시된 올리고뉴클레오티드; 서열번호 5 내지 8로 표시된 올리고뉴클레오티드; 및 서열번호 9 내지 12로 표시된 올리고뉴클레오티드;를 포함하는 벼의 키다리병 저항성 판별용 프라이머 세트 조성물, 상기 프라이머 세트 조성물을 포함하는 키트 및 상기 프라이머 세트 조성물을 이용한 벼의 키다리병 저항성 판별 방법에 관한 것이다.

Description

키다리병 저항성 벼 품종 판별을 위한 테트라 프라이머 ARMS-PCR용 분자마커 및 이의 용도{Tetra primers ARMS-PCR molecular marker for discriminating rice cultivars resistant to Bakanae disease and uses thereof}
본 발명은 키다리병 저항성 벼 품종 판별을 위한 테트라 프라이머 ARMS-PCR용 분자마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
Fusarium fujikurio로부터 발생되는 키다리병(Bakanae disease)은 대부분의 벼 생산 지역에서 심각한 피해를 보이고 있으며, 높은 수확량 손실(3.0 ~ 95.4%)을 초래하는 것으로 보고되고 있다. 키다리병은 아시아와 아프리카, 그리고 북아메리카와 이탈리아와 같은 쌀 재배 국가들의 심각한 문제들 중 하나이다. 이 병은 볍씨의 감염을 시작으로 발아 단계부터 성숙 단계까지 벼에 영향을 미치는 것으로 보고되고 있으며, 감염된 어린 묘는 자라면서 황색으로 변하며, 비정상적인 신장을 보인다. 이러한 키다리병을 방제하는 방법으로는 온수 침지법 또는 농약을 종자에 처리하는 것이다. 그러나 온수 침지법은 종피 내부까지 키다리병에 심각하게 오염된 볍씨에는 효과가 낮고, 최근에는 농약에 내성을 보이는 균주도 보고되고 있다. 특히 국내 육성 품종에는 키다리병 저항성을 갖는 품종이 거의 없어 다양한 저항성 자원을 확보하고, 적극적으로 품종 개발에 활용하는 것이 이 질병을 통제하는 보다 경제적이고 환경친화적인 방법이라고 할 수 있다.
최근의 분자육종에는 다양한 형질연관 다양한 분자마커가 선발에 활용(Marker-Assisted Selection, MAS)되어 보다 정확하게 원하는 유전자형을 식별하고 육종 효율성을 획기적으로 개선할 수 있게 되었다. 병 저항성에 대한 양적형질유전자좌(quantitative trait loci, QTL)의 탐색은 벼의 병 저항성 개선을 위한 MAS 전략 개발의 전제로 고려되었다.
특히 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)에 기반한 분자 마커는 많은 처리량과 자동화 시스템으로 인하여 벼에서 MAS 육종의 효율을 위해 유용한 것으로 알려져 있는데, 예를 들어 Kompetitive Allele Specific PCR genotyping system (KASP) 마커, Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (CAPS) 마커, Derived CAPS(dCAPS) 마커 및 Taqman 마커 등이 있다. 그러나, CAPS 마커는 제한 효소를 사용하는데 복잡하고 시간이 많이 소요되는 방법이며, KASP 또는 Taqman 마커는 분석과정에서 비용이 다소 많이 든다.
Tetra amplification refractory mutation system polymerase chain reaction (Tetra ARMS-PCR)은 SNP를 검출하기 위해 최근에 개발된 방법으로, 대립 유전자의 특이적인 부위를 증폭시키는 중합효소연쇄반응(PCR)을 기반으로 한다. 4개의 프라이머로 1회 PCR 증폭을 수행하고 전기영동으로 증폭산물을 분석하여 유전자형을 구별할 수 있으며, 빠르고, 간편하며, 가격이 저렴하다는 장점이 있다.
