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CN109476718A - 编码免疫调节多肽的mrna的组合及其用途 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及免疫调节多核苷酸(例如，mRNA)的组合的组合物以及用于制备、制造和治疗性使用所述组合的方法，所述免疫调节多核苷酸编码免疫应答引发物多肽(例如，白细胞介素23(IL‑23)多肽或白细胞介素36γ(IL‑36‑γ)多肽)和免疫应答共刺激信号多肽(例如，OX40L多肽)。

Description

编码免疫调节多肽的MRNA的组合及其用途
相关申请
本申请要求以下的权益：2016年5月18日提交的美国临时专利申请序列号62/338,496；2016年5月18日提交的美国临时专利申请序列号62/338,506；2016年5月18日提交的美国临时专利申请序列号62/338,467；2016年5月18日提交的美国临时专利申请序列号62/338,483；2016年10月4日提交的美国临时专利申请序列号62/404,173；2016年10月4日提交的美国临时专利申请序列号62/404,175；2016年10月31日提交的美国临时专利申请序列号62/415,424；2016年12月23日提交的美国临时专利申请序列号62/438,945；2016年12月23日提交的美国临时专利申请序列号62/438,942；2017年1月7日提交的美国临时专利申请序列号62/443,693；2017年3月16日提交的美国临时专利申请序列号62/472,513以及2017年4月1日提交的美国临时专利申请序列号62/480,400。以上引用的专利申请的全部内容以引用的方式并入本文。
背景技术
癌症是以不受控制的体内细胞分裂和生长为特征的疾病。在美国，大约三分之一的所有女性和一半的所有男性都将在它们的一生中经历癌症。由于目前使用的诸如化学疗法和放射疗法的标准治疗所带来的不良后果，用于操纵疾病相关肽及其功能的基因疗法为疾病诊断、治疗和管理提供了更有针对性的方法。然而，基因疗法提出了多种挑战，包括由于在基因组内的随机位置并入基因所致的不期望的免疫应答和安全性问题。因此，需要治疗肿瘤的改进的治疗方法。
发明内容
本公开提供了用于治疗癌症的mRNA治疗剂。本发明的mRNA治疗剂特别适用于治疗癌症，因为所述技术提供编码免疫调节多肽(例如，适用于免疫肿瘤学(“IO”)的肿瘤学相关多肽，包括免疫应答刺激物、共刺激因子、检查点抑制剂等)的mRNA的细胞内递送，然后在靶细胞内(例如在肿瘤中的靶细胞内)从头合成功能性蛋白质。本公开的特征是治疗性mRNA，所述治疗性mRNA具有修饰的核苷酸以(1)使不想要的免疫活化(例如，与体内引入外来核酸相关的先天性免疫应答)最小化和(2)优化mRNA至蛋白质的翻译效率。本公开的示例性方面的特征是治疗性mRNA，所述治疗性mRNA具有核苷酸修饰的组合以减少先天性免疫应答和序列优化，特别是编码免疫调节多肽的治疗性mRNA的开放阅读框(ORF)内的先天性免疫应答和序列优化以增强蛋白质表达。
在其他方面，本公开的mRNA治疗技术的特征是经由脂质纳米颗粒(LNP)递送系统递送编码免疫调节(例如，肿瘤学相关)多肽的mRNA。在示例性实施方案中，本公开的mRNA治疗技术的特征是经由脂质纳米颗粒(LNP)递送系统将编码免疫调节多肽的mRNA递送至肿瘤中。本公开的特征还是新颖的基于可电离脂质的LNP，所述LNP当与编码免疫调节(例如，肿瘤学相关)多肽的一种或多种mRNA组合并在体内施用时具有改进的性质，例如，细胞摄取、细胞内转运和/或内体释放或内体逃逸。本公开的LNP制剂还展现出与LNP的体内施用相关的降低的免疫原性。
因此，本公开的特征是用于治疗癌症的方法和组合物，特别是免疫治疗方法和组合物。在一些方面，本公开的特征是使用组合疗法治疗癌症的方法和组合物，所述组合疗法的特征是编码第一免疫应答引发物多肽和第二不同的免疫应答引发物多肽的两种或更多种免疫调节(例如，肿瘤学相关)多核苷酸(例如，mRNA)和任选的编码免疫应答共刺激信号多肽的多核苷酸以及任选的编码检查点抑制剂多肽或包含检查点抑制剂多肽的多肽的多核苷酸。在一些方面，本公开提供一种免疫调节组合物，其包含编码白细胞介素-23(IL-23)多肽的多核苷酸、编码白细胞介素-36γ(IL-36γ)多肽的多核苷酸和任选的编码OX40L多肽的多核苷酸。在其他方面，本公开提供一种免疫调节组合物，其包含编码IL-23多肽的多核苷酸、编码白细胞介素18(IL-18)多肽的多核苷酸和任选的编码OX40L多肽的多核苷酸。
本公开的其他方面的特征是用编码IL-23多肽的多核苷酸mRNA与编码IL-36多肽的mRNA的组合治疗。本公开的其他方面的特征是用编码IL-23多肽的mRNA与编码IL-18多肽的mRNA的组合治疗。本公开的其他方面的特征是用编码免疫应答引发物多肽的mRNA与额外治疗剂如检查点抑制剂多肽(例如，抗PD-1抗体、抗PDL-1抗体、抗-CTLA4或其组合)的组合治疗。示例性方面的特征是用脂质纳米颗粒-(LNP-)包封的mRNA治疗。示例性方面的特征是肿瘤内施用基于可电离氨基脂质的LNP中的mRNA。
在一些方面，本公开提供了通过施用至少两种多核苷酸来在有需要的受试者中减小或缩减肿瘤大小或抑制肿瘤生长的方法，其中所述至少两种多核苷酸是选自第一多核苷酸，所述第一多核苷酸编码第一免疫应答引发物多肽(例如，IL-23多肽)；和第二多核苷酸，所述第二多核苷酸编码第二免疫应答引发物多肽(不同于所述第一免疫应答引发物多肽)(例如IL-36γ多肽或IL-18多肽)；以及任选的第三多核苷酸，所述第三多核苷酸编码免疫应答共刺激信号多肽(例如，OX40L多肽)。
在一个实施方案中，所述第一多核苷酸包含编码第一多肽的mRNA，所述第二多核苷酸包含编码第二多肽的mRNA，和/或所述第三多核苷酸包含编码第三多肽的mRNA。在一个实施方案中，所述第一多核苷酸、第二多核苷酸和/或第三多核苷酸包含至少一个化学修饰的核苷。在一些实施方案中，所述至少一个化学修饰的核苷是选自由以下组成的组：假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲氧基尿苷以及其组合。
在一个方面，本公开提供了一种组合物，例如免疫调节组合物，所述组合物包含至少两种多核苷酸(例如，至少两种mRNA)，其中所述至少两种多核苷酸是选自：
(i)至少一种编码第一免疫应答引发物多肽的多核苷酸和至少一种编码第二免疫应答引发物多肽(不同于所述第一免疫应答引发物多肽)的多核苷酸(“双联体”)；
(ii)至少一种编码第一免疫应答引发物多肽的多核苷酸、至少一种编码第二免疫应答引发物多肽(不同于所述第一免疫应答引发物多肽)的多核苷酸和至少一种编码免疫应答共刺激信号多肽的多核苷酸(“三联体”)。
在一些方面，所述组合物还包含至少一种编码检查点抑制剂多肽的多核苷酸。在一些方面，所述组合物与另一种癌症疗法，如包含检查点抑制剂多肽(例如，抗PD-1抗体、抗PDL-1抗体、抗CTLA4抗体或其组合)的多肽组合施用于有需要的受试者。
在一个方面，所述组合物包含至少一种编码第一免疫应答引发物多肽的多核苷酸(例如，mRNA)和至少一种编码第二免疫应答引发物多肽(不同于所述第一免疫应答引发物多肽)的多核苷酸(例如，mRNA)，其中所述第一和第二免疫应答引发物多肽具有选自由以下组成的组的一种或多种活性：
(a)引发树突状细胞；
(b)促进树突状细胞成熟；
(c)促进抗原呈递细胞细胞因子和/或趋化因子产生；
(d)扩增或维持Th17细胞；
(e)增强Th1和/或Th9分化；以及
(f)(a)-(f)的任何组合。
在一个方面，所述免疫应答引发物多肽是IL-12家族成员。在一个实施方案中，所述IL-12家族成员是选自由以下组成的组的多肽：IL-12、IL-23、IL-12p40亚基、IL-23p19亚基、IL-27、IL-35以及其组合。在一个实施方案中，所述免疫应答引发物多肽是IL-23。在一个实施方案中，所述IL-23多肽包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:140的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述IL-23多肽由包含SEQ ID NO:141或142中所示的核苷酸序列的核苷酸序列编码。
在其他方面，所述免疫应答引发物多肽是IL-1家族成员。在一个实施方案中，所述IL-1家族成员是选自由以下组成的组的多肽：IL-1α、IL-1β、IL-1Ra、IL-18、IL-33、IL-36Ra、IL-36α、IL-36β、IL-36γ、IL-37、IL-38以及其组合。在一个实施方案中，所述免疫应答引发物多肽是IL-36-γ多肽或IL-18多肽。在一个实施方案中，所述免疫应答引发物多肽是IL-36-γ多肽。在一个实施方案中，所述IL-36-γ多肽包含SEQ ID NO:16中所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述IL-36-γ多肽由包含SEQ ID NO:143或144中所示的核苷酸序列的核苷酸序列编码。在一个实施方案中，所述免疫应答引发物多肽是IL-18。在一个实施方案中，所述IL-18多肽包含SEQ ID NO:147、149、151或153中所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述IL-18多肽由选自SEQ ID NO:148和155-162的核苷酸序列编码。
在一个方面，本公开提供了一种组合物(例如，免疫调节组合物)，所述组合物包含编码第一免疫应答引发物多肽和第二免疫应答引发物多肽的至少两种多核苷酸(例如，两种mRNA)，其中所述第一免疫应答引发物多肽是IL-12家族成员，并且所述第二免疫应答引发物多肽是IL-1家族成员。在一个实施方案中，所述第一免疫应答引发物多肽是IL-23多肽，并且所述第二免疫应答引发物多肽是IL-36-γ多肽。在一个实施方案中，所述第一免疫应答引发物多肽是IL-23多肽，并且所述第二免疫应答引发物多肽是IL-18多肽。
在另一个方面，本公开提供了一种组合物(例如，免疫调节组合物)，所述组合物包含编码以下的至少三种多核苷酸(例如，三种mRNA)：至少一种编码第一免疫应答引发物多肽的多核苷酸、至少一种编码第二免疫应答引发物多肽(不同于所述第一免疫应答引发物多肽)的多核苷酸和至少一种编码免疫应答共刺激信号多肽的多核苷酸。在一些方面，所述免疫应答共刺激信号多肽具有选自由以下组成的组的至少一种活性：
(a)活化、刺激、促进或增强T细胞增殖、T细胞存活、T细胞募集或其组合；和/或
(b)活化、刺激、促进或增强NK细胞增殖、NK细胞存活、NK细胞募集或其组合。
在一些方面，所述免疫应答共刺激信号多肽具有选自由以下组成的组的至少一种活性：
(c)促进或增强T细胞扩增和/或功能；
(d)促进或增强Th1、Th2和/或Th9细胞发育；
(e)抑制或遏制Treg发育和/或活性；
(f)促进或增强记忆细胞的发育和/或活性；以及
(g)(c)-(f)的任何组合。
在一个实施方案中，所述免疫应答共刺激信号多肽是选自由以下组成的组：OX40L、CD80、IL-15以及其组合。在一个实施方案中，所述免疫应答共刺激信号多肽是选自由以下组成的组：OX40L、CD80、IL-15以及其组合。在一个实施方案中，所述免疫应答共刺激信号多肽是OX40L。在一个实施方案中，所述OX40L多肽包含SEQ ID NO:21中所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述OX40L多肽由包含SEQ ID NO:145或146中所示的核苷酸序列的核苷酸序列编码。
在一个方面，本公开提供了一种组合物(例如，免疫调节组合物)，所述组合物包含编码第一免疫应答引发物多肽、第二免疫应答引发物多肽和免疫应答共刺激信号多肽的至少三种多核苷酸(例如，三种mRNA)，其中所述第一免疫应答引发物多肽是IL-23多肽，所述第二免疫应答引发物多肽是IL-18多肽，并且所述免疫应答共刺激信号多肽是OX-40L。在另一个方面，本公开提供了一种组合物(例如，免疫调节组合物)，所述组合物包含编码第一免疫应答引发物多肽、第二免疫应答引发物多肽和免疫应答共刺激信号多肽的至少三种多核苷酸(例如，三种mRNA)，其中所述第一免疫应答引发物多肽是IL-23多肽，所述第二免疫应答引发物多肽是IL-36-γ多肽，并且所述免疫应答共刺激信号多肽是OX-40L。在其他实施方案中，所述组合物还包含编码检查点抑制剂多肽的多核苷酸(例如，mRNA)。
在其他实施方案中，本公开提供了一种用于减小肿瘤大小或抑制肿瘤生长的组合物，所述组合物包含编码至少第一和第二多肽的至少两种多核苷酸(例如，两种mRNA)，其中所述至少两种多核苷酸是选自由以下组成的组：
(i)编码IL-23多肽的多核苷酸，
(ii)编码IL-36γ多肽的多核苷酸；
(iii)编码IL-18多肽的多核苷酸；
(iv)编码OX40L多肽的多核苷酸；
(v)编码CD80多肽的多核苷酸；以及
(vi)编码抗-CTLA4抗体的多核苷酸；以及
(vii)其组合。
在一个实施方案中，所述至少两种多核苷酸是选自由以下组成的组：
(i)编码IL-23多肽的多核苷酸，
(ii)编码IL-36γ多肽的多核苷酸；
(iii)编码IL-18多肽的多核苷酸；
(iv)编码OX40L多肽的多核苷酸；以及
(v)其组合。
在又一个实施方案中，所述至少两种多核苷酸是选自由以下组成的组：
(i)编码IL-23多肽的多核苷酸，
(ii)编码IL-36γ多肽的多核苷酸；
(iii)编码OX40L多肽的多核苷酸；以及
(iv)其组合。
在另一个实施方案中，所述至少两种多核苷酸是选自由以下组成的组：
(i)编码IL23多肽的多核苷酸和编码IL36γ多肽的多核苷酸；
(ii)编码IL23多肽的多核苷酸和编码OX40L多肽的多核苷酸；
(iii)编码IL36γ多肽的多核苷酸和编码OX40L多肽的多核苷酸；
(iv)编码IL23多肽的多核苷酸和编码IL18多肽的多核苷酸；
(v)编码IL36γ多肽的多核苷酸和编码IL18多肽的多核苷酸；以及
(vi)编码IL18多肽的多核苷酸和编码OX40L多肽的多核苷酸。
在另一个实施方案中，本公开提供了一种用于减小肿瘤大小或抑制肿瘤生长的组合物，所述组合物包含编码至少第一、第二和第三多肽的至少三种多核苷酸(例如，三种mRNA)，其中所述至少三种多核苷酸是选自由以下组成的组：
(i)编码IL23多肽的多核苷酸、编码IL36γ多肽的多核苷酸和编码OX40L多肽的多核苷酸；以及
(ii)编码IL23多肽的多核苷酸和编码IL18多肽的多核苷酸以及编码OX40L多肽的多核苷酸。
在一些方面，所述编码IL-23多肽的多核苷酸包含：(i)IL-12p40多肽；(ii)IL-23p19多肽；或(iii)IL-12p40多肽和IL-23p19多肽两者。在一个方面，所述编码IL-23多肽的多核苷酸包含IL-12p40多肽、IL-23p19多肽和可操作地位于所述IL-12p40多肽与所述IL-23p19多肽之间的接头。在一个方面，所述接头是Gly/Ser接头(例如，G4S)，其具有如SEQID NO:136-139中任一项所示的氨基酸序列)。在一个方面，所述编码IL-23多肽的多核苷酸包含SEQ ID NO:140中所示的氨基酸序列。在其他方面，所述编码IL-23多肽的多核苷酸包含SEQ ID NO:141中所示的核苷酸序列。
在一些方面，所述编码IL-18多肽的多核苷酸包含异源信号序列。在一个方面，所述编码IL-18多肽的多核苷酸包含SEQ ID NO:147、149、151或153中所示的氨基酸序列。在一个方面，所述编码IL-18多肽的多核苷酸包含选自SEQ ID NO:148和155-162的核苷酸序列。
在一些方面，所述编码IL-36γ多肽的多核苷酸包含异源信号序列。在一个方面，所述编码IL36-γ多肽的多核苷酸包含SEQ ID NO:16中所示的氨基酸序列。在一个方面，所述编码IL-36γ多肽的多核苷酸包含SEQ ID NO:143中所示的核苷酸序列。
在一个方面，所述编码OX40L多肽的多核苷酸包含SEQ ID NO:21中所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述编码OX40L多肽的多核苷酸包含SEQ ID NO:145中所示的核苷酸序列。
在一个方面，本公开提供了一种例如用于减小肿瘤大小或抑制肿瘤生长的组合物，所述组合物包含编码至少第一多肽、第二多肽和第三多肽的至少三种多核苷酸(例如，三种mRNA)，其中所述至少三种多核苷酸包含编码OX40L的第一多核苷酸、编码IL-23多肽的第二多核苷酸和编码IL-36γ的第三多核苷酸，其中所述第一多核苷酸、第二多核苷酸和第三多核苷酸分别以大约1:1:2的质量比存在于所述组合物中。在一个实施方案中，分别编码OX40L和IL-23的第一多核苷酸和第二多核苷酸以大约相等质量的量存在于所述组合物中，并且编码IL-36γ的第三多核苷酸以比所述第一多核苷酸和所述第三多核苷酸更高质量的量存在于所述组合物中。本文公开了所述组合物的另外质量比。
本公开的其他方面涉及一种脂质纳米颗粒，其包含前述或相关组合物中的任一种。在一些方面，所述脂质纳米颗粒与药学上可接受的载体或赋形剂一起配制。在一些方面，所述脂质纳米颗粒被配制用于肿瘤内施用(iTu)。
在一个方面，本公开提供了一种脂质纳米粒子，其包含：
编码人OX40L多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码人OX40L多肽的ORF；编码人IL23多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码与人IL-23p19多肽可操作地连接的人IL-12p40多肽的ORF；以及编码人IL-36γ多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码人IL-36γ多肽的ORF。
在一些方面，所述人IL-12p40多肽通过肽接头可操作地连接至人IL-23p19多肽。在一些方面，所述IL-12p40多肽位于所述IL-23p19多肽或所述接头(例如，肽接头)的5'末端。在其他方面，所述IL-12p40多肽位于所述IL-23p19多肽或所述接头(例如，肽接头)的5'末端。在一些方面，所述接头是肽接头，例如Gly/Ser接头(例如，G6S)。在一些方面，Gly/Ser接头包含(GnS)m，其中n是1、2 3、4、5、6、7、8、9、10、15或20，并且m是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20。在一些方面，所述Gly/Ser接头包含(GnS)m，并且其中n是6且m是1(即，G6S)。
在相关方面，包含编码人IL23多肽的ORF的多核苷酸或包含编码人IL-36γ多肽的ORF的多核苷酸还包含信号肽。在一些方面，所述信号肽是异源信号肽，例如源自人免疫球蛋白κ轻链可变区hIGVK4的信号肽。
在一些方面，所述人OX40L多肽包含SEQ ID NO:21中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述人IL-12p40多肽包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述人IL-23p19多肽包含SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列。在一些方面，所述人IL-36γ多肽包含SEQ ID NO:16中所示的氨基酸序列。
在一些方面，本公开提供了前述或相关多核苷酸中的任一种，所述多核苷酸还包含一个或多个微小RNA(miRNA)结合位点。在一些方面，所述miRNA结合位点是miR-122结合位点(例如，miR-122-3p结合位点、miR-122-5p结合位点或两者)。在一些实施方案中，所述miR结合位点是至少一个miR-122-5p结合位点。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含3'UTR，所述3'UTR包含至少一个miR-122-5p结合位点。在一些方面，所述miR-122-5p结合位点包含SEQ ID NO:26中所示的核苷酸序列。在一些方面，所述多核苷酸包含3'UTR，所述3'UTR包含SEQ ID NO:120中所示的核苷酸序列。在一个方面，所述多核苷酸包含5'UTR，所述5'UTR包含SEQ ID NO:27中所示的核苷酸序列。
在其他方面，本公开提供了如本文所述的前述或以上组合物或脂质纳米颗粒中的任一种在制造用于治疗个体的癌症或延迟个体的癌症进展的药物中的用途，其中所述药物包含所述组合物或脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体，并且其中所述治疗包括与包含检查点抑制剂多肽(例如，抗PD-1抗体、抗PDL-1抗体、抗CTLA4抗体或其组合)和任选的药学上可接受的载体的组合物组合施用所述药物。
在一些方面，本公开提供了一种药盒，所述药盒包括容器，所述容器包括如本文公开的多核苷酸(例如，mRNA)组合物或包含多核苷酸(例如，mRNA)的脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体；以及包装插入物，所述包装插入物包括用于施用所述脂质纳米颗粒或药物组合物以用于治疗个体的癌症或延迟个体的癌症进展的说明书。在一些方面，所述包装插入物还包括用于与包含检查点抑制剂多肽和任选的药学上可接受的载体的组合物组合施用所述药物组合物以用于治疗个体的癌症或延迟个体的癌症进展的说明书。
在其他方面，本公开提供了一种药盒，所述药盒包括药物，所述药物包含如本文所述的前述或以上组合物或脂质纳米颗粒中的任一种和任选的药学上可接受的载体；以及包装插入物，所述包装插入物包括用于单独施用或与包含检查点抑制剂多肽(例如，抗PD-1抗体、抗PDL-1抗体、抗CTLA4抗体或其组合)和任选的药学上可接受的载体的组合物组合施用所述药物以用于治疗个体的癌症或延迟个体的癌症进展的说明书。在一些方面，所述药盒还包括包装插入物，所述包装插入物包括用于施用第一药物和第二药物以用于治疗个体的癌症或延迟个体的癌症进展的说明书。
本公开的其他方面涉及一种用于治疗个体的癌症或延迟个体的癌症进展的组合物，所述组合物包含如本文所述的前述或以上脂质纳米颗粒中的任一种和任选的药学上可接受的载体，其中所述治疗包括与第二组合物组合施用所述脂质纳米颗粒，其中所述第二组合物包含检查点抑制剂多肽(例如，抗PD-1抗体、抗PDL-1抗体、抗CTLA4抗体或其组合)和任选的药学上可接受的载体。
在一些方面，所述检查点抑制剂多肽抑制PD1、PD-L1、CTLA4或其组合。在一个实施方案中，所述检查点抑制剂多肽是抗体或编码所述抗体的多核苷酸。在一个实施方案中，所述抗体是特异性地结合CTLA4的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段、特异性地结合PD1的抗PD1抗体或其抗原结合片段、特异性地结合PD-L1的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段以及其组合。在一个实施方案中，所述抗PD-L1抗体是阿特珠单抗、阿维鲁单抗或德瓦鲁单抗。在一个实施方案中，所述抗CTLA-4抗体是曲美木单抗或伊匹单抗。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体是纳武单抗或派姆单抗。
在所述组合物的各种实施方案中，所述组合物内的多核苷酸是mRNA，其中每种mRNA包含至少一种化学修饰。在一些实施方案中，所述化学修饰是选自由以下组成的组：假尿苷、N1-甲基假尿苷、2-硫代尿苷、4’-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷以及2’-O-甲基尿苷。在一些方面，所述mRNA包含至少一个化学修饰的核苷，其中所述至少一个化学修饰的核苷是选自由以下组成的组：假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲氧基尿苷以及其组合。在一些方面，所述至少一个化学修饰的核苷是N1-甲基假尿苷。在一些方面，所述多核苷酸是完全修饰的N1-甲基假尿苷mRNA。本文公开了另外的化学修饰。
在所述组合物的各种实施方案中，所述组合物被配制在脂质纳米颗粒载体中。例如，配制如本文所述的包含第一和第二多核苷酸和任选的第三多核苷酸的组合物，以使得所述组合物内的所有多核苷酸由相同脂质纳米颗粒载体负载。在一个实施方案中，所述脂质纳米颗粒载体包含约20％-60％可电离氨基脂质:5％-25％磷脂:25％-55％固醇；以及0.5％-15％PEG修饰的脂质的摩尔比。在一个实施方案中，所述可电离氨基脂质是选自由以下组成的组：例如，2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)以及二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)-十七烷二酸酯(L319)。在一个实施方案中，所述可电离氨基脂质是化合物18。
在其他方面，所述脂质纳米颗粒包含约20％-60％可电离氨基脂质:5％-25％磷脂:25％-55％固醇；以及0.5％-15％PEG修饰的脂质的摩尔比。在其他方面，所述脂质纳米颗粒载体包含约20％-60％化合物18:5％-25％磷脂:25％-55％胆固醇；以及0.5％-15％PEG修饰的脂质的摩尔比。在其他方面，所述脂质纳米颗粒载体包含约50％可电离氨基脂质:约10％磷脂:约38.5％胆固醇；以及约1.5％PEG修饰的脂质的摩尔比。在其他方面，所述脂质纳米颗粒载体包含约50％化合物18:约10％磷脂:约38.5％胆固醇；以及约1.5％PEG修饰的脂质的摩尔比。在其他方面，所述脂质纳米颗粒载体包含约49.83％可电离氨基脂质:约9.83％磷脂:约30.33％胆固醇；以及约2.0％PEG修饰的脂质的摩尔比。在其他方面，所述脂质纳米颗粒载体包含约49.83％化合物18:约9.83％磷脂:约30.33％胆固醇；以及约2.0％PEG修饰的脂质的摩尔比。
在另一方面，本发明涉及一种在有需要的受试者中减小或缩减肿瘤大小或抑制肿瘤生长的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的组合物中的任一种。在一个实施方案中，肿瘤内施用所述组合物。在另一个实施方案中，区域性地施用所述组合物(即，施用至肿瘤正在生长的区域中)，例如，对于腹膜腔中的肿瘤，可腹膜内施用所述组合物。在一个实施方案中，所述肿瘤是肝细胞癌。在另一个实施方案中，所述肿瘤是卵巢肿瘤、结肠肿瘤或播散性胃肿瘤。本文公开了用于治疗的其他合适的肿瘤和癌症。
在一些实施方案中，所述IL-23多肽包含IL-12p40亚基，所述IL-12p40亚基包含与表1中列出的序列至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列能够结合至IL-23p19亚基并形成IL-23，所述氨基酸序列具有IL-23活性。在其他实施方案中，所述IL-23多肽包含IL-23p19亚基，所述IL-23p19亚基包含与表1中列出的序列至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列能够结合至IL-12p40亚基并形成IL-23，所述氨基酸序列具有IL-23活性。在一些实施方案中，所述IL-12p40亚基和IL-23P19亚基是在单一多肽链或两条不同的链上。
在一些实施方案中，所述IL-36-γ多肽包含与表1中列出的序列至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有IL-36-γ活性。
在一些实施方案中，本公开的方法还包括施用第三蛋白质或编码所述第三蛋白质的第三多核苷酸。在一个实施方案中，所述第三蛋白质包含OX40L多肽。在另一个实施方案中，所述OX40L多肽包含与表1A中列出的序列至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有OX40L活性。
在某些实施方案中，所述第一多核苷酸(例如，mRNA)、所述第二多核苷酸(例如，mRNA)和/或所述第三多核苷酸(例如，mRNA)还包含核酸序列，所述核酸序列包含miRNA结合位点，例如，miR-122，例如，aacgccauua ucacacuaaa ua(SEQ ID NO:23)或uggagugugacaaugguguu ug(SEQ ID NO:25)。
所述第一多核苷酸和/或所述第二多核苷酸和/或所述第三多核苷酸还可包含5'UTR、3'UTR、5'末端帽和/或3'聚A尾。在其他实施方案中，所述第一多核苷酸(例如，mRNA)、所述第二多核苷酸(例如，mRNA)和/或所述第三多核苷酸(例如，mRNA)是密码子优化的、体外转录的、嵌合的或环状的。
在一些实施方案中，所述第一多核苷酸(例如，mRNA)、所述第二多核苷酸(例如，mRNA)和/或所述第三多核苷酸(例如，mRNA)与递送剂(例如，脂质纳米颗粒)一起配制。在其他实施方案中，所述递送剂包含具有式(I)的化合物
或其盐或立体异构体，其中
R1是选自由以下组成的组：C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR"、-YR"以及-R"M'R'；
R2和R3独立地选自由以下组成的组：H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR"、-YR"以及-R*OR"，或者R2和R3与它们所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4是选自由以下组成的组：C3-6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2以及未取代的C1-6烷基，其中Q是选自碳环、杂环、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-N(R)2、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(＝NR9)N(R)2、-N(R)C(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(＝NR9)N(R)2、-N(OR)C(＝CHR9)N(R)2、-C(＝NR9)N(R)2、-C(＝NR9)R、-C(O)N(R)OR以及–C(R)N(R)2C(O)OR，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；
每个R5独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R6独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
M和M'独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R')-、-N(R')C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR')O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基和杂芳基；
R7是选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
R8是选自由以下组成的组：C3-6碳环和杂环；
R9是选自由以下组成的组：H、CN、NO2、C1-6烷基、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6烯基、C3-6碳环和杂环；
每个R独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R'独立地选自由以下组成的组：C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR"、-YR"以及H；
每个R"独立地选自由以下组成的组：C3-14烷基和C3-14烯基；
每个R*独立地选自由以下组成的组：C1-12烷基和C2-12烯基；
每个Y独立地是C3-6碳环；
每个X独立地选自由以下组成的组：F、Cl、Br和I；并且
m是选自5、6、7、8、9、10、11、12和13；并且
其限制条件是当R4是-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、–CHQR或-CQ(R)2时，则(i)当n是1、2、3、4或5时，Q不是-N(R)2，或者(ii)当n是1或2时，Q不是5、6或7元杂环烷基。
在其他实施方案中，所述递送剂包含具有式(I)的化合物
或其盐或立体异构体，其中
R1是选自由以下组成的组：C5-20烷基、C5-20烯基、-R*YR"、-YR"以及-R"M'R'；
R2和R3独立地选自由以下组成的组：H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR"、-YR"以及-R*OR"，或者R2和R3与它们所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4是选自由以下组成的组：C3-6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2和未取代的C1-6烷基，其中Q是选自碳环、杂环、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-N(R)2、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2以及–C(R)N(R)2C(O)OR，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；
每个R5独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R6独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
M和M'独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R')-、-N(R')C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR')O-、-S(O)2-、芳基以及杂芳基；
R7是选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R'独立地选自由以下组成的组：C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR"、-YR"以及H；
每个R"独立地选自由以下组成的组：C3-14烷基和C3-14烯基；
每个R*独立地选自由以下组成的组：C1-12烷基和C2-12烯基；
每个Y独立地是C3-6碳环；
每个X独立地选自由以下组成的组：F、Cl、Br和I；并且
m是选自5、6、7、8、9、10、11、12和13；并且
其限制条件是当R4是-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、–CHQR或-CQ(R)2时，则(i)当n是1、2、3、4或5时，Q不是-N(R)2，或者(ii)当n是1或2时，Q不是5、6或7元杂环烷基。
在一些实施方案中，所述化合物具有式(IA)：
或是其盐或立体异构体，其中
l是选自1、2、3、4和5；
m是选自5、6、7、8和9；
M1是键或M’；
R4是未取代的C1-3烷基或-(CH2)nQ，其中n是1、2、3、4或5，并且Q是OH、-NHC(S)N(R)2或-NHC(O)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(＝NR9)N(R)2、-NHC(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、杂芳基或杂环烷基；
M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基以及杂芳基；并且
R2和R3独立地选自由以下组成的组：H、C1-14烷基和C2-14烯基。
在一些实施方案中，m是5、7或9。
在一些实施方案中，所述化合物具有式(IA)，或是其盐或立体异构体，其中
l是选自1、2、3、4和5；
m是选自5、6、7、8和9；
M1是键或M’；
R4是未取代的C1-3烷基或-(CH2)nQ，其中n是1、2、3、4或5，并且Q是OH、-NHC(S)N(R)2或-NHC(O)N(R)2；
M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、芳基以及杂芳基；并且
R2和R3独立地选自由以下组成的组：H、C1-14烷基和C2-14烯基。
在一些实施方案中，m是5、7或9。
在一些实施方案中，所述化合物具有式(II)：
或是其盐或立体异构体，其中
l是选自1、2、3、4和5；
M1是键或M’；
R4是未取代的C1-3烷基或-(CH2)nQ，其中n是2、3或4，并且Q是OH、-NHC(S)N(R)2或-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(＝NR9)N(R)2、-NHC(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、杂芳基或杂环烷基；
M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基以及杂芳基；并且
R2和R3独立地选自由以下组成的组：H、C1-14烷基和C2-14烯基。
在一些实施方案中，所述化合物具有式(II)，或是其盐或立体异构体，其中
l是选自1、2、3、4和5；
M1是键或M’；
R4是未取代的C1-3烷基或-(CH2)nQ，其中n是2、3或4，并且Q是OH、-NHC(S)N(R)2或-NHC(O)N(R)2；
M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、芳基以及杂芳基；并且
R2和R3独立地选自由以下组成的组：H、C1-14烷基和C2-14烯基。
在一些实施方案中，M1是M’。
在一些实施方案中，M和M’独立地是-C(O)O-或-OC(O)-。
在一些实施方案中，l是1、3或5。
在一些实施方案中，所述化合物是选自由以下组成的组：化合物1至化合物232、其盐和立体异构体以及其任何组合。在一些实施方案中，所述化合物是选自由以下组成的组：化合物1至化合物147、其盐和立体异构体以及其任何组合。
在某些实施方案中，所述递送剂包含具有式(IIa)的化合物，
或其盐或立体异构体。
在某些实施方案中，所述递送剂包含具有式(IIb)的化合物，
或其盐或立体异构体。
在某些实施方案中，所述递送剂包含具有式(IIc)或(IIe)的化合物，
或其盐或立体异构体。
在一些实施方案中，R4是如本文所描述。在一些实施方案中，R4是选自-(CH2)nQ和-(CH2)nCHQR。
在某些实施方案中，所述递送剂包含具有式(IId)的化合物，
或其盐或立体异构体，
其中n是选自2、3和4，并且m、R’、R”和R2至R6是如本文所描述。例如，R2和R3中的每个可独立地选自由以下组成的组：C5-14烷基和C5-14烯基。
在一些实施方案中，所述化合物具有式(IId)，或是其盐或立体异构体，其中R2和R3独立地选自由以下组成的组：C5-14烷基和C5-14烯基，n是选自2、3和4，并且R’、R”、R5、R6和m是如本文所定义。
在一些实施方案中，R2是C8烷基。
在一些实施方案中，R3是C5烷基、C6烷基、C7烷基、C8烷基或C9烷基。
在一些实施方案中，m是5、7或9。
在一些实施方案中，每个R5是H。
在一些实施方案中，每个R6是H。
在其他实施方案中，所述递送剂还包含磷脂、结构脂质、PEG脂质、可电离脂质和/或季胺化合物。
本公开还包含一种组合物，其包含本文公开的第一多核苷酸(例如，mRNA)、本文公开的第二多核苷酸(例如，mRNA)、本文公开的第三多核苷酸(例如，mRNA)或其组合，其中所述第一多核苷酸、所述第二多核苷酸和/或所述第三多核苷酸被配制在本文公开的递送剂中。
本公开还包含一种组合物，其包含本文公开的第一多核苷酸(例如，mRNA)、本文公开的第二多核苷酸(例如，mRNA)和本文公开的第三多核苷酸(例如，mRNA)，其中所述第一多核苷酸、所述第二多核苷酸和所述第三多核苷酸被配制在本文公开的递送剂中。
本公开还公开了一种药盒，其包括本文公开的组合物和根据本文公开的方法使用的说明书。
在本公开的方法的一些实施方案中，本公开的组合物或本公开的药盒、将所述多核苷酸施用于有需要的受试者使得(i)在施用双联体或三联体后从所述受试者获得的一种或多种样品中的粒细胞水平相对于阈值水平或相对于在施用编码IL-23、IL-36-γ或OX40L多肽的单一多核苷酸后的水平增加；(ii)在施用双联体或三联体后从所述受试者获得的一种或多种样品中的交叉呈递树突状细胞水平相对于阈值水平或相对于在施用编码IL-23、IL-36-γ或OX40L多肽的单一多核苷酸后的水平增加；(iii)在施用双联体或三联体后从所述受试者获得的一种或多种样品中的效应与抑制T细胞比率相对于阈值水平或相对于在施用编码OX40L多肽的单一多核苷酸后的比率增加；(iv)在施用双联体或三联体后从所述受试者获得的一种或多种样品中的效应记忆T细胞水平相对于阈值水平或相对于在施用编码OX40L多肽的单一多核苷酸后的水平增加；(v)在施用双联体或三联体后从所述受试者获得的一种或多种样品中的PDL1表达水平相对于阈值水平或相对于在施用编码IL-23、IL-36-γ或OX40L多肽的单一多核苷酸后的水平增加；或(vi)其组合。
本公开还提供了一种在有需要的受试者中减小或缩减肿瘤大小或抑制肿瘤生长的方法，所述方法包括向所述受试者施用组合物，所述组合物包含(a)组合的两种多核苷酸(双联体)，其中第一多核苷酸编码包含白细胞介素-23多肽(IL-23)的第一蛋白质，并且第二多核苷酸编码包含白细胞介素-36-γ多肽(IL-36-γ)的第二蛋白质；或者(b)组合的三种多核苷酸(三联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽的第二蛋白质，并且第三多核苷酸编码包含OX40L多肽(OX40L)的第三蛋白质，其中将所述双联体或三联体施用至所述受试者使得(i)在施用双联体或三联体后从所述受试者获得的一种或多种样品中的粒细胞水平相对于阈值水平或相对于在施用编码IL-23、IL-36-γ或OX40L多肽的单一多核苷酸后的水平增加；(ii)在施用双联体或三联体后从所述受试者获得的一种或多种样品中的交叉呈递树突状细胞水平相对于阈值水平或相对于在施用编码IL-23、IL-36-γ或OX40L多肽的单一多核苷酸后的水平增加；(iii)在施用双联体或三联体后从所述受试者获得的一种或多种样品中的效应与抑制T细胞比率相对于阈值水平或相对于在施用编码OX40L多肽的单一多核苷酸后的比率增加；(iv)在施用双联体或三联体后从所述受试者获得的一种或多种样品中的效应记忆T细胞水平相对于阈值水平或相对于在施用编码OX40L多肽的单一多核苷酸后的水平增加；(v)在施用双联体或三联体后从所述受试者获得的一种或多种样品中的PDL1表达水平相对于阈值水平或相对于在施用编码IL-23、IL-36-γ或OX40L多肽的单一多核苷酸后的水平增加；或(vi)其组合。在一些方面，其中粒细胞水平的增加被定量为(i)粒细胞占CD45+细胞的百分比，或者(ii)每mg肿瘤的粒细胞数。在一些方面，交叉呈递树突状细胞是CD103+细胞。在一些方面，交叉呈递树突状细胞水平的增加被定量为(i)每mg肿瘤的交叉呈递树突状细胞数，(ii)肿瘤引流淋巴结(TdLN)中的交叉呈递CD103+树突状细胞，或者(iii)交叉呈递CD103+树突状细胞占CD45+细胞的百分比。在一些方面，效应与抑制T细胞比率被定量为CD8:Treg比率。在一些方面，效应记忆T细胞是CD4+和/或CD8+细胞。在一些方面，PDL1表达水平被定量为(i)阳性CD11b+细胞的数量，或者(ii)CD11b+细胞中的PDL1表达。
本公开还提供了一种增加有需要的受试者的粒细胞水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用组合物，所述组合物包含(a)组合的两种多核苷酸(双联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，并且第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽的第二蛋白质；或者(b)组合的三种多核苷酸(三联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽的第二蛋白质，并且第三多核苷酸编码包含OX40L多肽的第三蛋白质，其中在从所述受试者获得的一种或多种样品中测量粒细胞水平。在一些方面，相对于阈值水平或相对于在施用编码IL-23的单一多核苷酸或编码IL-36-γ的单一多核苷酸后的水平，粒细胞水平的增加被测量为(i)粒细胞占CD45+细胞的百分比，和/或(ii)每mg肿瘤的粒细胞数。
本公开还提供了一种增加有需要的受试者的交叉呈递树突状细胞水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用组合物，所述组合物包含(a)组合的两种多核苷酸(双联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，并且第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽的第二蛋白质；或者(b)组合的三种多核苷酸(三联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽的第二蛋白质，并且第三多核苷酸编码包含OX40L多肽的第三蛋白质，其中在从所述受试者获得的一种或多种样品中测量交叉呈递树突状细胞水平。在一些方面，交叉呈递树突状细胞是CD103+细胞。在一些方面，相对于阈值水平或相对于在施用编码IL-23的单一多核苷酸、编码IL-36-γ的单一多核苷酸或编码OX40L的单一多核苷酸后的水平，交叉呈递CD103+树突状细胞水平的增加被测量为(i)每mg肿瘤的交叉呈递CD103+树突状细胞数，(ii)TdLN中的交叉呈递CD103+树突状细胞，(iii)交叉呈递CD103+树突状细胞占CD45+细胞的百分比，或者(iv)其组合。
本公开还提供了一种增加有需要的受试者的效应与抑制T细胞比率的方法，所述方法包括向所述受试者施用组合物，所述组合物包含(a)组合的两种多核苷酸(双联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，并且第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽的第二蛋白质；或者(b)组合的三种多核苷酸(三联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽的第二蛋白质，并且第三多核苷酸编码包含OX40L多肽的第三蛋白质，其中在从所述受试者获得的一种或多种样品中测量效应与抑制T细胞比率。在一些方面，效应与抑制T细胞比率被测量为CD8:Treg比率。
本公开还提供了一种增加有需要的受试者的效应记忆T细胞水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用组合物，所述组合物包含(a)组合的两种多核苷酸(双联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，并且第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽的第二蛋白质；或者(b)组合的三种多核苷酸(三联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽的第二蛋白质，并且第三多核苷酸编码包含OX40L多肽的第三蛋白质，其中在从所述受试者获得的一种或多种样品中测量效应记忆T细胞水平。在一些方面，效应记忆T细胞是CD4+和/或CD8+细胞。在一些方面，相对于阈值水平或相对于在施用编码OX40L的单一多核苷酸后的水平，效应记忆T细胞水平的增加被测量为肿瘤内的效应记忆T细胞。
本公开还提供了一种增加有需要的受试者的PDL1阳性细胞水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用组合物，所述组合物包含(a)组合的两种多核苷酸(双联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，并且第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽的第二蛋白质；或者(b)组合的三种多核苷酸(三联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽的第二蛋白质，并且第三多核苷酸编码包含OX40L多肽的第三蛋白质，其中在从所述受试者获得的一种或多种样品中测量PDL1阳性细胞水平。在一些方面，PDL1阳性细胞是CD11b+细胞。
在本文公开的方法的一些方面，从受试者获得的样品是选自例如肿瘤组织、肿瘤浸润物、血液、血浆或其组合。本领域技术人员将理解，在本文公开的方法中测量的任何细胞(例如，粒细胞、交叉呈递树突状细胞、效应T细胞、抑制性T细胞、PDL1阳性细胞等)和对应于那些测量的参数(例如，细胞的绝对或相对水平、与其他细胞的比率、特定亚型的水平、活化水平、标志物的存在/不存在等)可使用本领域中已知的方法在存在那些细胞的任何组织样品中进行测量而无需过度实验。
在本文公开的方法的一些方面，一种或多种对照样品是从健康受试者或患有肿瘤的受试者获得的一种或多种样品。在一些方面，阈值水平是预定值或从一种或多种样品获得的值。
本公开还提供了一种确定是否用组合物治疗患有肿瘤疾病的受试者的方法，所述组合物包含(a)组合的两种多核苷酸(双联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，并且第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽的第二蛋白质；或者(b)组合的三种多核苷酸(三联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽的第二蛋白质，并且第三多核苷酸编码包含OX40L多肽的第三蛋白质；所述方法包括(1)向所述受试者施用初始剂量的双联体或三联体，以及(2)如果在施用所述初始剂量的双联体或三联体后，所述受试者被确定受为相对于阈值水平具有(a)粒细胞水平、(b)交叉呈递树突状细胞水平、(c)效应与抑制T细胞比率、(d)效应记忆T细胞水平、(e)PDL1阳性细胞水平、(f)PDL1表达或(g)其组合的增加，则治疗所述受试者。
本公开还提供了一种选择被诊断患有肿瘤的受试者作为用组合物治疗的候选者的方法，所述组合物包含(a)组合的两种多核苷酸(双联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，并且第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽的第二蛋白质；或者(b)组合的三种多核苷酸(三联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽的第二蛋白质，并且第三多核苷酸编码包含OX40L多肽的第三蛋白质；所述方法包括(1)向所述受试者施用初始剂量的双联体或三联体，以及(2)如果在施用所述初始剂量的双联体或三联体后，所述受试者被确定受为相对于阈值水平具有(a)粒细胞水平、(b)交叉呈递树突状细胞水平、(c)效应与抑制T细胞比率、(d)效应记忆T细胞水平、(e)PDL1阳性细胞水平、(f)PDL1表达或(g)其组合的增加，则选择所述受试者用于治疗。
本公开还提供了一种测量组合物用于治疗有需要的受试者的肿瘤的功效的方法，其中所述组合物包含(a)组合的两种多核苷酸(双联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，并且第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽的第二蛋白质；或者(b)组合的三种多核苷酸(三联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽的第二蛋白质，并且第三多核苷酸编码包含OX40L多肽的第三蛋白质；其中所述方法包括在从所述受试者取得的至少一种样品中测量(a)粒细胞水平，(b)交叉呈递树突状细胞水平，(c)效应与抑制T细胞比率，(d)效应记忆T细胞水平，(e)PDL1阳性细胞水平，(f)PDL1表达，或(g)其组合，
其中所述测量值中的至少一者相对于阈值水平的增加表明所述受试者对用所述双联体或三联体治疗有反应。
附图说明
图1A和1B示出A20淋巴瘤动物模型中的IL-23mRNA单一疗法功效。图1A示出用NST-FIX对照(2.5μg mRNA)处理。在12名受试者中的1名(8.3％)中观察到完全反应。图1B示出用mIL-23miRless(2.5μg mRNA)处理。在12名受试者中的5名(41.6％)中观察到完全反应。给药条件：2.5μg mRNA，肿瘤内(iTu)施用，基于化合物18的脂质纳米颗粒(SM68LNP)。NST-FIX是阴性对照mRNA。
图2A和2B示出MC38-C结肠癌动物模型中的IL-23mRNA单一疗法功效。图2A示出用NST-OX40L(2.5μg mRNA)处理。图2B示出用3'UTR中缺乏miR结合位点(“miRless”)的mIL-23mRNA(2.5μg mRNA)处理。在10名受试者中的4名(40％)中观察到完全反应。在10名受试者中的2名(20％)中观察到部分反应。给药条件：2.5μgmRNA，iTu，基于化合物18的LNP。NST-OX40L是阴性对照mRNA。
图3A-3F示出向IL-23mRNA疗法中添加编码IL-36-γ或IL-18的mRNA提高在MC38-C结肠癌模型中的功效。图3A示出用编码IL-23和NST-FIX的mRNA(每种mRNA 2.5μg)处理。在10名受试者中的3名(30％)中观察到完全反应。在10名受试者中的6名(60％)中观察到部分反应。图3B示出用编码IL-23的mRNA与编码IL-36-γ的mRNA的组合(每种mRNA 2.5μg)处理。在10名受试者中的9名(90％)中观察到完全反应。在10名受试者中的1名(10％)中观察到部分反应。图3C示出用编码IL-23的mRNA与编码IL-18的mRNA的组合(每种mRNA 2.5μg)处理。在10名受试者中的6名(60％)中观察到完全反应。在10名受试者中的3名(30％)中观察到部分反应。图3D示出用NST-FIX对照(5μg mRNA)处理。给药条件：每种mRNA 2.5μgmRNA(对于对照，5μg)，iTu，基于化合物18的LNP。NST-FIX是阴性对照mRNA。图3E、图3F和图3G示出分别对应于图3A、图3B和图3D中呈现的相同实验、但是将实验的时间范围延长至第90天的数据。
图4A-4C示出IL-23和IL-36-γ或IL-18组合mRNA疗法在A20淋巴瘤模型中的功效。图4A示出用编码IL-23miRless和NST-FIX的mRNA(每种mRNA 2.5μg)处理。在12名受试者中的8名(66.6％)中观察到完全反应。在12名受试者中的1名(8.3％)中观察到部分反应。图4B示出用编码IL-23miRless的mRNA与编码IL-36-miR-122的mRNA的组合(每种mRNA 2.5μg)处理。在12名受试者中的10名(83.3％)中观察到完全反应。图4C示出用编码IL-23的“miRless”mRNA和编码IL-18的“miRless”mRNA(每种mRNA 2.5μg)处理。在12名受试者中的6名(50％)中观察到完全反应。图4D示出用NST-FIX对照(5μg mRNA)处理。给药条件：每种RNA2.5μg mRNA(对于对照，5μg)，iTu，基于化合物18的LNP。NST-FIX是阴性对照mRNA。
图5A-5C示出在A20淋巴瘤模型中在固定的5μg剂量mRNA的情况下编码IL-36-γ的mRNA加编码IL-23的mRNA相对于编码单独IL-23的mRNA的优异功效的早期指示。图5A示出用编码IL-23的mRNA(5μg mRNA)处理。在10名受试者中的1名(10％)中观察到完全反应。在10名受试者中的4名(40％)中观察到部分反应。图5B示出用编码IL-36-γ的mRNA(5μg mRNA)处理。在10名受试者中的2名(20％)中观察到完全反应。在10名受试者中的1名(10/％)中观察到部分反应。图5C示出用编码IL-23的mRNA和编码IL-36-γ的mRNA(每种mRNA 2.5μg)处理。图5D示出用NST-FIX mRNA对照(5μgmRNA)处理。给药条件：每种mRNA 2.5μg mRNA(对于对照，5μg)，iTu，基于化合物18的LNP。NST-FIX是阴性对照mRNA。在固定的5μg mRNA剂量下，IL-23/IL-36-γ组合优于单组分。
图6A-6C示出免疫浸润的MC38结肠癌模型比较。图6A示出MC38模型系统中CD4+、CD8+和CD11b+细胞在每mg组织的细胞中的浸润的量化。示出MC38-M(免疫原性差)和MC38-C(免疫原性强)的结果。图6B示出免疫原性差的MC38-M样品的组织显微照片，并且图6C示出免疫原性强的MC38-C样品的组织显微照片。
图7A-7D分析了IL-23mRNA单一疗法和IL-23/IL-36-γ或IL-23/IL-18组合mRNA疗法在MC38-M结肠癌模型中的功效。图7A示出用基于化合物18的LNP中的NST-OX40L(2.5μgmRNA)处理。未观察到反应。图7B示出用基于化合物18的LNP中的IL-23mRNA“miRless”(2.5μg mRNA)处理。仅观察到一例部分反应(10名中的1名，10％)。MC38-M是相对不敏感的模型，其中OX40L、抗PD-1抗体和IL-23单一疗法都无效。图7C示出用编码IL-23和IL-36-γ的mRNA(每种mRNA 2.5μg)处理。在10名受试者中的2名(20％)中观察到完全反应。在10名受试者中的5名(50％)中观察到部分反应。因此，IL-23/IL-36-γmRNA组合疗法在免疫原性差的MC38-M结肠癌中是有效的。图7E示出用编码IL-23和IL-18的mRNA(每种mRNA 2.5μg)处理。仅观察到一例部分反应(10名中的1名，10％)。图7D示出用NST-FIX对照(5μg mRNA)处理。
图8分析了OX40L mRNA单一疗法在A20肿瘤模型中的功效。编码OX40L的mRNA(2.5μg mRNA)被配制在基于化合物18的LNP中。观察到两例完全反应。
图9A-9C示出MC38-M(免疫原性差)结肠癌模型中的OX40LmRNA“miRless”或抗PD-1单一疗法功效。图9A示出用基于化合物18的LNP中的OX40L mRNA“miRless”(2.5μg mRNA)处理。图9B示出用抗PD-1抗体(5mg/kg 2x/周IP给药)处理。图9C示出MC38-M结肠癌模型组织的显微照相。
图10A-10H示出单一疗法；二重组合疗法；以及使用编码IL-23、IL-36-γ和OX40L的mRNA的三重组合疗法(包括在不同剂量水平下的单剂量和多剂量施用)的作用，其中每种mRNA包含miR122结合位点。图10A示出使用IL-23_miR-122的单一疗法处理。未观察到完全反应，但观察到八名逃脱者(escaper)。图10B示出使用IL-23_miR-122和IL-36-γ_miR-122的组合处理。观察到三例完全反应(25％)。观察到六名逃脱者。图10C示出用IL-23_miR-122、IL-36-γ_miR-122和OX40L_miR-122三重组合疗法处理。观察到三例完全反应(25％)。观察到四名逃脱者。对于每个样品：肿瘤内(iTu)施用5μg总mRNA/剂量。当施用非翻译对照mRNA和单独IL-36γ_miR-122时，所有小鼠到第26天进展(数据未示出)。图10D、图10E和图10F示出分别对应于图10A、图10B和图10C中呈现的相同实验、但是将实验的时间范围延长至第70天的数据。图10G示出相对于模拟对照，在MC38荧光素酶细胞中用单剂量(8μg)的IL-23_miR-122和IL-36-γ_miR-122双联体疗法和单剂量或多剂量(12μg)的IL-23_miR-122、IL-36-γ_miR-122和OX40L_miR-122三联体疗法处理。图10H示出在用单一8μg剂量的IL-23_miR-122和IL-36-γ_miR-122双联体疗法、单一12μg剂量的IL-23_miR-122、IL-36-γ_miR-122和OX40L_miR-122三联体疗法或多个12μg剂量的IL-23_miR-122、IL-36-γ_miR-122和OX40L_miR-122三联体疗法处理后至第47天的存活率。用多个12μg剂量的IL-23_miR-122、IL-36-γ_miR-122和OX40L_miR-122三联体疗法观察到处理相关的死亡。
图11示出与重组IL-23蛋白相比，由mRNA产生的IL-23蛋白的生物活性(例如，从原代小鼠脾细胞诱导鼠白细胞介素17(mIL-17)表达)。实线上线示出在添加从用编码mIL-23的mRNA转染的HeLa细胞获得的鼠IL-23(mIL-23)后从原代小鼠脾细胞分泌的mIL-17(pg/ml)；实线下线示出在添加从用编码hIL-23的mRNA转染的HeLa细胞获得的人IL-23(hIL-23)后的mIL-17(pg/ml)表达。黑色虚线示出在添加重组hIL-23后从小鼠原代脾细胞分泌的mIL-17；并且灰色虚线示出在添加重组mIL-23后来自脾细胞的mIL-17表达。实验中使用的IL-23蛋白水平是0.1ng/ml、1ng/ml、3.3ng/ml、10ng/ml和100ng/ml。
图12A示出如由鼠IL-36γ(mIL-36γ)蛋白诱导的骨髓来源的树突状细胞中的鼠白细胞介素6(mIL6)(ng/ml)产生。第一图(NT)是阴性对照。第二图示出在添加重组mIL-36γ后的mIL6表达。第三图示出在添加从用编码mIL-36γ的mRNA转染的HeLa细胞获得的mIL-36γ后的mIL6表达。第四图(模拟)显示模拟对照。图12B示出A431细胞中重组人IL-36-γ和来自用编码hIL-36-γ的三种mRNA转染的B16F10细胞的上清液对白细胞介素8(IL8)的表达(OD450)。
图13A-13E示出在用OX40L mRNA处理的细胞表面上表达的OX40L的共刺激生物活性。图13A示出T细胞活化测定的示意图。将表达OX40L的B16F10细胞或HeLa细胞与CD4+T细胞和抗小鼠CD3抗体(B16F10细胞)或Dynabeads人T活化剂(HeLa细胞)一起共培养。使用ELISA测量IL-2产生作为T细胞活化的相关性。图13B示出如通过小鼠IL-2测量的T细胞活化测定的结果。图13C示出如通过人IL-2测量的T细胞活化测定的结果。y轴示出mIL-2表达(ng/ml)。图13D示出来自图13C的数据，其中示意图示出将表达OX40L的细胞添加至初始T细胞活化测定中。图13E示出使用在表达OX40L的HeLa细胞存在或不存在下和抗人CD3抗体存在或不存在下培养的预先刺激的T细胞的T细胞活化测定。
图14A-14D示出在施用包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸后浸润A20肿瘤中的肿瘤微环境的不同类型的免疫细胞。图14A示出如通过DX5标志物检测的在处理后24小时肿瘤浸润物中的NK细胞的百分比。图14B示出如通过CD4标志物检测的在处理后14天肿瘤浸润物中的CD4+T细胞的百分比。图14C示出如通过CD8标志物检测的在处理后14天肿瘤浸润物中的CD8+T细胞的百分比。图14D示出在第一和第二剂量的包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸后24和72小时，MC38肿瘤的肿瘤浸润物中的CD8+T细胞的百分比。
图15A和15B示出肿瘤内递送的mOX40L_miR-122的体内抗肿瘤功效。图15A示出用对照mRNA(“NST-OX40L”)进行肿瘤内处理的动物中的肿瘤生长(箭头标记注射天数)。图15B示出用mOX40L_miR-122mRNA(“OX40L-miR-122”)进行肿瘤内处理的动物中的肿瘤生长(箭头标记注射天数)。
图16A-16F示出组合疗法的体内抗肿瘤功效，所述组合疗法包含含有编码OX40L多肽的mRNA和miR-122结合位点的多核苷酸和抗PD-1抗体。图16A示出用肿瘤内注射对照mRNA(“NST_mOX40L_122”)和对照抗体(“大鼠IgG2a”)处理的动物中的肿瘤生长。图16B示出用肿瘤内注射mOX40L_miR-122(“mOX40L_122”)和对照抗体(“大鼠IgG2a”)处理的动物中的肿瘤生长。图16C示出用肿瘤内注射对照mRNA(“NST_mOX40L_122”)和抗PD-1抗体(“抗PD-1”)处理的动物中的肿瘤生长。图16D示出用肿瘤内注射mOX40L_miR-122(“mOX40L_122”)和抗PD-1抗体(“抗PD-1”)处理的动物中的肿瘤生长。图16E示出用肿瘤内注射抗PD-1抗体和PBS处理的动物中的肿瘤生长。图16F示出用PBS和对照抗体(“大鼠IgG2a”)处理的动物中的肿瘤生长。CR＝完全反应者。
图17示出用组合疗法进行肿瘤内处理的动物的存活曲线，所述组合疗法包含对照mRNA和对照抗体("NST_mOX40L_122+大鼠IgG2a")、mOX40L_miR-122和对照抗体("mOX40L_122+大鼠IgG2a")、对照mRNA和抗PD-1抗体("NST_mOX40L_122+抗PD-1")、mOX40L_miR-122和抗PD-1抗体("mOX40L_122+抗PD-1")、抗PD-1抗体和PBS("PBS+抗PD-1")以及PBS和对照抗体("PBS+大鼠IgG2a")。
图18A和18B示出用组合疗法处理的动物中的记忆免疫应答，所述组合疗法包含含有编码OX40L多肽的mRNA和miR-122结合位点的多核苷酸和抗PD-1抗体。如图16D中所示最初用肿瘤内注射mOX40L_miR-122和抗PD-1抗体处理动物。将被鉴别为完全反应者(CR)的四只动物用MC38肿瘤细胞再次激发。图18A示出用MC38肿瘤细胞激发的首次接受试验的动物中的肿瘤生长。图18B示出用MC38肿瘤细胞再次激发的四只CR动物中的肿瘤生长。
图19A-19G示出使用双重mRNA疗法(编码IL-23和IL-36的mRNA的组合)和三联体mRNA疗法(编码IL-23、IL-36和OX40L的mRNA的组合)初次处理和未处理的远端肿瘤两者中的体内肿瘤功效。图19A示出在实验中使用的MC38-S双侧腹模型的示意性描述。对植入一侧的肿瘤进行处理，并且在初次处理的肿瘤和另一侧的未处理的肿瘤两者中测量作用。图19B示出阴性对照mRNA(编码OX40L的非翻译mRNA)对初次处理的肿瘤的作用。图19C示出阴性对照mRNA对未处理的肿瘤的作用。图19D示出双重mRNA疗法(编码IL-23的mRNA和编码IL-36-γ的mRNA)对初次处理的肿瘤的作用。图19E示出双重mRNA疗法(编码IL-23的mRNA和编码IL-36-γ的mRNA)对远端未处理的肿瘤的作用。图19F示出三联体mRNA疗法(编码IL-23的mRNA、编码IL-36-γ的mRNA和编码OX40L的mRNA)对初次处理的肿瘤的作用。图19G示出三联体mRNA疗法(编码IL-23的mRNA、编码IL-36-γ的mRNA和编码OX40L的mRNA)对远端未处理的肿瘤的作用。在每种情况下，肿瘤中注射的mRNA(对照、双重或三联体)的总剂量是5微克。以单剂量肿瘤内施用mRNA。
图20A-20D示出与抗PD-L1抗体组合的三联体mRNA疗法在难以治疗的B16F10-AP3肿瘤模型中具有改善的功效。图20A示出用阴性对照处理的动物中的肿瘤生长。图20B示出用抗PD-L1抗体处理的动物中的肿瘤生长。图20C显示用三联体mRNA疗法(编码IL-23的mRNA、编码IL-36-γ的mRNA和编码OX40L的mRNA)处理的动物中的肿瘤生长。图20D示出用三联体mRNA疗法(编码IL-23的mRNA、编码IL-36-γ的mRNA和编码OX40L的mRNA)加抗PD-L1抗体处理的动物中的肿瘤生长。
图21A和图21B示出用双联体mRNA疗法(编码IL-23的mRNA加编码IL-36-γ的mRNA)处理的动物中的记忆免疫应答。最初用肿瘤内Q7D施用的5ug总mRNA(2.5ug的编码IL-23的mRNA和2.5ug的编码IL-36-γ的mRNA)处理动物。将被鉴别为完全反应者(CR)的十只动物用MC38-S肿瘤细胞再次激发。图21A示出用MC38-S肿瘤细胞激发的首次接受试验的动物中的肿瘤生长。图21B示出用MC38-S肿瘤细胞再次激发的十只CR动物中的肿瘤生长。
图22A和图22B示出响应于用双联体mRNA疗法(编码IL-23的mRNA加编码IL-36-γ的mRNA)处理MC38肿瘤，Ly6G+粒细胞的增加。图22A示出在处理后24小时、72小时、7天和14天，作为CD45+细胞的百分比的粒细胞水平。图22B示出在处理后24小时、72小时、7天和14天，作为每mg肿瘤的粒细胞数的粒细胞水平。所呈现的测量值对应于用对照(“NoRx”和“NST”)、IL-23和IL-36-γ单一疗法(“IL23”和“IL36”)以及双联体mRNA组合疗法(对应于接受单剂量组合疗法的小鼠的“Combo”和对应于接受两个剂量的组合疗法的小鼠的“Combo 2剂量”)处理。竖直条表示平均值与标准偏差。数据上方的水平条表示统计显著性。
图23示出在用三联体mRNA组合疗法(编码IL-23的mRNA加编码IL-36-γ的mRNA加编码OX40L的mRNA)处理MC38肿瘤后24小时、72小时和7天，作为CD45+细胞的百分比的Ly6G+粒细胞增加。竖直条表示平均值与标准偏差。数据上方的水平条表示统计显著性。
图24A和图24B示出响应于用双联体mRNA疗法(编码IL-23的mRNA加编码IL-36-γ的mRNA)处理MC38肿瘤的CD103+树突状细胞(DC)增加。图24A示出处理后7天，作为CD45+细胞的百分比的CD103+树突状细胞水平。图24B示出处理后7天，作为每mg肿瘤的CD103+树突状细胞数的CD103+树突状细胞水平。所呈现的测量值对应于用对照(“NoRx”和“NST”)、IL-23和IL-36-γ单一疗法(“IL23”和“IL36”)和双联体mRNA组合疗法(“Combo”)处理。竖直条表示平均值与标准偏差。数据上方的水平条表示统计显著性。
图25A和图25B示出响应于用双联体mRNA疗法(编码IL-23的mRNA加编码IL-36-γ的mRNA)或三联体mRNA疗法(编码IL-23的mRNA加编码IL-36-γ的mRNA加编码OX40L的mRNA)处理MC38肿瘤，CD103+树突状细胞(DC)的增加。图25A示出在处理后7天，作为每mg肿瘤的CD8+细胞数的CD103+树突状细胞水平。图25B示出在处理后7天，肿瘤引流淋巴结(TdLN)中CD8+树突状细胞的水平。所呈现的测量值对应于用对照(“初始”和“NST”)、OX40L单一疗法(“OX40L”)以及双联体和三联体mRNA组合疗法(分别为“双联体”和“三联体”)处理。竖直条表示平均值与标准偏差。数据上方的水平条表示统计显著性。
图26A-26D示出响应于用三联体mRNA疗法(编码IL-23的mRNA加编码IL-36-γ的mRNA加编码OX40L的mRNA)处理，MC38肿瘤和引流淋巴结中的CD11b+树突状细胞的增加。图26A示出在处理后7天，作为每mg肿瘤的细胞数的CD11+cDC2细胞水平。图26B示出在处理后7天，肿瘤引流淋巴结(TdLN)中的CD11+cDC2树突状细胞的水平。图26C示出在肿瘤内施用三联体mRNA疗法后24小时和72小时，作为CD24cDC2细胞的百分比测量的引流淋巴结中CD11b+cDC2上的CD86活化。图26D示出在肿瘤内施用三联体mRNA疗法后24小时和72小时，作为平均荧光强度(MFI)测量的引流淋巴结中CD11b+cDC2上的CD86活化。竖直条表示平均值与标准偏差。数据上方的水平条表示统计显著性。
图27A和图27B示出在将三联体mRNA疗法肿瘤内施用至MC38肿瘤后24小时和72小时，作为CD38cDC1细胞的百分比(图27A)或作为平均荧光强度(MFI)(图27B)测量的引流淋巴结中CD8cDC1上的CD86活化。竖直条表示平均值与标准偏差。数据上方的水平条表示统计显著性。
图28A-28D示出响应于用三联体mRNA疗法(编码IL-23的mRNA加编码IL-36-γ的mRNA加编码OX40L的mRNA)处理，MC38肿瘤和引流淋巴结中炎性树突状细胞(iDC)的增加。图28A示出在处理后7天，作为每mg肿瘤的细胞数的肿瘤中的iDC水平。图28B示出在处理后7天肿瘤引流淋巴结(TdLN)中的iDC水平。图28C示出在肿瘤内施用三联体mRNA疗法后24小时和72小时，作为iDC的百分比测量的引流淋巴结中iDC上的CD86活化。图28D示出在肿瘤内施用三联体mRNA疗法后24小时和72小时，作为平均荧光强度(MFI)测量的引流淋巴结中iDC上的CD86活化。竖直条表示平均值与标准偏差。数据上方的水平条表示统计显著性。
图29示出响应于用双联体mRNA疗法(编码IL-23的mRNA加编码IL-36-γ的mRNA)和三联体疗法(编码IL-23的mRNA加编码IL-36-γ的mRNA加编码OX40L的mRNA)处理MC38肿瘤，效应CD8(杀伤)T细胞与调控性T细胞(Treg)的比率的增加。在处理后72小时和7天进行测量。所呈现的测量值对应于用对照(“NST”)、OX40L单一疗法(“OX40L”)以及双联体和三联体mRNA组合疗法(分别为“双联体”和“三联体”)处理。竖直条表示平均值与标准偏差。数据上方的水平条表示统计显著性。
图30A和图30B示出响应于用双联体mRNA疗法(编码IL-23的mRNA加编码IL-36-γ的mRNA)或三联体mRNA疗法(编码IL-23的mRNA加编码IL-36-γ的mRNA加编码OX40L的mRNA)处理MC38肿瘤，中央和效应CD4和CD8细胞的增加。图30A示出在处理后7天和10天，作为每mg肿瘤的CD4细胞数的CD4细胞水平。图30B示出在处理后7天和10天，作为每mg肿瘤的CD8细胞数的CD8细胞水平。所呈现的测量值对应于用对照(“NST”)、OX40L单一疗法(“OX40L”)以及双联体和三联体mRNA组合疗法(分别为“双联体”和“三联体”)处理。条形图示出初始、中央记忆和效应记忆CD4和CD8细胞的水平。
图31呈现存活曲线，其示出CD细胞消耗对用三联体mRNA疗法(编码IL-23的mRNA加编码IL-36-γ的mRNA加编码OX40L的mRNA)处理MC38肿瘤的功效的影响。通过向患有MC38肿瘤的小鼠施用抗CD4和抗CD8抗体来消耗CD4和CD8细胞水平。箭头表示施用三联体疗法。在施用三联体疗法之前和之后施用CD细胞消耗剂量的抗体(由圆圈表示)。
图32A和32B示出响应于施用三联体mRNA疗法，患有MC38肿瘤的小鼠的癌细胞中PD-L1的表达。图32A示出在用三联体mRNA疗法处理后7天，对PD-L1阳性的癌细胞(CD45-、FSchi、MHCII-)的百分比。图32B示出作为MFI(平均荧光强度)测量的癌细胞(CD45-、FSchi、MHCII-)中PD-L1表达的水平。竖直条表示平均值与标准偏差。数据上方的水平条表示统计显著性。
图33A和图33B示出响应于施用IL-23或IL-36-γ单一疗法或双联体mRNA疗法(编码IL-23的mRNA加编码IL-36-γ的mRNA)，患有MC38肿瘤的小鼠中PD-L1的表达。图33A示出对PD-L1阳性的CD11b+细胞的百分比。图33B示出作为MFI(平均荧光强度)测量的CD11b+细胞中PD-L1表达的强度。所呈现的测量值对应于用对照(“NoRx”和“NST”)、IL-23和IL-36-γ单一疗法(“IL23”和“IL36”)和双联体mRNA组合疗法(“Combo”)处理。竖直条表示平均值与标准偏差。数据上方的水平条表示统计显著性。在植入肿瘤细胞后7天进行所有测量。
图34A和图34B示出响应于施用OX40L单一疗法或双联体(编码IL-23的mRNA加编码IL-36-γ的mRNA)或三联体(编码IL-23的mRNA加编码IL-36-γ的mRNA加编码OX40L的mRNA)mRNA疗法，患有MC38肿瘤的小鼠中PD-L1的表达。图34A示出对PD-L1阳性的CD11b+细胞的百分比。图34B示出作为MFI(平均荧光强度)测量的CD11b+细胞中PD-L1表达的强度。所呈现的测量值对应于用对照(“NoRx”)、OX40L单一疗法(“OX40L”)以及双联体和三联体mRNA组合疗法(分别为“双联体”和“三联体”)处理。竖直条表示平均值与标准偏差。数据上方的水平条表示统计显著性。在植入肿瘤细胞植入物后7天进行所有测量。
图35A-35D示出与抗PD-L1抗体(10F.9G2)组合的三联体mRNA疗法在免疫抑制性MC38肿瘤中的体内抗肿瘤功效。图35A示出用肿瘤内注射对照抗体处理的动物中的肿瘤生长。图35B示出用肿瘤内注射单独抗PD-L1抗体(10F.9G2)处理的动物中的肿瘤生长。图35C示出用肿瘤内注射三联体mRNA疗法处理的动物中的肿瘤生长。图35D示出用肿瘤内注射三重mRNA疗法加抗PD-L1抗体(10F.9G2)处理的动物中的肿瘤生长。竖直虚线表示对照抗体、抗PD-L1抗体、三联体mRNA疗法或三联体mRNA疗法加抗PD-L1抗体的施用日。
图36A和图36B示出三联体mRNA组合疗法(编码IL-23的mRNA加编码IL-36-γ的mRNA加编码OX40L的mRNA)在同系H22(肝细胞癌(HCC))模型中的体内抗肿瘤功效。图36A示出用肿瘤内注射对照mRNA(“NST-FIX”)处理的动物中的肿瘤生长。图36B示出用肿瘤内注射三联体mRNA组合疗法处理的动物中的肿瘤生长。
图37示出根据表11中概述的设计处理的每组小鼠的平均肿瘤体积(mm3)。虚线箭头示出第8组中施用的OX40L的功效的缺乏，以及第5组中OX40L与IL-23的组合的协同作用。
图38A示出用包含小鼠OX40L、小鼠IL-23和小鼠IL-36-γ的三联体组合处理的小鼠组的平均肿瘤体积(mm3)。在每种三联体中使用不同量的编码小鼠IL-36-γ的mRNA。通过添加适量的NST对照mRNA，使每种三联体剂量中mRNA的总量保持恒定。
图38B示出用包含小鼠OX40L、小鼠IL-23和人IL-36-γ的三联体组合处理的小鼠组的平均肿瘤体积(mm3)。在每种三联体中使用不同量的编码人IL-36-γ的mRNA。通过添加适量的NST对照mRNA，使每种三联体剂量中mRNA的总量保持恒定。
图39A-39O示出根据表11中概述的研究设计处理的每组小鼠的肿瘤体积(mm3)。施用mRNA的日期通过竖直虚线指示。每幅图指示在研究结束时每组动物的数量(n)、完全反应者(CR)的数量和具有体积低于100mm3的肿瘤的动物的数量。每幅图还指示施用于每只动物的组合物和组合物中每种mRNA之间的比例。
图40示出根据表11中概述的研究设计处理的每组小鼠的体重变化(％)。所述图示出每组的平均体重值。
图41A-41O示出根据表11中概述的研究设计处理的每组小鼠的体重变化(％)。所述图示出每组中每只动物的体重值的个体变化。
图42呈现存活曲线，其示出根据表11中概述的设计处理MC38肿瘤的作用。虚线箭头示出(i)第8组中施用的OX40L的功效的缺乏，(ii)第9组中IL-23的中等功效，(iii)第5组中OX40L与IL-23的组合的协同作用，以及(iv)观察到的最高功效，其对应于第1组(mOX40L/mIL-23/mIL-36-γ1:1:1)。
图43A示出携带MC38-S肿瘤并用包含IL-23、IL-36-γ和OX40L的三联体组合处理的小鼠的平均肿瘤体积(mm3)。
图43B示出携带MC38-S肿瘤并用包含IL-23和OX40L的双联体组合处理的小鼠的平均肿瘤体积(mm3)。与如图43A中处理的小鼠相比，剂量中mRNA的总量通过添加适量的NST对照mRNA而保持恒定。
图44是说明癌症治疗的远位效应的图。
具体实施方式
用于治疗癌症的特别令人兴奋的方法涉及用刺激免疫应答的物质预防或治疗疾病，其被称为免疫疗法。免疫疗法(在本领域中也被称为免疫肿瘤学)已经开始通过引入不靶向肿瘤、而是靶向宿主免疫系统的疗法来彻底改变癌症治疗。这些疗法具有独特的药理学反应概况，并且因此代表可治愈许多不同类型的癌症的疗法。肺癌、肾癌、膀胱癌和皮肤癌是就存活率或肿瘤反应而言从用免疫肿瘤学治疗中获得实质功效的癌症之一，其中黑素瘤可能显示出最大的益处。免疫疗法通常特征是使用令人兴奋的新型生物药物(称为检查点抑制剂抗体)的检查点抑制剂治疗。
本公开的特征是用于治疗癌症的方法和组合物，特别是免疫治疗方法和组合物。在一些方面，本公开的特征是使用组合疗法治疗癌症的方法和组合物，所述组合疗法的特征是编码第一免疫应答引发物多肽和第二不同的免疫应答引发物多肽的两种或更多种多核苷酸(例如，mRNA)和任选的编码免疫应答共刺激信号多肽的多核苷酸以及任选的编码检查点抑制剂多肽或包含检查点抑制剂多肽的多肽的多核苷酸。在一些方面，本公开提供一种免疫调节组合物，其包含编码白细胞介素-23(IL-23)多肽的多核苷酸、编码白细胞介素-36γ(IL-36γ)多肽的多核苷酸和任选的编码OX40L多肽的多核苷酸。在其他方面，本公开提供一种免疫调节组合物，其包含编码IL-23多肽的多核苷酸、编码白细胞介素18(IL-18)多肽的多核苷酸和任选的编码OX40L多肽的多核苷酸。
在一些方面，本公开涉及使用组合方法治疗癌症的方法，所述组合方法的特征是编码IL-23、IL-36或IL-18和/或OX40L的mRNA。不受理论束缚，据信通过例如肿瘤内施用编码IL-12家族成员(例如，IL-23)和/或IL-1家族成员(例如，IL-36或IL-18)的mRNA可能引发抗癌免疫应答。IL-23在刺激例如T细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞和或树突状细胞中是重要的。IL-36在刺激例如T细胞、自然杀伤细胞、粒细胞和/或树突状细胞中是重要的。IL-18与IL-12一起诱导细胞介导的免疫并且在刺激例如T细胞、自然杀伤细胞和/或巨噬细胞中是重要的。编码IL-36的mRNA或编码IL-18的mRNA与编码IL-23的mRNA组合据信例如在肿瘤环境内，例如经由肿瘤内注射所述mRNA而向免疫系统提供第一刺激信号。当与编码IL-23和IL-36的mRNA组合提供时，编码免疫应答共刺激信号多肽(例如，OX40L)的mRNA的施用据信提供第二刺激信号，这至少部分地归因于OX40L刺激T细胞的能力。
在一些方面，本文公开的免疫治疗方法可(1)转化肿瘤微环境(TME)以优化免疫原性，和/或(2)增强T细胞应答以引发远端控制和抗癌记忆。远位效应(即局部治疗肿瘤、但全局作用)在图44中说明。
本公开的一些方面的特征是用编码IL-23的mRNA与编码IL-36的mRNA的组合治疗。本公开的其他方面的特征是用编码IL-23的mRNA与编码IL-18的mRNA的组合治疗。示例性方面的特征是用脂质纳米颗粒-(LNP-)包封的mRNA治疗。示例性方面的特征是肿瘤内施用基于可电离氨基脂质的LNP中的mRNA。
本公开的其他方面的特征是通过向有需要的受试者施用有效量的包含编码IL-23、IL-36-γ或IL-18和OX40L的mRNA的组合来在所述受试者中减小或缩减肿瘤大小或抑制有肿瘤生长的组合物和方法。在一些方面，所述mRNA组合包含编码IL-23多肽的第一多核苷酸、编码包含IL-36-γ多肽或IL-18多肽的第二蛋白质的第二多核苷酸和编码包含OX40L多肽的第三蛋白质的第三多核苷酸。本公开的一个方面涉及药物组合物，其包含编码IL-23多肽的两种或更多种多核苷酸(例如，mRNA)、编码IL-36-γ多肽或IL-18多肽的多核苷酸(例如，mRNA)和编码OX40L多肽的多核苷酸(例如，mRNA)。
在另一方面，所述组合物是包含可电离氨基脂质的脂质组合物，如下文公开的式(I)化合物，例如化合物18、25、26或48。在本公开的一些方面，所述药物组合物的脂质组合物包含另外的脂质/组分。例如，所述脂质组合物可包含一种或多种磷脂，例如MSPC或DSPC。所述脂质组合物还可包含季胺化合物，如DOTAP。
在另一方面，本申请提供了一种脂质组合物(例如，脂质纳米颗粒(LNP))，其包含：(1)具有式(I)的化合物；(2)任选的辅助脂质(例如磷脂)；(3)任选的结构脂质(例如固醇)；(4)任选的脂质缀合物(例如PEG-脂质)；以及(5)任选的季胺化合物。
本文提供的标题不是对本公开的各个方面或方面的限制，所述方面可通过参考整个说明书来获得。因此，通过参考说明书全文，更充分地定义了紧接着在下文中定义的术语。在详细描述本公开之前，应了解，本公开并不限于特定的组合物或方法步骤，因为所述组合物或方法步骤可改变。
I.定义
为了能够更容易地理解本公开内容，首先定义了某些术语。如本申请中所用，除非在本文中另外明确提供，否则以下术语中的每一个应具有下面阐述的含义。另外的定义在整个本申请中阐述。
本公开包括其中恰有组中的一个成员存在于、被用于或以其他方式关联于给定产物或方法的实施方案。本公开包括其中多于一个或所有的组成员存在于、被用于或以其他方式关联于给定产物或方法的实施方案。
在本说明书和随附的权利要求书中，除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括复数指示物。术语“一个/种(a/an)”以及术语“一个/种或多个/种(one or more)”和“至少一个/种(at least one)”可在本文中互换使用。在某些方面，术语“一个/种(a/an)”是指“单一(single)”。在其他方面，术语“一个/种(a/an)”包括“两个/种或更多个/种(two or more)”或“多个/种(multiple)”。