본 발명은 전체유전체 상관분석연구(genome-wide association study, GWAS)와 전사체 분석을 적용하여 169개의 국내 재래종을 이용하여 벼의 키다리병 관련 QTL 또는 유전자를 확인하는 것이다. 또한 확인된 유전자 내 유전자형 변이를 탐색하고 이들 변이를 감지할 수 있는 Tetra ARMS-PCR 방법에 기반한 분자마커 세트를 개발하였다.
한편, 한국등록특허 제2267339호에는 Os09g0298700 유전자의 InDel (Insertion/Deletion) 부위에 기반한 '삼광벼 유래 키다리병 저항성 선발 마커'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제2081973호에는 Os01g0601675 유전자의 SNP 변이에 기반한 '벼 키다리병 저항성 벼 판별용 SNP 마커'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2018-0054070호에는 LRR (leucine rich repeat) 패밀리에 속하는 유전자 2종(Os01g0601625, Os01g0601675)의 InDel 부위에 기반한 '남평벼 유래 DNA 마커를 포함하는 키다리병 저항성 벼 품종 선별용 조성물 및 상기 DNA 마커를 이용한 키다리병 저항성 벼 품종 선별 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 OsUBC18 (Os09g12230) 유전자의 SNP에 기반한 '키다리병 저항성 벼 품종 판별을 위한 테트라 프라이머 ARMS-PCR용 분자마커 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 169점의 국내 재래종 벼 자원의 유전적 다양성과 집단 구조를 분석하고, GWAS 분석을 통해 키다리병(Bakanae disease) 저항성 유전자 좌위를 탐색하여, 9번 염색체에 위치하는 OsUBC18 (Os09g12230) 유전자에서 키다리병 저항성 품종과 감수성 품종간 SNP 변이를 발견하였고, 상기 SNP 변이를 포함하는 OsUBC18 유전자의 단상형(haplotype) 유형을 구분할 수 있는 테트라 프라이머 ARMS-PCR 마커를 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 13의 염기서열 중 203, 2,092 및 2,320번째 염기에 위치한 SNP (single nucleotide polymorphism)를 각각 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벼의 키다리병 저항성 판별을 위한 SNP 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 4로 표시된 올리고뉴클레오티드; 서열번호 5 내지 8로 표시된 올리고뉴클레오티드; 및 서열번호 9 내지 12로 표시된 올리고뉴클레오티드;를 포함하는, 벼의 키다리병 저항성 판별용 프라이머 세트 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 조성물 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 벼의 키다리병 저항성 판별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 벼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 벼의 키다리병 저항성 판별 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 분자마커를 이용하면 효율적으로 키다리병 저항성 또는 감수성 벼 자원을 구분할 수 있으므로, 본 발명의 분자마커는 MAS (Marker-Assisted Selection)를 통한 키다리병 저항성을 개선한 벼 품종 육종에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
도 1은 169점의 국내 재래종 벼에 대한 집단 구조(population structure) 분석 결과이다. (A)는 벼의 전장 유전체에서 맵핑된 SNP의 분포를 보여주며, (B)는 169점 재래종 벼의 PCA 분석 결과이고, (C)는 K (diverse groups) 값의 교차검증(CV) 에러를 보여주고, (D)는 K = 3일 때 유추된 집단 구조를 보여준다.
도 2는 GLM, MLM, CMLM 및 FarmCPU 방법을 이용하여 169점의 국내 재래종 벼의 키다리병 저항성에 대해 분석한 맨허튼 플랏(manhattan plot) 결과이다.
도 3은 qBK9에서 확인된 키다리병 저항성 관련 후보유전자 5종(LOC_Os09g12230, LOC_Os09g12270, LOC_Os09g12290, LOC_Os09g12300, LOC_Os09g12390)의 발현량 차이를 키다리병 저항성과 감수성 품종간 RNA-Seq. 데이터를 통해 확인한 결과이다.