此外，当在本文中使用时将“和/或”视为对两个指定特征或组分中的每一者具有或不具有另一者的具体公开内容。因此，如本文中诸如“A和/或B”的短语中所用的术语“和/或”意图包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样，如在诸如“A、B和/或C”的短语中所用的术语“和/或”意图涵盖以下方面中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语均具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。例如，the Concise Dictionary ofBiomedicine and Molecular Biology,Juo,Pei-Show,第2版,2002,CRC Press；TheDictionary of Cell and Molecular Biology,第3版,1999,Academic Press；以及theOxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology,修订版,2000,OxfordUniversity Press为本领域的技术人员提供了本公开中使用的许多术语的通用词典。
无论在什么情况下在本文用语言“包含”描述方面时，还提供了关于“由……组成”和/或“主要由……组成”描述的其他类似方面。
单位、前缀和符号以它们的国际单位制(SI)可接受的形式来表示。数值范围包括限定所述范围的数字。在列举值的范围的情况下，应理解，在所述范围的所列举的上限和下限之间的每个中间整数值及其每一部分也与此类值之间的每个子范围一起具体地公开。任何范围的上限和下限都可独立地包括在所述范围中或者从所述范围中排除，并且其中包括任一极限、无一极限或两个极限的每个范围也涵盖在本公开内。在明确列举值的情况下，应该理解的是，与所列举的值大致相同的量或量的值也在本公开的范围内。在公开了组合的情况下，所述组合的要素的每个子组合也具体地公开并且在本公开的范围内。相反，在单独公开不同要素或要素组的情况下，还公开了其组合。在本公开的任何要素被公开为具有多个替代方案的情况下，在此还公开了其中每个替代方案单独地或与其他替代方案组合排除在外的本公开的实施例；本公开的多于一个要素可以具有这样的排除，并且在此公开具有这种排除的要素的全部组合。
核苷酸由其通常接受的单字母代码提及。除非另外指明，否则核酸是以5′至3′定向自左至右书写。核苷酸在本文中通过其由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的通常已知的单字母符号来提及。因此，A代表腺嘌呤，C代表胞嘧啶，G代表鸟嘌呤，T代表胸腺嘧啶，并且U代表尿嘧啶。
氨基酸在本文中通过其通常已知的三个字母符号或通过IUPAC-IUB生物化学命名委员会所推荐的单字母符号来参考。除非另外指明，否则氨基酸序列是以氨基至羧基定向自左至右书写。
约：结合整个说明书和权利要求中的数值使用的术语“约”表示本领域技术人员熟悉且可接受的准确性区间。一般来说，这种准确性区间为±10％。
在给出范围时，端点被包括在内。另外，除非另外指明，或者另外从上下文以及本领域的普通技术人员的理解明显可见，否则以范围表示的值在本公开的不同实施例中可以采用所规定的范围内的任何特定值或子范围，除非上下文中另外清楚地指示，否则精确到该范围的下限单位的十分之一。
组合施用：如本文所使用，术语“组合施用”或“组合的施用”或“组合疗法”是指同时或在使得对患者存在每种剂的作用重叠的时间段内向受试者施用两种或更多种试剂。在一些实施方案中，在彼此约60、30、15、10、5或1分钟内施用它们。在一些实施方案中，使剂的施用足够靠近地间隔以使得实现组合(例如，协同)作用。
氨基酸取代：术语“氨基酸取代”是指用另一氨基酸残基置换亲本或参考序列(例如，野生型序列)中存在的氨基酸残基。氨基酸可以在亲本或参考序列(例如，野生型多肽序列)序列中例如经由化学肽合成或通过本领域已知的重组方法被取代。因此，提及“位置X处的取代”是指位置X处存在的氨基酸用替代氨基酸残基取代。在一些方面，取代模式可以根据图式AnY描述，其中A是对应于位置n处天然或原始存在的氨基酸的单字母代码，并且Y是取代氨基酸残基。在其他方面，取代模式可以根据图式An(YZ)描述，其中A是对应于取代位置X处天然或原始存在的氨基酸的氨基酸残基的单字母代码，并且Y和Z是替代取代氨基酸残基。
在本公开的上下文中，取代(即使它们被称为氨基酸取代)在核酸水平下进行，即用替代氨基酸残基取代氨基酸残基通过用编码第二氨基酸的密码子取代编码第一氨基酸的密码子来进行。
动物：如本文所使用，术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的人。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的非人动物。在某些实施方案中，非人动物为哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、绵羊、牛、灵长类动物或猪)。在一些实施方案中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼以及蠕虫。在一些实施方案中，动物为转基因动物、基因工程化的动物或克隆。
近似：如本文所用，在应用于一个或多个目标值时，术语“大约”是指类似于所阐述的参考值的值。在某些实施方案中，术语“大约”是指在所阐述的参考值的任一方向上的(大于或小于)25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小范围内的值范围，除非另外说明或以另外的方式从上下文显而易见(除了这样的数值将超过可能值的100％的情况)。
与……相关：如本文关于疾病所使用，术语“与……相关”是指所讨论的症状、测量、特征或状态与所述疾病的诊断、发展、存在或进展相关。这种关联可能(但不一定)与疾病有因果关系。
在关于两个或更多个部分使用时，术语“缔合”、“缀合”、“连接”、“附着”和“栓系”当关于两个或更多个部分使用时意味着所述部分直接或经充当连接剂的一个或多个另外的部分彼此物理缔合或连接以形成足够稳定的结构，从而使得在使用所述结构的条件例如生理条件下所述部分保持物理缔合。“缔合”不需要是严格地通过直接共价化学结合。还可表明离子键合或氢键合或基于杂交的连接足够稳定以使得“缔合的”实体保持物理缔合。
生物相容：如本文所使用，术语“生物相容”意指与活细胞、组织、器官或系统相容，造成很少或没有损伤、毒性或被免疫系统排斥的风险。
生物可降解：如本文所使用，术语“生物可降解”意指能够通过活物的作用分解成无害产物。
序列优化：术语“序列优化”是指参考核酸序列中的核碱基被替代核碱基置换、从而产生具有改进的性质，例如改进的蛋白质表达或降低的免疫原性的核酸序列的过程或一系列过程。
一般来说，序列优化的目标是产生编码由参考核苷酸序列编码的相同多肽序列的同源核苷酸序列。因此，由密码子优化的核苷酸序列编码的多肽中不存在相对于由参考核苷酸序列编码的多肽的氨基酸取代(作为密码子优化的结果)。
密码子取代：在序列优化的上下文中，术语“密码子取代”或“密码子置换”是指用另一个密码子置换参考核酸序列中存在的密码子。密码子可在参考核酸序列中例如经由化学肽合成或通过本领域已知的重组方法被取代。因此，在核酸序列(例如，mRNA)中的某个位置或在核酸序列(例如，mRNA)的某个区域或子序列内提及“取代”或“置换”是指用替代密码子取代这种位置或区域处的密码子。
如本文所用，术语“编码区”和“编码……的区”及其语法变化形式是指多核苷酸中在表达后产生多肽或蛋白质的开放阅读框(ORF)。
化合物：如本文所使用，术语“化合物”是指包括所描绘的结构的所有立体异构体和同位素。如本文所用，术语“立体异构体”是指化合物的任何几何异构体(例如，顺式-和反式-异构体)、对映异构体或非对映异构体。本公开涵盖本文所述化合物的任何和所有立体异构体，包括立体异构纯形式(例如，几何纯、对映异构纯或非对映异构纯)以及对映异构和立体异构混合物，例如外消旋体。化合物的对映异构和立体异构混合物以及将它们拆分成其组分对映异构体或立体异构体的方法是众所周知的。“同位素”是指具有相同原子数但具有由原子核中的中子数不同而产生的不同质量数的原子。举例来说，氢的同位素包括氚和氘。此外，本公开的化合物、盐或复合物可通过常规方法与溶剂或水分子组合以形成溶剂合物和水合物来制备。
保守氨基酸取代：“保守性氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代的一种氨基酸取代。在本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸或组氨酸)、酸性侧链(例如，天门冬氨酸或谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或半胱氨酸)、非极性的侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、以及芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或组氨酸)。因此，如果多肽中的氨基酸用来自同一侧链家族的另一氨基酸置换，则将氨基酸取代视为保守的。在另一方面，一串氨基酸可以用在侧链家族成员的顺序和/或组成上不同的结构类似的串保守置换。
非保守氨基酸取代包括以下那些，其中(i)具有正电性侧链的残基(例如，Arg、His或Lys)被取代成负电性残基(例如，Glu或Asp)或被负电性残基取代，(ii)亲水性残基(例如，Ser或Thr)被取代成疏水性残基(例如，Ala、Leu、Ile、Phe或Val)或被疏水性残基取代，(iii)半胱氨酸或脯氨酸被取代成任何其他残基或被任何其他残基取代，或(iv)具有大体积疏水性或芳香族侧链的残基(例如，Val、His、Ile或Trp)被取代成具有更小侧链的残基(例如，Ala或Ser)或无侧链的残基(例如，Gly)或被具有更小侧链的残基或无侧链的残基取代。
其他氨基酸取代可通过普通技术人员容易地鉴定。例如，对于氨基酸丙氨酸，取代可以自D-丙氨酸、甘氨酸、β-丙氨酸、L-半胱氨酸和D-半胱氨酸中的任何一种取得。对于赖氨酸，置换可以是D-赖氨酸、精氨酸、D-精氨酸、高精氨酸、甲硫氨酸、D-甲硫氨酸、鸟氨酸或D-鸟氨酸中的任何一种。通常，可预期诱导分离多肽的特性变化的功能重要区域中的取代是以下那些，其中(i)极性残基例如丝氨酸或苏氨酸被取代成疏水性残基例如亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、或丙氨酸(或被其取代)；(ii)半胱氨酸残基被取代成任何其他残基(或被其取代)；(iii)具有正电性侧链的残基例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸被取代成具有负电性侧链的残基例如谷氨酸或天冬氨酸(或被其取代)；或(iv)具有大体积侧链的残基例如苯丙氨酸被取代成不具有这样侧链的残基例如甘氨酸(或被其取代)。前述非保守取代之一可以改变蛋白质的功能性质的可能性也与取代相对于蛋白质的功能重要区的位置相关：一些非保守取代可以相应地对于生物性质几乎没有影响。
保守的：如本文所使用，术语“保守的”是指分别在比较的两个或更多个序列的相同位置上未发生改变的多核苷酸序列或多肽序列的核苷酸或氨基酸残基。相对保守的核苷酸或氨基酸为在较为相关的序列之间比出现于序列的其他地方的核苷酸或氨基酸保守的那些核苷酸或氨基酸。
在一些实施方案中，如果两个或更多个序列彼此100％相同，将它们称为“完全保守的”。在一些实施方案中，如果两个或更多个序列彼此至少70％相同、至少80％相同、至少90％相同或至少95％相同，将它们被称为“高度保守的”。在一些实施方案中，如果两个或更多个序列彼此约70％相同、约80％相同、约90％相同、约95％、约98％或约99％相同，将它们称为“高度保守的”。在一些实施方案中，如果两个或更多个序列彼此至少30％相同、至少40％相同、至少50％相同、至少60％相同、至少70％相同、至少80％相同、至少90％相同或至少95％相同，将它们被称为“保守的”。在一些实施方案中，如果两个或更多个序列彼此约30％相同、约40％相同、约50％相同、约60％相同、约70％相同、约80％相同、约90％相同、约95％相同、约98％相同或约99％相同，将它们称为“保守的”。序列的保守可适用于多核苷酸或多肽的整个长度或可适用于其部分、区或特征。
接触：如本文所用，术语“接触”是指在两个或更多个实体之间建立物理连接。例如，使哺乳动物细胞与纳米颗粒组合物接触是指使哺乳动物细胞和纳米颗粒共享物理连接。使细胞与外部实体在体内和离体接触的方法是生物学领域中众所周知的。例如，使纳米颗粒组合物与置于哺乳动物体内的哺乳动物细胞接触可通过不同的施用途径(例如，静脉内、肌肉内、皮内和皮下)进行，并且可涉及不同量的纳米颗粒组合物。此外，纳米颗粒组合物可接触多于一种哺乳动物细胞。
控制释放：如本文所使用，术语“控制释放”是指遵循用于实现治疗结果的特定释放模式的药物组合物或化合物释放概况。
共价衍生物：当提及多肽时术语“共价衍生物”包括用有机蛋白质或非蛋白质衍生化试剂修饰天然或起始蛋白质，和/或翻译后修饰。传统上通过使蛋白质的靶标氨基酸残基与能够与选定侧链或末端残基反应的有机衍生化试剂反应，或通过利用在选定重组宿主细胞中起作用的翻译后修饰的机制来引入共价修饰。所得共价衍生物适用于旨在鉴别对于生物活性、对于免疫测定或对于制备用于重组糖蛋白的免疫亲和纯化的抗蛋白质抗体来说重要的残基的程序中。这类修饰在本领域普通技术的范围内并且在无过度实验的情况下进行。
环状或环化：如本文所使用，术语“环状”是指存在连续环路。环状分子不需要为环形的，仅连接形成不断开链的亚单位。环状分子如本公开的工程化的RNA或mRNA可为单一单元或多聚体或包含复合物或高级结构的一种或多种组分。
细胞毒性：如本文所使用，“细胞毒性”是指杀死细胞(例如，哺乳动物细胞(例如，人细胞))、细菌、病毒、真菌、原生动物、寄生虫、朊病毒或其组合或对其造成有害的、毒性的或致死的作用。
递送：如本文所用，术语“递送”是指向目标提供实体。例如，将多核苷酸递送至受试者可涉及向所述受试者施用包含所述多核苷酸的纳米颗粒组合物(例如，通过静脉内、肌肉内、皮内或皮下途径)。向哺乳动物或哺乳动物细胞施用纳米颗粒组合物可涉及使一种或多种细胞与所述纳米颗粒组合物接触。
递送剂：如本文所使用，“递送剂”是指至少部分地促进多核苷酸体内、体外或离体递送至靶细胞的任何物质。
去稳定：如本文所使用，术语“不稳定的”、“去稳定化”或“去稳定区”意指比相同区或分子的起始野生型或天然形式的稳定性差的区或分子。
可检测标记：如本文所使用，“可检测标记”是指附接、并入或缔合另一个通过本领域中已知的方法容易检测的实体的一种或多种标志物、信号或部分，所述方法包括射线照相术、荧光、化学发光、酶活性、吸光度等。可检测标记包括放射性同位素、荧光团、发色团、酶、染料、金属离子、配体如生物素、抗生物素蛋白、抗生物素蛋白链菌素和半抗原、量子点等。可检测标记可位于本文公开的肽或蛋白质中的任何位置上。它们可在氨基酸、肽或蛋白质内，或位于N-末端或C-末端上。
非对映异构体：如本文所用，术语“非对映异构体”意指彼此不为镜像并且彼此不可重叠的立体异构体。
消化：如本文所使用，术语“消化”意指裂开成更小的片或组分。在指多肽或蛋白质时，消化引起肽的产生。
远端：如本文所使用，术语“远端”意指位置远离中心或远离目标点或区。
结构域：如本文所用，当提及多肽时术语“结构域”是指具有一种或多种可鉴别的结构或功能特征或特性(例如，结合能力，用作蛋白质-蛋白质相互作用的位点)的多肽的基序。
给药方案：如本文所使用，术语“给药方案”或“给药方案”为施用时间表或治疗、预防或缓和护理的医师确定方案。
有效量：如本文所用，术语剂的“有效量”是足以实现有益或所需结果，例如临床结果的量，并且因此“有效量”取决于施加其的背景。例如，在施用治疗肿瘤的剂的背景下，剂的有效量是例如与没有施用所述剂所获得的反应相比，足以减小或缩减肿瘤大小或抑制肿瘤生长的量。术语“有效量”可与“有效剂量”、“治疗有效量”或“治疗有效剂量”互换使用。
对映异构体：如本文使用，否则术语“对映异构体”是指具有至少80％(即，至少90％的一种对映异构体和至多10％的另一种对映异构体)、至少90％或至少98％的光学纯度或对映异构体过量(如由本领域中标准的方法测定)的本公开化合物的各单个旋光形式。
包封：如本文所使用，术语“包封”是指封住、包围或包住。
包封效率：如本文所用，“包封效率”是指相对于制备纳米颗粒组合物中使用的多核苷酸的初始总量，成为纳米颗粒组合物的一部分的多核苷酸的量。例如，如果将初始提供至组合物的总计100mg多核苷酸中的97mg多核苷酸包封在纳米颗粒组合物中，则包封效率可给出为97％。如本文所用，“包封”可指完全、实质或部分封住、约束、包围或包住。
编码的蛋白质裂解信号：如本文所使用，“编码的蛋白质裂解信号”是指编码蛋白质裂解信号的核苷酸序列。
工程化的：如本文所使用，本公开的实施方案在它们被设计来具有不同于起始点野生型或天然分子的无论结构或化学上的特征或特性时为“工程化的”。
增强的递送：如本文所用，术语“增强的递送”是指与通过对照纳米颗粒(例如，MC3、KC2或DLinDMA)向目标靶组织递送多核苷酸的水平相比，通过纳米颗粒向目标靶组织(例如,哺乳动物肝脏)递送更多(例如，多至少1.5倍、多至少2倍、多至少3倍、多至少4倍、多至少5倍、多至少6倍、多至少7倍、多至少8倍、多至少9倍、多至少10倍)的多核苷酸。向特定组织递送纳米颗粒的水平可通过比较组织中产生的蛋白质的量与所述组织的重量、比较组织中的多核苷酸的量与所述组织的重量、比较组织中产生的蛋白质的量与所述组织中的总蛋白质的量或者比较组织中多核苷酸的量与所述组织中的总多核苷酸的量来进行测量。应理解，纳米颗粒向靶组织的增强的递送不需要在所治疗的受试者中确定，它可在诸如动物模型(例如，大鼠模型)的替代物中确定。
外来体：如本文所使用，“外来体”为哺乳动物细胞分泌的囊泡或涉及RNA降解的复合物。
表达：如本文所用，核酸序列的“表达”是指以下事件中的一个或多个：(1)从DNA序列产生RNA模板(例如，通过转录)；(2)加工RNA转录物(例如，通过剪接、编辑、5’帽形成和/或3’端加工)；(3)RNA翻译成多肽或蛋白质；以及(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。
离体：如本文所用，术语“离体”是指发生在生物体(例如，动物、植物或微生物或其细胞或组织)外部的事件。离体事件可在从天然(例如，体内)环境最小改变的环境中发生。
特征：如本文所使用，“特征”是指特点、特性或独特要素。当提及多肽时，“特征”被定义为分子的基于氨基酸序列的不同组分。由本公开的多核苷酸编码的多肽的特征包括表面表观、局部构象形状、折叠、环、半环、结构域、半结构域、位点、末端或其任何组合。
制剂：如本文所用，“制剂”至少包含多核苷酸以及载体、赋形剂和递送剂中的一种或多种。
片段：如本文所使用的“片段”是指部分。例如，蛋白质的片段可包含通过消化从培养的细胞中分离的全长蛋白质获得的多肽。在一些实施方案中，片段是全长蛋白质的子序列(例如，IL-23的亚基之一)，其中N-末端和/或C-末端和/或内部子序列已缺失。在本公开的一些优选的方面，本公开的蛋白质的片段是功能性片段。
功能性：如本文使用，“功能性”生物分子是呈表现出可借以对其进行表征的性质和/或活性的形式的生物分子。因此，本公开的多核苷酸的功能性片段是能够表达功能性白细胞介素片段的多核苷酸。如本文所用，白细胞介素的功能性片段是指野生型白细胞介素的片段(即，白细胞介素的天然存在形式的片段)，或其突变体或变体，其中所述片段保留相应全长蛋白质的生物活性地至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％。
辅助脂质：如本文所用，术语“辅助脂质”是指包含脂质部分(用于插入脂质层，例如脂质双层中)和极性部分(用于与脂质层表面处的生理溶液相互作用)的化合物或分子。通常，辅助脂质是磷脂。辅助脂质的功能是“补充”氨基脂质并增加双层的融合性和/或有助于促进例如递送至细胞的核酸的内体逃逸。辅助脂质也据信是LNP表面的关键结构组分。
同源性：如本文所使用，术语“同源性”是指聚合物分子之间，例如核酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。一般来说，术语“同源性”意味着两个分子之间的进化关系。因此，同源的两个分子将具有共同的进化祖先。在本公开的上下文中，术语同源性涵盖同一性和相似性两者。
在一些实施方案中，如果聚合物分子中至少至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的单体是相同的(完全相同的单体)或相似的(保守取代)，则认为所述分子是彼此“同源的”。术语“同源的”必定是指至少两个序列(多核苷酸序列或多肽序列)之间的比较。
同一性：如本文所使用，术语“同一性”是指聚合物分子之间例如多核苷酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体单体保守性。两个多核苷酸序列的同一性百分比的计算例如可通过出于最佳比较目的比对两个序列来进行(例如，为了最佳比对可将空位引入第一核酸序列和第二核酸序列之一或两者中并且出于比较目的可忽视不相同的序列)。在某些实施方案中，出于比较目的比对的序列的长度为参比序列长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。然后比较相应核苷酸位置的核苷酸。当第一序列中的位置由与第二序列中的相应位置相同核苷酸占据时，那么在此位置的分子是相同的。两个序列之间的一致性百分比随着由序列共享的相同位置的数目而变化，考虑到为了最优比对两个序列而需要引入的间隙的数目，和每个间隙的长度。两个序列之间的序列的比较和一致性百分比的确定可使用数学算法来完成。当比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可被认为是等同的。
合适的软件程序可自各种来源获得，并且可用于比对蛋白质和核苷酸序列两者。用以确定序列同一性百分比的一个合适程序为bl2seq，其为可获自美国政府国家生物技术信息中心BLAST网址(blast.ncbi.nlm.nih.gov)的BLAST程序套件的部分。Bl2seq使用BLASTN或BLASTP算法在两个序列之间执行比较。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。其他合适程序为例如Needle、Stretcher、Water或Matcher，其为生物信息程序的EMBOSS套件的部分，并且也可自欧洲生物信息研究所(EBI)在www.ebi.ac.uk/Tools/psa上得到。
序列比对可使用本领域中已知的方法如MAFFT、Clustal(ClustalW、Clustal X或Clustal Omega)、MUSCLE等来进行。
与多核苷酸或多肽参考序列比对的单个多核苷酸或多肽靶序列内的不同区域可各自具有其自己的百分比序列同一性。应当指出的是序列一致性百分比值被四舍五入至最近的十分位。例如，80.11、80.12、80.13以及80.14向下舍入至80.1，而80.15、80.16、80.17、80.18以及80.19向上舍入至80.2。还应当指出的是长度值将总是整数。
在某些方面，第一氨基酸序列(或核酸序列)与第二氨基酸序列(或核酸序列)的百分比同一性“％ID”计算为％ID＝100x(Y/Z)，其中Y是在第一序列和第二序列的比对中评分为相同匹配的氨基酸残基(或核碱基)的数目(如通过目视检查或特定序列比对程序所比对)，并且Z是第二序列中的残基的总数目。如果第一序列的长度比第二序列长，那么所述第一序列与第二序列的同一性百分比将比所述第二序列与所述第一序列的同一性百分比长。
本领域技术人员应当了解用于计算序列一致性百分比的序列比对的产生不限于完全由基本序列数据驱动的二元序列-序列比较。还应理解，序列比对可以通过整合序列数据与异类来源的数据产生，所述异类来源的数据诸如为结构数据(例如，结晶蛋白结构)、功能数据(例如，突变的定位)或谱系学数据。整合异类数据以产生多重序列比对的合适程序为T-Coffee，其获自www.tcoffee.org且可替代地获自例如EBI。还应理解，用于计算百分比序列同一性的最终比对可以自动地或人工地加以验证。
免疫检查点抑制剂：“免疫检查点抑制剂”或简称“检查点抑制剂”是指阻止免疫细胞被癌细胞关闭的分子。如本文所用，术语检查点抑制剂是指多肽(例如，抗体)或编码此类多肽的多核苷酸(例如，mRNA)，所述多肽或多核苷酸中和或抑制抑制性检查点分子，如细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、程序性死亡1受体(PD-1)或PD-1配体1(PD-L1)。
免疫应答：术语“免疫应答”是指例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞以及由上述细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，所述作用产生侵入病原体、感染病原体的细胞或组织、癌细胞、或在自身免疫性或病理性炎症的情况下正常人细胞或组织的选择性损伤、破坏或从人体消除。
免疫应答共刺激信号：术语“免疫应答共刺激信号”是指促进T细胞和/或NK细胞募集、增殖、活化、存活或其组合的免疫刺激分子。在一些方面，免疫应答共刺激信号是增强T细胞扩增、功能和记忆形成的多肽(例如，OX40L)。在一些方面，共刺激信号促进Th1、Th2和/或Th9发育，抑制Treg发育或活性，增强CD4和/或CD8T细胞的扩增和/或存活，和/或促进记忆细胞。在特定方面，免疫应答共刺激信号多肽是选自由以下组成的组：OX40L、CD80和IL-15。在一些具体方面，免疫应答共刺激信号多肽是选自由OX40L和CD80组成的组。
免疫应答引发物：_术语“免疫应答引发物”是指增强抗原呈递和/或识别的免疫刺激分子。在一些方面，免疫应答引发物是引发树突状细胞、促进树突状细胞成熟、促进抗原呈递细胞细胞因子/趋化因子产生、扩增和/或维持Th17细胞、增强T细胞增殖和/或增强Th1和/或Th9分化的多肽。在一些方面，免疫应答引发物是IL-12家族的成员(例如，IL-12、IL-23、IL-12p40亚基、IL-23p19亚基、IL-27、IL-35)。在其他方面，免疫应答引发物是IL-1家族的成员(例如，IL-1α、IL-1β、IL-1Ra、IL-18、IL-33、IL-36Ra、IL-36α、IL-36β、IL-36γ、IL-37、IL-38)。在一些方面，免疫应答引发物是选自由以下组成的组的多肽：IL-23、IL-12p40亚基、IL-23p19亚基、IL-12、IL-36-γ和IL-18。
炎症应答：“炎症应答”是指涉及特异性和非特异性防御系统的免疫应答。特异性防御系统反应是对抗原的特异性免疫系统反应。特异性防御系统反应的实例包括抗体应答。非特异性防御系统反应是由通常不能免疫记忆的白细胞(例如，巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞)介导的炎症应答。在一些方面，免疫应答包括炎性细胞因子的分泌，从而导致炎性细胞因子水平升高。
炎性细胞因子：术语“炎性细胞因子”是指在炎症应答中升高的细胞因子。炎性细胞因子的实例包括白细胞介素-6(IL-6)、CXCL1(趋化因子(C-X-C基序)配体1；也称为GROα、干扰素-γ(IFNγ)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素γ-诱导的蛋白10(IP-10)或粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。术语炎性细胞因子还包括本领域中已知的与炎症应答相关的其他细胞因子，例如白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-12(IL-12)、白细胞介素-13(IL-13)、干扰素α(IFN-α)等。
体外：如本文所用，术语“体外”是指事件发生在人工环境中，例如在试管或反应容器中、在细胞培养物中、在皮氏培养皿(Petri dish)中等，而非在生物体(例如，动物、植物或微生物)内。
体内：如本文所使用，术语“体内”是指发生在生物体(例如，动物、植物或微生物或其细胞或组织)内的事件。
插入和缺失变体：当提及多肽时“插入变体”是具有紧邻天然或起始序列中的特定位置处的氨基酸插入的一个或多个氨基酸的那些变体。“紧邻”氨基酸意指连接至所述氨基酸的α-羧基或α-氨基官能团。当提及多肽时“缺失变体”是天然或起始氨基酸序列中的一个或多个氨基酸被去除的那些变体。通常，缺失变体将使一个或多个氨基酸在分子的特定区中缺失。
完整：如本文所用，在多肽的上下文中，术语“完整”是指保留对应于野生型蛋白质的氨基酸，例如，不突变或取代野生型氨基酸。反之，在核酸的上下文中，术语“完整”是指保留对应于野生型核酸的核碱基，例如，不突变或取代野生型核碱基。
可电离氨基脂质：术语“可电离氨基脂质”包括具有一个、两个、三个或更多个脂肪酸或脂肪烷基链和pH可滴定的氨基头基(例如，烷基氨基或二烷基氨基头基)的那些脂质。可电离氨基脂质通常在低于氨基头基的pKa的pH下质子化(即，带正电荷)并且在高于所述pKa的pH下基本上不带电荷。此类可电离氨基脂质包括但不限于DLin-MC3-DMA(MC3)和(13Z,165Z)-N,N-二甲基-3-壬二十二碳-13-16-二烯-1-胺(L608)。
体外：如本文所用，术语“体外”是指事件发生在人工环境中，例如在试管或反应容器中、在细胞培养物中、在皮氏培养皿(Petri dish)中等，而非在生物体(例如，动物、植物或微生物)内。
体内：如本文所使用，术语“体内”是指发生在生物体(例如，动物、植物或微生物或其细胞或组织)内的事件。
分离的：如本文所使用，术语“分离的”是指已从其缔合(无论在自然中或在实验设置中)的至少一些组分中分离的物质或实体。分离的物质(例如，核苷酸序列或蛋白质序列)可相对于它们缔合的物质具有不同水平的纯度。分离的物质和/或实体可从至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或更多的它们最初与其缔合的其他组分中分离。在一些实施方案中，分离的剂为大于约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或多于约99％纯。如本文所使用，如果物质基本上不含其他组分，则它为“纯的”。术语“基本上分离的”是指化合物从其形成或检测的环境中基本上分离。部分分离可包括例如富集本公开化合物的组合物。基本上分离可包括含有至少约50重量％、至少约60重量％、至少约70重量％、至少约80重量％、至少约90重量％、至少约95重量％、至少约97重量％或至少约99重量％的本公开化合物或其盐的组合物。
“分离的”多核苷酸、载体、多肽、细胞或本文公开的任何组合物是呈自然界中未发现形式的多核苷酸、载体、多肽、细胞或组合物。分离的多核苷酸、载体、多肽或组合物包括已经被纯化到不再以它们在自然界被发现的形式的程度的那些。在一些方面中，多核苷酸、载体、多肽或组合物是基本上纯的。
异构体：如本文所用，术语“异构体”是指本公开的任何化合物的任何互变异构体、立体异构体、对映异构体或非对映异构体。可认识到本公开的化合物可具有一个或多个手性中心和/或双键，并且因此呈立体异构体如双键异构体(即，几何E/Z异构体)或非对映异构体(例如，对映异构体(即，(+)或(-))或顺式/反式异构体)存在。根据本公开，本文描绘的化学结构并且因此本公开的化合物涵盖所有对应的立体异构体，即立体异构纯形式(例如，几何纯、对映异构纯或非对映异构纯)和对映异构和立体异构混合物，例如消旋体。本公开的化合物的对映异构和立体异构混合物通常可通过熟知的方法，如手性相气相色谱法、手性相高效液相色谱法、使化合物结晶为手性盐复合物或在手性溶剂中结晶化合物来拆分成其组分对映异构体或立体异构体。还可通过熟知的不对称合成方法从立体异构或对映异构纯中间体、试剂和催化剂中获得对映异构体和立体异构体。
接头：如本文所用，接头是指一组原子，例如10-1,000个原子，并且可包含原子或基团如但不限于碳、氨基、烷基氨基、氧、硫、亚砜、磺酰基、羰基和亚胺。接头可在第一端处附着至核碱基或糖部分上的修饰核苷或核苷酸，并且在第二端处附着至有效负载例如可检测剂或治疗剂。接头可具有足够的长度以便不干扰并入到核酸序列中。可出于任何有用目的使用接头，如为了形成多核苷酸多聚体(例如，通过连接两个或更多个嵌合多核苷酸分子或IVT多核苷酸)或多核苷酸缀合物以及为了施用如本文所述的有效负载。可并入到接头中的化学基团的实例包括但不限于烷基、烯基、炔基、酰氨基、氨基、醚、硫醚、酯、亚烷基、杂亚烷基、芳基或杂环基，其各自均可如本文所述任选取代的。接头的实例包括但不限于不饱和烷烃、聚乙二醇(例如，乙二醇或丙二醇单体单元，例如二乙二醇、二丙二醇、三乙二醇、三丙二醇、四乙二醇或四乙二醇)以及葡聚糖聚合物及其衍生物。其他实例包括但不限于接头内的可裂解部分，例如像二硫键(-S-S-)或偶氮键(-N＝N-)，其可使用还原剂或光分解进行裂解。选择性可裂解的键的非限制性实例包括可例如通过使用三(2-羧乙基)膦(TCEP)或其他还原剂和/或光分解裂解的酰胺键，以及可例如通过酸性或碱性水解裂解的酯键。
施用方法：如本文所用，“施用方法”可包括静脉内、肌肉内、皮内、皮下或将组合物递送至受试者的其他方法。可选择施用方法以使递送靶向(例如，特异性地递送至)身体的特定区域或系统。
修饰的：如本文所用，“修饰的”是指本公开的分子的变化的状态或结构。可以许多方式，包括化学上、结构上和功能上的方式修饰分子。在一些实施方案中，本公开的mRNA分子通过引入非天然的核苷和/或核苷酸来修饰，例如在它涉及天然核糖核苷酸A、U、G和C时。诸如帽结构的非规范核苷酸虽然它们不同于A、C、G、U核糖核苷酸的化学结构，但不被认为“修饰的”。
纳米颗粒组合物：如本文所用，“纳米颗粒组合物”是包含一种或多种脂质的组合物。纳米颗粒组合物的尺寸通常为近似微米或更小，并且可包括脂质双层。纳米颗粒组合物涵盖脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体(例如，脂质囊泡)和脂质复合物。例如，纳米颗粒组合物可以是具有直径为500nm或更小的脂质双层的脂质体。
天然存在的：如本文所用，“天然存在的”意指不需要人工辅助在自然中存在。
非人脊椎动物：如本文所使用，“非人脊椎动物”包括除了智人(Homo sapiens)以外的所有脊椎动物，包括野生种类和驯养种类。非人脊椎动物的实例包括但不限于哺乳动物，如羊驼、白臀野牛、野牛、骆驼、猫、牛、鹿、狗、驴、大额牛、山羊、豚鼠、马、美洲驼、骡、猪、兔、驯鹿、绵羊、水牛以及牦牛。
核酸序列：术语“核酸序列”、“核苷酸序列”或“多核苷酸序列”可互换使用并且是指连续的核酸序列。序列可以是单链或双链DNA或RNA，例如mRNA。
术语“核酸”在其广义上包括包含核苷酸聚合物的任何化合物和/或物质。这些聚合物经常被称为多核苷酸。本公开的示例性核酸或多核苷酸包括但不限于，核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、苏糖核酸(TNA)、乙二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA，包括具有β-D-核糖构型的LNA、具有α-L-核糖构型的α-LNA(LNA的非对映体)、具有2’-氨基官能化的2’-氨基-LNA以及具有2’-氨基官能化的2’-氨基-α-LNA)、乙烯核酸(ENA)、环己烯基核酸(CeNA)或其杂合体或组合。
短语“编码……的核苷酸序列”是指编码多肽的核酸(例如，mRNA或DNA分子)编码序列。编码序列还可包含可操作地连接至调控元件的起始信号和终止信号，所述调控元件包括能够在施用核酸的个体或哺乳动物的细胞中指导表达的启动子和聚腺苷酸化信号。编码序列还可包含编码信号肽的序列。
脱靶：如本文所用，“脱靶”是指对任何一个或多个靶标、基因或细胞转录物的任何非预期作用。
开放阅读框：如本文所使用，“开放阅读框”或“ORF”是指在给定阅读框中不含有终止密码子的序列。
可操作地连接：如本文所使用，短语“可操作地连接”是指两个或更多个分子、构建体、转录物、实体、部分等之间的功能连接。
任选取代的：在本文中形式“任选取代的X”(例如，任选取代的烷基)的短语旨在等于“X，其中X为任选取代的”(例如，“烷基，其中所述烷基为任选取代的”)。并不用以意指特征“X”(例如，烷基)本身为任选的。
部分：如本文所用，多核苷酸的“部分”或“区域”被定义为所述多核苷酸的小于多核苷酸的整个长度的任何部分。
患者：如本文所使用，“患者”是指可寻求或有治疗需要、要求治疗、正接受治疗、将接受治疗的受试者，或针对特定疾病或病状在受过训练的专业人员的护理下的受试者。
药学上可接受的：本文采用短语“药学上可接受的”来指在合理医学判断范围内、适用于与人和动物组织接触而无过量毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症、与合理的利益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
药学上可接受的赋形剂：如本文所使用的短语“药学上可接受的赋形剂”是指除了本文描述的化合物以外的任何成分(例如，能够悬浮或溶解活性化合物的媒介物)并且在患者中具有基本上无毒和非炎症性的特性。赋形剂可包括例如：抗粘剂、抗氧化剂、粘合剂、包衣、压缩助剂、崩解剂、染料(颜料)、软化剂、乳化剂、填充剂(稀释剂)、成膜剂或包衣、调味剂、香料、助流剂(流动增强剂)、润滑剂、防腐剂、印刷油墨、吸附剂、悬浮剂或分散剂、甜味剂以及水合作用的水。示例性赋形剂包括但不限于：丁羟甲苯(BHT)、碳酸钙、磷酸钙(二碱的)、硬脂酸钙、交联羧甲纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、交聚维酮、半胱氨酸、乙基纤维素、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乳糖、硬脂酸镁、麦芽糖醇、甘露醇、甲硫氨酸、甲基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、微晶纤维素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、预胶凝淀粉、对羟基苯甲酸丙酯、棕榈酸视黄酯、虫胶、二氧化硅、羧甲基纤维素钠、柠檬酸钠、淀粉羟基乙酸钠、山梨糖醇、淀粉(玉米)、硬脂酸、蔗糖、滑石、二氧化钛、维生素A、维生素E、维生素C以及木糖醇。
药学上可接受的盐：本公开还包括本文所述的化合物的药学上可接受的盐。如本文所使用，“药学上可接受的盐”是指公开的化合物的衍生物，其中母体化合物通过将现有酸或碱部分转化为其盐形式(例如，通过使自由碱基团与合适的有机酸反应)来修饰。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基的矿物盐或有机酸盐，诸如胺，酸性残基(如羧酸等)的碱盐或有机盐。代表性酸加成盐包括乙酸盐(acetate)、乙酸(acetic acid)盐、己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐(benzenesulfonate)、苯磺酸(benzene sulfonic acid)盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。代表性碱金属盐或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等以及无毒的铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲铵、四乙铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。本公开的药学上可接受的盐包括例如从无毒无机酸或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐。可通过常规化学方法从含有碱性部分或酸性部分的母体化合物合成本公开的药学上可接受的盐。通常，此类盐可通过使游离酸或游离碱形式的这些化合物与化学计量的量的适当碱或酸在水或在有机溶剂中或者在水与有机溶剂的混合物中反应来制备；通常，使用了像醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈的非水性介质。合适的盐的列表见于Remington's Pharmaceutical Sciences,第17版,Mack PublishingCompany,Easton,Pa.,1985,第1418页,Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use,P.H.Stahl和C.G.Wermuth(编著),Wiley-VCH,2008和Berge等人,Journal ofPharmaceutical Science,66,1-19(1977)，所述参考文献各自以引用的方式整体并入本文。
药学上可接受的溶剂合物：如本文所使用的术语“药学上可接受的溶剂合物”意指其中合适溶剂的分子并入晶格中的本发明的化合物。合适的溶剂在所施用的剂量下为生理上可耐受的。例如，可通过从包括有机溶剂、水或其混合物的溶液中结晶、重结晶或沉淀来制备溶剂合物。合适溶剂的实例是乙醇、水(例如，一水合物、二水合物和三水合物)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲亚砜(DMSO)、N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N’-二甲基乙酰胺(DMAC)、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮(DMEU)、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氢-2-(1H)-嘧啶酮(DMPU)、乙腈(ACN)、丙二醇、乙酸乙酯、苯甲醇、2-吡咯烷酮、苯甲酸苄酯等。当水为溶剂时，溶剂合物被称为“水合物”。
药物代谢动力学：如本文所使用，“药物代谢动力学”是指当涉及确定施用给活生物体的物质的命运时，分子或化合物的任何一种或多种特性。药物代谢动力学分成若干区域，包括吸收、分布、代谢和排泄的程度和速率。这通常称为ADME，其中：(A)吸收是物质进入血液循环的过程；(D)分布是物质在整个身体的体液和组织中的分散或散布；(M)代谢(或生物转化)是母体化合物不可逆转化成子代谢物；并且(E)排泄(或消除)是指物质从身体消除。在极少数情况下，一些药物不可逆地在身体组织中积累。
物理化学：如本文所使用，“物理化学”意指或关于物理和/或化学特性。
多核苷酸：如本文所用的术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸聚合物，包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、其类似物或其混合物。此术语是指分子的一级结构。因此，所述术语包括三链、双链和单链脱氧核糖核酸(“DNA”)，以及三链、双链和单链核糖核酸(“RNA”)。它还包括修饰(例如通过烷基化和/或通过加帽)和未修饰形式的多核苷酸。更特别地，术语“多核苷酸”包括聚脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)；聚核糖核苷酸(含有D-核糖)，包括tRNA、rRNA、hRNA、siRNA和mRNA，无论是剪接的还是未剪接的；为嘌呤或嘧啶碱基的N-或C-糖苷的任何其他类型的多核苷酸；以及含有正核苷酸主链的其他聚合物，例如聚酰胺(例如，肽核酸“PNA”)和聚吗啉代聚合物；以及其他合成的序列特异性核酸聚合物，条件是所述聚合物含有呈允许碱基配对和碱基堆积，如在DNA和RNA中发现的构型的核碱基。在特定方面，多核苷酸包含mRNA。在另一方面，mRNA是合成mRNA。在一些方面，合成mRNA包含至少一个非天然核碱基。在一些方面，某一类别的所有核碱基已经被非天然核碱基置换(例如，本文公开的多核苷酸中的所有尿苷都可被非天然核碱基，例如5-甲氧基尿苷置换)。在一些方面，多核苷酸(例如，合成RNA或合成DNA)仅包含天然核碱基，即在合成DNA的情况下A、C、T和U，或者在合成RNA的情况下A、C、T和U中。
熟练的技术人员将理解，本文公开的密码子图谱中的T碱基存在于DNA中，而T碱基将被相应RNA中的U碱基置换。例如，本文公开的呈DNA形式的密码子-核苷酸序列(例如载体或体外翻译(IVT)模板)的T碱基将在其相应的转录mRNA中转录为U碱基。在此方面，密码子优化的DNA序列(包含T)及其相应的RNA序列(包含U)两者均被认为是本公开的密码子优化的核苷酸序列。熟练的技术人员还将理解，可通过用非天然碱基置换一个或多个碱基来产生等效密码子图谱。因此，例如，TTC密码子(DNA图谱)将对应于UUC密码子(RNA图谱)，其进而将对应于ΨΨC密码子(其中U已被假尿苷置换的RNA图谱)。
标准的A-T和G-C碱基对在允许分别在胸苷的N3-H和C4-氧基与腺苷的N1和C6-NH2之间以及分别在胞苷的C2-氧基、N3和C4-NH2与鸟苷的C2-NH2、N′—H和C6-氧基之间形成氢键的条件下形成。因此，例如，可修饰鸟苷(2-氨基-6-氧基-9-β-D-呋喃核糖基-嘌呤)以形成异鸟苷(2-氧基-6-氨基-9-β-D-呋喃核糖基-嘌呤)。这种修饰产生将不再与胞嘧啶有效形成标准碱基对的核苷碱基。然而，修饰胞嘧啶(1-β-D-呋喃核糖基-2-氧基-4-氨基-嘧啶)以形成异胞嘧啶(1-β-D-呋喃核糖基-2-氨基-4-氧基-嘧啶-)产生修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸将不与鸟苷有效碱基配对、但将与异尿苷形成碱基对(Collins等人的美国专利号5,681,702)。异胞嘧啶可从Sigma Chemical Co.(St.Louis,Mo.)获得；异胞苷可通过Switzer等人(1993)Biochemistry 32:10489-10496和其中引用的参考文献描述的方法来制备；2'-脱氧-5-甲基-异胞苷可通过Tor等人(1993)J.Am.Chem.Soc.115:4461-4467和其中引用的参考文献的方法来制备；并且异鸟嘌呤核苷酸可使用Switzer等人,1993,同上,和Mantsch等人(1993)Biochem.14:5593-5601所描述的方法或通过Collins等人的美国专利号5,780,610中描述的方法来制备。其他非天然碱基对可通过Piccirilli等人(1990)Nature 343:33-37中描述的用于合成2,6-二氨基嘧啶及其补体(1-甲基吡唑并-[4,3]嘧啶-5,7-(4H,6H)-二酮的方法来合成。形成独特碱基对的其他此类修饰的核苷酸单元是已知的，如Leach等人(1992)J.Am.Chem.Soc.114:3675-3683和Switzer等人,同上中所描述的那些。
核酸序列：术语“核酸序列”、“核苷酸序列”或“多核苷酸”可互换使用并且是指连续的核酸序列。序列可以是单链或双链DNA或RNA，例如mRNA。
短语“编码……的核苷酸序列”及其变型是指包含编码如本文所述的多肽或其功能性片段的核苷酸序列的核酸(例如，mRNA或DNA分子)编码序列。编码序列还可包含可操作地连接至调控元件的起始信号和终止信号，所述调控元件包括能够在施用核酸的个体或哺乳动物的细胞中指导表达的启动子和聚腺苷酸化信号。编码序列还可包含编码信号肽的序列。
多肽：术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换用于指代任何长度的氨基酸聚合物。所述聚合物可包含修饰的氨基酸。所述术语还涵盖经天然或通过干涉修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操纵或修饰，诸如与标记组分缀合。定义中还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括，例如非天然氨基酸，诸如高半胱氨酸、鸟氨酸、对乙酰基苯丙氨酸、D-氨基酸和肌酸)以及本领域已知的其他修饰的多肽。
如本文所用，所述术语是指具有任何大小、结构或功能的蛋白质、多肽和肽。多肽包括基因产物、天然存在的多肽、合成多肽、同源物、直向同源物、横向同源物、前述的片段和其他等效物、变体和类似物。多肽可以是单个多肽或可以是多分子复合物如二聚物、三聚物或四聚物。它们还可包含单链或多链多肽。最常见地，在多链多肽中发现二硫键。术语多肽还可应用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在氨基酸的人工化学类似物。在一些实施方案中，“肽”可小于或等于50个氨基酸长，例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长。
多肽变体：如本文所用，术语“多肽变体”是指在其氨基酸序列方面与天然或参考序列不同的分子。与天然或参考序列相比，氨基酸序列变体可具有在氨基酸序列内的某些位置处的取代、缺失和/或插入。通常，变体将与天然或参考序列具有至少约50％同一性、至少约60％同一性、至少约70％同一性、至少约80％同一性、至少约90％同一性、至少约95％同一性、至少约99％同一性。在一些实施方案中，它们将与天然或参考序列至少约80％或至少约90％相同。
多肽/单位药物(PUD)：如本文所使用，PUD或产物/单位药物定义为总每日剂量的细分部分，通常如在体液或组织中所测量的1mg、pg、kg等的产物(如多肽)，通常以除以体液中的量值的浓度定义如pmol/mL、mmol/mL等。
预防：如本文所使用，术语“预防”是指部分或完全延迟感染、疾病、病症和/或病状的发作；部分或完全延迟特定感染、疾病、病症和/或病状的一个或多个症状、特征或临床表现的发作；部分或完全延迟特定感染、疾病、病症和/或病状的一个或多个症状、特征或表现的发作；部分或完全延迟特定疾病、病症和/或病状从感染的进展；和/或减少发展与感染、疾病、病症和/或病状相关的病理的风险。
前药：本公开还包括本文描述的化合物的前药。如本文所使用，“前药”是指呈在化学或物理改变时充当治疗剂的物质、分子或实体的形式的任何物质、分子或实体。前药可以一定方式共价键合或螯合并且在向哺乳动物受试者施用之前、之时或之后释放或转化为活性药物部分。可通过以在常规操纵或体内使修饰裂解为母体化合物的方式修饰存在于化合物中的官能团来制备前药。前药包括其中羟基、氨基、硫氢基或羧基结合至在向哺乳动物受试者施用时分别裂解以形成游离羟基、氨基、硫氢基或羧基的任何基团的化合物。前药的制备和用途讨论于T.Higuchi和V.Stella,“Pro-drugs as Novel Delivery Systems,”A.C.S.学术讨论会丛刊第14期和Bioreversible Carriers in Drug Design,EdwardB.Roche编著,American Pharmaceutical Association and Pergamon Press,1987中，所述参考文献均特此以引用的方式整体并入。
增殖：如本文所使用，术语“增殖”意指生长、扩增或增加或引起快速生长、扩增或增加。“增殖性的”意指具有增殖的能力。“抗增殖性的”意指具有抵消或与增殖特性相反的特性。
预防性(Prophylactic)：如本文所用,“预防性”是指用于预防疾病的传播的治疗或作用过程。
预防(Prophylaxis)：如本文所用，“预防”是指用于维持健康且预防疾病的传播的措施。“免疫预防”是指用于产生主动或被动免疫以防止疾病的传播的措施。
蛋白质裂解位点：如本文所使用，“蛋白质裂解位点”是指其中可通过化学方式、酶促方式或光化学方法完成氨基酸链的控制裂解的位点。
蛋白质裂解信号：如本文所使用，“蛋白质裂解信号”是指标志或标记用于裂解的多肽的至少一个氨基酸。
目标蛋白质：如本文所使用，术语“目标蛋白质”或“所需的蛋白质”包括本文提供的那些和其片段、突变体、变体和改变。
近端：如本文所使用，术语“近端”意指位置比较靠近中心或目标点或区。
假尿苷：如本文所使用，假尿苷是指核苷尿苷的C-糖苷异构体。“假尿苷类似物”为假尿苷的任何修饰、变体、同工型或衍生物。例如，假尿苷类似物包括但不限于1-羧甲基-假尿苷、1-丙炔基-假尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷、1-甲基假尿苷(m1ψ)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧丙基)假尿苷(acp3ψ)以及2’-O-甲基-假尿苷(ψm)。
纯化的：如本文所使用，“纯化”、“纯化的”、“纯化作用”意指使之为基本上纯的或没有不想要的组分、材料污物、混合物或瑕疵。
参考核酸序列：术语“参考核酸序列”或“参考核酸”或“参考核苷酸序列”或“参考序列”是指可进行序列优化的起始核酸序列(例如，RNA，例如mRNA序列)。在一些实施方案中，参考核酸序列是野生型核酸序列、其片段或变体。在一些实施方案中，参考核酸序列是先前序列优化的核酸序列。
重复转染：如本文所用，术语“重复转染”是指用多核苷酸转染同一细胞培养物多次。细胞培养物可转染至少2次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少7次、至少8次、至少9次、至少10次、至少11次、至少12次、至少13次、至少14次、至少15次、至少16次、至少17次、至少18次、至少19次、至少20次、至少25次、至少30次、至少35次、至少40次、至少45次、至少50次或更多次。
盐：在一些方面，本文公开的用于肿瘤内递送的药物组合物包含其一些脂质成分的盐。术语“盐”包括任何阴离子和阳离子络合物。阴离子的非限制性实例包括无机阴离子和有机阴离子，例如氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、草酸根(例如，半草酸根)、磷酸根、膦酸根、磷酸氢根、磷酸二氢根、氧化物、碳酸根、碳酸氢根、硝酸根、亚硝酸根、氮化物、亚硫酸氢根、硫化物、亚硫酸根、硫酸氢根、硫酸根、硫代硫酸根、硫酸氢根、硼酸根、甲酸根、乙酸根、苯甲酸根、柠檬酸根、酒石酸根、乳酸根、丙烯酸根、聚丙烯酸根、富马酸根、马来酸根、衣康酸根、羟乙酸根、葡糖酸根、苹果酸根、扁桃酸根、巴豆酸根、抗坏血酸根、水杨酸根、聚甲基丙烯酸根、高氯酸根、氯酸根、亚氯酸根、次氯酸根、溴酸根、次溴酸根、碘酸根、烷基磺酸根、芳基磺酸根、砷酸根、亚砷酸根、铬酸根、重铬酸根、氰化物、氰酸根、硫氰酸根、氢氧化物、过氧化物、高锰酸根及其混合物。
样品：如本文所使用，术语“样品”或“生物样品”是指其组织、细胞或组成部分的子集(例如体液，包括但不限于血液、粘液、淋巴液、滑液、脑脊髓液、唾液、羊水、羊膜脐带血、尿、阴道液和精液)。样品进一步可包括从整个生物体或其组织、细胞或组成部分的子集或其馏分或部分制备的匀浆、裂解物或萃取物，包括但不限于例如血浆、血清、脊髓液、淋巴液，皮肤、呼吸道、肠道和泌尿生殖道的外切片，眼泪、唾液、乳、血细胞、肿瘤、器官。样品进一步是指可含有细胞组分如蛋白质或核酸分子的培养基如营养肉汤或凝胶。
信号序列：如本文所用，短语“信号序列”、“信号肽”和“转运肽”可互换使用并且是指可指导蛋白质转运或定位至某种细胞器、细胞区室或细胞外输出的序列。所述术语涵盖信号序列多肽和编码信号序列的核酸序列两者。因此，在核酸的上下文中对信号序列的提及实际上是指编码信号序列多肽的核酸序列。
信号转导途径：“信号转导途径”是指多种信号转导分子之间的生物化学关系，所述信号转导分子在将信号从细胞的一部分传递至细胞的另一部分中起作用。如本文所用，短语“细胞表面受体”包括，例如，能够接收信号并跨细胞质膜传递这种信号的分子和分子复合物。
相似性：如本文所使用，术语“相似性”是指聚合物分子之间例如多核苷酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。可以与同一性百分比计算相同的方式进行聚合物分子彼此的相似性百分比的计算，除了相似性百分比计算考虑到如本领域中所理解的保守取代。
特异性递送：如本文所用，术语“特异性递送”、“特异性地递送”是指与脱靶组织(例如，哺乳动物脾脏)相比，通过纳米颗粒向目标靶组织(例如,哺乳动物肝脏)递送更多(例如，多至少1.5倍、多至少2倍、多至少3倍、多至少4倍、多至少5倍、多至少6倍、多至少7倍、多至少8倍、多至少9倍、多至少10倍)的多核苷酸。向特定组织递送纳米颗粒的水平可通过比较组织中产生的蛋白质的量与所述组织的重量、比较组织中的多核苷酸的量与所述组织的重量、比较组织中产生的蛋白质的量与所述组织中的总蛋白质的量或者比较组织中多核苷酸的量与所述组织中的总多核苷酸的量来进行测量。例如，对于肾血管靶向，如果在全身施用多核苷酸后与递送至肝脏或脾脏的多核苷酸相比，每1g组织多1.5倍、2倍、3倍、5倍、10倍、15倍或20倍的多核苷酸被递送至肾脏，则与肝脏和脾脏相比，多核苷酸被特异性地提供至哺乳动物肾脏。应理解，纳米颗粒向靶组织特异性递送地能力不需要在所治疗的受试者中确定，它可在诸如动物模型(例如，大鼠模型)的替代物中确定。
稳定的：如本文所使用“稳定的”是指足够稳固以经受从反应混合物中分离成有用的纯度并且在一些情况下能够配制成有效治疗剂的化合物。
稳定：如本文所使用，术语“使……稳定”、“稳定了的”、“稳定区”意指使之稳定或变为稳定的。
立体异构体：如本文所使用，术语“立体异构体”是指化合物可拥有的所有可能的不同异构体形式以及构象形式(例如，本文描述的任何式的化合物)，具体为基本分子结构的所有可能的立体化学和构象异构体形式、所有非对映异构体、对映异构体和/或构象异构体。本公开的一些化合物可以不同互变异构形式存在，所有互变异构形式都包括在本发明的范围内。
受试者：“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指需要诊断、预后或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括但不限于人、家养动物、农场动物、动物园动物、运动动物、宠物动物如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛；灵长类动物，如猿、猴、猩猩和黑猩猩；犬科动物，如狗和狼；猫科动物，如猫、狮子和老虎；马科动物，如马、驴和斑马；熊；食用动物，如牛、猪和绵羊；有蹄类动物，如鹿和长颈鹿；啮齿动物，如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；等。在某些实施方案中，哺乳动物是人受试者。在其他实施方案中，受试者是人患者。在特定实施方案中，受试者是需要癌症治疗的人患者。
基本上：如本文所用，术语“基本上”是指展现总体或接近总体范围或程度的目标特征或特性的定性情况。生物领域的普通技术人员将了解生物和化学现象很少(如果曾发生)达到完全和/或进行至完全或达成或避免绝对结果。因此，本文使用术语“基本上”来获得在许多生物现象和化学现象中固有的潜在完全性缺乏。
基本上相等：如本文所使用，在它涉及剂量之间的时间差时，术语意指正/负2％。
基本上同时：如本文所使用并且在它涉及多个剂量时，术语意指在2秒内。
患有：“患有”疾病、病症和/或病状的个体已被诊断具有或展现所述疾病、病症和/或病状的一种或多种症状。
易患：“易感”疾病、病症和/或病状的个体尚未诊断具有和/或可不展现疾病、病症和/或病状的症状但怀疑有发展疾病或其症状的倾向。在一些实施方案中，易感疾病、病症和/或病状(例如，癌症)的个体可具有以下的一个或多个特征：(1)与发展疾病、病症和/或病状相关的基因突变；(2)与发展疾病、病症和/或病状相关的遗传多态性；(3)与疾病、病症和/或病状相关的蛋白质和/或核酸的表达和/或活性增加和/或减少；(4)与发展疾病、病症和/或病状相关的习惯和/或生活方式；(5)疾病、病症和/或病状的家族史；以及(6)暴露于和/或感染与发展疾病、病症和/或病状相关的微生物。在一些实施方案中，易患疾病、病症和/或病状的个体将发展所述疾病、病症和/或病状。在一些实施方案中，易患疾病、病症和/或病状的个体将不发展所述疾病、病症和/或病状。
持续释放：如本文所使用，术语“持续释放”是指在特定时间段内遵循释放速率的药物组合物或化合物释放概况。
合成的：术语“合成的”意指通过人为产生、制备和/或制造的。本公开的多核苷酸或其他分子的合成可以是化学或酶促的。
靶向细胞：如本文所使用，“靶向细胞”是指任何一种或多种目标细胞。细胞可存在于体外、体内、原位或在生物体的组织或器官中。生物体可为动物，优选地哺乳动物，更优选地人并且最优选地患者。
靶组织：如本文所用，“靶组织”是指其中多核苷酸的递送将产生所需的生物学和/或药理学作用的任何一种或多种目标组织类型。目标靶组织的实例包括特定组织、器官和系统或其组。在特定应用中，靶组织可以是肾脏、肺、脾脏、血管中的血管内皮(例如，冠状动脉内或股内)或肿瘤组织(例如，通过肿瘤内注射)。“脱靶组织”是指其中编码的蛋白质的表达不会产生所需的生物学和/或药理学作用的任何一种或多种组织类型。在特定应用中，脱靶组织可包括肝脏和脾脏。
靶向序列：如本文所使用，短语“靶向序列”是指可指导蛋白质或多肽的转运或定位的序列。
末端：如本文所用，术语“末端(termini)”或“末端(terminus)”当提及多肽时是指肽或多肽的末尾。这种末尾不仅仅限于肽或多肽的第一或最后位点，而且可包括末端区中的另外氨基酸。本公开的基于多肽的分子可被表征为具有N末端(由具有自由氨基(NH2)的氨基酸封端)和C末端(由具有自由羧基(COOH)的氨基酸封端)两者。本公开的蛋白质在一些情况下由通过二硫键或通过非共价力(多聚体、低聚物)集合在一起的多个多肽链组成。这些种类的蛋白质将具有多个N末端和C末端。或者，多肽的末端可进行修饰以使得它们根据情况以基于非多肽的部分(如有机缀合物)开始或结束。
治疗剂：术语“治疗剂”是指当向受试者施用时具有治疗、诊断和/或预防作用和/或引出希望的生物和/或药理学作用的剂。例如，在一些实施方案中，编码IL-36-γ多肽的mRNA可以是治疗剂。
治疗有效量：如本文所使用，术语“治疗有效量”意指在向遭受或易感感染、疾病、病症和/或病状的受试者施用时足以实现感染、疾病、病症和/或病状的治疗、症状改善、诊断、预防和/或发作延迟的待递送剂(例如，核酸、药物、治疗剂、诊断剂、预防剂等)的量。
治疗有效结果：如本文所使用，术语“治疗有效结果”意指在遭受或易感感染、疾病、病症和/或病状的受试者中足以实现感染、疾病、病症和/或病状的治疗、症状改善、诊断、预防和/或发作延迟的结果。
总每日剂量：如本文所使用，“总每日剂量”为24小时时期内给予或规定的量。总每日剂量可以单个单位剂量或分次剂量施用。
转录因子：如本文所使用，术语“转录因子”是指例如通过激活或抑制转录来调节DNA向RNA的转录的DNA结合蛋白。一些转录因子单独实现转录的调节，而其他转录因子与其他蛋白质协力作用。一些转录因子在某些条件下可激活和抑制转录。通常，转录因子结合特定靶序列或与靶基因的调节区中的特定共有序列高度相似的序列。转录因子可单独或与其他分子复合来调节靶基因的转录。
转录：如本文所用，术语“转录”是指将外源核酸引入细胞的方法。转染方法包括但不限于化学方法、物理处理和阳离子脂质或混合物。
转染：如本文所用，“转染”是指将多核苷酸引入细胞中，在所述细胞中表达由所述多核苷酸编码的多肽(例如，mRNA)或所述多肽调节细胞功能(例如，siRNA、miRNA)。如本文所用，核酸序列的“表达”是指多核苷酸(例如，mRNA)翻译成多肽或蛋白质和/或多肽或蛋白质的翻译后修饰。
治疗(Treating)、治疗(treatment)、治疗(therapy)：如本文所用，术语治疗(treating)、治疗(treatment)或治疗(therapy)是指部分或完全减轻、改善、改进、缓解过度增生性疾病(例如癌症)的一种或多种症状或特征，延迟其发作、抑制其进展、降低其严重程度和/或降低其发生率。例如，“治疗”癌症可指抑制肿瘤的存活、生长和/或扩散。可出于减少发展与疾病、病症和/或病状相关的病理的风险的目的，向没有展现疾病、病症和/或病状的征兆的受试者和/或仅展现疾病、病症和/或病状的早期征兆的受试者施用治疗。
肿瘤微环境：如本文所用，“肿瘤微环境”是指肿瘤内关于浸润性免疫细胞和/或炎性细胞的存在或不存在的细胞组成以及肿瘤内此类细胞的一种或多种类型。在一个方面，肿瘤微环境是“发炎的肿瘤微环境”，其是指存在浸润到肿瘤中的免疫和/或炎性细胞，其中主要的细胞类型是粒细胞。在另一方面，肿瘤微环境是“免疫抑制性肿瘤微环境”，其是指存在浸润到肿瘤中的免疫和/或炎性细胞，其中主要的细胞类型是单核细胞和巨噬细胞。在另一方面，肿瘤微环境是“免疫学上的贫瘠肿瘤微环境”，其是指不存在免疫和/或炎性细胞显著浸润到肿瘤中。
未修饰的：如本文所用，“未修饰的”是指在以任何方式变化之前的任何物质、化合物或分子。未修饰的可但并非总是指野生型或天然形式的生物分子。分子可经历一系列修饰，从而每个修饰分子均可充当后续修饰的“未修饰的”起始分子。
尿嘧啶：尿嘧啶是RNA的核酸中的四个核碱基之一，并且它由字母U表示。尿嘧啶可经由β-N1-糖苷键与核糖环，或更具体地呋喃核糖连接以产生核苷尿苷。核苷尿苷也通常根据其核碱基的单字母代码缩写，即U。因此，在本公开的上下文中，当多核苷酸序列中的单体是U时，这种U可互换地指定为“尿嘧啶”或“尿苷”。
尿苷含量：术语“尿苷含量”或“尿嘧啶含量”是可互换的并且是指某种核酸序列中存在的尿嘧啶或尿苷的量。尿苷含量或尿嘧啶含量可表示为绝对值(序列中尿苷或尿嘧啶的总数)或相对值(相对于核酸序列中核碱基得总数的尿苷或尿嘧啶百分比)。
尿苷修饰的序列：术语“尿苷修饰的序列”是指相对于候选核酸序列的尿苷含量和/或尿苷模式具有不同的总体或局部尿苷含量(更高或更低的尿苷含量)或具有不同的尿苷模式(例如，梯度分布或簇集)的序列优化的核酸(例如，合成mRNA序列)。在本公开的上下文中，术语“尿苷修饰的序列”和“尿嘧啶修饰的序列”被认为是等效的和可互换的。
“高尿苷密码子”被定义为包含两个或三个尿苷的密码子，“低尿苷密码子”被定义为包含一个尿苷的密码子，并且“无尿苷密码子”是不含任何尿苷的密码子。在一些实施方案中，尿苷修饰的序列包含用低尿苷密码子取代高尿苷密码子、用无尿苷密码子取代高尿苷密码子、用高尿苷密码子取代低尿苷密码子、用无尿苷密码子取代低尿苷密码子、用低尿苷密码子取代无尿苷密码子、用高尿苷密码子取代无尿苷密码子以及其组合。在一些实施方案中，高尿苷密码子可用另一个高尿苷密码子置换。在一些实施方案中，低尿苷密码子可用另一个低尿苷密码子置换。在一些实施方案中，无尿苷密码子可用另一个无尿苷密码子置换。尿苷修饰的序列可以是尿苷富集的或尿苷稀疏的。
尿苷富集的：如本文所用，术语“尿苷富集的”和语法变体是指相对于相应候选核酸序列的尿苷含量，序列优化的核酸(例如，合成mRNA序列)中尿苷含量增加(以绝对值或以百分比值表示)。尿苷富集可通过用含有较少尿苷核碱基的同义密码子取代候选核酸序列中的密码子来实现。尿苷富集可以是全局的(即，相对于候选核酸序列的整个长度)或局部的(即，相对于候选核酸序列的子序列或区域)。
尿苷稀疏的：如本文所用，术语“尿苷稀疏的”和语法变体是指相对于相应候选核酸序列的尿苷含量，序列优化的核酸(例如，合成mRNA序列)中尿苷含量减少(以绝对值或以百分比值表示)。尿苷稀疏可通过用含有较少尿苷核碱基的同义密码子取代候选核酸序列中的密码子来实现。尿苷稀疏可以是全局的(即，相对于候选核酸序列的整个长度)或局部的(即，相对于候选核酸序列的子序列或区域)。
变体：如在本公开中使用的术语变体是指天然变体(例如，多态性、同种型等)；和人工变体，其中天然或起始序列(例如，野生型序列)中的至少一个氨基酸残基已被除去并且在同一位置处在其位置中插入不同的氨基酸。这些变体可被描述为“取代变体”。取代可以是单一的，其中分子中的仅一个氨基酸已被取代；或取代可以是多重的，其中同一分子中的两个或更多个氨基酸已被取代。如果插入或缺失氨基酸，则所得变体将分别是“插入变体”或“缺失变体”。
II.包含编码免疫调节多肽的多核苷酸的组合
本公开提供了用于治疗癌症的组合物(“本公开的组合物”)。在一个实施方案中，所述组合物在单一制剂中包含至少两种多核苷酸(例如，mRNA)或至少三种多核苷酸(例如，mRNA)，所述组合物中的每种选自编码IL-23的第一多核苷酸、编码IL-36-γ(或可替代地，IL-18)的第二多核苷酸和/或编码OX40L的第三多核苷酸。因此，本公开提供了例如，(i)编码包含IL-23多肽的第一蛋白质的第一多核苷酸(例如，mRNA)，(ii)编码包含IL-36-γ多肽(或IL-18多肽)的第二蛋白质的第二多核苷酸(例如，mRNA)，以及(iii)编码包含OX40L多肽的第三蛋白质的第三多核苷酸(例如mRNA)，其中所述第一多核苷酸、第二多核苷酸和第三多核苷酸以各种组合使用。在一个方面，所述组合物包含所述第一多核苷酸、第二多核苷酸和第三多核苷酸。术语“本公开的多核苷酸”是指本文公开的第一多核苷酸、第二多核苷酸和第三多核苷酸。
如本文所用，术语“本公开的组合”包括例如以下组合：(i)编码包含IL-23多肽的第一蛋白质的第一多核苷酸(例如，mRNA)，和编码包含IL-36-γ多肽或IL-18多肽的第二蛋白质的第二多核苷酸；(ii)编码包含IL-23多肽的第一蛋白质的第一多核苷酸(例如，mRNA)，和编码包含OX40L多肽的第三蛋白质的第三多核苷酸(例如，mRNA)；(iii)编码包含IL-36-γ多肽或IL-18多肽的第二蛋白质的第二多核苷酸(例如，mRNA)，和编码包含OX40L多肽的第三蛋白质的第三多核苷酸(例如，mRNA)；或(iv)编码包含IL-23多肽的第一蛋白质的第一多核苷酸(例如，mRNA)、编码包含IL-36-γ多肽或IL-18多肽的第二蛋白质的第二多核苷酸(例如，mRNA)以及编码包含OX40L多肽的第三蛋白质的第三多核苷酸(例如，mRNA)。应理解，术语“本公开的组合”不限于第一多核苷酸、第二多核苷酸和/或第三多核苷酸的物理组合，而且涵盖同时或依次单独施用这些多核苷酸。
因此，在另一个实施方案中，本公开的组合物包含编码单一多肽IL-23、IL-36-γ或IL-18、或OX40L的多核苷酸(例如，mRNA)，但是所述组合物中的每种(例如，包含编码IL-23的第一多核苷酸的组合物、包含编码IL-36-γ或IL-18的第二多核苷酸的组合物和编码OX40L的第三多核苷酸)可在本文所述的方法中组合使用。
本领域技术人员还将了解，本公开的替代实施方案包括IL-23、IL-36-γ或IL-18和/或OX40作为多核苷酸和/或蛋白质的组合疗法。例如，本公开涵盖以下组合疗法：(i)编码IL-23的第一多核苷酸(例如，mRNA)和包含IL-36-γ或IL-18的第二蛋白质；包含IL-23的第一蛋白质和编码包含IL-36γIL-18的第二蛋白质的第二多核苷酸(例如，mRNA)；或(iii)包含IL-23的第一蛋白质和包含IL-36γ或IL-18的第二蛋白质。同样地，本公开还涵盖以下的组合疗法：IL-23多核苷酸(例如，mRNA)或包含IL-23多肽的第一蛋白质，IL-36-γ多核苷酸或IL-18多核苷酸(例如，mRNA)或包含IL-36-γ多肽或IL-18多肽的第二蛋白质，OX40L多核苷酸(例如，mRNA)或包含OX40L多肽的第三蛋白质，或其组合。
编码IL-23的多核苷酸
IL-23是在先天性和适应性免疫中起重要作用的促炎性细胞因子。Croxford等人(2012)Eur.J.Immunol.42:2263-2273。IL-23主要作为由二硫键连接的p19和p40亚基组成的60kDa异二聚体蛋白起作用。IL-23在结构和功能上与促炎性细胞因子IL-12相似。IL-23含有与IL-12相同的p40亚基，但包含p19亚基而不是IL-12的p35。Oppman等人(2000)Immunity 13:715-725。p19亚基的前体形式(NCBI参考序列：NP_057668；NM_016584；Uniprot：Q9NPF7；也称为IL-23A和IL-23亚基α)的长度是189个氨基酸，而其成熟形式是170个氨基酸长。p40亚基的前体形式(NCBI参考序列：NM_002187；Uniprot：P29460；也称为IL-12B，自然杀伤细胞刺激因子2和细胞毒性淋巴细胞成熟因子2)的长度是328个氨基酸，而其成熟形式是306个氨基酸长。
许多不同的免疫细胞(包括树突状细胞和巨噬细胞)在抗原刺激后产生IL-23。IL-12与IL-23之间的一个区别是IL-12与Th1T细胞群体的发育和活性相关，而IL-23与Th17T细胞群体的发育和活性相关。参见Vignali等人(2014)Nat.Immunol.13:722-728。
尽管一些早期研究暗示IL-23用于抗肿瘤治疗(Belladonna等人(2002)J.Immunol.168:5448-5454)，但是最近的研究表明IL-23的潜在促肿瘤发生功能。参见例如，Croxford等人(2012)Eur.J.Immunol.42:2263-2273.Langowski等人(2007)TrendsImmunol.28:207-212；Langowski等人(2006)Nature 442:461-465；Teng等人(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 107:8328-8333；Teng等人(2012)Cancer Res.72:3987-3996.Langowski(2006)观察到人肿瘤中IL-23的增加。还参见Ngiow等人(2013)TrendsImmunol.34:548-555；Wilke等人(2011)Carcinogenesis 32:643-649；Xu等人(2010)Clin.Dev.Immunol.2010。例如，Wang等人(2015)Clin.Exp.Rheumatol.33(增刊92):S87-S90教导了IL-23的表达升高在癌症中具有致病功能。IL-23在肿瘤发展和进展中具有因果作用，并且与不良预后结果和快速进展至转移性疾病相关，从而表明抑制IL-23表达可适用于治疗和预防癌症，特别是结肠直肠癌。Teng等人(2015)Nature Medicine 21:719-29教导IL-23间接或直接促进肿瘤发生、生长和转移，并且表明抑制IL-23表达可用于治疗和预防癌症。
如在本公开中使用，术语“IL-23多肽”是指例如IL-23的IL-12p40亚基、IL-23的IL-23p19亚基，或包含IL-12p40亚基多肽和IL-23p19亚基多肽的融合蛋白。在一些方面，所述融合蛋白从N-末端至C-末端包含：
(a)IL-12p40亚基，所述亚基包含IL-12p40信号肽、肽接头和成熟IL-23p19亚基，或
(b)IL-23p19亚基，所述亚基包含IL-23p19信号肽、肽接头和成熟IL-12p40。
在一个特定方面，所述IL-23多肽包含表1的人或鼠IL-23多肽(例如，前体或成熟IL-12p40或IL-23p19)或其组合，由其组成或基本上由其组成。在一个特定方面，编码IL-23多肽的多核苷酸包含表1的IL-23编码多核苷酸，由其组成或基本上由其组成。
在一些实施方案中，所述IL-23多肽包含与表1中列出的IL-23氨基酸序列或由表1中列出的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述IL-23多肽具有相应野生型IL-23多肽的至少10％的活性(例如，与其受体结合)。在特定实施方案中，所述IL-23多肽包含与SEQ ID NO:1、SEQID NO:5或SEQ ID NO:140至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且具有相应野生型IL-23多肽的至少10％的活性(例如，与其受体结合)。在另一个特定实施方案中，所述IL-23多肽基本上由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:140组成，并且具有相应野生型IL-23多肽的至少10％的活性(例如，与其受体结合)。
在其他实施方案中，由本公开的多核苷酸编码的IL-23多肽包含具有一个或多个保守取代的表1中列出的或SEQ ID NO:1、5或140中所示的氨基酸序列，其中所述保守取代不会显著影响IL-23多肽与其受体的结合活性，即所述IL-23多肽在所述取代后与IL-23受体结合。
在一些实施方案中，编码IL-23多肽的核苷酸序列(即，mRNA)包含与表1中列出的编码IL-23多肽的核酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的序列。在特定实施方案中，编码IL-23多肽的核苷酸序列(即，mRNA)包含与SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:141或SEQ ID NO:142至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的序列。在另一个特定实施方案中，编码IL-23多肽的核苷酸序列(即，mRNA)基本上由SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:141或SEQ ID NO:142组成。应理解，编码IL-23多肽开放阅读框(ORF)的核苷酸序列(即mRNA，例如SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:71或SEQ ID NO:141)可以是例如还包含5'末端帽、5'UTR(例如，SEQ ID NO:27或44)、3'UTR(例如，SEQ ID NO:119或120)和/或聚A尾的较大构建体内的一个元件。
编码IL-12多肽的多核苷酸
在一些方面，第一多核苷酸编码包含IL-12多肽的第一蛋白质。如在本公开中使用，术语“IL-12多肽”是指例如，IL-12的IL-12p40亚基(即，IL12B)、IL-12的IL-12p35亚基(即，IL12Aa)，或包含IL-12p40亚基多肽和IL-12p35亚基多肽的融合蛋白。在一些方面，所述融合蛋白包含选自以下的IL12B多肽：
(i)全长IL12B多肽(例如，具有与野生型IL12B相同或基本相同的长度)；
(ii)全长IL12B多肽的功能性片段(例如，比IL12B野生型更短的截短的(例如，缺失羧基、氨基末端或内部区域)序列；但仍保留IL12B酶活性)；
(iii)其变体(例如，其中一个或多个氨基酸已被置换的全长或截短的IL12B蛋白，例如，相对于野生型IL12B多肽保留多肽的全部或大部分IL12B活性的变体(例如像，V33I、V298F或本领域中已知的任何其他天然或人工变体)；或
(iv)融合蛋白，所述融合蛋白包含(i)全长IL12B野生型、其功能性片段或变体和(ii)异源蛋白；
和/或
选自以下的IL12A多肽：
(i)全长IL12A多肽(例如，具有与野生型IL12A相同或基本相同的长度)；
(ii)全长IL12A多肽的功能性片段(例如，比IL12A野生型更短的截短的(例如，缺失羧基、氨基末端或内部区域)序列；但仍保留IL12A酶活性)；
(iii)其变体(例如，其中一个或多个氨基酸已被置换的全长或截短的IL12A蛋白，例如，相对于wtIL12A多肽保留多肽的全部或大部分IL12A活性的变体(如本领域中已知的天然或人工变体)；或
(iv)融合蛋白，所述融合蛋白包含(i)全长IL12A野生型、其功能性片段或变体和(ii)异源蛋白。
在一个特定方面，所述IL-12多肽包含表1的人或鼠IL-12多肽(例如，前体或成熟IL-12p40或IL-12p35)或其组合，由其组成或基本上由其组成。在一个特定方面，编码IL-12多肽的多核苷酸包含表1的IL-23编码多核苷酸，由其组成或基本上由其组成。
在一些实施方案中，所述IL-12多肽包含与表1中列出的IL-12氨基酸序列或由表1中列出的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述IL-12多肽具有相应野生型IL-12多肽的至少10％的活性(例如，与其受体结合)。
在其他实施方案中，由本公开的多核苷酸编码的IL-12多肽包含具有一个或多个保守取代的表1中列出的氨基酸序列，其中所述保守取代不会显著影响IL-12多肽与其受体的结合活性，即所述IL-12多肽在所述取代后与IL-12受体结合。
在一些实施方案中，编码IL-12多肽的核苷酸序列(即，mRNA)包含与表1中列出的编码IL-12多肽的核酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的序列。在特定实施方案中，编码IL-12多肽的核苷酸序列(即，mRNA)包含与SEQ ID NO:183至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的序列。应理解，编码IL-12多肽开放阅读框(ORF)的核苷酸序列(即，mRNA)可以是例如还包含5'末端帽、5'UTR(例如，SEQ ID NO:27或44)、3'UTR(例如，SEQ ID NO:119或120)和/或聚A尾的较大构建体内的一个元件。
编码IL-36-γ多肽的多核苷酸
在一些方面，编码包含IL-23多肽的第一蛋白质的第一多核苷酸可与编码包含IL-36多肽的第二蛋白质的多核苷酸组合。
IL-36-γ是白细胞介素-1细胞因子家族的成员。与白细胞介素-1细胞因子家族的其他成员一样，IL-36-γ需要N-末端裂解以获得完全生物活性。IL-36-γ不具有信号序列，并且因此不通过内质网高尔基体途径分泌。参见Gresnigt和van de Veerdonk(2013)Seminars in Immunology 25:458-465)。尚不清楚IL-36-γ如何从细胞释放以作用于例如免疫细胞、其他上皮细胞和成纤维细胞(Gabay等人(2015)Journal of Leukocyte Biology97:645-652)。在本发明的示例性方面，编码IL-36(例如IL-36-γ)的多核苷酸包含编码异源信号肽的序列。不受理论束缚，据信编码这种“工程改造的”信号肽-白细胞介素嵌合蛋白的多核苷酸在体内表达时，在不存在炎性体活化的情况下提供活性蛋白质的产生。
在一个实施方案中，所述异源信号肽源自免疫球蛋白重链或轻链。在一个示例性实施方案中，所述异源信号肽源自免疫球蛋白轻链，例如源自所述轻链的可变区。在示例性实施方案中，所述异源信号肽源自人免疫球蛋白κ轻链可变区hIGVK4。在示例性方面，本发明的多核苷酸编码异源信号肽，其可操作地连接至编码IL-36-γ多肽的序列。
在一个特定方面，所述IL-36-γ多肽包含表1的IL-36-γ多肽，由其组成或基本上由其组成。在一个特定方面，编码IL-36-γ多肽的多核苷酸包含表1的IL-36-γ编码多核苷酸，由其组成或基本上由其组成。
在一些实施方案中，所述IL-36-γ多肽包含与表1中列出的IL-36-γ氨基酸序列或由表1中列出的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述IL-36-γ多肽具有相应野生型IL-36-γ多肽的至少10％的活性(例如，与其受体结合)。在特定实施方案中，所述IL-36-γ多肽包含与SEQ ID NO:16至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且具有相应野生型IL-36-γ多肽的至少10％的活性(例如，与其受体结合)。在另一个特定实施方案中，所述IL-36-γ多肽基本上由SEQ ID NO:16组成，并且具有相应野生型IL-36-γ多肽的至少10％的活性(例如，与其受体结合)。
在其他实施方案中，由本公开的多核苷酸编码的IL-36-γ多肽包含具有一个或多个保守取代的表1中列出的或SEQ ID NO:16中所示的氨基酸序列，其中所述保守取代不会显著影响IL-36-γ多肽与其受体的结合活性，即所述IL-36-γ多肽在所述取代后与IL-36-γ受体结合。
在一些实施方案中，编码IL-36-γ多肽的核苷酸序列(即，mRNA)包含与表1中列出的编码IL-36-γ多肽的核酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的序列。在特定实施方案中，编码IL-36-γ多肽的核苷酸序列(即，mRNA)包含与SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:143或SEQID NO:144至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的序列。在另一个特定实施方案中，编码IL-36-γ多肽的核苷酸序列(即，mRNA)基本上由SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:143或SEQ ID NO:144组成。应理解，编码IL-23多肽开放阅读框(ORF)的核苷酸序列(即mRNA，例如SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:94或SEQ ID NO:143)可以是例如还包含5'末端帽、5'UTR(例如，SEQ ID NO:27或44)、3'UTR(例如，SEQ ID NO:119或120)和/或聚A尾的较大构建体内的一个元件。
编码IL-18多肽的多核苷酸
在一些方面，编码包含IL-23多肽的第一蛋白质的第一多核苷酸可与编码第二蛋白质的第二多核苷酸组合，其中所述第二蛋白质包含IL-18多肽。
IL-18(也称为干扰素-γ诱导因子(IGIF)和IFN-γ诱导因子)是白细胞介素-1细胞因子家族的成员。IL-18具有两种已知的同种型，同种型1和同种型2。同种型2与同种型1的不同之处在于它缺失残基27-30。与白细胞介素-1细胞因子家族的其他成员一样，IL-18需要N-末端裂解以获得完全生物活性(Dinarello等人(2013)Frontiers in Immunology4:289)。IL-18不具有信号序列，并且因此不通过内质网高尔基体途径分泌。参见Gresnigt和van de Veerdonk(2013)Seminars in Immunology 25:458-465)。