도 4는 키다리병 저항성 품종[홍도(ja127), 강원도(ja177)]과 감수성 품종[고구도(ja181), 연안조(ja220)]을 대상으로 병원균 접종 1, 2 및 3주 후의 LOC_Os09g12230, LOC_Os09g12270, LOC_Os09g12290, LOC_Os09g12300 및 LOC_Os09g12390 유전자의 상대적 발현 수준을 분석한 결과이다.
도 5는 벼에서 키다리병 저항성과 관련된 LOC_Os09g12230 (OsUBC18)의 단상형(haplotype)에 관한 것으로, (A)는 LOC_Os09g12230에서 SNP 다형성 정보를 보여주는 것이고, (B)는 169개 재래종 벼에서 확인된 LOC_Os09g12230의 단상형 유형을 나타내며, (C)는 다른 단상형 유형을 가지는 벼 자원들의 키다리병 저항성 분석 box-plot 결과이다.
도 6은 본 발명의 분자마커(표 3)의 표적 서열에 대한 결합 위치를 보여준다.
도 7은 본 발명의 분자마커(표 3)를 이용한 테트라 프라이머 ARMS-PCR 증폭 산물의 아가로스 겔 로딩 사진으로, (A)는 PNU_Bak_1 마커를 이용한 결과이고, (B)는 PNU_Bak_2 및 PNU_Bak_3 마커를 이용한 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 13의 염기서열 중 203, 2,092 및 2,320번째 염기에 위치한 SNP (single nucleotide polymorphism)를 각각 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벼의 키다리병 저항성 판별을 위한 SNP 마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 SNP 마커 조성물에 있어서, 상기 서열번호 13은 OsUBC18 (Os09g12230) 유전자 서열로, 각 SNP 위치의 염기변이 정보는 도 5에 개시되어 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 SNP 마커 조성물에 있어서, 키다리병에 대한 저항성을 보이는 벼 자원은 상기 서열번호 13의 염기서열 중 203, 2,092 및 2,320번째 염기가 차례대로 A, G, G 또는 A, A, G일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 연속된 뉴클레오티드는 8 내지 100개의 연속된 뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 용어, "뉴클레오티드"는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이며, 특별하게 다르게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.
본 발명은 또한, 서열번호 1 내지 4로 표시된 올리고뉴클레오티드; 서열번호 5 내지 8로 표시된 올리고뉴클레오티드; 및 서열번호 9 내지 12로 표시된 올리고뉴클레오티드;를 포함하는, 벼의 키다리병 저항성 판별용 프라이머 세트 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 상기 서열번호 1 내지 12의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 3개의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 OsUBC18 (Os09g12230) 유전자(서열번호 13)에 위치하는 키다리병 저항성 관련 염기 변이를 검출할 수 있는 테트라 프라이머 ARMS-PCR (tetra-primers amplification refractory mutation system-polymerase chain reaction)용 프라이머 세트이다.