IL-18是通过IL-18α和IL-18β共受体发出信号以诱导活化NFκB和MAPK的信号级联的促炎性激动剂(Dinarello等人(2013)。与在IL-23的情况下一样，关于IL-18用于抗癌治疗的潜在用途存在相互矛盾的报道。Ma等人(2016)Clin.Cancer Res.22:2969-2680教导与IL-18共同治疗增强了通过抗PD-L1和/或抗CTLA-4引发的抗肿瘤活性。然而，Fabbi等人(2015)J.Leukoc.Biol.97:665-675教导IL-18可能在癌症中发挥不同的作用，在一些情况下具有抗癌活性，并且在其他情况下具有肿瘤促进活性。Fabbi表明，虽然临床前研究和一些临床试验表明IL-18具有抗肿瘤活性，但其他研究表明IL-18可不同肿瘤模型中发挥促侵袭、促血管生成和免疫-调控活性。例如，Term等人(2011)Cancer Res.71:5393-9教导IL-18是癌症中的免疫抑制性细胞因子，并且由肿瘤细胞产生的IL-18以PD-1依赖性方式促进NK控制的转移的发展。Kang等人(2009)Carcinogenesis 30:1987-86教导IL-18增加胃癌的转移和免疫逃逸。
在本发明的示例性方面，编码IL-18的多核苷酸包含编码异源信号肽的序列。不受理论束缚，据信编码这种“工程改造的”信号肽-白细胞介素嵌合蛋白的多核苷酸在体内表达时，在不存在炎性体活化的情况下提供活性蛋白质的产生。
在一个实施方案中，所述异源信号肽源自免疫球蛋白重链或轻链。在一个示例性实施方案中，所述异源信号肽源自免疫球蛋白轻链，例如源自所述轻链的可变区。
在示例性实施方案中，所述异源信号肽源自人免疫球蛋白κ轻链可变区hIGVK4。在示例性方面，本发明的多核苷酸编码异源信号肽，其可操作地连接至编码IL-18多肽的序列。
在一个特定方面，所述IL-18多肽包含表1的IL-18多肽，由其组成或基本上由其组成。在一个特定方面，编码IL-18多肽的多核苷酸包含表1的IL-18编码多核苷酸，由其组成或基本上由其组成。
在一些实施方案中，所述IL-18多肽包含与表1中列出的IL-18氨基酸序列或由表1中列出的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述IL-18多肽具有相应野生型IL-18多肽的至少10％的活性(例如，与其受体结合)。在特定实施方案中，编码IL-18多肽的核苷酸序列(即，mRNA)包含与SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:155、SEQ IDNO:156、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:161或SEQ ID NO:162至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的序列。在另一个特定实施方案中，编码IL18多肽的核苷酸序列(即，mRNA)基本上由SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQ IDNO:157、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:161或SEQ ID NO:162组成。应理解，编码IL-18多肽开放阅读框(ORF)的核苷酸序列(即mRNA，例如SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:159、SEQID NO:160、SEQ ID NO:161或SEQ ID NO:162)可以是例如还包含5'末端帽、5'UTR(例如，SEQ ID NO:27或44)、3'UTR(例如，SEQ ID NO:119或120)和/或聚A尾的较大构建体内的一个元件。
编码OX40L多肽的多核苷酸
在一些方面，编码包含IL-23多肽的第一蛋白质的第一多核苷酸可与编码第三蛋白质的第三多核苷酸组合，其中所述第三蛋白质包含OX40L多肽。在其他方面，编码包含IL-36-γ多肽或IL-18多肽的第二蛋白质的第二多核苷酸可与编码第三蛋白质的第三多核苷酸组合，其中所述第三蛋白质包含OX40L多肽。在某些方面，编码包含IL-23多肽的第一蛋白质的第一多核苷酸和编码包含IL-36-γ多肽或IL-18多肽的第二蛋白质的第二多核苷酸可与编码第三蛋白质的第三多核苷酸组合，其中所述第三蛋白质包含OX40L多肽。
人OX40L首先由Tanaka等人(Tanaka等人,International Journal of Cancer(1985),36(5):549-55)在感染人T细胞白血病病毒I型(HTLV-1)的人淋巴细胞的表面上鉴别。OX40L是OX40(CD134)的配体。OX40L也被命名为CD252(分化簇252)，肿瘤坏死因子(配体)超家族，成员4，tax转录活化糖蛋白1(TXGP1)或gp34。人OX40L的长度是183个氨基酸并且含有三个结构域：氨基酸1-23的细胞质结构域；氨基酸24-50的跨膜结构域和氨基酸51-183的细胞外结构域。
在一些实施方案中，所述第三多核苷酸包含编码哺乳动物OX40L多肽的mRNA。在一些实施方案中，哺乳动物OX40L多肽是鼠OX40L多肽。在一些实施方案中，哺乳动物OX40L多肽是人OX40L多肽。在一些实施方案中，所述OX40L多肽包含表1A中列出的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的每种多核苷酸包含mRNA，即编码IL-23多肽的mRNA、编码IL-36-γ多肽的mRNA和编码OX40L多肽的mRNA。在一些实施方案中，所述编码IL-23多肽的mRNA编码哺乳动物IL-23多肽。在一些实施方案中，所述编码IL-36-γ多肽的mRNA编码哺乳动物IL-36-γ多肽。在一些实施方案中，所述编码OX40L多肽的mRNA编码哺乳动物OX40L多肽。在一些实施方案中，所述编码IL-23多肽的mRNA编码鼠IL-23多肽。在一些实施方案中，所述编码IL-36-γ多肽的mRNA编码鼠IL-36-γ多肽。在一些实施方案中，所述编码OX40L多肽的mRNA编码鼠OX40L多肽。在一些实施方案中，所述编码IL-23多肽的mRNA编码人IL-23多肽。在一些实施方案中，所述编码IL-36-γ多肽的mRNA编码人IL-36-γ多肽。在一些实施方案中，所述编码OX40L多肽的mRNA编码人OX40L多肽。
在一些实施方案中，所述IL-23多肽包含表1中列出的人氨基酸序列。在一些实施方案中，所述IL-36-γ多肽包含表1中列出的人氨基酸序列。在其他实施方案中，所述OX40L多肽包含表1A中列出的人氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述OX40L多肽包含与表1A中列出的氨基酸序列或由表1A中列出的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列能够结合至OX40受体。在特定实施方案中，所述OX40L多肽包含与SEQ ID NO:21至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且能够结合至OX40受体。在另一个特定实施方案中，所述OX40L多肽基本上由SEQ ID NO:21组成并且能够结合至OX40受体。
在某些实施方案中，由本公开的多核苷酸编码的OX40L多肽包含具有一个或多个保守取代的表1A中列出的或SEQ ID NO:21中所示的氨基酸序列，其中所述保守取代不会显著影响OX40L多肽与其受体的结合活性，即所述OX40L多肽在所述取代后与OX40受体结合。
在其他实施方案中，编码OX40L多肽的核苷酸序列(即，mRNA)包含与表1A中列出的核酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的序列。在特定实施方案中，编码OX40L多肽的核苷酸序列(即，mRNA)包含与SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:145或SEQ ID NO:146至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的序列。在另一个特定实施方案中，编码OX40L多肽的核苷酸序列(即，mRNA)基本上由SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:145或SEQ ID NO:146组成。应理解，编码OX40L多肽开放阅读框(ORF)的核苷酸序列(即mRNA，例如SEQ ID NO:116或SEQ ID NO:145)可以是例如还包含5'末端帽、5'UTR(例如，SEQ ID NO:27或44)、3'UTR(例如，SEQ ID NO:119或120)和/或聚A尾的较大构建体内的一个元件。
在一些实施方案中，可用于所述方法和组合物的多核苷酸(例如，mRNA)包含编码OX40L的细胞外结构域的开放阅读框。在其他实施方案中，所述多核苷酸(例如，mRNA)包含编码OX40L的细胞质结构域的开放阅读框。在一些实施方案中，所述多核苷酸(例如，mRNA)包含编码OX40L的跨膜结构域的开放阅读框。在某些实施方案中，所述多核苷酸(例如，mRNA)包含编码OX40L的细胞外结构域和OX40L的跨膜的开放阅读框。在其他实施方案中，所述多核苷酸(例如，mRNA)包含编码OX40L的细胞外结构域和OX40L的细胞质结构域的开放阅读框。在其他实施方案中，所述多核苷酸(例如，mRNA)包含编码OX40L的细胞外结构域、OX40L的跨膜和OX40L的细胞质结构域的开放阅读框。
表1或表1A呈现，例如IL-23、IL-36-γ和OX40L的前体和成熟序列以及包含IL-23或IL-36-γ的构建体。在本公开的上下文中，IL-23多核苷酸或IL-23多肽涵盖“前体”形式和“成熟”形式两者。此外，包含编码IL-23、IL-36-γ和OX40L的多核苷酸并且还包含诸如3'UTR和5'UTR的组分的构建体将被认为是IL-23、IL-36-γ和OX40L编码多核苷酸。本领域技术人员将理解，除了表1或1A中隐含地公开的天然信号序列和前肽序列(在前体中存在且在成熟相应形式中不存在的序列)和表1或1A中公开的非天然信号肽(IgKV4信号肽)以外，还可使用其他信号序列。因此，提及根据表1的IL-23、IL-36-γ和OX40L多肽或多核苷酸涵盖其中本领域中已知的替代信号肽(或编码序列)已连接至所述IL-23、IL-36-γ和OX40L多肽(或多核苷酸)的变体。还应理解，在整个本申请中提及表1中公开的序列同样适用，并且涵盖直系同源物和功能性变体(例如多态变体)以及在本申请提交时本领域中已知的那些序列的同种型。
表1.IL-23、IL-36-γ和IL-18多肽和多核苷酸序列
表1A：OX40L多肽和多核苷酸序列
基于本文提供的RNA序列，并且特别是表1和表1A，本领域普通技术人员将了解相应的DNA序列(例如，尿嘧啶转化为胸腺嘧啶)。同样地，基于所提供的DNA序列，本领域普通技术人员将了解相应的RNA序列(例如，胸腺嘧啶转化为尿嘧啶)。
在一些实施方案中，所述第一多核苷酸包含mRNA(例如，SEQ ID NO:141)，所述mRNA包含编码IL-23多肽的密码子优化的序列。在一些实施方案中，所述第二多核苷酸包含mRNA(例如，SEQ ID NO:143)，所述mRNA包含编码IL-36-γ多肽的密码子优化的序列。在其他实施方案中，所述第三多核苷酸包含mRNA(例如，SEQ ID NO:145)，所述mRNA包含编码OX40L多肽的密码子优化序列。
在一些实施方案中，所述第一多核苷酸包含编码全长的IL-23多肽的mRNA。在一些实施方案中，所述第一多核苷酸包含编码人IL-23多肽的mRNA，所述多肽缺乏野生型IL-23多肽的N-末端或C-末端处的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少14个或至少15个氨基酸。
在一些实施方案中，所述第二多核苷酸包含编码全长的IL-36-γ多肽的mRNA。在一些实施方案中，所述第二多核苷酸包含编码人IL-36-γ多肽的mRNA，所述多肽缺乏野生型IL-36-γ多肽的N-末端或C-末端处的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少14个或至少15个氨基酸。
在一些实施方案中，所述多核苷酸包含编码全长的OX40L多肽的mRNA。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含编码长度为183个氨基酸的人OX40L多肽的mRNA。在某些实施方案中，所述OX40L多肽可缺乏OX40L多肽的N-末端或C-末端处的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少14个或至少15个氨基酸。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸(例如，mRNA)是“结构修饰的”或“化学修饰的”。如本文所用，“结构”修饰是其中两个或更多个连接的核苷在多核苷酸中插入、缺失、复制、反转或随机化而无对所述mRNA本身的显著化学修饰的修饰。因为要实现结构修饰就必须使化学键断裂并重新形成，所以结构修饰具有化学性质并因此是化学修饰。然而，结构修饰将产生不同的核苷酸序列。例如，mRNA“AUCG”可化学修饰为“AU-5meC-G”。同一mRNA可在结构上从“AUCG”修饰为“AUCCCG”。在此，已插入二核苷酸“CC”，从而产生对多核苷酸的结构修饰。
在一个实施方案中，本公开的多核苷酸(例如，mRNA)可具有全部或任何同一核苷类型的均一化学修饰，或通过在全部或任何同一核苷类型中的相同起始修饰的仅仅向下滴定而产生的修饰群体，或全部或任何同一核苷类型的测量百分比的化学修饰但伴有随机并入，如其中所有尿苷被尿苷类似物(例如假尿苷或5-甲氧基尿苷)置换。在另一个实施方案中，多核苷酸(例如，编码IL-23多肽的mRNA、编码IL-36-γ多肽的mRNA和/或编码OX40L多肽的mRNA)可在整个多核苷酸(例如，mRNA)中具有两种、三种或四种同一核苷类型的均一化学修饰(如所有尿苷和所有胞嘧啶等以相同的方式修饰)。当本公开的多核苷酸(例如，编码IL-23多肽的mRNA、编码IL-36-γ多肽的mRNA和/或编码OX40L多肽的mRNA)被化学和/或结构修饰时，所述mRNA可被称为“修饰的mRNA”。化学修饰的非限制性实例在本文其他地方描述。
在一些实施方案中，所述第一多核苷酸和/或第二多核苷酸包含至少一个化学修饰的核苷。在一些实施方案中，所述至少一个化学修饰的核苷是选自由本文公开的任何化学修饰的核苷以及其组合组成的组。
在一些实施方案中，所述至少一个化学修饰的核苷是选自由以下组成的组：假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲氧基尿苷以及其组合。
在一些实施方案中，其中所述第一多核苷酸、第二多核苷酸和/或第三多核苷酸中的核苷被化学修饰至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或约100％。
在一些实施方案中，所述第一多核苷酸、第二多核苷酸和/或第三多核苷酸中的化学修饰的核苷是选自由尿苷、腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤以及其任何组合组成的组。在一些实施方案中，所述第一多核苷酸、第二多核苷酸和/或第三多核苷酸中的尿苷核苷被化学修饰至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或约100％。
在一些实施方案中，所述第一多核苷酸、第二多核苷酸和/或第三多核苷酸中的腺苷核苷被化学修饰至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或约100％。
在一些实施方案中，所述第一多核苷酸、第二多核苷酸和/或第三多核苷酸中的胞苷核苷被化学修饰至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或约100％。
在一些实施方案中，所述第一多核苷酸、第二多核苷酸和/或第三多核苷酸中的鸟苷核苷被化学修饰至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或约100％。
在一些实施方案中，编码第一蛋白质的mRNA、编码第二蛋白质的mRNA和编码第三蛋白质的mRNA中的每一种包含开放阅读框。
在一些实施方案中，所述IL-23多肽包含IL-12p40亚基，所述IL-12p40亚基包含与表1中列出的IL-23多肽序列至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列能够结合至IL-23p19亚基并形成IL-23，所述氨基酸序列具有IL-23活性。
在一些实施方案中，所述IL-12p40亚基由与表1中列出的IL-23多肽编码序列至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少99％或100％相同的核酸序列编码。
在一些实施方案中，所述IL-23多肽包含IL-23p19亚基，所述IL-23p19亚基包含与表1中列出的IL-23多肽序列至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列能够结合至IL-12p40亚基并形成IL-23，所述氨基酸序列具有IL-23活性。
在一些实施方案中，所述IL-23p19亚基由与表1中列出的IL-23多肽编码序列至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％相同的核酸序列编码。
在一些实施方案中，所述IL-23蛋白的IL-12p40亚基和IL-23p19亚基在单一多肽链或两条不同的链上。在一些实施方案中，所述IL-12p40亚基和IL-23p19亚基通过接头融合。在一些实施方案中，所述IL-12p40亚基包含信号肽。在一些实施方案中，所述IL-23p19亚基包含信号肽。在一些实施方案中，所述IL-12p40亚基是成熟IL-12p40(即，它不包含信号肽)。在一些实施方案中，所述IL-23p19亚基是成熟IL-23p19(即，它不包含信号肽)。在一些实施方案中，所述IL-12p40亚基包含非天然信号肽。在一些方面，所述IL-23p19亚基包含非天然信号肽。
在一些实施方案中，所述IL-23是融合多肽，所述融合多肽包含根据以下替代式中的任一者的IL-12p40亚基和IL-23p19亚基：
[信号肽1]-[IL-12p40]-[接头]-[IL-23p19]
[信号肽2]-[IL-23p19]-[接头]-[IL-12p40]
其中[信号肽1]可以是IL-12p40信号肽或非天然信号肽，[信号肽2]可以是IL-23p19信号肽或非天然信号肽，[IL-12p40]是成熟IL-12p40，[IL-23p19]是成熟IL-23p29，并且[接头]是肽接头。
在一些实施方案中，所述肽接头包含(GS)接头。在一些方面，所述(GS)接头包含(GnS)m序列，其中n是1-20并且m是1-100。在一些实施方案中，所述(GS)接头包含序列GGS、GGGS、GGGGS(SEQ ID NO:136)、GGGGGS(SEQ ID NO:137)、GGGGGGS(SEQ ID NO:138)、GGGGGGGS(SEQ ID NO:139)、GGSGGGGSGG(SEQ ID NO:183)、GGSGGGGG(SEQ ID NO:184)或GSGSGSGS(SEQ ID NO:185)。在一些实施方案中，所述接头可包含(EAAAK)q(SEQ ID NO:163)，其中q是1至5的整数。在一个实施方案中，所述接头可包含(EAAAK)3，即，EAAAKEAAAKEAAAK(SEQ ID NO:164)。在一些实施方案中，所述接头可以是富含Gly的接头，例如，包含(Gly)p，其中p是1至40的整数。在一些实施方案中，富含Gly的接头可包含GGGGG(SEQ ID NO:165)、GGGGGG(SEQ ID NO:166)、GGGGGGG(SEQ ID NO:167)或GGGGGGGG(SEQ IDNO:168)。其他示例性接头包括但不限于，GGGGSLVPRGSGGGGS(SEQ ID NO:169)、GSGSGS(SEQID NO:170)、GGGGSLVPRGSGGGG(SEQ ID NO:171)、GGSGGHMGSGG(SEQ ID NO:172)、GGSGGSGGSGG(SEQ ID NO:173)、GGSGG(SEQ ID NO:174)、GSGSGSGS(SEQ ID NO:175)、GGGSEGGGSEGGGSEGGG(SEQ ID NO:176)、AAGAATAA(SEQ ID NO:177)、GGSSG(SEQ ID NO:178)、GSGGGTGGGSG(SEQ ID NO:179)、GSGSGSGSGGSG(SEQ ID NO:180)、GSGGSGSGGSGGSG(SEQ ID NO:181)以及GSGGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO:182)。本文描述的接头可用于本文所述的任何多核苷酸中。
在一些实施方案中，根据上述式的IL-23多肽(即，包含IL-12p40亚基和IL-23p19亚基的IL-23多肽)包含与表1中列出的IL-23多肽序列至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列能够具有至少一种IL-23活性(例如，与IL-23受体结合)。
在一些实施方案中，根据上述式的IL-23多肽(即，包含IL-12p40亚基和IL-23p19亚基的IL-23多肽)由与表1中列出的序列至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％相同的核酸序列编码。
在一些实施方案中，所述IL-36-γ多肽包含与表1中列出的IL-36-γ多肽序列至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述多肽能够具有IL-36-γ活性(例如，与IL-36受体结合)。
在一些实施方案中，所述IL-36-γ多肽由与表1中列出的IL-36-γ多肽编码序列至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％相同的核酸序列编码。
在一些实施方案中，所述IL-18多肽包含与表1中列出的IL-18多肽序列至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述多肽能够具有IL-18活性(例如，与IL-18受体结合)。
在一些实施方案中，所述IL-18多肽由与表1中列出的IL-18多肽编码序列至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％相同的核酸序列编码。
在其他实施方案中，本公开的组合物还包含编码第三蛋白质的第三多核苷酸。在一个实施方案中，所述第三多核苷酸包含编码第三蛋白质的mRNA。在另一个实施方案中，所述第三多核苷酸编码OX40L多肽。
在一些实施方案中，所述OX40L多肽包含与表1A中列出的OX40L多肽序列至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述多肽能够具有OX40L活性(例如，与OX40L受体结合)。
在一些实施方案中，所述OX40L多肽由与表1A中列出的OX40L多肽编码序列至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％相同的核酸序列编码。
在某些实施方案中，所述组合物还包含编码第四蛋白质的第四多核苷酸。在一些实施方案中，所述第四多核苷酸包含编码第四蛋白质的mRNA。在一些实施方案中，所述第一多核苷酸、第二多核苷酸、第三多核苷酸和/或第四多核苷酸还包含含有miRNA结合位点的核酸序列。
在一些实施方案中，所述miRNA结合位点结合至miR-122。在一些实施方案中，所述miRNA结合位点结合至miR-122-3p或miR-122-5p。在一些实施方案中，所述miRNA结合位点包含与SEQ ID NO:24至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或100％相同的核苷酸序列，其中所述miRNA结合位点结合至miR-122(miR-122-3p，22nt-aacgccauuaucacacuaaaua)。在一些实施方案中，所述miRNA结合位点包含与SEQ ID NO:26至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或100％相同的核苷酸序列，其中所述miRNA结合位点结合至miR-122(miR-122-5p，22nt-uggagugugacaaugguguuug)。在一些实施方案中，所述第一多核苷酸、第二多核苷酸、第三多核苷酸和/或第四多核苷酸包含两个不同的miRNA结合位点或相同的miRNA结合位点。在一些实施方案中，所述第一多核苷酸、第二多核苷酸、第三多核苷酸和/或第四多核苷酸包含至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个miRNA结合位点。
在一些实施方案中，所述第一多核苷酸、第二多核苷酸、第三多核苷酸和/或第四多核苷酸还包含5'UTR。在一些实施方案中，所述5'UTR包含与表3中列出的5'UTR序列至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的核酸序列。在特定实施方案中，所述5'UTR包含与SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:44至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的核酸序列。在另一个特定实施方案中，所述5'UTR基本上由SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:44的核酸序列组成。应理解，所述5'UTR可以是例如还包含5'末端帽、OFR(例如，SEQ ID NO:17、19、71、94和116)、3'UTR(例如，SEQ ID NO:119或120)和/或聚A尾的较大构建体内的一个元件。在一些实施方案中，一个或多个miRNA结合位点可在一个或多个可能的插入位点处位于所述5'UTR内。
在一些实施方案中，所述第一多核苷酸、第二多核苷酸、第三多核苷酸和/或第四多核苷酸包含3'UTR。在一些实施方案中，所述3'UTR包含与表4A或4B中列出的3'UTR序列至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的核酸序列。在特定实施方案中，所述3'UTR包含与SEQ ID NO:119或120至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的核酸序列。在另一个特定实施方案中，所述3'UTR基本上由SEQ ID NO:119或SEQ ID NO:120的核酸序列组成。应理解，所述3'UTR可以是例如还包含5'末端帽、5'UTR(例如，SEQ ID NO:27或44)、OFR(例如，SEQ ID NO:17、19、71、94和116)和/或聚A尾的较大构建体内的一个元件。
在一些实施方案中，所述miRNA结合位点(例如，miR-122结合位点)被插入3'UTR内。在一些实施方案中，miRNA结合位点(例如，miR-122结合位点)被插入本发明的多核糖核苷酸(例如，mRNA)内的编码区的终止密码子下游的3'UTR内，在这种情况下在所述终止密码子与一个或多个miR结合位点之间存在3’UTR碱基。在一些实施方案中，如果构建体中存在多个终止密码子拷贝，则miRNA结合位点(例如，miR-122结合位点)被插入最终终止密码子下游。在一些实施方案中，miRNA结合位点(例如，miR-122结合位点)被插入终止密码子(或者如果构建体中存在多个终止密码子，则最终终止密码子)下游约10、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90或约100个碱基处。在特定实施方案中，miRNA结合位点(例如，miR-122结合位点)被插入终止密码子(或者如果构建体中存在多个终止密码子，则最终终止密码子)下游，以使得在所述终止密码子与一个或多个miR结合位点之间存在79个3’UTR碱基。
在一些实施方案中，所述第一多核苷酸、第二多核苷酸、第三多核苷酸和/或第四多核苷酸还包含与miRNA结合位点融合的间隔区序列。在一些实施方案中，所述间隔区序列包含至少约10个核苷酸、至少约15个核苷酸、至少约20个核苷酸、至少约25个核苷酸、至少约30个核苷酸、至少约35个核苷酸、至少约40个核苷酸、至少约45个核苷酸、至少约50个核苷酸、至少约55个核苷酸、至少约60个核苷酸、至少约65个核苷酸、至少约70个核苷酸、至少约75个核苷酸、至少约80个核苷酸、至少约85个核苷酸、至少约90个核苷酸、至少约95个核苷酸或至少约100个核苷酸。
在一些实施方案中，所述第一多核苷酸、第二多核苷酸、第三多核苷酸和/或第四多核苷酸还包含5'末端帽。在一些实施方案中，所述5'末端帽是帽0、帽1、ARCA、肌苷、N1-甲基-鸟苷、2'氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷、2-叠氮基鸟苷、帽2、帽4、5'甲基G帽或其类似物。在一些实施方案中，所述第一多核苷酸、第二多核苷酸、第三多核苷酸和/或第四多核苷酸包含3'聚A尾。在一些实施方案中，所述第一多核苷酸、第二多核苷酸、第三多核苷酸和/或第四多核苷酸是密码子优化的。在一些实施方案中，所述第一多核苷酸、第二多核苷酸、第三多核苷酸和/或第四多核苷酸是体外转录的(IVT)。在一些实施方案中，所述第一多核苷酸、第二多核苷酸、第三多核苷酸和/或第四多核苷酸是嵌合的。在一些实施方案中，所述第一多核苷酸、第二多核苷酸、第三多核苷酸和/或第四多核苷酸是环状的。
在一些实施方案中，所述IL-23多肽IL-12p40亚基、IL-23多肽IL-23p19亚基、IL-36-γ多肽和/或OX40L多肽与异源多肽融合。
在一些实施方案中，所述第一多核苷酸(例如，mRNA)、第二多核苷酸(例如，mRNA)和第三多核苷酸(例如，mRNA)包含5'末端帽、5'UTR、开放阅读框(ORF)、3'UTR和聚A尾，基本上由其组成或由其组成。在一个实施方案中，所述第一多核苷酸(例如，mRNA)包含SEQ IDNO:27或44、SEQ ID NO:19、71或141以及SEQ ID NO:119或120的核酸序列，基本上由其组成或由其组成。在另一个实施方案中，所述第二多核苷酸(例如，mRNA)包含SEQ ID NO:27或44、SEQ ID NO:17、94或143以及SEQ ID NO:119或120的核酸序列，基本上由其组成或由其组成。在另一个实施方案中，所述第三多核苷酸(例如，mRNA)包含SEQ ID NO:27或44、SEQID NO:116或145以及SEQ ID NO:119或120的核酸序列，基本上由其组成或由其组成。
在特定实施方案中，所述第一多核苷酸包含与SEQ ID NO:142至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的核酸序列。在另一个特定实施方案中，所述第一多核苷酸基本上由SEQ ID NO:142的核酸序列组成。在另一个特定实施方案中，所述第一多核苷酸由SEQ ID NO:142的核酸序列组成。
在特定实施方案中，所述第二多核苷酸包含与SEQ ID NO:144至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的核酸序列。在另一个特定实施方案中，所述第二多核苷酸基本上由SEQ ID NO:144的核酸序列组成。在另一个特定实施方案中，所述第二多核苷酸由SEQ ID NO:144的核酸序列组成。
在特定实施方案中，所述第三多核苷酸包含与SEQ ID NO:146至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的核酸序列。在另一个特定实施方案中，所述第三多核苷酸基本上由SEQ ID NO:146的核酸序列组成。在另一个特定实施方案中，所述第三多核苷酸由SEQ ID NO:146的核酸序列组成。
在一些实施方案中，所述第一多核苷酸包含与表1中公开的IL-23编码序列中的任一者至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述第二多核苷酸包含与表1中公开的IL-36-γ编码序列中的任一者至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述第二多核苷酸包含与编码IL-18的序列至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％相同的核苷酸序列，其中所述序列包含表1中公开的IL-18编码序列。
在一些实施方案中，所述第三多核苷酸包含与表1A的OX40L编码序列或OX40L_miR-122构建体至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
在其他实施方案中，本公开的组合物包含第四蛋白质或编码第四蛋白质的第四多核苷酸。例如，所述第四多核苷酸可包含编码第四蛋白质的mRNA。
在一些实施方案中，本文公开的组合物用于在有需要的受试者中减小或缩减肿瘤大小或抑制肿瘤生长。在一些实施方案中，本文公开的组合物用于在有需要的受试者中减小或缩减肿瘤大小或抑制肿瘤生长。
在一些实施方案中，将本文公开的组合物施用于有需要的受试者以治疗癌症，并且所述组合物的施用治疗或改善癌症的症状。
在一些实施方案中，癌症是选自由以下组成的组：肾上腺皮质癌、晚期癌症、肛门癌、再生障碍性贫血、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨转移、脑肿瘤、脑癌、乳腺癌、儿童癌症、原发灶不明癌症、卡斯尔曼氏病(Castleman disease)、宫颈癌、结肠/直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、尤文氏家族肿瘤、眼癌、胆囊癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道间质瘤、妊娠滋养细胞疾病、霍奇金疾病、卡波济肉瘤、肾细胞癌、喉癌和下咽癌、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、慢性粒单核细胞白血病、肝癌、肝细胞癌(HCC)、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺类癌瘤、皮肤淋巴瘤、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、口腔和口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体瘤、前列腺癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、成人软组织肉瘤、基底和鳞状细胞皮肤癌、黑素瘤、小肠癌、胃癌、睾丸癌、喉癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、维尔姆斯瘤、由癌症治疗引起的继发性癌症以及其任何组合。
在一些实施方案中，所述第一多核苷酸、第二多核苷酸和/或第三多核苷酸被配制用于通过以下递送：包括泵、贴片、药物储库、短针装置、单针装置、多针装置、微型针装置、喷射注射装置、弹道粉末/颗粒输递送装置、导管、管腔、低温探针、套管、微套管的装置，或利用热、RF能量、电流的装置，或其任何组合。在一些实施方案中，本文公开的组合物的有效量是介于约0.10mg/kg至约1000mg/kg之间。在一些实施方案中，本文公开的组合物被配制用于施用于人受试者。
在一些实施方案中，本文公开的组合物和制剂用于治疗癌症。在一些实施方案中，所公开的组合物和制剂用于制造用以治疗癌症的药物。
应理解，无意将本文公开的多核苷酸组合(例如，包含编码IL-23多肽的mRNA的第一多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽或IL-18多肽的mRNA的第二多核苷酸或包含编码OX40L多肽的mRNA的第三多核苷酸)限于所公开的特定形式。在这方面，本章节中涉及特定多核苷酸及其对应编码的多肽的公开内容同样适用于与另外的多核苷酸及其对应编码的多肽，例如与本文公开的IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L编码多核苷酸组合的第三、第四、第五等多肽。因此，涉及“第一多核苷酸”或“第二多核苷酸”(或对应编码的多肽)的公开内容同样适用于“第三多核苷酸”和相继多核苷酸(或其对应编码的多肽)。
此外，涉及由第一或第二多核苷酸编码的特定蛋白质的具体公开内容，例如，“所述第二多核苷酸包含编码人IL-36-γ多肽的mRNA，所述多肽缺乏野生型IL-36-γ多肽的N-末端或C-末端处的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少14个或至少15个氨基酸”的公开内容将同样适用于第三和相继蛋白质。因此，本领域技术人员将理解，如果第三蛋白质是例如OX40L，则第三多核苷酸可包含编码人OX40L多肽的mRNA，所述多肽缺乏野生型OX40L多肽的N-末端或C-末端处的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少14个或至少15个氨基酸，如上文关于本公开的第一或第二多肽所公开的。
III.编码免疫调节多肽的多核苷酸的组合的使用方法
免疫疗法(也称为免疫肿瘤学)通过引入不靶向肿瘤、而是靶向宿主免疫系统的疗法、具有独特不良事件概况的疗法以及可治愈许多类型的癌症的疗法而彻底改变了癌症治疗。如本文所用，术语“免疫疗法”是指通过诱导、增强或遏制免疫应答来治疗疾病。被设计用于引发或增强免疫应答的免疫疗法被称为“活化免疫疗法”，而减少或遏制免疫应答的免疫疗法被称为“遏制免疫疗法”。
肺癌、肾癌、膀胱癌和皮肤癌是就存活率或肿瘤反应而言从用免疫肿瘤学治疗中获得实质功效的癌症之一，其中黑素瘤可能显示出最大的益处。免疫疗法通常特征是使用令人兴奋的新型生物药物(称为检查点抑制剂抗体)的检查点抑制剂治疗。靶标包括例如PD-1、PD-L1和CTLA-4。
靶向PD-1、PD-L1或CTLA4的单克隆抗体可加强针对癌细胞的免疫应答，并且已经在治疗某些癌症方面显示出很大希望。例如，派姆单抗和纳武单抗靶向PD-1；阿特珠单抗靶向PD-L1；并且伊匹单抗结合并抑制CTLA-4。
这些药物的一个问题是它们可能允许免疫系统攻击体内的某些正常器官，这可在一些人中导致严重甚至危及生命的副作用。用于减少此类副作用的一种途径是与这些检查点抑制剂抗体一起施用其他剂，从而理想地使医生能够降低抗体的治疗剂量。
因此，本公开提供了用于治疗癌症的方法(例如，在有需要的受试者中减小或缩减肿瘤大小或抑制肿瘤生长)，所述方法包括施用上文第II部分中公开的任何组合物。特别地，本公开提供了用于治疗癌症的方法(例如，在有需要的受试者中减小或缩减肿瘤大小或抑制肿瘤生长)，所述方法包括向有需要的受试者施用：
(i)至少一种包含mRNA的多核苷酸，所述mRNA编码包含IL-23多肽的蛋白质，
(ii)至少一种包含mRNA的多核苷酸，所述mRNA编码包含IL-36-γ多肽或IL-18多肽的蛋白质，和/或
(iii)至少一种包含mRNA的多核苷酸，所述mRNA编码包含OX40L多肽的蛋白质。
在一些实施方案中，本公开提供了一种在有需要的受试者中减小或缩减肿瘤大小和/或抑制肿瘤生长的方法，所述方法包括向所述受试者施用至少两种多核苷酸，其中所述至少两种多核苷酸是选自编码IL-23多肽的第一多核苷酸、编码IL-36-γ多肽或IL-18多肽的第二多核苷酸和编码OX40L多肽的第三多核苷酸。在一个特定方面，所述在有需要的受试者中减小或缩减肿瘤大小和/或抑制肿瘤生长的方法包括向所述受试者施用(i)编码包含IL-23多肽的第一蛋白质的第一多核苷酸，(ii)编码包含IL-36-γ多肽或IL-18多肽的第二蛋白质的第二多核苷酸，(iii)编码包含OX40L多肽的第三蛋白质的第三多肽，和/或(iv)其任何组合。在另一个特定实施方案中，所述在有需要的受试者中减小或缩减肿瘤大小和/或抑制肿瘤生长的方法包括向所述受试者施用优选1:2:1w/w质量比的(i)编码包含IL-23多肽的第一蛋白质的第一多核苷酸(例如，SEQ ID NO:141)，(ii)编码包含IL-36-γ多肽的第二蛋白质的第二多核苷酸(例如，SEQ ID NO:143)，和(iii)编码包含OX40L多肽的第三蛋白质的第三多肽(例如，SEQ ID NO:145)。在一些特定方面，所述在有需要的受试者中减小或缩减肿瘤大小和/或抑制肿瘤生长的方法还包括向所述受试者施用有效量的额外多核苷酸，例如编码第四或第五蛋白质的第四或第五多核苷酸。
在其他实施方案中，本公开提供了通过施用本文公开的第一、第二和/或第三多核苷酸(例如，mRNA)来促进抗肿瘤作用(例如，诱导T细胞增殖、诱导肿瘤中的T细胞浸润、诱导记忆T细胞应答、增加NK细胞的数量等)的方法。
在一个实施方案中，本公开提供了一种在有需要的受试者中活化T细胞、在有需要的受试者中诱导T细胞增殖、在有需要的受试者的肿瘤中诱导T细胞浸润和/或在有需要的受试者中诱导记忆T细胞应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用编码IL-23的第一多核苷酸、编码IL-36-γ或IL-18的第二多核苷酸、编码OX40L的第三多核苷酸或其组合。在特定实施方案中，所述在有需要的受试者中活化T细胞、在有需要的受试者中诱导T细胞增殖、在有需要的受试者的肿瘤中诱导T细胞浸润和/或在有需要的受试者中诱导记忆T细胞应答的方法包括向所述受试者施用优选1:2:1w/w质量比的(i)编码包含IL-23多肽的第一蛋白质的第一多核苷酸(例如，SEQ ID NO:141)，(ii)编码包含IL-36-γ多肽的第二蛋白质的第二多核苷酸(例如，SEQ ID NO:143)，和(iii)编码包含OX40L多肽的第三蛋白质的第三多肽(例如，SEQ ID NO:145)。在某些实施方案中，所述第一多核苷酸(例如，mRNA)、第二多核苷酸(例如，mRNA)和/或第三多核苷酸(例如，mRNA)的肿瘤内施用可相较于其他施用途径增加抗肿瘤作用(例如，肿瘤中的T细胞浸润)的功效。
在一个实施方案中，受试者中的活化的T细胞在所述受试者中减小或缩减肿瘤大小或抑制肿瘤生长。T细胞的活化可使用本领域中的应用来进行测量，如测量T细胞增殖；用酶联免疫吸附测定(ELISA)或酶联免疫斑点测定(ELISPOT)来测量细胞因子产生；或者用诸如流式细胞术的技术检测与T细胞活化相关的细胞表面标志物(例如，CD69、CD40L、CD137、CD25、CD71、CD26、CD27、CD28、CD30、CD154和CD134)。
在一个实施方案中，受试者中的T细胞增殖是针对受试者中的抗肿瘤免疫应答。在另一方面，受试者中的T细胞增殖在所述受试者中减小或缩减肿瘤大小或抑制肿瘤生长。T细胞增殖可使用本领域中的应用来测量，如细胞计数、活力染色、光密度测定或用诸如流式细胞术的技术检测与T细胞活化相关的细胞表面标志物(例如，CD69、CD40L、CD137、CD25、CD71、CD26、CD27、CD28、CD30、CD154和CD134)。
在一个实施方案中，受试者的肿瘤中的T细胞浸润是针对受试者中的抗肿瘤免疫应答。在另一方面，受试者的肿瘤中的T细胞浸润在所述受试者中减小或缩减肿瘤大小或抑制肿瘤生长。肿瘤中的T细胞浸润可使用本领域中的应用来测量，如组织切片和细胞标志物的染色，测量肿瘤部位的局部细胞因子产生，或用诸如流式细胞术的技术检测T细胞表面标志物。
在一个实施方案中，受试者中的记忆T细胞应答是针对受试者中的抗肿瘤免疫应答。在另一方面，受试者中的记忆T细胞应答在所述受试者中减小或缩减肿瘤大小或抑制肿瘤生长。记忆T细胞应答可使用本领域中的应用来测量，如测量与记忆T细胞相关的T细胞标志物，测量与记忆免疫应答有关的局部细胞因子产生，或用诸如流式细胞术的技术检测记忆T细胞表面标志物。
在某些实施方案中，通过本发明方法活化的T细胞是CD4+细胞、CD8+细胞、CD62+(L-选择素+)细胞、CD69+细胞、CD40L+细胞、CD137+细胞、CD25+细胞、CD71+细胞、CD26+细胞、CD27+细胞、CD28+细胞、CD30+细胞、CD45+细胞、CD45RA+细胞、CD45RO+细胞、CD11b+细胞、CD154+细胞、CD134+细胞、CXCR3+细胞、CCR4+细胞、CCR6+细胞、CCR7+细胞、CXCR5+细胞、Crth2+细胞、γδT细胞或其任何组合。在一些实施方案中，通过本发明方法活化的T细胞是Th1细胞。在其他实施方案中，通过本发明方法活化的T细胞是Th2细胞。在其他实施方案中，通过本公开活化的T细胞是细胞毒性T细胞。
在一些实施方案中，通过本发明方法诱导的浸润T细胞是CD4+细胞、CD8+细胞、CD62+(L-选择素+)细胞、CD69+细胞、CD40L+细胞、CD137+细胞、CD25+细胞、CD71+细胞、CD26+细胞、CD27+细胞、CD28+细胞、CD30+细胞、CD45+细胞、CD45RA+细胞、CD45RO+细胞、CD11b+细胞、CD154+细胞、CD134+细胞、CXCR3+细胞、CCR4+细胞、CCR6+细胞、CCR7+细胞、CXCR5+细胞、Crth2+细胞、γδT细胞或其任何组合。在一些实施方案中，通过本发明方法诱导的浸润T细胞是Th1细胞。在其他实施方案中，通过本发明方法诱导的浸润T细胞是Th2细胞。在其他实施方案中，通过本公开诱导的浸润T细胞是细胞毒性T细胞。
在一些实施方案中，通过本发明方法诱导的记忆T细胞是CD4+细胞、CD8+细胞、CD62+(L-选择素+)细胞、CD69+细胞、CD40L+细胞、CD137+细胞、CD25+细胞、CD71+细胞、CD26+细胞、CD27+细胞、CD28+细胞、CD30+细胞、CD45+细胞、CD45RA+细胞、CD45RO+细胞、CD11b+细胞、CD154+细胞、CD134+细胞、CXCR3+细胞、CCR4+细胞、CCR6+细胞、CCR7+细胞、CXCR5+细胞、Crth2+细胞、γδT细胞或其任何组合。在一些实施方案中，通过本发明方法诱导的记忆T细胞是Th1细胞。在其他实施方案中，通过本发明方法诱导的记忆T细胞是Th2细胞。在其他实施方案中，通过本公开诱导的记忆T细胞是细胞毒性T细胞。
本公开还提供了一种在有需要的受试者中增加自然杀伤(NK)细胞的数量的方法，所述方法包括施用包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-23的mRNA的多核苷酸和/或包含编码IL-36-γ或IL-18的mRNA的多核苷酸。在特定实施方案中，所述在有需要的受试者中增加自然杀伤(NK)细胞的数量的方法包括向所述受试者施用优选1:2:1w/w质量比的(i)编码包含IL-23多肽的第一蛋白质的第一多核苷酸(例如，SEQ ID NO:141)，(ii)编码包含IL-36-γ多肽的第二蛋白质的第二多核苷酸(例如，SEQ ID NO:143)，和(iii)编码包含OX40L多肽的第三蛋白质的第三多肽(例如，SEQ ID NO:145)。在一个方面，受试者中NK细胞数量的增加是针对受试者中的抗肿瘤免疫应答。在另一方面，受试者中NK细胞数量的增加在所述受试者中减小或缩减肿瘤大小或抑制肿瘤生长。受试者中NK细胞数量的增加可使用本领域中的应用测量，如检测NK细胞表面标志物(例如，CD335/NKp46；CD336/NKp44；CD337/NPp30)或细胞内NK细胞标志物(例如，穿孔素；颗粒酶；颗粒溶素)。
在某些实施方案中，施用选自编码IL-23的mRNA、编码IL-36-γ的mRNA或编码IL-18的mRNA以及编码OX40L多肽的mRNA的至少两种mRNA与未施用所述至少两种mRNA或者施用单独编码IL-23的mRNA、单独编码IL-36-γ的mRNA、编码II-18的mRNA或单独编码OX40L的mRNA的受试者中的NK细胞数量相比，增加了受试者中的NK细胞总数。在其他实施方案中，施用选自编码IL-23的mRNA、编码IL-36-γ的mRNA、编码IL-18的mRNA和编码OX40L多肽的mRNA的至少两种mRNA与施用用单独编码OX40L多肽的mRNA、单独编码IL-23的mRNA或单独编码IL-36-γ的mRNA或编码IL-18的mRNA转导的树突状细胞的受试者相比，增加了受试者中的NK细胞总数。在其他实施方案中，施用选自编码IL-23的mRNA、编码IL-36-γ的mRNA、编码IL-18的mRNA以及编码OX40L多肽的mRNA的至少两种mRNA与未施用所述至少两种mRNA或者施用单独编码IL-23的mRNA、单独编码IL-36-γ的mRNA、单独编码IL-18的mRNA或单独编码OX40L的mRNA的受试者中的NK细胞数量相比，增加了受试者中肿瘤微环境内的NK细胞的数量。在其他实施方案中，施用选自编码IL-23的mRNA、编码IL-36-γ的mRNA、编码IL-18的mRNA和编码OX40L多肽的mRNA的至少两种mRNA与施用用单独编码OX40L多肽的mRNA、单独编码IL-23的mRNA、单独编码IL-18的mRNA或单独编码IL-36-γ的mRNA转导的树突状细胞的受试者的NK细胞数量相比，增加了受试者中肿瘤微环境内的NK细胞的数量。在其他实施方案中，肿瘤微环境内NK细胞的浓度增加，而受试者中NK细胞的总数保持相同。
在本公开的某些实施方案中，与对照(例如，盐水或无IL-23、IL-36-γ或OX40L表达的mRNA)相比，NK细胞的数量增加至少约两倍、至少约三倍、至少约四倍、至少约五倍、至少约六倍、至少约七倍、至少约八倍、至少约九倍或至少约十倍。在特定实施方案中，与对照(例如，盐水或无IL-23、IL-36-γ、IL-18或OX40L表达的mRNA)相比，NK细胞的数量通过选自编码IL-23的mRNA、编码IL-36-γ的mRNA、编码IL-18的mRNA和编码OX40L多肽的mRNA的至少两种mRNA增加至少约两倍。
在一个方面，施用本文公开的组合减小或缩减肿瘤大小或抑制肿瘤生长与(i)单独施用编码第一蛋白质的第一多核苷酸(例如，编码包含IL-23多肽的蛋白质的多核苷酸)，(ii)单独施用编码第二蛋白质的第二多核苷酸(例如，编码包含IL-36-γ多肽或IL-18多肽的蛋白质的多核苷酸)或(iii)单独施用编码第三蛋白质的第三多核苷酸(例如，编码包含OX40L多肽的蛋白质的多核苷酸)相比好至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍或至少5倍。肿瘤大小的减小或缩减或肿瘤生长的抑制可使用本领域肿已知的任何方法测量而无需过多实验。
在一些方面，肿瘤大小的减小或缩减或肿瘤生长的抑制比对照(例如，用PBS处理、用编码对照蛋白质的多核苷酸处理或用对照蛋白至处理)高至少为1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍或至少5倍。
在一些方面，根据本文公开的方法施用的第一多核苷酸包含编码第一蛋白质(例如，包含IL-23多肽的蛋白质)的RNA(例如，mRNA)。在一些方面，根据本文公开的方法施用的第二多核苷酸包含编码第二蛋白质(例如，包含IL-36-γ多肽或IL-18多肽的蛋白质)的RNA(例如，mRNA)。在一些方面，根据本文公开的方法施用的第三多核苷酸包含编码第三蛋白质(例如，包含OX40L多肽的蛋白质)的RNA(例如，mRNA)。
本文公开的方法包括通过任何可用的途径施用本公开的任何组合物，所述途径包括但不限于肿瘤内、肠内、胃肠、硬膜外、经口、透皮、硬膜外(epidural)(硬膜外(peridural))、脑内(进入大脑)、脑室内(进入脑室)、皮外(涂敷在皮肤上)、皮内(进入皮肤本身)、皮下(在皮肤下)、鼻施用(通过鼻子)、静脉内(进入静脉)、腹膜内(进入腹膜)、动脉内(进入动脉)、肌肉内(进入肌肉)、心脏内(进入心脏)、骨内输注(进入骨髓)、鞘内(进入椎管)、腹膜内(输注或注射到腹膜中)、膀胱内输注、玻璃体内(通过眼睛)、海绵体内注射(进入阴茎底部)、阴道内施用、子宫内、羊膜外施用、透皮(扩散通过完整皮肤用于全身分布)、透粘膜(扩散通过粘膜)、吹入(嗅吸)、舌下、唇下、灌肠、滴眼液(滴在结膜上)或用滴耳液。
在一些方面，本文公开的方法包括皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内、颅内、脑室内、口服、通过吸入喷雾、局部、直肠、经鼻、经颊、阴道或经由植入的储库施用所述第一多核苷酸、第二多核苷酸和/或第三多核苷酸。
在一些方面，本文公开的方法包括作为用于肌肉内、皮下、肿瘤内或皮内递送的制剂施用所述第一多核苷酸、第二多核苷酸和/或第三多核苷酸。在一些实施方案中，所述用于肌肉内、皮下、肿瘤内或皮内递送的制剂包含额外多核苷酸，例如第三、第四或第五多核苷酸。在某些实施方案中，与其他施用途径相比，所述第一多核苷酸、第二多核苷酸和/或第三多核苷酸的肿瘤内施用可增加抗肿瘤作用的功效。在一些实施方案中，肿瘤内施用额外多核苷酸，例如第三、第四或第五多核苷酸，从而与其他施用途径相比增加抗肿瘤作用的功效。
在本文公开的方法的一些方面，所述第一多核苷酸、第二多核苷酸和/或第三多核苷酸被配制用于体内递送。在一些实施方案中，所述第一多核苷酸、第二多核苷酸和第三多核苷酸可以不同的重量比共同配制，例如，使用相等量(按重量计)的每种多核苷酸或者所述多核苷酸中的任一者以其他多核苷酸的量(按重量计)的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50倍存在。在一个实施方案中，IL-23:IL-36γ:OX40L多核苷酸以使得IL-23和OX40L多核苷酸处于大约相等的量并且IL-36γ多核苷酸以更高的重量(质量)的量，如高1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0倍重量(质量)的量存在的重量(质量)比共同配制。在一个特定实施方案中，IL-23:IL-36γ:OX40L多核苷酸以1:2:1的重量(质量)比共同配制。在本文中使用时，质量比还可参考以1:1:2的重量(质量)比配制的包含编码OX40L:IL-23:IL-36γ的多核苷酸(例如，mRNA)的组合物提及。
在其他实施方案中，IL-23:IL-36γ:OX40L多核苷酸以1:1:1、2:1:1、1:2:1、1:1:2、3:1:1、1:3:1、1:1:3、4:1:1、1:4:1、1:1:4、5:1:1、1:5:1、1:1:5、6:1:1、1:6:1、1:1:6、7:1:1、1:7:1、1:1:8、9:1:1、1:9:1、1:1:9、10:1:1、1:10:1、1:1:10、11:1:1、1:11:1、1:1:11、12:1:1、1:12:1、1:1:12、13:1:1、1:13:1、1:1:13、14:1:1、1:14:1、1:1:14、15:1:1、1:15:1、1:1:15、16:1:1、1:16:1、1:1:16、17:1:1、1:17:1、1:1:17、18:1:1、1:18:1、1:1:18、19:1:1、1:19:1、1:1:19、20:1:1、1:20:1、1:1:20、25:1:1、1:25:1、1:1:25、30:1:1、1:30:1、1:1:30、35:1:1、1:35:1、1:1:35、40:1:1、1:40:1、1:1:40、45:1:1、1:45:1、1:1:45、50:1:1、1:50:1或1:1:50的重量(质量)比共同配制。在其他实施方案中，三种多核苷酸中的每种可以不同的重量存在于共制剂中。仅作为举例，IL-23:IL-36γ:OX40L多核苷酸可以1:2:3、1:3:2、2:1:3、2:3:1、3:1:2或3:2:1的重量(质量)比；或者替代地以1:3:5、1:5:3、3:5:1、3:1:5、5:1:3或5:3:1的重量(质量)比；或者替代地以1:5:10、1:10:5、5:1:10、5:10:1、10:1:5或10:5:1的重量(质量)比共同配制。在特定实施方案中，(i)编码包含IL-23多肽(例如，SEQ ID NO:140)的第一蛋白质的第一多核苷酸、(ii)编码包含IL-36-γ多肽(例如，SEQ IDNO:16)的第二蛋白质的第二多核苷酸和(iii)编码包含OX40L多肽(例如，SEQ ID NO:21)的第三蛋白质的第三多肽以1:2:1的重量(质量)比配制。虽然这是优选的制剂，但本领域技术人员将容易理解，在此比例之外的三种成分中的任一者的量也可提供适用于本文公开的任何方法的制剂。
多核苷酸共制剂可以单剂量或多剂量施用。具有不同重量(质量)比的共制剂，例如，其中第一多核苷酸、第二多核苷酸和第三多核苷酸以1:2:1w/w存在的共制剂#1和其中第一多核苷酸、第二多核苷酸和第三多核苷酸以1:1:2w/w存在的共制剂#2可各自依次、并行或同时施用一次或多次。
在一个实施方案中，(i)编码包含IL-23多肽(例如，SEQ ID NO:140)的第一蛋白质的第一多核苷酸、(ii)编码包含IL-36-γ多肽(例如，SEQID NO:16)的第二蛋白质的第二多核苷酸和(iii)编码包含OX40L多肽(例如，SEQ ID NO:21)的第三蛋白质的第三多肽的1:2:1共制剂以单剂量或多剂量施用。
在本文公开的方法的一些方面，本文公开的组合物的施用治疗癌症。
在本文公开的方法的某些方面，施用本文公开的组合物以治疗选自由以下组成的组的癌症：肾上腺皮质癌、晚期癌症、肛门癌、再生障碍性贫血、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨转移、脑肿瘤、脑癌、乳腺癌、儿童癌症、原发灶不明癌症、卡斯尔曼氏病、宫颈癌、结肠/直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、尤文氏家族肿瘤、眼癌、胆囊癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道间质瘤、妊娠滋养细胞疾病、霍奇金疾病、卡波济肉瘤、肾细胞癌、喉癌和下咽癌、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、慢性粒单核细胞白血病、肝癌、肝细胞癌(HCC)、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺类癌瘤、皮肤淋巴瘤、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、口腔和口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体瘤、前列腺癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、成人软组织肉瘤、基底和鳞状细胞皮肤癌、黑素瘤、小肠癌、胃癌、睾丸癌、喉癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、维尔姆斯瘤、由癌症治疗引起的继发性癌症以及其任何组合。
在本文公开的方法的一些方面，所述第一多核苷酸、第二多核苷酸和/或第三多核苷酸通过以下递送：包括泵、贴片、药物储库、短针装置、单针装置、多针装置、微型针装置、喷射注射装置、弹道粉末/颗粒输递送装置、导管、管腔、低温探针、套管、微套管的装置，或利用热、RF能量、电流的装置，或其任何组合。在本文公开的方法的其他方面，额外多核苷酸，例如第三、第四或第五多核苷酸也通过以下递送：包括泵、贴片、药物储库、短针装置、单针装置、多针装置、微型针装置、喷射注射装置、弹道粉末/颗粒输递送装置、导管、管腔、低温探针、套管、微套管的装置，或利用热、RF能量、电流的装置，或其任何组合。
在一些实施方案中，在本公开的方法中使用的本文公开的组合物的有效量是介于约0.10mg/kg至约1000mg/kg之间。在一些实施方案中，受试者是人。
在本文公开的方法的一些实施方案中，编码包含IL-23多肽的第一蛋白质的第一多核苷酸、编码包含IL-36-γ多肽或IL-18多肽的第二蛋白质的第二多核苷酸和编码包含OX40L多肽的第三蛋白质的第三多核苷酸是同一组合物的部分(例如，溶液含有第一、第二和第三多核苷酸)。在本文公开的方法的一些实施方案中，编码包含IL-23多肽的第一蛋白质的第一多核苷酸、编码包含IL-36-γ多肽或IL-18多肽的第二蛋白质的第二多核苷酸和编码包含OX40L多肽的第三蛋白质的第三多核苷酸是不同组合物的部分(例如，每种多核苷酸可在不同的溶液中，或者它们可组合在不同的溶液中)。
在本文公开的方法的一些实施方案中，编码包含IL-23多肽的第一蛋白质的第一多核苷酸和编码包含IL-36-γ多肽或IL-18多肽的第二蛋白质的第二多核苷酸同时施用。在本文公开的方法的一些实施方案中，所述编码包含IL-23多肽的第一蛋白质的第一多核苷酸和编码包含IL-36-γ多肽或IL-18多肽的第二蛋白质的第二多核苷酸并行施用。在本文公开的方法的一些实施方案中，编码包含IL-23多肽的第一蛋白质的第一多核苷酸和编码包含IL-36-γ多肽或IL-18多肽的第二蛋白质的第二多核苷酸依次施用(即，可首先施用第一多核苷酸，然后施用第二多核苷酸，或反之亦然)。
在本文公开的方法的一些实施方案中，编码包含OX40L多肽的第一蛋白质的多核苷酸和编码包含IL-36-γ多肽或IL-18多肽的第二蛋白质的多核苷酸同时施用。在本文公开的方法的一些实施方案中，编码包含OX40L多肽的蛋白质的多核苷酸和编码包含IL-36-γ多肽或IL-18多肽的蛋白质的多核苷酸并行施用。在本文公开的方法的一些实施方案中，编码包含OX40L多肽的蛋白质的多核苷酸和编码包含IL-36-γ多肽的蛋白质的多核苷酸依次施用(即，可首先施用OX40L多核苷酸，然后施用IL-36-γ多核苷酸或IL-18多核苷酸，或反之亦然)。
在本文公开的方法的一些实施方案中，编码包含IL-23多肽的第一蛋白质的第一多核苷酸、编码包含IL-36-γ多肽或IL-18多肽的第二蛋白质的第二多核苷酸和编码包含OX40L多肽的第三蛋白质的第三多核苷酸同时施用。在本文公开的方法的一些实施方案中，编码包含IL-23多肽的第一蛋白质的第一多核苷酸、编码包含IL-36-γ多肽或IL-18多肽的第二蛋白质的第二多核苷酸和编码包含OX40L多肽的第三蛋白质的第三多核苷酸并行施用。在本文公开的方法的一些实施方案中，编码包含IL-23多肽的第一蛋白质的第一多核苷酸、编码包含IL-36-γ多肽或IL-18多肽的第二蛋白质的第二多核苷酸和编码包含OX40L多肽的第三蛋白质的第三多核苷酸依次施用(即，可根据任何施用顺序施用所述第一、第二和第三多核苷酸)。在特定实施方案中，包含IL-23多肽(例如，SEQ ID NO:140，由SEQ ID NO:141编码)的第一蛋白质、编码包含IL-36-γ多肽(例如，SEQ ID NO:16，由SEQ ID NO:143编码)的第二蛋白质的第二多核苷酸和编码包含OX40L多肽(例如，SEQ ID NO:21，由SEQ IDNO:145编码)的第三蛋白质的第三多核苷酸以1:2:1的最终重量(质量)比施用，无论施用顺序。
在一些实施方案中，本公开提供了一种治疗相对于所治疗的肿瘤(近端肿瘤)位于远端的肿瘤(例如，减小肿瘤大小)的方法。在一些实施方案中，用编码包含IL-23多肽的第一蛋白质的第一多核苷酸(例如，mRNA)、编码包含IL-36-γ多肽或IL-18多肽的第二蛋白质的第二多核苷酸(例如，mRNA)和编码包含OX40L多肽的第三蛋白质的第三多核苷酸(例如，mRNA)或其组合治疗近端肿瘤。本文公开的方法可用于例如，通过将本文公开的组合物(例如，编码IL-23多肽的mRNA(例如，SEQ ID NO:141)，编码IL-36-γ多肽的mRNA(例如，SEQ IDNO:143)和编码OX40L多肽的第三mRNA(例如，SEQ ID NO:145)肿瘤内施用至一个或多个可及的肿瘤来治疗其中肿瘤内施用疗法将不安全或不实际的位置处的肿瘤。在一些实施方案中，将本文公开的疗法施用至近端肿瘤可用于治疗转移。
在一些实施方案中，本公开提供了一种治疗对检查点抑制剂(例如，靶向PD-1或PD-L1的分子，如抗PD-L1抗体)无反应或反应较差的肿瘤的方法，所述方法包括施用编码包含IL-23多肽的第一蛋白质的第一多核苷酸(例如，mRNA)、编码包含IL-36-γ多肽或IL-18多肽的第二蛋白质的第二多核苷酸(例如，mRNA)和编码包含OX40L多肽的第三蛋白质的第三多核苷酸(例如，mRNA)或其组合、以及检查点抑制剂(例如，抗PD-L1抗体和/或抗PD-1抗体和/或抗CTLA-4抗体)。在特定实施方案中，包含IL-23多肽(例如，SEQ ID NO:140，由SEQID NO:141编码)的第一蛋白质、编码包含IL-36-γ多肽(例如，SEQ ID NO:16，由SEQ IDNO:143编码)的第二蛋白质的第二多核苷酸和编码包含OX40L多肽(例如，SEQ ID NO:21，由SEQ ID NO:145编码)的第三蛋白质的第三多核苷酸与检查点抑制剂(例如，抗PD-L1抗体和/或抗PD-1抗体和/或抗CTLA-4抗体)一起施用。
如本文所用，术语“双联体”、“双联体疗法”、“双联体组合疗法”、“双联体mRNA疗法”及其语法变体是指其中将编码选自IL-23多肽、IL-36-γ多肽或IL-18多肽和OX40L多肽的两种蛋白质的两种mRNA施用于有需要的患者的组合治疗。在一些实施方案中，双联体疗法基本上由分别编码IL-23多肽和IL-36-γ多肽或IL-18多肽的两种mRNA组成或由其组成。双联体疗法可例如(i)作为包含两种mRNA的单一组合物或(ii)作为各自包含一种mRNA的单独组合物施用。在一些实施方案中，同时施用双联体疗法中的mRNA。在其他实施方案中，依次施用双联体疗法中的mRNA。
如本文所用，术语“三联体”、“三联体疗法”、“三联体组合疗法”、“三联体mRNA疗法”及其语法变体可互换使用，并且是指其中将编码IL-23多肽、IL-36-γ多肽或IL-18多肽和OX40L多肽的三种mRNA施用于有需要的患者的组合治疗。在一些实施方案中，三联体疗法基本上由分别编码IL-23多肽、IL-36-γ多肽或IL-18多肽和OX40L多肽的三种mRNA组成或由其组成。三联体疗法可例如(i)作为包含三种mRNA的单一组合物(例如，以1:2:1w/w IL-23:IL-36γ:OX40L的最终重量(质量)比)或(ii)作为各自包含一种或两种mRNA的单独组合物(例如，以1:2:1w/w IL-23:IL-36γ:OX40L的最终重量(质量)比)施用。在一些实施方案中，同时施用三联体疗法中的mRNA。在其他实施方案中，依次施用三联体疗法中的每种mRNA或其组合。在特定实施方案中，三联体疗法包括以下或基本上由以下组成：优选以1:2:1的重量(质量)比配制、根据任何施用顺序(例如，依次、并行或同时)施用的(i)编码包含IL-23多肽(例如，SEQ ID NO:140，由SEQ ID NO:141编码)的第一蛋白质的第一多核苷酸，(ii)编码包含IL-36-γ多肽(例如，SEQ ID NO:16，由SEQ ID NO:143编码)的第二蛋白质的第二多核苷酸和(iii)编码包含OX40L多肽的第三蛋白质的第三多肽(例如，SEQ ID NO:145，由SEQID NO:145编码)。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗方法，其中将本文公开的多核苷酸或多核苷酸(例如，mRNA)的组合施用于有需要的受试者(例如，癌症患者)使得：
(a)在施用双联体或三联体后从所述受试者获得的一种或多种样品中的粒细胞水平相对于阈值水平或相对于在施用编码IL-23、IL-36-γ或IL-18多肽或OX40L多肽的单一多核苷酸后的水平增加；
(b)在施用双联体或三联体后从所述受试者获得的一种或多种样品中的交叉呈递树突状细胞水平相对于阈值水平或相对于在施用编码IL-23、IL-36-γ或IL-18多肽或OX40L多肽的单一多核苷酸后的水平增加；
(c)在施用双联体或三联体后从所述受试者获得的一种或多种样品中的效应与抑制T细胞比率相对于阈值水平或相对于在施用编码OX40L多肽的单一多核苷酸后的比率增加；
(d)在施用双联体或三联体后从所述受试者获得的一种或多种样品中的效应记忆T细胞水平相对于阈值水平或相对于在施用编码OX40L多肽的单一多核苷酸后的水平增加；
(e)在施用双联体或三联体后从所述受试者获得的一种或多种样品中的PDL1表达水平相对于阈值水平或相对于在施用编码IL-23、IL-36-γ或IL-18多肽或OX40L多肽的单一多核苷酸后的水平增加；或
(f)其组合。
本公开提供了一种在有需要的受试者中减小或缩减肿瘤大小或抑制肿瘤生长的方法，所述方法包括向所述受试者施用组合物，所述组合物包含：(i)组合的两种多核苷酸(例如，mRNA)(双联体)，其中第一多核苷酸编码包含白细胞介素-23多肽(IL-23)的第一蛋白质，并且第二多核苷酸编码包含白细胞介素-36-γ多肽(IL-36-γ)或IL-18多肽的第二蛋白质；或者(ii)组合的三种多核苷酸(例如，mRNA，例如SEQ ID NO:141、143和145)(三联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽的第二蛋白质，并且第三多核苷酸编码包含OX40L多肽(OX40L)的第三蛋白质，其中将所述双联体或三联体施用至所述受试者使得：
(a)在施用双联体或三联体后从所述受试者获得的一种或多种样品中的粒细胞水平相对于阈值水平或相对于在施用编码IL-23、IL-36-γ或IL-18多肽或OX40L多肽的单一多核苷酸后的水平增加；
(b)在施用双联体或三联体后从所述受试者获得的一种或多种样品中的交叉呈递树突状细胞水平相对于阈值水平或相对于在施用编码IL-23、IL-36-γ或IL-18多肽或OX40L多肽的单一多核苷酸后的水平增加；
(c)在施用双联体或三联体后从所述受试者获得的一种或多种样品中的效应与抑制T细胞比率相对于阈值水平或相对于在施用编码OX40L多肽的单一多核苷酸后的比率增加；
(d)在施用双联体或三联体后从所述受试者获得的一种或多种样品中的效应记忆T细胞水平相对于阈值水平或相对于在施用编码OX40L多肽的单一多核苷酸后的水平增加；
(e)在施用双联体或三联体后从所述受试者获得的一种或多种样品中的PDL1表达水平相对于阈值水平或相对于在施用编码IL-23、IL-36-γ或OX40L多肽的单一多核苷酸后的水平增加；或
(f)其组合。
粒细胞、交叉呈递树突状细胞(例如，CD103+细胞)、效应T细胞(例如，CD4+或CD8+细胞)、抑制T细胞(例如，Treg细胞)、效应记忆T细胞(例如CD4+或CD8+细胞)、CD11b+细胞、PD-L1的表达等的水平可根据本领域中已知的任何方法在从受试者获得的一种或多种样品中进行测量。
在一些实施方案中，粒细胞水平的增加被定量为(i)粒细胞占CD45+细胞的百分比，或者(ii)每mg肿瘤的粒细胞数。在一些实施方案中，交叉呈递树突状细胞是CD103+细胞。在一些实施方案中，交叉呈递树突状细胞水平的增加被定量为(i)每mg肿瘤的交叉呈递树突状细胞数，(ii)肿瘤引流淋巴结(TdLN)中的交叉呈递CD103+树突状细胞，(iii)交叉呈递CD103+树突状细胞占CD45+细胞的百分比，或其任何组合。在一些实施方案中，效应与抑制T细胞比率被定量为CD8:Treg比率。在一些实施方案中，效应记忆T细胞是CD4+和/或CD8+细胞。在一些实施方案中，PD-L1表达水平被定量为(i)阳性CD11b+细胞的数量，或者(ii)CD11b+细胞中的PD-L1表达。
本公开还提供了一种增加有需要的受试者的粒细胞水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用组合物，所述组合物包含(i)组合的两种多核苷酸(例如，mRNA)(双联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，并且第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽或IL-18多肽的第二蛋白质；或者(ii)组合的三种多核苷酸(例如，mRNA)(三联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽或IL-18多肽的第二蛋白质，并且第三多核苷酸编码包含OX40L多肽的第三蛋白质，其中在从所述受试者获得的一种或多种样品中测量粒细胞水平。在一些实施方案中，相对于阈值水平或相对于在施用编码IL-23的单一多核苷酸或编码IL-36-γ或IL-18多肽的单一多核苷酸后的水平，粒细胞水平的增加被测量为(i)粒细胞占CD45+细胞的百分比，和/或(ii)每mg肿瘤的粒细胞数。
还提供了一种增加有需要的受试者的交叉呈递树突状细胞水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用组合物，所述组合物包含(i)组合的两种多核苷酸(例如，mRNA)(双联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，并且第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽或IL-18多肽的第二蛋白质；或者(ii)组合的三种多核苷酸(例如，mRNA，例如，SEQ ID NO:141、143和145)(三联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽或IL-18多肽的第二蛋白质，并且第三多核苷酸编码包含OX40L多肽的第三蛋白质，其中在从所述受试者获得的一种或多种样品中测量交叉呈递树突状细胞水平。在一些实施方案中，交叉呈递树突状细胞是CD103+细胞。在一些实施方案中，相对于阈值水平或相对于在施用编码IL-23的单一多核苷酸、编码IL-36-γ或IL-18多肽的单一多核苷酸或编码OX40L的单一多核苷酸后的水平，交叉呈递CD103+树突状细胞水平的增加被测量为(i)每mg肿瘤的交叉呈递CD103+树突状细胞数，(ii)TdLN中的交叉呈递CD103+树突状细胞，(iii)交叉呈递CD103+树突状细胞占CD45+细胞的百分比，或者(iv)其组合。
本公开还提供了一种增加有需要的受试者的效应与抑制T细胞比率的方法，所述方法包括向所述受试者施用组合物，所述组合物包含(i)组合的两种多核苷酸(例如，mRNA)(双联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，并且第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽或IL-18多肽的第二蛋白质；或者(ii)组合的三种多核苷酸(例如，mRNA，例如，SEQ ID NO:141、143和145)(三联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽或IL-18多肽的第二蛋白质，并且第三多核苷酸编码包含OX40L多肽的第三蛋白质，其中在从所述受试者获得的一种或多种样品中测量效应与抑制T细胞比率。在一些实施方案中，效应T细胞与抑制性T细胞比率被测量为CD8+细胞与调控性T细胞(Treg)之间的比率，即CD8:Treg比率。
本公开还提供了一种增加有需要的受试者的效应记忆T细胞水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用组合物，所述组合物包含(i)组合的两种多核苷酸(例如，mRNA)(双联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，并且第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽或IL-18多肽的第二蛋白质；或者(ii)组合的三种多核苷酸(例如，mRNA，例如，SEQ ID NO:141、143和145)(三联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽或IL-18多肽的第二蛋白质，并且第三多核苷酸编码包含OX40L多肽的第三蛋白质，其中在从所述受试者获得的一种或多种样品中测量效应记忆T细胞水平。在一些实施方案中，效应记忆T细胞是CD4+和/或CD8+细胞。在一些实施方案中，相对于阈值水平或相对于在施用编码OX40L的单一多核苷酸后的水平，效应记忆T细胞水平的增加被测量为肿瘤内的效应记忆T细胞。
本公开还提供了一种增加有需要的受试者的PD-L1阳性细胞水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用组合物，所述组合物包含(i)组合的两种多核苷酸(例如，mRNA)(双联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，并且第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽或IL-18多肽的第二蛋白质；或者(ii)组合的三种多核苷酸(例如，mRNA，例如，SEQ ID NO:141、143和145)(三联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽或IL-18多肽的第二蛋白质，并且第三多核苷酸编码包含OX40L多肽的第三蛋白质，其中在从所述受试者获得的一种或多种样品中测量PD-L1阳性细胞水平。在一些实施方案中，PD-L1阳性细胞是CD11b+细胞。
在本文公开的方法的一些方面，从受试者获得的一种或多种样品是选自由以下组成的组：肿瘤组织、肿瘤浸润物、血液、血浆以及其任何组合。在一些实施方案中，一种或多种对照样品是从健康受试者或患有肿瘤的受试者获得的一种或多种样品。
在一些实施方案中，阈值水平是预定值或从一种或多种样品获得的值，例如，从来自健康个体群体或患有肿瘤的受试者群体的样品池获得的值。
本公开还提供了一种确定是否用组合物治疗患有肿瘤疾病的受试者的方法，所述组合物包含(i)组合的两种多核苷酸(例如，mRNA)(双联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，并且第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽或IL-18多肽的第二蛋白质；(ii)组合的三种多核苷酸(例如，mRNA，例如，SEQ ID NO:141、143和145)(三联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽或IL-18多肽的第二蛋白质，并且第三多核苷酸编码包含OX40L多肽的第三蛋白质，或(iii)本文公开的任何组合物，所述方法包括：
(i)向所述受试者施用初始剂量的双联体或三联体，以及
(ii)如果在施用所述初始剂量的双联体或三联体后，所述受试者被确定受为相对于阈值水平具有以下的增加，则治疗所述受试者：
(a)粒细胞水平，
(b)交叉呈递树突状细胞水平，
(c)效应与抑制T细胞比率，
(d)效应记忆T细胞水平，
(e)PD-L1阳性细胞的水平，
(f)PD-L1表达，或
(g)其组合。
还提供了一种选择被诊断患有肿瘤的受试者作为用组合物治疗的候选者的方法，所述组合物包含(i)组合的两种多核苷酸(例如，mRNA)(双联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，并且第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽或IL-18多肽的第二蛋白质；或者，(ii)组合的三种多核苷酸(例如，mRNA，例如，SEQ ID NO:141、143和145)(三联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽或IL-18多肽的第二蛋白质，并且第三多核苷酸编码包含OX40L多肽的第三蛋白质，或(iii)本文公开的任何组合物，所述方法包括：
(i)向所述受试者施用初始剂量的双联体或三联体，以及
(ii)如果在施用所述初始剂量的双联体或三联体后，所述受试者被确定受为相对于阈值水平具有以下的增加，则选择所述受试者用于治疗：
(a)粒细胞水平，
(b)交叉呈递树突状细胞水平，
(c)效应与抑制T细胞比率，
(d)效应记忆T细胞水平，
(e)PD-L1阳性细胞的水平，
(f)PD-L1表达，或
(g)其组合。
本公开还提供了一种测量组合物用于治疗有需要的受试者的肿瘤的功效的方法，其中所述组合物包含(i)组合的两种多核苷酸(例如，mRNA)(双联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，并且第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽或IL-18多肽的第二蛋白质；或者，(ii)组合的三种多核苷酸(例如，mRNA，例如，SEQ ID NO:141、143和145)(三联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽或IL-18多肽的第二蛋白质，并且第三多核苷酸编码包含OX40L多肽的第三蛋白质，或(iii)本文公开的任何组合物，其中所述方法包括在从所述受试者取得的至少一种样品中测量(a)粒细胞水平，(b)交叉呈递树突状细胞水平，(c)效应与抑制T细胞比率，(d)效应记忆T细胞水平，(e)PD-L1阳性细胞水平，(f)PD-L1表达，或(g)其组合，其中所述测量值中的至少一者相对于阈值水平的增加表明所述受试者对用所述双联体或三联体治疗有反应。
IV.疾病、病症和/或病状
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸(例如，mRNA)，例如，包含编码包含IL-23多肽的第一蛋白质的mRNA的第一多核苷酸、包含编码包含IL-36-γ多肽或IL-18多肽的第二蛋白质的mRNA的第二多核苷酸和/或包含编码包含OX40L多肽的第三蛋白质的mRNA的第三多核苷酸可用于在有需要的受试者中减小或缩减肿瘤大小或抑制肿瘤生长。
在一些实施方案中，额外多核苷酸(例如，第四多核苷酸)可与包含编码包含IL-23多肽的第一蛋白质的mRNA的第一多核苷酸、包含编码包含IL-36-γ多肽或IL-18多肽的第二蛋白质的mRNA的第二多核苷酸和/或包含编码包含OX40L多肽的第三蛋白质的mRNA的第三多核苷酸组合施用以在有需要的受试者中减小或缩减肿瘤大小或抑制肿瘤生长。
因此，在一些实施方案中，本公开的多核苷酸(例如，mRNA)，即，包含编码包含IL-23多肽的第一蛋白质的mRNA的第一多核苷酸、包含编码包含IL-36-γ多肽或IL-18多肽的第二蛋白质的mRNA的第二多核苷酸和包含编码包含OX40L多肽的第三蛋白质的mRNA的第三多核苷酸可用于在有需要的受试者中减小或缩减肿瘤大小或抑制肿瘤生长。
在一些实施方案中，所述肿瘤与疾病、病症和/或病状相关。在特定实施方案中，所述疾病、病症和/或病状是癌症。因此，在一个方面，包含编码包含IL-23多肽的第一蛋白质的mRNA第一多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽或IL-18多肽的mRNA的第二多核苷酸和/或包含编码OX40L多肽的mRNA的第三多核苷酸的施用治疗癌症。
在另一方面，包含编码包含IL-23多肽的第一蛋白质的mRNA第一多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽或IL-18多肽的mRNA的第二多核苷酸以及进一步与包含编码第三蛋白质的mRNA的第三多核苷酸(其中所述第三蛋白质包含OX40L多肽)组合的施用治疗癌症。
“癌症”是指广泛的各种疾病，其特征在于体内异常细胞的不受控制的生长。不受调控的细胞分裂和生长导致恶性肿瘤的形成，所述恶性肿瘤侵入邻近组织并且还可通过淋巴系统或血流转移至身体的远端部分。“癌症”或“癌症组织”可包括各个阶段的肿瘤。在某些实施方案中，癌症或肿瘤是0期，以致例如癌症或肿瘤在发育的早期并且尚未转移。在一些实施方案中，癌症或肿瘤是I期，以致例如癌症或肿瘤的大小相对较小，尚未扩散到附近组织中，并且尚未转移。在其他实施方案中，癌症或肿瘤是II期或III期，以致例如癌症或肿瘤比0期或I期中更大，并且它已经生长到邻近组织中但是它尚未转移，除了潜在转移至淋巴结。在其他实施方案中，癌症或肿瘤是IV期，以致例如癌症或肿瘤已经转移。IV期也可称为晚期或转移性癌症。
在一些方面，癌症可包括但不限于，肾上腺皮质癌、晚期癌症、肛门癌、再生障碍性贫血、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨转移、脑肿瘤、脑癌、乳腺癌、儿童癌症、原发灶不明癌症、卡斯尔曼氏病、宫颈癌、结肠/直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、尤文氏家族肿瘤、眼癌、胆囊癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道间质瘤、妊娠滋养细胞疾病、霍奇金疾病、卡波济肉瘤、肾细胞癌、喉癌和下咽癌、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、慢性粒单核细胞白血病、肝癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺类癌瘤、皮肤淋巴瘤、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、口腔和口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体瘤、前列腺癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、成人软组织肉瘤、基底和鳞状细胞皮肤癌、黑素瘤、小肠癌、胃癌、睾丸癌、喉癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、维尔姆斯瘤以及由癌症治疗引起的继发性癌症。
在一些方面，肿瘤是实体瘤。“实体瘤”包括但不限于肉瘤、黑素瘤、癌或其他实体瘤癌症。“肉瘤”是指由类似胚性结缔组织的物质组成并且通常由嵌入纤维状或均质物质中的紧密堆积的细胞组成的肿瘤。肉瘤包括但不限于，软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑素肉瘤、粘液肉瘤、骨肉瘤、阿贝迈斯肉瘤、脂肪性肉瘤、脂肪肉瘤、肺泡软组织肉瘤、成釉细胞肉瘤、葡萄状肉瘤、绿色肉瘤、绒毛膜癌、胚胎性肉瘤、维尔姆斯氏肿瘤肉瘤、子宫内膜肉瘤、间质肉瘤、尤文氏肉瘤、筋膜肉瘤、成纤维细胞肉瘤、巨细胞肉瘤、粒细胞肉瘤、何杰金氏肉瘤、自发性多发性出血肉瘤、B细胞的成免疫细胞肉瘤、淋巴瘤、T-细胞的成免疫细胞肉瘤，詹森肉瘤，卡波西肉瘤，肝星形细胞肉瘤、血管肉瘤、白色肉瘤、恶性间叶瘤肉瘤、骨膜外肉瘤、骨网状细胞肉瘤、劳斯肉瘤、浆液囊性肉瘤、滑膜肉瘤或毛细血管扩张性肉瘤。