본 발명에서 용어 "ARMS-PCR"이란, 대립유전자 특이적(allele-specific) 프라이머를 이용하여 SNP를 검출하기 위한 PCR이다. Taq 중합효소를 이용한 PCR에 있어서, 프라이머의 3' 말단에 위치하는 미스매치는 PCR 과정 중 결합(annealing)을 현저하게 감소시켜 더 이상 증폭이 되지 않도록 한다. 이는 Taq 중합효소의 3'에서 5' 방향으로 핵산말단가수분해효소(exonuclease) 교정(proofreading) 활성의 부재에 기인한다. 따라서, ARMS-PCR에는 고충실도(high fidelity)를 가지는 중합효소는 사용이 불가하다. ARMS-PCR의 증폭 산물은 대립유전자의 SNP 위치 염기가 동형성(homogygous)일 경우 2개의 산물이 생성되며, 대립유전자의 SNP 위치 염기가 이형성(heterogygous)일 경우 3개의 증폭 산물이 생성된다. ARMS-PCR에는 2개의 바깥쪽(outer) 프라이머와 2개의 내부(inner) 프라이머가 필요되는데, 바깥쪽 프라이머는 SNP 위치 염기를 포함하는 영역의 양쪽 말단을 표적으로 디자인되어, 이들 프라이머에 의해 증폭되는 산물은 증폭 반응의 대조군 역할과 동시에 내부 프라이머의 증폭 주형으로 사용될 수 있다. 또한, 내부 프라이머는 3' 말단에 대립유전자에 위치한 각각의 SNP 염기와 매칭되도록 디자인된다. 본 발명에서는 내부 프라이머의 3' 말단 염기뿐만 아니라, 3' 말단으로부터 3번째 위치하는 염기도 주형과 미스매치되도록 변형하여 내부 프라이머를 설계하였다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 벼의 키다리병 저항성 판별용 프라이머 세트 조성물에 있어서, 상기 서열번호 1, 5 및 9는 정방향 내부 프라이머(forward inner primer)이고, 서열번호 2, 6 및 10은 역방향 내부 프라이머(reverse inner primer)이며, 서열번호 3, 7 및 11은 정방향 바깥쪽 프라이머(forward outer primer)이고, 서열번호 4, 8 및 12는 역방향 바깥쪽 프라이머(reverse outer primer)이다(표 3).
구체적으로, Tetra ARMS-PCR 분자 마커를 이용하여 PCR을 수행할 경우, 표 3 및 도 6에 나타낸 바와 같이 각각의 마커는 outer 프라이머 세트에 의해 증폭되는 공통의 증폭산물과 reference allele 또는 variation allele에 특이적인 프라이머 세트에 의해 증폭되는 크기가 다른 증폭산물을 가지게 된다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 각 프라이머의 서열 길이에 따라 각 서열 내의 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 서열번호 12의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고 뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고 뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30bp의 길이로 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다.
본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트 조성물 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 벼의 키다리병 저항성 판별용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 및 버퍼를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 dNTPs는 dATP, dCTP, dGTP, dTTP를 포함하며, DNA 폴리머라제는 내열성 DNA 중합효소로서 Taq DNA 폴리머라제 등 시판되는 폴리머라제를 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명은 또한,
벼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 벼의 키다리병 저항성 판별 방법을 제공한다.
본 발명의 판별 방법은 벼 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 벼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 또한, 상기 벼 시료는 벼 종자, 떡잎, 잎, 뿌리, 줄기 또는 꽃일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 본 발명의 증폭 반응은 바람직하게는 테트라 프라이머 ARMS-PCR일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 판별 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 산물의 검출은 겔 전기영동, DNA 칩, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABI Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 벼의 키다리병 저항성 판별은 테트라 프라이머 ARMS-PCR에 따른 증폭 산물의 크기에 기반하여 OsUBC18 (Os09g12230) 유전자 내 3곳의 염기(서열번호 13의 염기서열 기준 203, 2,092 및 2,320번째 위치)를 분석하고, 이들의 조합을 통해 상기 유전자의 단상형 유형을 결정하여 벼의 키다리병 저항성을 판별할 수 있게 된다.
구체적으로, 서열번호 1 내지 4의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 PNU_Bak_1 마커 증폭용 프라이머 세트를 이용하면 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 OsUBC18의 203번째 염기를 분석할 수 있는데, 해당 위치 염기가 G일 경우 193 bp 및 148 bp의 증폭산물을 나타내고, 해당 위치 염기가 A일 경우 193 bp 및 101 bp의 증폭산물을 나타낸다. 또한, 서열번호 5 내지 8의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 PNU_Bak_2 마커 증폭용 프라이머 세트를 이용하면 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 OsUBC18의 2,092번째 염기를 분석할 수 있는데, 해당 위치 염기가 A일 경우 401 bp 및 198 bp의 증폭산물을 나타내고, 해당 위치 염기가 G일 경우 401 bp 및 258 bp의 증폭산물을 나타낸다. 또한, 서열번호 9 내지 12의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 PNU_Bak_3 마커 증폭용 프라이머 세트를 이용하면 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 OsUBC18의 2,320번째 염기를 분석할 수 있는데, 해당 위치 염기가 A일 경우 252 bp 및 167 bp의 증폭산물을 나타내고, 해당 위치 염기가 G일 경우 252 bp 및 139 bp의 증폭산물을 나타낸다. 따라서, 상기 3개의 프라이머 세트를 이용한 증폭 산물의 결과 조합을 통해 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 OsUBC18의 203, 2,092 및 2,320번째 염기가 차례대로 A, G, G 또는 A, A, G의 염기를 가지는 단상형으로 확인될 경우 키다리병에 대한 저항성 벼로 판별할 수 있는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
식물 재료와 유전체 분석
본 발명에서 169점의 재래종 벼는 파종기의 키다리병 저항성 조사를 위해 사용되었다. 재래종의 종자들은 대한민국 전주에 위치하는 농촌진흥청 유전자은행에서 제공받았으며, 부산대학교 부속농장에서 증식하여 사용하였다. 저항성 품종인 '신광'과 감수성 품종인 '일품'은 각각 대조품종으로 사용되었다. '신광'과 '일품'은 키다리병 저항성 정도가 명확하게 구분되었다. 본 발명에서 사용한 벼 키다리병의 병원균은 푸사리움 모닐리포르메(Fusarium moniliforme)로, 국립농업과학원에서 분양받은 푸사리움 모닐리포르메 균계의 CF283을 사용하였다. CF283은 테부코나졸(tebuconazole)과 베노밀(benomyl)에 내성이 있다. 접종을 위해 병원균을 PDB (Potato Dextrose Broth)에 치상하였고, 1×106 spores/㎖로 희석하였다. 재래종의 각 개체당 30립의 종자를 접종을 위해 Cassette에 담았고, 암막처리되고 26℃로 설정된 생장상에서 3일 동안 접종을 시행하였다. 접종 후 병원균이 처리된 종자들을 모판에 파종하였다. 3주 동안 온실에서 생장시켰으며, 표현형 조사를 위해 병원균이 처리된 식물체들을 조사하였다. 병원균의 반응 정도는 5단계(1, 3, 5, 7, 9)로 저항성 정도를 나누었고, 30개체의 저항성을 계산하여 표기하였다. 각 집단들 중, 키다리병에 대한 증상을 확인하지 못할 정도라면 저항성(1, 3)이 있는 것으로 보았고, 식물체의 변화가 보이거나 괴사한다면 감수성(9)을 나타나는 것으로 조사하였다. 중간정도(5, 7) 피해를 보인 집단들은 중간저항성이 있는 것으로 판단하였다. 수치화된 표현형 데이터를 확보하기 위해 다음과 같은 방법으로 표현형을 계산하였다.
(개체 수 * 저항성 점수; 저항성 1, 중간저항성 0.5, 감수성 0)/발아된 개체들의 수
건강한 식물체의 추정 비율은 백분율로 변환되었다.
집단 구조 분석
유전체 분석은 KNU Axiom Oryza 580K Genotyping Array와 Affymetrix Power Tools을 활용하였고, 필터 작업을 통해 266,042개의 다형성을 지닌 SNP들을 확보하였다[Missing > 20%, Minor allele frequency (MAF) < 0.03, Heterozygosity > 20%]. 169점의 재래종의 집단 구조 분석과 교차검정(cross-validation, CV) 분석은 ADMIXTURE 1.3.0으로 실시하였고, PCA (principal components analysis) 분석은 통계프로그램인 R을 활용하여 수행하였다.
GWAS (Genome-wide association study) 분석
GWAS는 Genome Association and Prediction Integrated Tool (GAPIT)을 이용하여 분석을 진행하였고, general linear model (GLM), mixed linear model (MLM), compressed MLM (CMLM)과 fixed and random model circulating probability unification (FarmCPU)으로 설정하여 진행하였다. 전장 임계값은 formula(-log10(1/effective SNP 수)를 이용하여 계산하였고, -log10(p-valued)≥6인 값을 후보유전자 탐색을 위한 중요한 부위라고 간주하여 수행하였다.