术语“黑素瘤”是指起源于皮肤和其他器官的黑色素系统的肿瘤。黑素瘤包括例如，肢端-雀斑样痣性黑素瘤、无黑色素性黑素瘤、良性幼年黑素瘤、克劳德曼黑素瘤、S91黑素瘤、哈-帕二氏黑素瘤(Harding-Passey melanoma)、幼年黑素瘤、恶性雀斑样痣黑素瘤、恶性黑素瘤、转移性黑素瘤、结节状黑素瘤、指甲下黑素瘤或浅表扩散性黑素瘤。
术语“癌”是指由趋于浸润周围组织并产生转移的上皮细胞组成的恶性的新生长。示例性癌包括例如，腺泡细胞癌、腺泡癌、腺样癌、腺样囊性癌、腺癌、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌、基底上皮细胞癌、基底细胞样癌、鳞状基底细胞癌、细支气管肺泡癌、细支气管癌、支气管癌、脑状癌、胆管细胞癌、绒毛膜癌、胶质性癌(colloidcarcinoma)、粉刺状癌、子宫体癌、筛状癌、铠甲状癌、皮肤癌、圆柱细胞癌(cylindricalcarcinoma)、柱状细胞癌(cylindrical cell carcinoma)、导管癌、硬癌(carcinomadurum)、胚胎性癌、髓样癌(encephaloid carcinoma)、表皮样癌、腺样上皮细胞癌、外植癌、溃疡性癌、纤维癌、胶样癌(gelatiniforni carcinoma)、胶状癌(gelatinouscarcinoma)、巨大细胞癌(giant cell carcinoma)、巨细胞癌(carcinomagigantocellulare)、腺癌(glandular carcinoma)、粒层细胞癌、发母质癌、多血癌、肝细胞癌、许特耳细胞癌、透明细胞癌、肾上腺样癌、幼稚型胚胎性癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、侵蚀性溃疡，库尔契茨基细胞癌，大细胞癌，透镜状癌、豆状癌、脂瘤样癌、淋巴上皮癌(lymphoepithelialcarcinoma)、髓样癌(carcinoma medullare)、髓样癌(medullary carcinoma)、黑色素癌、软癌、粘液癌(mucinous carcinoma)、粘液癌(carcinoma muciparum)、粘液细胞癌(carcinoma mucocellulare)、粘液表皮样癌、粘液癌(carcinoma mucosum)、粘液癌(mucous carcinoma)、粘液瘤样癌、鼻咽癌、燕麦细胞癌、骨化性癌、骨样癌、乳头状癌、门静脉周癌、浸润前期癌、棘细胞癌、软糊状癌、肾脏的肾细胞癌、储备细胞癌、肉瘤样癌、施耐德氏癌、硬癌(scirrhous carcinoma)、阴囊癌、印戒细胞癌、单纯癌、小细胞癌、马铃薯状癌、球状细胞癌、梭形细胞癌、髓样癌(carcinoma spongiosum)、鳞癌、鳞状细胞癌、串癌(string carcinoma)、毛细管扩张性癌(carcinoma telangiectaticum)、毛细管扩张性癌(carcinoma telangiectode)、移行细胞癌、结节性皮癌(carcinoma tuberosum)、结节性皮癌(tuberous carcinoma)、疣状癌或绒毛状癌。
可治疗的另外癌症包括例如，白血病、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、小细胞肺肿瘤、原发性脑肿瘤、胃癌、结肠癌、恶性胰腺胰岛瘤、恶性类癌、膀胱癌、癌前皮肤病变、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、乳头状甲状腺癌、成神经细胞瘤、神经内分泌癌、食道癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、宫颈癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、前列腺癌、苗勒氏癌、卵巢癌、腹膜癌、输卵管癌或子宫浆液性乳头状癌。
适合于根据本发明的方法治疗的癌症和/或肿瘤包括可通过直接肿瘤内和/或区域性施用(即，在靶肿瘤区域内施用)可及的那些。例如，用简单注射器注射施用可及的肿瘤易于进行治疗。还适合于治疗的是其中注射需要一些成像和/或引导施用的肿瘤，和/或其中注射可能经由图像引导的经皮注射、或导管/套管直接注射到部位中或内窥镜检查进行的那些肿瘤。
适于治疗的示例性癌症和/或肿瘤包括黑素瘤、乳腺癌(例如TNBC)、头颈癌、肉瘤、CTLC、NHL、基底细胞癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肝细胞癌(HCC)、神经胶质瘤、胃癌和胰腺癌。特别适于治疗的是黑素瘤、乳腺癌(例如TNBC)和头颈癌。
黑素瘤
黑素瘤是最具侵袭性形式的皮肤癌之一。此外，发病率正在增加，并且可用的治疗选择很少。黑素瘤的检测率为全球每年132,000例新病例(在美国每年76,000例新病例)，是美国每年大约10,000例死亡的原因。约25％的患者<40岁。PD-1抑制剂(例如，纳武单抗、派姆单抗)目前是护理标准并且证明持久应答率为37％，并且2年无进展存活率为30％。然而，还观察到无反应者的快速进展(中值为4个月)，并且在3年时仅观察到40％的总体存活率，没有平稳期的证据，即治疗的患者继续消退。
因此，在这种情况下明显需要新的、更有效的治疗方法。黑素瘤还可充当了解对癌症的免疫性的模型肿瘤。黑素瘤肿瘤相关抗原是被鉴别并分类的首批癌抗原之一，进一步研究表明这些中的许多也由其他肿瘤类型表达。此外，黑素瘤消退一直与白癜风相关，明显证实了免疫系统在这类癌症中的积极作用，并且在一些病例中也观察到原发性黑素瘤的自发消退。这些观察结果(与黑素瘤中的免疫系统的活动有关)提供了强有力的证据证明这种肿瘤应该适合于免疫疗法。在这种背景下，黑素瘤一直处于免疫肿瘤学研究的最前沿，并且可能继续被用作模型肿瘤，以增加对免疫肿瘤学的了解并为其他类型的免疫疗法反应性癌症提供治疗选择。
三阴性乳腺癌
乳腺癌展示需要不同类型的治疗的不同特征。大多数乳腺癌是激素受体阳性，这意味着癌细胞被刺激从暴露于雌性激素雌激素和/或黄体酮中生长。其他乳腺癌被称为HER2阳性，这意味着它们过表达人表皮生长因子受体2(一种参与细胞复制和生长的生物途径)。HER2阳性乳腺癌占乳腺癌的大约25％，并且用靶向受体的剂治疗以减缓生长和复制。未被刺激从暴露于雌激素或黄体酮生长并且为HER2阴性的乳腺癌被称为三阴性乳腺癌。与其他乳腺癌相比，三阴性乳腺癌往往比其他乳腺癌更具侵袭性并且治疗选择更少。虽然乳腺癌历来被认为是免疫沉默，但一些临床前和临床研究表明，免疫疗法具有改善乳腺癌患者的临床结果的潜力。总体而言，免疫疗法具有相对于针对肿瘤本身的常规化学治疗和靶向治疗的若干关键优势。首先，免疫疗法通常导致较少的副作用，从而使其能够施用更长的时间段和/或与其他剂组合施用而无添加毒性。由于免疫系统能够同时靶向多种癌症抗原并适应不断变化的癌细胞，患者也可能不太可能发展对免疫疗法的抗性。
头颈癌
头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)通过各种机制诱导免疫遏制状态。与健康对照相比，患有HNSCC的患者具有改变的淋巴细胞稳态(主要是降低的CD3+、CD4+和CD8+T细胞水平)。这种不平衡甚至在根治性目的治疗后仍然保持2年。一致地，较高数量的肿瘤浸润性CD4+和CD8+淋巴细胞与HNSCC患者中更好的总体存活相关。另外，HNSCC患者的自然杀伤细胞(NK)功能受损。
HNSCC细胞应用某些策略来逃避免疫监视和随后的消除。例如，它们与免疫系统间接相互作用以维持免疫抑制微环境。实质上，HNSCC利用以下事实：免疫系统通过免疫检查点严格调控以避免自身免疫性或在生理环境下的免疫系统过度活化。
肿瘤定向的免疫疗法
免疫肿瘤学领域的重要目标是提高反应率并增加对免疫疗法有反应的肿瘤适应症的数量，而不增加不良副作用。实现这些目标的一种方法是使用肿瘤定向的免疫疗法，即使免疫活化集中于免疫系统的最相关部分。这可提高抗肿瘤功效以及减少免疫相关的不良事件。肿瘤定向的免疫活化可通过将免疫调节剂直接局部注射到肿瘤或肿瘤区域中来实现。疗法集中于靶向检查点抑制剂并且共刺激受体可通过局部免疫活化而产生肿瘤特异性T细胞应答。
肿瘤微环境的调节
在某些实施方案中，本发明的组合物(例如，双联体或三联体mRNA组合物)可用于调节肿瘤微环境和/或可基于待治疗的受试者中的肿瘤微环境而被选择用于治疗。在一个实施方案中，本发明的组合物用于治疗具有发炎的肿瘤微环境的肿瘤。在另一个实施方案中，本发明的组合物用于治疗具有免疫抑制性肿瘤微环境的肿瘤。在另一个实施方案中，本发明的组合物用于治疗具有免疫性贫瘠肿瘤微环境的肿瘤。在肿瘤具有发炎的肿瘤微环境的情况下，即肿瘤微环境已经表现出免疫和/或炎性细胞的浸润，用双联体mRNA疗法进行治疗可能是足够的，而不是用三联体mRNA疗法进行治疗(参见例如，实施例23，图45A-45B)。例如，对于具有发炎的肿瘤微环境的肿瘤的治疗，在一个实施方案中，用编码IL-12家族成员(例如IL-23)的多核苷酸和编码免疫应答共刺激信号(例如，OX40L)的多核苷酸治疗所述肿瘤。
V.组合疗法
在某些实施方案中，本文公开的治疗方法包括施用编码包含IL-23多肽的第一蛋白质的第一多核苷酸、编码IL-36-γ多肽或IL-18多肽的第二多核苷酸和/或编码包含OX40L多肽的第三蛋白质的第三多核苷酸，并且还包括向受试者施用一种或多种抗癌剂。在某些实施方案中，本文公开的治疗方法包括施用编码包含IL-23多肽的第一蛋白质的第一多核苷酸、编码IL-36-γ多肽或IL-18多肽的第二多核苷酸、编码OX40L多肽的第三多核苷酸，并且还包括向受试者施用一种或多种抗癌剂。
在一些实施方案中，一种或多种抗癌剂是mRNA。在某些实施方案中，一种或多种抗癌剂是编码肿瘤抗原的mRNA。在其他实施方案中，一种或多种抗癌剂不是肿瘤抗原或编码肿瘤抗原的mRNA。在一些实施方案中，一种或多种抗癌剂是美国食品和药品管理局批准的剂。在其他实施方案中，一种或多种抗癌剂是美国食品和药品管理局预先批准的剂。
在一些方面，本发明方法或组合物的受试者已用一种或多种标准护理疗法治疗。在其他方面，本发明方法或组合物的受试者未对一种或多种标准护理疗法或抗癌疗法产生反应。
近年来，用于治疗目的的免疫检查点抑制剂的引入已经彻底改变了癌症治疗。令人感兴趣的是以检查点抑制剂与其他共刺激或抑制分子的组合为特征的疗法。
T细胞调控，即活化或抑制是经由共刺激或共抑制信号介导的。这种相互作用经由配体/受体相互作用发挥作用。T细胞含有大量活化受体(如OX40)和抑制性受体(即免疫检查点)，如程序性死亡受体1(PD-1)或细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)(Mellman等人2011Nature.；480:480–489)。这种免疫检查点的活化导致T细胞失活，并且肿瘤细胞对这些途径的征用促成其成功的免疫逃逸。
靶向程序性死亡受体1/程序性死亡配体1(PD-1/PD-L1)与PD-L2之间的相互作用的免疫检查点抑制剂，如派姆单抗或纳武单抗最近已被批准用于治疗各种恶性肿瘤并且目前正在临床试验中针对包括黑素瘤、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)的癌症进行研究。可从这些试验获得的数据表明在这些患者群体中伴有有利安全性和毒性概况的实质活性。
例如，已经在用于治疗黑素瘤的临床试验中对检查点抑制剂进行了测试。特别地，III期临床试验已经揭示，分别靶向CTLA4和PD-1免疫检查点的诸如伊匹单抗和派姆单抗的疗法已使黑素瘤患者的三年存活率提高至约70％，并使总体存活率(>5年)提高至约30％。
同样地，已经在用于治疗头颈癌的临床试验中对检查点抑制剂进行了测试。在临床前研究中，已经显示45％-80％的HNSCC肿瘤表达程序性死亡配体1(PD-L1)(Zandberg等人(2014)OralOncol.50:627–632)。目前，存在许多评估免疫检查点抑制剂作为HNSCC中的单一疗法或组合方案的功效和安全性的临床试验。例如，正在HNSCC中测试PD1、PD-L1和CTLA-4抑制剂的临床试验。PD-1抗体派姆单抗可在转移性/复发性(R/M)HNSCC患者中有效的数据在1b期Keynote-012I/II期试验中产生(Cheng.ASCO 2015，口头报告)。最近，提交了随机化CheckMate-141III期临床试验的数据(Gillison.AACR 2016，口头报告)。此研究调查了在铂难治性R/MHNSCC患者中每2周给予单克隆PD 1抗体纳武单抗的功效。由于所述研究的纳武单抗臂的优异性，所述研究提前终止。
在一个方面，在本公开的多核苷酸之前，先前已经用PD-1拮抗剂治疗了受试者。在另一方面，在本公开的多核苷酸之前，已经用结合至PD-1的单克隆抗体治疗了受试者。在另一方面，在本发明方法或组合物的多核苷酸之前，已经用抗PD-1单克隆抗体疗法治疗了受试者。在其他方面，抗PD-1单克隆抗体疗法包括纳武单抗、派姆单抗、匹地利珠单抗或其任何组合。在另一方面，在本公开的多核苷酸之前，已经用结合至PD-L1的单克隆抗体治疗了受试者。在另一方面，在本发明方法或组合物的多核苷酸之前，已经用抗PD-L1单克隆抗体疗法治疗了受试者。在其他方面，抗PD-L1单克隆抗体疗法包括德瓦鲁单抗、阿维鲁单抗、MEDI473、BMS-936559、阿特珠单抗或其任何组合。
在一些方面，在用本公开的组合物治疗之前，已经用CTLA-4拮抗剂治疗了受试者。在另一方面，在本公开的组合物之前，先前已经用结合至CTLA-4的单克隆抗体治疗了受试者。在另一方面，在本公开的多核苷酸之前，已经用抗CTLA-4单克隆抗体治疗了受试者。在其他方面，抗CTLA-4抗体疗法包括伊匹单抗或曲美木单抗。
在一些方面，本公开涉及在有需要的受试者中治疗癌症的方法和/或免疫疗法的方法，所述方法包括向所述受试者施用(例如，肿瘤内、腹膜内或静脉内)分别编码IL-23多肽、或IL-36γ多肽、IL-18多肽和OX40L多肽的第一、第二和/或第三多核苷酸(例如，RNA，例如，mRNA)，与PD-1拮抗剂(例如特异性地结合至PD-1的抗体或其抗原结合部分，例如抗PD-1单克隆抗体)组合。
在一个实施方案中，可用于本公开的抗PD-1抗体(或其抗原结合部分)是派姆单抗。派姆单抗(也称为兰布罗利珠单抗和MK-3475)是针对人细胞表面受体PD-1(程序性死亡-1或程序性细胞死亡-1)的人源化单克隆IgG4抗体。派姆单抗描述于，例如，美国专利号8,900,587中；还参见http://www.cancer.gov/drugdictionary？cdrid＝695789(最后访问：2014年12月14日)。派姆单抗已获FDA批准用于治疗复发性或难治性黑素瘤和晚期NSCLC。
在另一个实施方案中，可用于本公开的抗PD-1抗体是纳武单抗。纳武单抗(也称为以前称为5C4、BMS-936558、MDX-1106或ONO-4538)是完全人IgG4(S228P)PD-1免疫检查点抑制剂抗体，其可选择性地阻止与PD-1配体(PD-L1和PD-L2)的相互作用，从而阻断抗肿瘤T细胞功能的下调(美国专利号8,008,449；Wang等人,2014Cancer ImmunolRes.2(9):846-56)。纳武单抗已经在多种晚期实体瘤中表现出活性，包括肾细胞癌(肾腺癌或肾上腺瘤)、黑素瘤和非小细胞肺癌(NSCLC)(Topalian等人,2012a；Topalian等人,2014；Drake等人,2013；WO 2013/173223。
在其他实施方案中，抗PD-1抗体是MEDI0680(以前称为AMP-514)，其是针对PD-1受体的单克隆抗体。MEDI0680描述于例如美国专利号8,609,089B2或http://www.cancer.gov/drugdictionary？cdrid＝756047(最后访问于2014年12月14日)中。
在某些实施方案中，抗PD-1抗体是BGB-A317，其是人源化单克隆抗体。BGB-A317描述于美国公布号2015/0079109中。
在某些实施方案中，PD-1拮抗剂是AMP-224，其是B7-DC Fc融合蛋白。AMP-224论述于美国公布号2013/0017199或http://www.cancer.gov/publications/dictionaries/cancer-drug？cdrid＝700595(最后访问于2015年7月8日)中。
在其他实施方案中，本公开包括在有需要的受试者中治疗癌症的方法和/或免疫疗法的方法，所述方法包括向受试者施用(例如，肿瘤内、腹膜内或静脉内)分别编码IL-23多肽、或IL-36γ多肽、IL-18多肽和OX40L多肽的第一、第二和/或第三多核苷酸(例如，RNA，例如mRNA)，以及特异性地结合至PD-1的抗体或其抗原结合部分，例如抗PD-1单克隆抗体，例如抗PD-1单克隆抗体包括纳武单抗、派姆单抗、匹地利珠单抗或其任何组合。
在一些方面，本公开涉及在有需要的受试者中治疗癌症的方法和/或免疫疗法的方法，所述方法包括向所述受试者施用(例如，肿瘤内、腹膜内或静脉内)分别编码IL-23多肽、或IL-36γ多肽、IL-18多肽和OX40L多肽的第一、第二和/或第三多核苷酸(例如，RNA，例如，mRNA)，与PD-L1拮抗剂组合，所述PD-L1拮抗剂例如是特异性地结合至PD-L1的抗体或其抗原结合部分，例如抗PD-L1单克隆抗体，例如抗PD-L1单克隆抗体包括德瓦鲁单抗、阿维鲁单抗、MEDI473、BMS-936559、阿特珠单抗或其任何组合。
在某些实施方案中，可用于本公开的抗PD-L1抗体是MSB0010718C(也称为阿维鲁单抗；参见US 2014/0341917)或BMS-936559(以前称为12A4或MDX-1105)(参见例如，美国专利号7,943,743；WO 2013/173223)。在其他实施方案中，抗PD-L1抗体是MPDL3280A(也称为RG7446)(参见例如，Herbst等人(2013)J Clin Oncol 31(suppl):3000.摘要；美国专利号8,217,149)、MEDI4736(也称为德瓦鲁单抗；Khleif(2013)于：2013年欧洲癌症大会的会议记录中；2013年9月27日-10月1日；荷兰阿姆斯特丹。
在其他方面，本公开涉及在有需要的受试者中治疗癌症的方法和/或免疫疗法的方法，所述方法包括向所述受试者施用(例如，肿瘤内、腹膜内或静脉内)分别编码IL-23多肽、或IL-36γ多肽、IL-18多肽和OX40L多肽的第一、第二和/或第三多核苷酸(例如，RNA，例如，mRNA)，与CTLA-4拮抗剂组合，所述CTLA-4拮抗剂例如是特异性地结合至CTLA-4的抗体或其抗原结合部分，例如抗CTLA-4单克隆抗体，例如抗CTLA-4单克隆抗体包括伊匹单抗或曲美木单抗或其任何组合。
示例性临床抗CTLA-4抗体是人mAb 10D1(现在称为伊匹单抗并以销售)，如美国专利号6,984,720中所公开。可用于本发明方法的另一种抗CTLA-4抗体是曲美木单抗(也称为CP-675,206)。曲美木单抗是人IgG2单克隆抗CTLA-4抗体。曲美木单抗描述于WO/2012/122444、美国公布号2012/263677或WO公布号2007/113648A2中。
在一个实施方案中，编码包含IL-23多肽的第一蛋白质的第一多核苷酸、编码包含IL-36γ多肽或IL-18多肽的第二蛋白质的第二多核苷酸和编码包含OX40L多肽的第三蛋白质的第三多肽与特异性地结合至CTLA-4的抗体或其抗原结合部分、特异性地结合至PD-1受体的抗体或其抗原结合部分、特异性地结合至PD-L1受体的抗体或其抗原结合部分、编码其的多核苷酸或其任何组合一起施用。
在一个实施方案中，编码包含IL-23多肽的第一蛋白质的第一多核苷酸、编码包含IL-36γ多肽或IL-18多肽的第二蛋白质的第二多核苷酸和编码包含OX40L多肽的第三蛋白质的第三多肽与特异性地结合至PD-1或PD-L1受体的抗体或其抗原结合部分或编码其的多核苷酸组合施用。
在另一个实施方案中，编码包含IL-23多肽的第一蛋白质的第一多核苷酸、编码包含IL-36γ多肽或IL-18多肽的第二蛋白质的第二多核苷酸和编码包含OX40L多肽的第三蛋白质的第三多肽与特异性地结合至CTLA-4的抗体或其抗原结合部分或编码其的多核苷酸组合施用。
在另一个实施方案中，编码包含IL-23多肽的第一蛋白质的第一多核苷酸、编码包含IL-36γ多肽或IL-18多肽的第二蛋白质的第二多核苷酸和编码包含OX40L多肽的第三蛋白质的第三多肽与特异性地结合至PD-1或PD-L1受体的抗体或其抗原结合部分以及特异性地结合至CTLA-4的抗体或其抗原结合部分(或其多核苷酸)组合施用。
VI.编码免疫调节多肽的序列优化的多核苷酸序列
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含编码本文公开的多肽(例如IL-23(IL-23的至少一个亚基或包含IL-23的两个亚基的融合蛋白)、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L)的序列优化的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含编码IL-23多肽的开放阅读框(ORF)，其中所述ORF已进行序列优化(例如，SEQ ID NO:141)。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含编码IL-36-γ多肽或IL-18多肽的开放阅读框(ORF)，其中所述ORF已进行序列优化(例如，SEQ ID NO:143)。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含编码OX40L多肽的开放阅读框(ORF)，其中所述ORF已进行序列优化(例如，SEQ ID NO:145)。
在一些实施方案中，序列优化的IL-23、IL-36-γ或IL-18多肽和/或OX40L序列、片段及其变体用于实施本文公开的方法。在一些实施方案中，序列优化的IL-23、IL-36-γ或IL-18多肽和/或OX40L片段及其变体与它们各自的野生型序列组合或替代它们各自的野生型序列(在表1和1A中示出)。
本文公开的序列优化的核苷酸序列不同于相应的野生型核苷酸序列和其他已知的序列优化的核苷酸序列，例如，这些序列优化的核酸具有独特的组成特征。
在一些实施方案中，序列优化的核苷酸序列(例如，编码IL-23、IL-36-γ或IL-18多肽和/或OX40L多肽、其功能性片段或变体)中的尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基的百分比相对于参考野生型核苷酸序列中的尿嘧啶或胸腺嘧啶核碱基的百分比被改变(例如，降低)。这种序列被称为尿嘧啶修饰的或胸腺嘧啶修饰的序列。核苷酸序列中的尿嘧啶或胸腺嘧啶含量的百分比可通过将序列中的尿嘧啶或胸腺嘧啶的数量除以核苷酸的总数并乘以100来确定。在一些实施方案中，序列优化的核苷酸序列具有比参考野生型序列中的尿嘧啶或胸腺嘧啶含量更低的尿嘧啶或胸腺嘧啶含量。在一些实施方案中，本公开的序列优化的核苷酸序列中的尿嘧啶或胸腺嘧啶含量大于参考野生型序列中的尿嘧啶或胸腺嘧啶含量，并且仍然保持有益作用，例如当与参考野生型序列相比时表达和/或信号传导应答增加。
在一些实施方案中，本公开的优化的序列在序列中含有独特范围的尿嘧啶或胸腺嘧啶(如果是DNA)。优化的序列的尿嘧啶或胸腺嘧啶含量可以各种方式表达，例如相对于理论最小值(％UTM或％TTM)、相对于野生型(％UWT或％TWT)和相对于总核苷酸含量(％UTL或％TTL)的优化的序列的尿嘧啶或胸腺嘧啶含量。对于DNA，认识到胸腺嘧啶代替尿嘧啶存在，并且将在出现U的情况下取代T。因此，所有涉及例如关于RNA的％UTM、％UWT或％UTL的公开内容同样适用于关于DNA的％TTM、％TWT或％TTL。
相对于尿嘧啶或胸腺嘧啶理论最小值的尿嘧啶或胸腺嘧啶含量是指通过将序列优化的核苷酸序列中的尿嘧啶或胸腺嘧啶的数量除以假定核苷酸序列(其中所述假定序列中的所有密码子被具有最低可能的尿嘧啶或胸腺嘧啶含量的同义密码子置换)中的尿嘧啶或胸腺嘧啶的总数并乘以100而确定的参数。此参数在本文中缩写为％UTM或％TTM。
编码本公开的IL-23、IL-36-γ和/或OX40L多肽的尿嘧啶或胸腺嘧啶修饰的序列也可根据其相对于相应野生型核酸序列中的尿嘧啶或胸腺嘧啶含量的尿嘧啶或胸腺嘧啶含量(％UWT或％TWT)来描述。短语“相对于野生型核酸序列中的尿嘧啶或胸腺嘧啶含量的尿嘧啶或胸腺嘧啶含量”是指通过将序列优化的核酸中的尿嘧啶或胸腺嘧啶的数量除以相应野生型核酸序列中的尿嘧啶或胸腺嘧啶的总数并乘以100而确定的参数。此参数在本文中缩写为％UWT或％TWT。
在一些实施方案中，编码本公开的IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的尿嘧啶修饰的序列相对于相应野生型核酸序列具有减少数量的连续尿嘧啶。例如，两个连续亮氨酸可由序列CUUUUG编码，其包括四个尿嘧啶簇。这种子序列可例如用CUGCUC取代，其除去了尿嘧啶簇。苯丙氨酸可由UUC或UUU编码。因此，即使由UUU编码的苯丙氨酸被UUC置换，同义密码子仍含有尿嘧啶对(UU)。因此，序列中苯丙氨酸的数量建立了最小数量的尿嘧啶对(UU)，其在不改变编码的多肽中的苯丙氨酸的数量的情况下不能被消除。
在一些实施方案中，编码本公开的IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的尿嘧啶修饰的序列相对于野生型核酸序列具有减少数量的尿嘧啶三联体(UUU)。在一些实施方案中，编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的尿嘧啶修饰的序列相对于野生型核酸序列中的尿嘧啶对(UU)的数量具有减少数量的尿嘧啶对(UU)。在一些实施方案中，编码本公开的IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的尿嘧啶修饰的序列具有对应于野生型核酸序列中的最小可能数量的尿嘧啶对(UU)的数量的尿嘧啶对(UU)。
短语“相对于野生型核酸序列中的尿嘧啶对(UU)的尿嘧啶对(UU)”是指通过将序列优化的核苷酸序列中的尿嘧啶对(UU)的数量除以相应野生型核苷酸序列中的尿嘧啶对(UU)的总数并乘以100而确定的参数。此参数在本文中缩写为％UUwt。在一些实施方案中，编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的尿嘧啶修饰的序列具有低于100％之间的％UUwt。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含编码本文公开的IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的尿嘧啶修饰的序列。在一些实施方案中，编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的尿嘧啶修饰的序列包含至少一个化学修饰的核碱基，例如5-甲氧基尿嘧啶。在一些实施方案中，编码本公开的IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的尿嘧啶修饰的序列中的至少95％的核碱基(例如，尿嘧啶)是修饰的核碱基。在一些实施方案中，编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的尿嘧啶修饰的序列中至少95％的尿嘧啶是5-甲氧基尿嘧啶。在一些实施方案中，包含尿嘧啶修饰的序列的多核苷酸还包含miRNA结合位点，例如结合至miR-122的miRNA结合位点。在一些实施方案中，包含尿嘧啶修饰的序列的多核苷酸与递送剂一起配制，所述递送剂例如是具有式(I)的化合物，例如化合物1-147中的任一者或化合物1-232中的任一者。
VII.用于序列优化的方法
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸(例如，包含编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽(例如，野生型序列、功能性片段或其变体)的核苷酸序列的多核苷酸)是序列优化的。
序列优化的核苷酸序列(核苷酸序列在本文中也称为“核酸”)包含相对于参考序列(例如，编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的野生型序列)的至少一个密码子修饰。因此，在序列优化的核酸中，至少一个密码子不同于参考序列(例如，野生型序列)中的相应密码子。
一般来说，序列优化的核酸通过至少一个步骤产生，所述步骤包括用同义密码子(即编码相同氨基酸的密码子)取代参考序列中的密码子。可例如通过应用密码子取代图谱(即，提供将编码密码子优化的序列中的每个氨基酸的密码子的表)或通过应用一组规则(例如，如果甘氨酸紧邻中性氨基酸，则甘氨酸将由某个密码子编码，但如果它紧邻极性氨基酸，则它将由另一个密码子编码)来实现这种取代。除密码子取代(即“密码子优化”)之外，本文公开的序列优化方法还包括额外的优化步骤，所述步骤不严格针对密码子优化，如除去有害基序(去稳定化基序取代)。包含这些序列优化的核酸(例如，RNA，例如mRNA)的组合物和制剂可施用于有需要的受试者，以促进功能活性IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的体内表达。
大分子在细胞培养物中的重组表达可能是具有许多限制(例如，蛋白质表达水平差，翻译停滞产生截短的表达产物，蛋白质错误折叠等)的具有挑战性的任务。这些限制可通过向患有癌症的患者施用编码功能活性IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的多核苷酸(例如，RNA，例如mRNA)或包含所述多核苷酸的组合物或制剂来减少或避免，因此内源性地发生IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的合成和递送以用于治疗癌症。
从体外表达系统(例如，细胞培养物)变为体内表达需要重新设计编码治疗剂的核酸序列。通过选择不同密码子而不必改变编码的氨基酸序列来重新设计天然存在的基因序列通常可产生蛋白质表达水平的显著增加(Gustafsson等人,2004,Journal/TrendsBiotechnol 22,346-53)。诸如密码子适应指数(CAI)、mRNA二级结构、顺式调控序列、GC含量的变量和许多其他类似变量已显示与蛋白质表达水平有些相关(Villalobos等人,2006,"Journal/BMC Bioinformatics 7,285)。但是，由于遗传密码的简并性，存在可编码相同治疗剂的许多不同的核酸序列。每个氨基酸由最多六个同义密码子编码；并且这些密码子之间的选择影响基因表达。另外，密码子使用(即，不同生物使用密码子以用于表达多肽序列的频率)在生物体之间不同(例如，人或人源化治疗性抗体的重组产生在仓鼠细胞培养物中频繁发生)。
在一些实施方案中，可通过应用密码子图谱对参考核酸序列进行序列优化。熟练的技术人员将理解，下文公开的密码子图谱中的T碱基存在于DNA中，而T碱基将被相应RNA中的U碱基置换。例如，本文公开的呈DNA形式的序列优化的核酸(例如载体或体外翻译(IVT)模板)的T碱基将在其相应的转录mRNA中转录为U碱基。在此方面，序列优化的DNA序列(包含T)及其相应的RNA序列(包含U)两者均被认为是本公开的序列优化的核酸。熟练的技术人员还将理解，可通过用非天然碱基置换一个或多个碱基来产生等效密码子图谱。因此，例如，TTC密码子(DNA图谱)将对应于UUC密码子(RNA图谱)，其进而可对应于ΨΨC密码子(其中U已被假尿苷置换的RNA图谱)。
在一个实施方案中，编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的参考序列可通过用在密码子图谱中提供的替代密码子中的仅一个置换编码某种氨基酸的所有密码子来进行优化。例如，优化的序列中的所有缬氨酸将由GTG或GTC或GTT编码。
可使用一种或多种密码子优化方法或其组合来产生本公开的序列优化的多核苷酸。本文详细描述了可用于序列优化核酸序列的序列优化方法。这种方法列表并不全面或具有限制性。
应理解，针对下文论述的序列优化方法中的每种描述的设计原理和规则可以许多不同的方式组合，例如对于参考核酸序列的一些区域高G/C含量序列优化或者对于参考核酸序列的其他区域尿苷含量序列优化，以及靶向核苷酸突变以使整个序列中的二级结构最小化或消除有害基序。
序列优化方法的潜在组合的选择可例如取决于用于产生合成多核苷酸的特定化学。这种选择还可取决于由序列优化的核酸编码的蛋白质的特征，例如包含IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的完整序列、功能性片段或融合蛋白等。在一些实施方案中，这种选择可取决于由序列优化的核酸(例如，治疗性合成mRNA)靶向的特定组织或细胞。
组合从优化方法的应用和分析得到的序列优化方法或设计规则的机制可以是简单的或复杂的。例如，组合可以是：
(i)顺序：每种序列优化方法或一组设计规则应用于整个序列的不同子序列，例如在密码子位置1至30处减少尿苷且然后为序列的其余部分选择高频密码子；
(ii)分层：若干序列优化方法或多组设计规则以分层的确定性方式组合。例如，使用最富含GC的密码子，通过选择那些密码子中最频繁的来破坏结系(其是常见的)。
(iii)多因素/多参数：机器学习或其他建模技术用于设计最能满足多个重叠且可能相互矛盾的要求的单个序列。这种方法将需要使用应用许多数学技术(例如遗传算法)的计算机。
最终，这些方法中的每一种都可产生一组特定的规则，所述规则在许多情况下可总结在单个密码子表中，即，靶蛋白(即，IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽)中每个氨基酸的密码子的分类列表，具有指示如何为每个氨基酸位置选择特定密码子的特定规则或一组规则。
a尿苷含量优化
核酸序列中局部高浓度尿苷的存在可对翻译产生不利影响，例如减缓或过早终止翻译，尤其是当修饰的尿苷类似物用于合成mRNA的产生时。此外，高尿苷含量还可由于TLR活化而降低合成mRNA的体内半衰期。
因此，可使用包含至少一个尿苷含量优化步骤的方法对核酸序列进行序列优化。这种步骤包括，例如，用替代密码子取代参考核酸中的至少一个密码子以产生尿苷修饰的序列，其中所述尿苷修饰的序列具有以下性质中的至少一种：
(i)总体尿苷含量增加或减少；
(ii)局部尿苷含量增加或减少(即，尿苷含量的变化限于特定子序列)；
(iii)尿苷分布的变化而不改变总体尿苷含量；
(iv)尿苷簇集的变化(例如，簇的数量、簇的位置或簇之间的距离)；或
(v)其组合。
在一些实施方案中，序列优化过程包括优化总体尿苷含量，即相对于参考核酸序列中的尿苷核碱基的百分比，优化序列优化的核酸中的尿苷核碱基的百分比。例如，30％的核碱基可以是参考序列中的尿嘧啶，并且10％的核碱基可以是序列优化的核酸中的尿嘧啶。
在其他实施方案中，序列优化过程包括降低参考核酸序列的特定区域中的局部尿苷含量，即，相对于参考核酸序列的相应子序列中的尿苷核碱基的百分比，降低序列优化的核酸的子序列中的尿苷核碱基的百分比。例如，参考核酸序列可具有局部尿苷含量为30％的5'-端区域(例如，30个密码子)，并且在序列优化的核酸中所述相同区域中的尿苷含量可降低至10％。
在具体实施方案中，可在参考核酸序列中置换密码子以减少或修饰例如可能对蛋白质翻译具有有害影响的尿苷簇的数量、大小、位置或分布。尽管通常希望降低参考核酸序列的尿苷含量，但在某些实施方案中，可增加参考核酸序列的一些子序列的尿苷含量，并且特别是局部尿苷含量。
降低尿苷含量以避免对翻译的不利影响可与在此公开的其他优化方法组合进行以实现其他设计目标。例如，尿苷含量优化可与斜坡设计组合，因为除了少数例外，使用大多数氨基酸的最稀有密码子将降低U含量。
在一些实施方案中，设计尿苷修饰的序列以在与参考核酸序列比较时诱导更低的Toll样受体(TLR)应答。若干TLR识别并响应于核酸。双链(ds)RNA(一种常见的病毒组分)已显示活化TLR3。参见Alexopoulou等人(2001)Nature,413:732–738和Wang等人(2004)Nat.Med.,10:1366–1373。单链(ss)RNA活化TLR7。参见Diebold等人(2004)Science 303:1529–1531。RNA寡核苷酸(例如具有硫代磷酸酯核苷酸间键联的RNA)是人TLR8的配体。参见Heil等人(2004)Science 303:1526–1529。含有未甲基化CpG基序(其是细菌和病毒DNA的特征)的DNA活化TLR9。参见Hemmi等人(2000)Nature,408:740–745。
如本文所用，术语“TLR应答”被定义为TLR7受体对单链RNA的识别，并且在一些实施方案中涵盖由受体识别单链RNA引起的RNA降解和/或生理应答。用于确定和定量RNA与TLR7的结合的方法是本领域中已知的。类似地，用于确定RNA是否已经触发TLR7介导的生理应答(例如，细胞因子分泌)的方法是本领域中熟知的。在一些实施方案中，TLR应答可由TLR3、TLR8或TLR9而不是TLR7介导。
TLR7介导的应答的抑制可经由核苷修饰来实现。RNA在自然界中经历超过一百种不同的核苷修饰(参见RNA修饰数据库，可在mods.rna.albany.edu获得)。例如，人rRNA具有比细菌rRNA多10倍的假尿苷(Ψ)和多25倍的2'-O-甲基化核苷。细菌mRNA不含核苷修饰，而哺乳动物mRNA除了N7-甲基鸟苷(m7G)外还具有修饰的核苷，如5-甲基胞苷(m5C)、N6-甲基腺苷(m6A)、肌苷和许多2'-O-甲基化核苷。
尿嘧啶和核糖(其为RNA的两个定义特征)对于TLR7刺激均是必需的和充分的，并且短的单链RNA(ssRNA)以与序列无关的方式充当TLR7激动剂，只要它们在附近含有若干尿嘧啶即可。参见Diebold等人(2006)Eur.J.Immunol.36:3256-3267，所述文献特此以引用的方式整体并入。因此，本文公开的一种或多种优化方法包括降低尿苷含量(局部和/或局部)和/或减少或修饰尿苷簇以减少或遏制TLR7介导的应答。
在一些实施方案中，由尿苷修饰的序列引起的TLR应答(例如，由TLR7介导的应答)比由参考核酸序列引起的TLR应答低至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约100％。
在一些实施方案中，由参考核酸序列引起的TLR应答比由尿苷修饰的序列引起的TLR应答高至少约1倍、至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍或至少约10倍。
在一些实施方案中，尿苷修饰的序列的尿苷含量(平均总体尿苷含量)(绝对或相对)高于参考核酸序列的尿苷含量(绝对或相对)。因此，在一些实施方案中，尿苷修饰的序列含有比参考核酸序列多至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约100％的尿苷。
在其他实施方案中，尿苷修饰的序列的尿苷含量(平均总体尿苷含量)(绝对或相对)低于参考核酸序列的尿苷含量(绝对或相对)。因此，在一些实施方案中，尿苷修饰的序列含有比参考核酸序列少至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约100％的尿苷。
在一些实施方案中，尿苷修饰的序列的尿苷含量(平均总体尿苷含量)(绝对或相对)小于尿苷修饰的序列中的总核碱基的50％、49％、48％、47％、46％、45％、44％、43％、42％、41％、40％、39％、38％、37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。在一些实施方案中，尿苷修饰的序列的尿苷含量介于约10％与约20％之间。在一些特定实施方案中，尿苷修饰的序列的尿苷含量介于约12％与约16％之间。
在一些实施方案中，可使用滑动窗口来测量参考核酸序列的尿苷含量。在一些实施方案中，滑动窗口的长度是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核碱基。在一些实施方案中，滑动窗口的长度超过40个核碱基。在一些实施方案中，滑动窗口的长度是20个核碱基。基于用滑动窗测量的尿苷含量，有可能产生代表参考核酸序列和序列优化的核酸的整个长度的尿苷含量的直方图。
在一些实施方案中，可修饰参考核酸序列以减少或消除所述直方图中高于或低于特定百分比值的峰。在一些实施方案中，可修饰参考核酸序列以消除滑动窗口表示中高于65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％或30％尿苷的峰。在另一个实施方案中，可修饰参考核酸序列，以使得在序列优化的核酸中没有峰超过30％尿苷，如使用20个核碱基的滑动窗口所测量。在一些实施方案中，可修饰参考核酸序列，以使得在序列优化的核酸序列中不超过或不少于预定数量的峰(如使用20个核碱基的滑动窗口所测量)高于或低于特定阈值。例如，在一些实施方案中，可修饰参考核酸序列，以使得序列优化的核酸中没有峰或不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个峰高于10％、15％、20％、25％或30％尿苷。在另一个实施方案中，序列优化的核酸含有介于0个与与2个之间的尿苷含量为30％或更高的峰。
在一些实施方案中，可对参考核酸序列进行序列优化以降低连续尿苷的发生率。例如，两个连续亮氨酸可由序列CUUUUG编码，其将包括四个尿苷簇。这种子序列可用CUGCUC取代，其将有效地除去尿苷簇。因此，可通过减少或消除尿苷对(UU)、尿苷三联体(UUU)或尿苷四联体(UUUU)来对参考核酸序列进行序列优化。U的高阶组合不被认为是低阶组合的组合。因此，例如，UUUU严格地被认为是四联体，而不是两个连续的U对；或者UUUUUU被认为是六联体，而不是三个连续的U对或两个连续的U三联体等。
在一些实施方案中，可从参考核酸序列中除去所有尿苷对(UU)和/或尿苷三联体(UUU)和/或尿苷四联体(UUUU)。在其他实施方案中，尿苷对(UU)和/或尿苷三联体(UUU)和/或尿苷四联体(UUUU)可在序列优化的核酸中降低至特定阈值以下，例如，出现不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次。在特定实施方案中，序列优化的核酸含有少于20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个尿苷对。在另一个特定实施方案中，序列优化的核酸不含尿苷对和/或三联体。