키다리병 저항성 후보유전자 탐색
GWAS 분석을 통해 얻어진 lead SNP를 기준으로 200 kb 앞뒤로 후보유전자를 확인하였다. QTL 부위에 있는 후보유전자들의 발현정도를 확인하기 위해 BioSample SAMN13972374에서 SAMN13972381까지의 RNA-seq 데이터를 NCBI Sequence Read Archive database로부터 확보하였다. 해당 데이터에서 활용된 재료중 Zerawchanica karatals (ZK)을 키다리병 감수성 품종으로, Tainung67 (TNG67)을 키다리병 저항성 품종으로 사용하였다.
qRT-PCR (quantitative real-time polymerase chain reaction)
발현분석을 위해 홍도(ja127), 강원도(ja177), 고구도(ja181), 연안조(ja220) 4품종을 활용하였으며, 1, 2, 3주마다 CF283을 처리한 시료를 채취하여 TRizol(Thermo Fisher Scientific, USA) 시약을 활용하여 총 RNA를 추출하고 발현분석을 진행하였다. cDNA는 RNA 시료(2 ㎍)와 SuperScript Ⅲ reverse transcriptase (Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 합성하였다. qRT-PCR의 조건으로는 10분간 95℃로 처리 후 95℃ 10초, 60℃ 15초, 72℃ 15초로 40반복을 해주었다. 융해곡선(melting curve) 분석 조건으로는 72-95℃로 초당 1.6℃씩 증가하도록 하였다. 상대적인 전사체 수준은 방법으로 계산하였다.
실시예 1. 169점 재래종 품종의 유전적 다양성(genetic diversity)과 집단 구조(population sturucture) 분석
단일형인 좌위와 MAF가 0.03 이하인 좌위를 제외해서 266,042개의 SNP를 74,111개로 줄였으며, 연관분석에 활용하였다. 벼 전장 유전체의 길이는 380 Mbp 이하인 것으로 보고되고 있어, SNP 당 평균적으로 5.1 Kbp로 나누어졌을 것으로 예상되었다. 염색체들 중 가장 많은 SNP를 가지고 있는 염색체는 1번(15,515 SNPs)이었으며, 가장 낮은 보유를 한 염색체는 9번(2,699 SNPs)이었다. 집단 구조의 모델 기반 분석은 Admixture로 수행되었으며, CV error는 K = 3으로 나타났다. 구조 분석을 통해 첫 번째 그룹에서 63점이 나타났고 두 번째 그룹에서 62점, 마지막 그룹에서 19점이 나타났다. PCA 분석에서는 각각의 성분(component)이 78.59%, 10.99%, 10.41%로 나타났다. 해당 분석에서도 사용된 재료들이 3가지의 그룹으로 나누어졌다(도 1).
실시예 2. GWAS 분석을 통한 키다리병 저항성 유전자 좌위 탐색
GLM, MLM, CMLM과 FarmCPU 방법을 통해 GWAS 분석을 실시하였으며 -log10P≥6인 부위를 탐색하였다. 사용된 재료에서는 염색체 9번에서 하나의 QTL(qBK9)만 탐색되었다. 169점중 25점이 6,944,283 위치에 있는 "C" allele로 인해 키다리병 저항성이 증가(72.30%)하는 것을 확인하였으며, 해당 부위가 "T"인 allele는 키다리병 저항성이 감소(41.71%)하는 것으로 나타났다.
실시에 3. 유의한 SNP 주위의 후보 유전자 탐색
Ensemble plants (https://plants.ensembl.org/)를 활용하여 QTL 부위 내에 있는 키다리병 저항성 유전자 관련 후보유전자들을 추려냈다. 총 48개의 유전자가 qBK9 QTL 내에 있는 것을 확인하였으며, 5개의 후보유전자(LOC_Os09g12230, LOC_Os09g12270, LOC_Os09g12290, LOC_Os09g12300, LOC_Os09g12390)에서 키다리병 저항성과 감수성 품종간 발현량의 차이를 보이는 것을 RNA-Seq 데이터를 통해 확인하였다(도 3).
후보유전자들 중, LOC_Os09g12230와 LOC_Os09g12390 유전자의 경우 저항성을 지닌 품종은 상기 유전자들의 발현이 하향조절되고, 감수성인 품종은 상기 유전자들의 발현이 상향조절되는 것을 확인하였다. LOC_Os09g12230 유전자는 OsUBC18로 불리며 ubiquitin-conjugating enzyme gene family로 예상되었다. LOC_Os09g12390은 기능이 알려지지 않은 hypothetical protein으로 보였으며, LOC_Os09g12270은 키다리병 저항성과 감수성 품종 모두에서 상향 조절되었고, FKBP-type immunophilin family protein의 구성요소로 예상되었다. LOC_Os09g12290은 homoserine dehydrogenase였으며, LOC_Os09g12300은 serine/threonine-protein kinase였다.
추가적으로 저항성 품종[홍도(ja127), 강원도(ja177)]과 감수성 품종[고구도(ja181), 연안조(ja220)]에 대해 선발된 5가지 후보유전자에 대한 발현분석을 실시하였으며, 각 품종들의 키다리병 저항성 정도는 92.6 (ja127), 100.0 (ja177), 5.4 (ja181), 0.0 (ja220)으로 각각 나타났다. 결과는 도 4와 같았으며, LOC_Os09g12230 (OsUBC18)과 LOC_Os09g12390 유전자 중에 키다리병 저항성에 긍정적이거나 부정적으로 관여할 것으로 나타났다.
이 두 유전자에 대해 대표적인 키다리병 저항성 품종인 주남벼와 감수성인 삼광벼의 유전자 영역에서 발생한 SNP 다형성을 분석한 결과 LOC_Os09g12230 (OsUBC18)에서만 변이를 발견하였으며, 이 유전자에 대한 단상형(haplotype) 분석을 수행한 결과, 4가지 단상형을 확인하였으며, haplotype 2와 haplotype 3은 키다리병 저항성이 높은 그룹임을 확인하였다(도 5).
실시예 4. Tetra ARMS-PCR 분자 마커 세트의 제작
상기 실시예 3에서 규명한 SNP에 대해 primer 3 (https://primer3.ut.ee/)를 사용하여 4가지 단상형을 모두 구분할 수 있는 Tetra ARMS-PCR 분자 마커를 제작하였다.
Tetra ARMS-PCR 프라이머 세트
분자표지 Forward inner
primer
(reference allele)		 Reverse inner
primer
(variation allele)		 Forward outer
primer
(5'→3')		 Reverse outer
primer
(5'→3')
PNU_Bak_1 CCAAATCTTTCCTGGTCCATTCACAG
(서열번호 1)		 GAGAACTAAACAGAACAAGAACTAGTAAAT
(서열번호 2)		 CATCTAATCTGAGCTCTCTAGTCTGCAG
(서열번호 3)		 CCCAAGTAATCTTAAGCAAACAAGCTAC
(서열번호 4)
PNU_Bak_2 GGCTATATAGCTTCTTCACAAATTTGA
(서열번호 5)		 ATCAAATATAAACTCCATATTGTCCCTC
(서열번호 6)		 AAGAAAAATGCTCTGCCTAACTATAATG
(서열번호 7)		 AGCACATATTGTTATCAATTCTTTGTTC
(서열번호 8)
PNU_Bak_3 AGAAAAGAACAGTTGTATTGCTATCATA
(서열번호 9)		 CTTGAATCTTTCCTGATATTTAGCAC
(서열번호 10)		 CTATCATAATCTCTTCAAGGAATGAGTT
(서열번호 11)		 GAAAAATGACAAATATCACTAACTTCAG
(서열번호 12)
구체적으로, Tetra ARMS-PCR 분자 마커를 이용하여 PCR을 수행할 경우, 표 4 및 도 6에 나타낸 바와 같이 PNU_Bak_1인 경우 outer 프라이머 세트에 의해 193 bp의 PCR 단편과 함께, reference allele를 가진 경우 148 bp의 PCR 단편을, variation allele를 가진 경우 101 bp의 PCR 단편을 각각 나타낸다. PNU_Bak_2인 경우 outer 프라이머 세트에 의해 401 bp의 PCR 단편과, reference allele를 가진 경우 198 bp의 PCR 단편을, variation allele를 가진 경우 258 bp의 PCR 단편을 나타낸다. PNU_Bak_3인 경우 outer 프라이머 세트에 의해 252 bp의 PCR 단편과, reference allele를 가진 경우 167 bp의 PCR 단편을, variation allele를 가진 경우 139 bp의 PCR 단편을 나타낸다.
Tetra 프라이머 ARMS-PCR 증폭산물 결과
분자표지 Product size for reference allele Product size for variation allele Product size of two outer primers
PNU_Bak_1 148 bp 101 bp 193 bp
PNU_Bak_2 198 bp 258 bp 401 bp
PNU_Bak_3 167 bp 139 bp 252 bp
Tetra 프라이머 ARMS-PCR은 홍도(ja127), 강원도(ja177), 고구도(ja181), 연안조(ja220) 시료의 10 ng의 DNA와 10 pmol의 총 4개의 프라이머, 0.2 mM dNTP mix, 1X PCR buffer[50 mM KCl,10 mM Tris-HCl(pH 8.9), 1.5 mM MgCl2] 및 1 unit의 Taq 중합효소(TaKaRa, Japan)를 이용하여 총부피 25 ㎕로 실시하였다. T100 Thermal Cycler (BIO-RAD, USA)를 사용하여, 95℃에서 5분간 초기 변성 후 95℃에서 20초, 55℃에서 30초, 72℃에서 60초로 총 30회 반복하고, 72℃에서 10분간 반응시켰다. 결과물은 2% agarose gel을 이용하여 전기영동 한 후 유전자형을 판정하였다.
Tetra 프라이머 ARMS-PCR 결과, 도 7에 개시된 바와 같이, 표 3의 프라이머는 키다리병 저항성과 관련된 LOC_Os09g12230 (OsUBC18) 유전자의 SNP 특이적인 증폭산물을 보여주었다. 이를 통해 증폭산물 크기 차이를 통해서 벼의 키다리병 저항성 또는 감수성 특성을 효과적으로 판별할 수 있음을 확인할 수 있었다.

Claims (7)

  1. 서열번호 13의 염기서열 중 203, 2,092 및 2,320번째 염기에 위치한 SNP (single nucleotide polymorphism)를 각각 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벼의 키다리병 저항성 판별을 위한 SNP 마커 조성물.
  2. 서열번호 1 내지 4로 표시된 올리고뉴클레오티드; 서열번호 5 내지 8로 표시된 올리고뉴클레오티드; 및 서열번호 9 내지 12로 표시된 올리고뉴클레오티드;를 포함하는, 벼의 키다리병 저항성 판별용 프라이머 세트 조성물.
  3. 제2항의 프라이머 세트 조성물 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 벼의 키다리병 저항성 판별용 키트.
  4. 제3항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 및 완충액을 포함하는 것인 키트.
  5. 벼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제2항의 프라이머 세트 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 벼의 키다리병 저항성 판별 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 증폭 반응은 테트라 프라이머 ARMS-PCR (tetra-primers amplification refractory mutation system-polymerase chain reaction)인 것을 특징으로 하는 판별 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 증폭 단계의 산물의 검출은 겔 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 판별 방법.
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