苯丙氨酸密码子(即UUC或UUU)包含尿苷对或三联体，并且因此降低尿苷含量的序列优化最多可使苯丙氨酸U三联体减少至苯丙氨酸U对。在一些实施方案中，尿苷对(UU)和/或尿苷三联体(UUU)的出现仅指非苯丙氨酸U对或三联体。因此，在一些实施方案中，非苯丙氨酸尿苷对(UU)和/或尿苷三联体(UUU)可在序列优化的核酸中降低至特定阈值以下，例如，出现不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次。在特定实施方案中，序列优化的核酸含有少于20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或或1个非苯丙氨酸尿苷对和/或三联体。在另一个特定实施方案中，序列优化的核酸不含非苯丙氨酸尿苷对和/或三联体。
在一些实施方案中，序列优化的核酸中的尿苷组合(例如，对、三联体、四联体)减少可表示为相对于参考核酸序列中存在的尿苷组合的减少百分比。
在一些实施方案中，序列优化的核酸可含有参考核酸序列中存在的尿苷对总数的约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或65％。在一些实施方案中，序列优化的核酸可含有参考核酸序列中存在的尿苷三联体总数的约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或65％。在一些实施方案中，序列优化的核酸可含有参考核酸序列中存在的尿苷四联体总数的约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或65％。
在一些实施方案中，序列优化的核酸可含有参考核酸序列中存在的非苯丙氨酸尿苷对总数的约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或65％。在一些实施方案中，序列优化的核酸可含有参考核酸序列中存在的非苯丙氨酸尿苷三联体总数的约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或65％。
在一些实施方案中，序列优化的序列中的尿苷含量可相对于所述序列中的理论最小尿苷含量表示。术语“理论最小尿苷含量”被定义为作为序列中的所有密码子已被具有最低尿苷含量的同义密码子置换后的序列长度的百分比的核酸序列的尿苷含量。在一些实施方案中，序列优化的核酸的尿苷含量与参考序列(例如，野生型序列)的理论最小尿苷含量相同。在一些方面，序列优化的核酸的尿苷含量是参考序列(例如，野生型序列)的理论最小尿苷含量的约90％、约95％、约100％、约105％、约110％、约115％、约120％、约125％、约130％、约135％、约140％、约145％、约150％、约155％、约160％、约165％、约170％、约175％、约180％、约185％、约190％、约195％或约200％。
在一些实施方案中，序列优化的核酸的尿苷含量与参考序列(例如，野生型序列)的理论最小尿苷含量相同。
参考核酸序列(例如，野生型序列)可包含尿苷簇，所述尿苷簇由于它们的数量、大小、位置、分布或其组合而对翻译具有负面影响。如本文所用，术语“尿苷簇”是指参考核酸序列或序列优化的核酸序列中的子序列，所述子序列含有高于特定阈值的尿苷含量(通常描述为百分比)。因此，在某些实施方案中，如果子序列包含大于约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或65％的尿苷含量，则这种子序列将被视为尿苷簇。
尿苷簇的负面影响可以是，例如，引发TLR7应答。因此，在本文公开的核酸序列优化方法的一些实施方式中，希望减少簇的数量、簇的大小、簇的位置(例如，接近核酸序列的5'和/或3'端)、簇之间的距离或尿苷簇的分布(例如，沿着核酸序列的簇的某种模式，簇相对于表达的产物中的二级结构元件的分布，或簇相对于mRNA的二级结构的分布)。
在一些实施方案中，参考核酸序列包含至少一个尿苷簇，其中所述尿苷簇是参考核酸序列的子序列，其中所述子序列中的总尿苷核碱基的百分比高于预定阈值。在一些实施方案中，所述子序列的长度是至少约10、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约55、至少约60、至少约65、至少约70、至少约75、至少约80、至少约85、至少约90、至少约95或至少约100个核碱基。在一些实施方案中，所述子序列长于100个核碱基。在一些实施方案中，阈值是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或25％尿苷含量。在一些实施方案中，阈值高于25％。
例如，包含A、D、G、S和R的氨基酸序列可由核酸序列GCU、GAU、GGU、AGU、CGU编码。虽然这种序列不含任何尿苷对、三联体或四联体，但三分之一的核碱基是尿苷。可通过使用替代密码子，例如通过使用将不含尿苷的GCC、GAC、GGC、AGC和CGC来除去这种尿苷簇。
在其他实施方案中，参考核酸序列包含至少一个尿苷簇，其中所述尿苷簇是参考核酸序列的子序列，其中如使用滑动窗口测量的所述子序列的尿苷核碱基的百分比高于预定阈值。在一些实施方案中，滑动窗口的长度是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核碱基。在一些实施方案中，滑动窗口的长度超过40个核碱基。在一些实施方案中，阈值是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或25％尿苷含量。在一些实施方案中，阈值高于25％。
在一些实施方案中，参考核酸序列包含至少两个尿苷簇。在一些实施方案中，尿苷修饰的序列含有比参考核酸序列更少的富含尿苷的簇。在一些实施方案中，尿苷修饰的序列含有比参考核酸序列更多的富含尿苷的簇。在一些实施方案中，尿苷修饰的序列含有富含尿苷的簇，所述簇的长度短于参考核酸序列中的相应富含尿苷的簇。在其他实施方案中，尿苷修饰的序列含有富含尿苷的簇，所述簇的长度长于参考核酸序列中的相应富含尿苷的簇。
参见，Kariko等人(2005)Immunity 23:165-175；Kormann等人(2010)NatureBiotechnology 29:154-157；或Sahin等人(2014)Nature Reviews Drug Discovery|AOP,2014年9月19日在线公开m doi:10.1038/nrd4278；其全部以引用的方式整体并入本文。
b.鸟嘌呤/胞嘧啶(G/C)含量
可使用包括改变参考核酸序列的鸟嘌呤/胞嘧啶(G/C)含量(绝对或相对)的方法对参考核酸序列进行序列优化。这种优化可包括改变(例如，增加或减少)参考核酸序列的总体G/C含量(绝对或相对)；引入参考核酸序列中G/C含量的局部变化(例如，增加或减少参考核酸序列中的选定区域或子序列中的G/C)；改变参考核酸序列中的G/C簇的频率、大小和分布，或其组合。
在一些实施方案中，相对于参考核酸序列的G/C含量(绝对或相对)，编码IL-23、IL-36-γ和/或OX40L多肽的序列优化的核酸包含G/C含量(绝对或相对)的总体增加。在一些实施方案中，G/C含量(绝对或相对)的总体增加是相对于参考核酸序列的G/C含量(绝对或相对)至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约100％。
在一些实施方案中，相对于参考核酸序列的G/C含量，编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的序列优化的核酸包含G/C含量(绝对或相对)的总体减少。在一些实施方案中，G/C含量(绝对或相对)的总体减少是相对于参考核酸序列的G/C含量(绝对或相对)至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约100％。
在一些实施方案中，相对于参考核酸序列中相应子序列的G/C含量(绝对或相对)，编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的序列优化的核酸包含子序列(即，G/C修饰的子序列)中鸟嘌呤/胞嘧啶(G/C)含量(绝对或相对)的局部增加。在一些实施方案中，G/C含量(绝对或相对)的局部增加是相对于参考核酸序列中相应子序列的G/C含量(绝对或相对)至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约100％。
在一些实施方案中，相对于参考核酸序列中相应子序列的G/C含量(绝对或相对)，编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的序列优化的核酸包含子序列(即，G/C修饰的子序列)中鸟嘌呤/胞嘧啶(G/C)含量(绝对或相对)的局部减少。在一些实施方案中，G/C含量(绝对或相对)的局部减少是相对于参考核酸序列中相应子序列的G/C含量(绝对或相对)至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约100％。
在一些实施方案中，G/C含量(绝对或相对)在子序列中增加或减少，所述子序列的长度是至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个核碱基。
在一些实施方案中，G/C含量(绝对或相对)在子序列中增加或减少，所述子序列的长度是至少约100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990或1000个核碱基。
在一些实施方案中，G/C含量(绝对或相对)在子序列中增加或减少，所述子序列的长度是至少约1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、5100、5200、5300、5400、5500、5600、5700、5800、5900、6000、6100、6200、6300、6400、6500、6600、6700、6800、6900、7000、7100、7200、7300、7400、7500、7600、7700、7800、7900、8000、8100、8200、8300、8400、8500、8600、8700、8800、8900、9000、9100、9200、9300、9400、9500、9600、9700、9800、9900或10000个核碱基。
本文所述的G和C含量(绝对或相对)的增加或减少可通过用具有较高G/C含量的同义密码子置换具有低G/C含量的同义密码子来进行，或反之亦然。例如，L具有6个同义密码子：其中两个具有2个G/C(CUC、CUG)，3个具有单个G/C(UUG、CUU、CUA)，并且一个没有G/C(UUA)。因此，如果参考核酸在某个位置具有CUC密码子，则可通过用任何具有单个G/C的密码子或没有G/C的密码子置换CUC来减少所述位置的G/C含量。
参见，美国公布号US20140228558、US20050032730A1；Gustafsson等人(2012)Protein Expression and Purification 83:37–46；其全部以引用的方式整体并入本文。
c.密码子频率-密码子使用偏性
本领域已知的许多密码子优化方法是基于用具有更高频率的密码子取代参考核酸序列中的密码子。因此，在一些实施方案中，编码本文公开的IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的核酸序列可相对于非密码子优化的序列中使用的频率，使用包括相对于序列优化的核酸中的其他同义密码子，利用一种或多种密码子的使用频率的修饰的方法来进行序列优化。
如本文所用，术语“密码子频率”是指密码子使用偏性，即编码DNA/RNA中同义密码子的出现频率的差异。普遍认为，密码子偏好性反映了突变偏性与翻译优化的自然选择之间的平衡。最优密码子有助于实现更快的翻译速率和高准确性。由于这些因素，预期翻译选择在高表达的基因中更强。在生物信息学和计算生物学领域，许多统计方法已经提出并用于分析密码子使用偏性。参见例如，Comeron&Aguadé(1998)J.Mol.Evol.47:268–74。诸如'最优密码子的频率'(Fop)(Ikemura(1981)J.Mol.Biol.151(3):389–409)、相对密码子适应(RCA)(Fox&Eril(2010)DNA Res.17(3):185–96)或'密码子适应指数'(CAI)(Sharp&Li(1987)Nucleic Acids Res.15(3):1281–95)的方法用于预测基因表达水平，而来自信息理论的诸如‘有效密码子数’(Nc)和香农熵的方法用于测量密码子使用均匀性。多变量统计方法(如对应分析和主成分分析)被广泛用于分析基因间密码子使用的变化(Suzuki等人(2008)DNA Res.15(6):357–65；Sandhu等人,In Silico Biol.2008；8(2):187-92)。
编码本文公开的IL-23、IL-36-γ和/或OX40L多肽的核酸序列(例如，野生型核酸序列、突变型核酸序列、嵌合核酸序列等，其可例如是mRNA)可使用包括用同义密码子组中具有较高或较低密码子频率的替代密码子取代参考核酸序列中的至少一个密码子的方法进行密码子优化；其中所得序列优化的核酸相对于参考核酸序列具有至少一种优化的性质。
在一些实施方案中，编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的参考核酸序列中至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％的密码子被替代密码子取代，每个替代密码子的密码子频率高于同义密码子组中取代的密码子的密码子频率。
在一些实施方案中，编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的参考核酸序列中的至少一个密码子被密码子频率高于同义密码子组中取代的密码子的密码子频率的替代密码子取代，并且参考核酸序列中的至少一个密码子被密码子频率低于同义密码子组中取代的密码子的密码子频率的替代密码子取代。
在一些实施方案中，编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的参考核酸序列中至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％或至少约75％的密码子被替代密码子取代，每个替代密码子的密码子频率高于同义密码子组中取代的密码子的密码子频率。
在一些实施方案中，具有较高密码子频率的至少一个替代密码子在同义密码子组中具有最高密码子频率。在其他实施方案中，具有较高密码子频率的所有替代密码子在同义密码子组中具有最高密码子频率。
在一些实施方案中，具有较低密码子频率的至少一个替代密码子在同义密码子组中具有最低密码子频率。在一些实施方案中，具有较高密码子频率的所有替代密码子在同义密码子组中具有最高密码子频率。
在一些具体实施方案中，至少一个替代密码子具有同义密码子组中的第二最高、第三最高、第四最高、第五最高或第六最高频率。在一些具体实施方案中，至少一个替代密码子具有同义密码子组中的第二最低、第三最低、第四最低、第五最低或第六最低频率。
基于密码子频率的优化可如上所述总体应用，或局部应用于编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的参考核酸序列。在一些实施方案中，当局部应用时，参考核酸序列的区域可基于密码子频率进行修饰，用其对应同义密码子组中具有较高或较低频率的密码子取代特定子序列中的全部或特定百分比的密码子。因此，在一些实施方案中，参考核酸序列的子序列中至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％的密码子被替代密码子取代，每个替代密码子的密码子频率高于同义密码子组中取代的密码子的密码子频率。
在一些实施方案中，编码IL-23、IL-36-γ和/或OX40L多肽的参考核酸序列的子序列中的至少一个密码子被密码子频率高于同义密码子组中取代的密码子的密码子频率的替代密码子取代，并且参考核酸序列的子序列中的至少一个密码子被密码子频率低于同义密码子组中取代的密码子的密码子频率的替代密码子取代。
在一些实施方案中，编码IL-23和/或IL-36-γ、IL-18多肽的参考核酸序列的子序列中至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％或至少约75％的密码子被替代密码子取代，每个替代密码子的密码子频率高于同义密码子组中取代的密码子的密码子频率。
在一些实施方案中，在编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的参考核酸序列的子序列中取代的并具有较高密码子频率的至少一个替代密码子具有同义密码子组中的最高密码子频率。在其他实施方案中，在参考核酸序列的子序列中取代的并具有较低密码子频率的所有替代密码子在同义密码子组中具有最低密码子频率。
在一些实施方案中，在编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的参考核酸序列的子序列中取代的并具有较低密码子频率的至少一个替代密码子具有同义密码子组中的最低密码子频率。在一些实施方案中，在参考核酸序列的子序列中取代的并具有较高密码子频率的所有替代密码子在同义密码子组中具有最高密码子频率。
在具体实施方案中，编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的序列优化的核酸可包含在特定位置，例如，在序列优化的核酸的5'端或3'端或在距那些区域的预定距离内(例如，距序列优化的核酸的5'端或3'端至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个密码子)总体密码子频率高于或低于参考核酸序列的相应子序列中的总体密码子频率的子序列。
在一些实施方案中，编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的序列优化的核酸可包含总体密码子频率高于或低于参考核酸序列的相应子序列中的总体密码子频率的超过一个子序列。本领域技术人员将理解，具有总体较高或较低总体密码子频率的子序列可以无数模式组构，这取决于总体密码子频率是较高还是较低、子序列的长度、子序列之间的距离、子序列的位置等。
参见美国专利号US5082767、US8126653、US7561973、US8401798；美国公布号US20080046192、US 20080076161；国际公布号WO2000018778；Welch等人(2009)PLoS ONE 4(9):e7002；Gustafsson等人(2012)Protein Expression and Purification 83:37–46；Chung等人(2012)BMC Systems Biology 6:134；其全部以引用的方式整体并入本文。
d.去稳定化基序取代
存在可影响序列优化的多种基序，所述基序属于各种非排他性类别，例如：
(i)基于一级序列的基序：由核苷酸的简单排列定义的基序。
(ii)结构基序：由倾向于形成某种二级结构的核苷酸排列编码的基序。
(iii)局部基序：以一个连续子序列编码的基序。
(iv)分布式基序：以两个或多个不相交的子序列编码的基序。
(v)有利基序：改进核苷酸结构或功能的基序。
(vi)不利基序：对核苷酸结构或功能具有不利影响的基序。
存在归属于不利基序的类别的许多基序。一些实例包括，例如，限制性酶基序，其倾向于相对短的精确序列，如Xba1(TCTAGA)、EcoRI(GAATTC)、EcoRII(CCWGG，其中W是指A或T，根据IUPAC模糊性代码)或HindIII(AAGCTT)的限制性位点基序；酶位点，其倾向于更长且基于共有而不是精确序列，如T7RNA聚合酶中(GnnnnWnCRnCTCnCnnWnD，其中n是指任何核苷酸，R是指A或G，W是指A或T，D是指A或G或T、但不是C)；结构基序，如GGGG重复序列(Kim等人(1991)Nature 351(6324):331-2)；或其他基序，如CUG-三联体重复序列(Querido等人(2014)J.Cell Sci.124:1703-1714)。
因此，可使用包括取代参考核酸中的至少一个去稳定化基序并除去这种不利基序或用有利基序置换它的方法对编码本文公开的IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的核酸序列进行序列优化。
在一些实施方案中，优化过程包括鉴别参考核酸序列中的有利和/或不利基序，其中此类基序是例如可在优化过程之前或期间引起参考核酸序列的稳定性丧失的特定子序列。例如，在优化期间取代特定碱基可产生由限制酶识别的子序列(基序)。因此，在优化过程中，可通过将序列优化序列与已知不利的基序文库进行比较来监测不利基序的出现。然后，不利基序的鉴别可用作事后过滤器，即，以确定是否应该实际实施潜在可能在参考核酸序列中引入的某种修饰。
在一些实施方案中，可在应用本文公开的序列优化方法之前使用不利基序的鉴别，即编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的参考核酸序列中的基序的鉴别及其用替代核酸序列置换可用作例如尿苷减少之前的预处理步骤。
在其他实施方案中，不利基序的鉴别及其除去被用作整合在多参数核酸优化方法中的另外序列优化技术，所述多参数核酸优化方法包括两种或更多种本文公开的序列优化方法。当以这种方式使用时，在优化过程期间鉴别的不利基序将被除去，例如，通过取代最低可能数量的核碱基以尽可能接近地保留原始设计原理(例如，低U，高频率等)。
参见，例如，美国公布号US20140228558、US20050032730或US20140228558，其以引用的方式整体并入本文。
e.有限密码子组优化
在一些特定实施方案中，编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的参考核酸序列的序列优化可使用有限密码子组进行，例如其中少于天然数量的密码子用于编码20种天然氨基酸、20种天然氨基酸的子集或氨基酸的扩展集(包括例如非天然氨基酸)的密码子组。
遗传密码在所有生物体中高度相似，并且可在具有64个条目的简单表格中表示，所述遗传密码将编码参与蛋白质翻译的20种标准氨基酸加起始和终止密码子。遗传密码是简并的，即通常，超过一个密码子指定每个氨基酸。例如，氨基酸亮氨酸由UUA、UUG、CUU、CUC、CUA或CUG密码子指定，而氨基酸丝氨酸由UCA、UCG、UCC、UCU、AGU或AGC密码子指定(差异在第一、第二或第三位置中)。天然遗传密码包含编码天然存在的氨基酸的62个密码子。因此，在本文公开的方法的一些实施方案中，包含少于62个密码子以编码20种氨基酸的优化密码子组(遗传密码)可包含61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21或20个密码子。
在一些实施方案中，有限密码子组包含少于20个密码子。例如，如果蛋白质含有少于20种类型的氨基酸，则这种蛋白质可由具有少于20个密码子的密码子组编码。因此，在一些实施方案中，优化的密码子组包含与由参考核酸序列编码的蛋白质中存在的不同类型的氨基酸一样多的密码子。在一些实施方案中，优化的密码子组包含19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或甚至1个密码子。
在一些实施方案中，选自由Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Tyr以及Val组成的组的至少一种氨基酸(即由超过一个密码子天然编码的氨基酸)用比天然存在数量的同义密码子更少的密码子编码。例如，在一些实施方案中，Ala可在序列优化的核酸中由3、2或1个密码子编码；Cys可在序列优化的核酸中由1个密码子编码；Asp可在序列优化的核酸中由1个密码子编码；Glu可在序列优化的核酸中由1个密码子编码；Phe可在序列优化的核酸中由1个密码子编码；Gly可在序列优化的核酸中由3个密码子、2个密码子或1个密码子编码；His可在序列优化的核酸中由1个密码子编码；Ile可在序列优化的核酸中由2个密码子或1个密码子编码；Lys可在序列优化的核酸中由1个密码子编码；Leu可在序列优化的核酸中由5个密码子、4个密码子、3个密码子、2个密码子或1个密码子编码；Asn可在序列优化的核酸中由1个密码子编码；Pro可在序列优化的核酸中由3个密码子、2个密码子或1个密码子编码；Gln可在序列优化的核酸中由1个密码子编码；Arg可在序列优化的核酸中由5个密码子、4个密码子、3个密码子、2个密码子或1个密码子编码；Ser可在序列优化的核酸中由5个密码子、4个密码子、3个密码子、2个密码子或1个密码子编码；Thr可在序列优化的核酸中由3个密码子、2个密码子或1个密码子编码；Val可在序列优化的核酸中由3个密码子、2个密码子或1个密码子编码；并且Tyr可在序列优化的核酸中由1个密码子编码。
在一些实施方案中，选自由Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Tyr以及Val组成的组的至少一种氨基酸(即由超过一个密码子天然编码的氨基酸)由有限密码子组中的单个密码子编码。
在一些具体实施方案中，序列优化的核酸是DNA，并且有限密码子组由20个密码子组成，其中每个密码子编码20种氨基酸中的一种。在一些实施方案中，序列优化的核酸是DNA，并且有限密码子组包含至少一个选自由GCT、GCC、GCA和GCG组成的组的密码子；至少一个选自由CGT、CGC、CGA、CGG、AGA和AGG组成的组的密码子；至少一个选自AAT或ACC的密码子；至少一个选自GAT或GAC的密码子；至少一个选自TGT或TGC的密码子；至少一个选自CAA或CAG的密码子；至少一个选自GAA或GAG的密码子；至少一个选自由GGT、GGC、GGA和GGG组成的组的密码子；至少一个选自CAT或CAC的密码子；至少一个选自由ATT、ATC和ATA组成的组的密码子；至少一个选自由TTA、TTG、CTT、CTC、CTA和CTG组成的组的密码子；至少一个选自AAA或AAG的密码子；ATG密码子；至少一个选自TTT或TTC的密码子；至少一个选自由CCT、CCC、CCA和CCG组成的组的密码子；至少一个选自由TCT、TCC、TCA、TCG、AGT和AGC组成的组的密码子；至少一个选自由ACT、ACC、ACA和ACG组成的组的密码子；TGG密码子；至少一个选自TAT或TAC的密码子；以及至少一个选自由GTT、GTC、GTA和GTG组成的组的密码子。
在其他实施方案中，序列优化的核酸是RNA(例如，mRNA)，并且有限密码子组由20个密码子组成，其中每个密码子编码20种氨基酸中的一种。在一些实施方案中，序列优化的核酸是RNA，并且有限密码子组包含至少一个选自由GCU、GCC、GCA和GCG组成的组的密码子；至少一个选自由CGU、CGC、CGA、CGG、AGA和AGG组成的组的密码子；至少一个选自AAU或ACC的密码子；至少一个选自GAU或GAC的密码子；至少一个选自UGU或UGC的密码子；至少一个选自CAA或CAG的密码子；至少一个选自GAA或GAG的密码子；至少一个选自由GGU、GGC、GGA和GGG组成的组的密码子；至少一个选自CAU或CAC的密码子；至少一个选自由AUU、AUC和AUA组成的组的密码子；至少一个选自由UUA、UUG、CUU、CUC、CUA和CUG组成的组的密码子；至少一个选自AAA或AAG的密码子；AUG密码子；至少一个选自UUU或UUC的密码子；至少一个选自由CCU、CCC、CCA和CCG组成的组的密码子；至少一个选自由UCU、UCC、UCA、UCG、AGU和AGC组成的组的密码子；至少一个选自由ACU、ACC、ACA和ACG组成的组的密码子；UGG密码子；至少一个选自UAU或UAC的密码子；以及至少一个选自由GUU、GUC、GUA和GUG组成的组的密码子。
在一些具体实施方案中，有限密码子组已被优化用于在施用于某些组织或细胞后体内表达序列优化的核酸(例如，合成mRNA)。
在一些实施方案中，优化的密码子组(例如，编码20种氨基酸的20个密码子组)至少符合以下性质中的一种：
(i)优化的密码子组具有比原始或天然密码子组更高的平均G/C含量；或者，
(ii)优化的密码子组具有比原始或天然密码子组更低的平均U含量；或者，
(iii)优化的密码子组由具有最高频率的密码子组成；或者
(iv)优化的密码子组由具有最低频率的密码子组成；或者
(v)其组合。
在一些具体实施方案中，优化的密码子组中的至少一个密码子具有同义密码子组中的第二最高、第三最高、第四最高、第五最高或第六最高频率。在一些具体实施方案中，优化的密码子中的至少一个密码子具有同义密码子组中的第二最低、第三最低、第四最低、第五最低或第六最低频率。
如本文所用，术语“天然密码子组”是指由源生物体天然地用于编码参考核酸序列的密码子组。如本文所用，术语“原始密码子组”是指用于在序列优化开始之前编码参考核酸序列的密码子组，或用于在迭代地或递归地应用序列优化时的新优化迭代开始时编码参考核酸序列的优化的变体的密码子组。
在一些实施方案中，所述密码子组中5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的密码子是具有最高频率的密码子。在其他实施方案中，所述密码子组中5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的密码子是具有最低频率的密码子。
在一些实施方案中，所述密码子组中5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的密码子是具有最高尿苷含量的密码子。在一些实施方案中，所述密码子组中5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的密码子是具有最低尿苷含量的密码子。
在一些实施方案中，所述密码子组的平均G/C含量(绝对或相对)比原始密码子组的平均G/C含量(绝对或相对)高5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，所述密码子组的平均G/C含量(绝对或相对)比原始密码子组的平均G/C含量(绝对或相对)低5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
在一些实施方案中，所述密码子组的尿嘧啶含量(绝对或相对)比原始密码子组的平均尿嘧啶含量(绝对或相对)高5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，所述密码子组的尿嘧啶含量(绝对或相对)比原始密码子组的平均尿嘧啶含量(绝对或相对)低5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
还参见美国申请公布号2011/0082055和国际公布号WO2000018778，其两者均以引用的方式整体并入本文。
VIII.序列优化的核酸的表征
在本公开的一些实施方案中，包含编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的本文公开的序列优化的核酸的多核苷酸(例如，RNA，例如mRNA)可进行测试以确定至少一种核酸序列性质(例如，当暴露于核酸酶时的稳定性)或表达性质是否已经相对于非序列优化的核酸得以改进。
如本文所用，“表达性质”是指核酸序列在体内的性质(例如，在施用于有需要的受试者后合成mRNA的翻译功效)或体外的性质(例如，在体外模型系统中测试的合成mRNA的翻译功效)。表达性质包括但不限于在施用后由编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的mRNA产生的蛋白质的量，以及所产生的可溶性或其他功能性蛋白质的量。在一些实施方案中，可根据表达由编码本文公开的IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的序列优化的核酸序列(例如，RNA，例如mRNA)编码的蛋白质的细胞的活力来评价本文公开的序列优化的核酸。
在特定实施方案中，相对于非优化的参考核酸序列含有密码子取代的本文公开的多种序列优化的核酸(例如，RNA，例如，mRNA)可在功能上进行表征以测量目标性质，例如在体外模型系统中的表达性质或在靶组织或细胞中的体内表达性质。
a.核酸序列固有性质的优化
在本公开的一些实施方案中，多核苷酸的所需性质是核酸序列的固有性质。例如，核苷酸序列(例如，RNA，例如mRNA)可针对体内或体外稳定性进行序列优化。在一些实施方案中，可针对在特定靶组织或细胞中的表达对核苷酸序列进行序列优化。在一些实施方案中，对核酸序列进行序列优化以通过防止其通过内切核酸酶和外切核酸酶降解来增加其血浆半衰期。
在其他实施方案中，对核酸序列进行序列优化以增加其在溶液中的耐水解性，例如，以延长序列优化的核酸或包含序列优化的核酸的药物组合物可在水性条件下储存且降解最小的时间。
在其他实施方案中，可对序列优化的核酸进行优化以增加其在干燥储存条件下的耐水解性，例如，以延长序列优化的核酸可在冻干后储存且降解最小的时间。
b.针对蛋白质表达优化的核酸序列
在本公开的一些实施方案中，多核苷酸的所需性质是由本文公开的序列优化的序列编码的IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的表达水平。可使用一种或多种表达系统来测量蛋白质表达水平。在一些实施方案中，可在细胞培养系统，例如CHO细胞或HEK293细胞中测量表达。在一些实施方案中，可使用由活细胞的提取物(例如，兔网织红细胞溶解产物)制备的体外表达系统或通过组装纯化的单独组分制备的体外表达系统来测量表达。在其他实施方案中，在体内系统，例如小鼠、兔、猴等中测量蛋白质表达。
在一些实施方案中，可能希望呈溶液形式的蛋白质表达。因此，在一些实施方案中，可对参考序列进行序列优化以产生序列优化的核酸序列，所述序列优化的核酸序列具有优化水平的可溶性形式的表达的蛋白质。蛋白质表达水平和其他性质如溶解度、聚集水平和截短产物的存在(即由于蛋白水解、水解或缺陷翻译而产生的片段)可根据本领域中已知的方法，例如使用电泳(例如，天然或SDS-PAGE)或色谱方法(例如，HPLC、尺寸排阻色谱发等)进行测量。
c.靶组织或靶细胞活力的优化
在一些实施方案中，由核酸序列编码的异源治疗性蛋白质的表达可能在靶组织或细胞中具有有害作用，从而降低蛋白质产量或降低表达的产物的质量(例如，由于存在蛋白质片段或表达的蛋白质沉淀在包涵体中所致)或引起毒性。
因此，在本公开的一些实施方案中，本文公开的核酸序列(例如编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的核酸序列)的序列优化可用于增加表达由序列优化的核酸编码的蛋白质的靶细胞的活力。
异源蛋白质表达也可能对用用于自体或异源移植的核酸序列转染的细胞有害。因此，在本公开的一些实施方案中，本文公开的核酸序列的序列优化可用于增加表达由序列优化的核酸序列编码的蛋白质的靶细胞的活力。可根据本领域中已知的方法测量细胞或组织活力、毒性和其他生理反应的变化。
d.减少免疫和/或炎症应答
在一些情况下，编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽或其功能性片段的序列优化的核酸的施用可触发免疫应答，其可能是由以下引起：(i)治疗剂(例如，编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的mRNA)，或(ii)这种治疗剂(例如，由mRNA编码的IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽)的表达产物或(iv)其组合。因此，在本公开的一些实施方案中，本文公开的核酸序列(例如，mRNA)的序列优化可用于降低由施用编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的核酸或由这种核酸编码的IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的表达产物触发的免疫或炎症应答。
在一些方面，可通过使用本领域中已知的方法(例如ELISA)检测一种或多种炎性细胞因子的水平增加来测量炎症应答。术语“炎性细胞因子”是指在炎症应答中升高的细胞因子。炎性细胞因子的实例包括白细胞介素-6(IL-6)、CXCL1(趋化因子(C-X-C基序)配体1；也称为GROα、干扰素-γ(IFNγ)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素γ-诱导的蛋白10(IP-10)或粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。术语炎性细胞因子还包括本领域中已知的与炎症应答相关的其他细胞因子，例如白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-13(IL-13)、干扰素α(IFN-α)等。
IX.编码包含微小RNA结合位点的免疫调节多肽的多核苷酸
编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的多核苷酸(例如，mRNA)还可包含一个或多个微小RNA结合位点。微小RNA(或miRNA)是19-25个核苷酸长的非编码RNA，所述非编码RNA结合至核酸分子的3’UTR并且通过降低核酸分子稳定性或通过抑制翻译来下调基因表达。
本发明还提供了包含上述多核糖核苷酸中的任一种的药物组合物和制剂。在一些实施方案中，所述组合物或制剂还包含递送剂。
在一些实施方案中，所述组合物或制剂可含有多核糖核苷酸，所述多核糖核苷酸包含编码多肽的本文公开的序列优化的核酸序列。在一些实施方案中，所述组合物或制剂可含有多核糖核苷酸(例如，RNA，例如mRNA)，所述多核糖核苷酸包含与编码多肽的本文公开的序列优化的核酸序列具有显著序列同一性的多核糖核苷酸(例如，ORF)。在一些实施方案中，所述多核糖核苷酸还包含miRNA结合位点，例如结合miR-122的miRNA结合位点。
通过将微小RNA靶序列工程化至本公开的多核苷酸中(例如，3’UTR样区或其他区中)，可靶向用于降解或减少翻译的分子，条件是所讨论的微小RNA是可获得的。这可减少递送多核糖核苷酸时的脱靶效应。例如，如果本发明的多核糖核苷酸不意图被递送至组织或细胞但在所述组织或细胞中结束，则在将miRNA的一个或多个结合位点工程化到多核糖核苷酸的5'UTR和/或3'UTR中的情况下，在所述组织或细胞中丰富的miRNA可抑制目标基因的表达。因此，在一些实施方案中，将一个或多个miRNA结合位点并入本公开的mRNA中可降低在核酸分子递送时的脱靶效应的危害和/或实现由所述mRNA编码的多肽的表达的组织特异性调控。在其他实施方案中，将一个或多个miRNA结合位点并入本公开的mRNA中可在体内核酸递送后调节免疫应答。在其他实施方案中，将一个或多个miRNA结合位点并入本公开的mRNA中可调节本文所述的含脂质化合物和组合物的加速血液清除(ABC)。
相反，可从它们所天然存在的多核糖核苷酸序列中除去miRNA结合位点，以增加特定组织中的蛋白质表达。例如，可从多核糖核苷酸中除去特定miRNA的结合位点，以改进含有所述miRNA的组织或细胞中的蛋白质表达。
微小RNA从RNA转录物的区酶促衍生，所述RNA转录物自身折叠以形成通常称为pre-miRNA(前体-miRNA)的短发夹结构。pre-miRNA通常在其3'端具有双核苷酸突出端，并且具有3'羟基和5'磷酸基团。这种前体-mRNA在细胞核中加工且随后转运至细胞质，在细胞质中其通过DICER(RNA酶III酶)进一步加工，以形成大约22个核苷酸的成熟微小RNA。然后将成熟微小RNA并入核糖核颗粒中以形成RNA诱导的沉默复合物RISC，其介导基因沉默。本领域公认的成熟miRNA命名法通常指定成熟miRNA所来源的pre-miRNA的臂；“5p”意味着微小RNA来自pre-miRNA发夹的5臂，并且“3p”意味着微小RNA来自pre-miRNA发夹的3端。本文中通过数字提及的miR可指源自同一pre-miRNA的相对臂的两种成熟微小RNA中的任一种(例如，3p或5p微小RNA)。除非由3p或5p名称特别指定，否则本文提及的所有miR均意图包括3p和5p臂/序列。
在一个实施方案中，miRNA结合位点(例如，miR-122结合位点)结合至相应的成熟miRNA，所述成熟miRNA是含有Dicer的活性RNA诱导的沉默复合物(RISC)的一部分。在另一个实施方案中，miRNA结合位点与RISC中的相应miRNA的结合降解含有所述miRNA结合位点的mRNA或阻止所述mRNA被翻译。
如本文所用，术语“微小RNA结合位点”是指微小RNA靶位点或微小RNA识别位点或微小RNA所结合或缔合的任何核苷酸序列。应理解“结合”可遵循传统沃森-克里克杂交规则或可反映微小RNA与靶序列在或邻近微小RNA位点处的任何稳定的缔合。
一些微小RNA(例如miR-122)在正常组织中丰富，但在癌症或肿瘤组织中以低得多的水平存在。因此，将微小RNA靶序列(即，微小RNA结合位点)工程化到编码IL-23和/或IL-36-γ、IL-18和/或第三蛋白质(例如，OX40L多肽)的多核苷酸中(例如，3'UTR样区或其他区中)可有效地靶向用于在正常组织(其中微小RNA丰富)中降解或减少翻译的分子，同时在癌症或肿瘤组织(其中微小RNA以低的多的水平存在)中提供高水平的翻译。这为本公开的方法和组合物提供了肿瘤靶向方法。
在一些实施方案中，微小RNA结合位点(例如，miR-122结合位点)与miRNA(例如，miR-122)完全互补，从而降解与miRNA结合位点融合的mRNA。在其他实施方案中，miRNA结合位点不与相应的miRNA完全互补。在某些实施方案中，miRNA结合位点(例如，miR-122结合位点)与相应的miRNA(例如，miR-122)具有相同的长度。在其他实施方案中，微小RNA结合位点(例如，miR-122结合位点)比在5'末端、3'末端或两者处的相应微小RNA(例如，具有22nt的miR-122)短一个核苷酸。在其他实施方案中，微小RNA结合位点(例如，miR-122结合位点)比在5'末端、3'末端或两者处的相应微小RNA(例如，miR-122)短两个核苷酸。在其他实施方案中，微小RNA结合位点(例如，miR-122结合位点)比在5'末端、3'末端或两者处的相应微小RNA(例如，miR-122)短三个核苷酸。在一些实施方案中，微小RNA结合位点(例如，miR-122结合位点)比在5'末端、3'末端或两者处的相应微小RNA(例如，miR-122)短四个核苷酸。在其他实施方案中，微小RNA结合位点(例如，miR-122结合位点)比在5'末端、3'末端或两者处的相应微小RNA(例如，miR-122)短五个核苷酸。在一些实施方案中，微小RNA结合位点(例如，miR-122结合位点)比在5'末端、3'末端或两者处的相应微小RNA(例如，miR-122)短六个核苷酸。在其他实施方案中，微小RNA结合位点(例如，miR-122结合位点)比在5'末端或3'末端处的相应微小RNA(例如，miR-122)短七个核苷酸。在其他实施方案中，微小RNA结合位点(例如，miR-122结合位点)比在5'末端或3'末端处的相应微小RNA(例如，miR-122)短八个核苷酸。在其他实施方案中，微小RNA结合位点(例如，miR-122结合位点)比在5'末端或3'末端处的相应微小RNA(例如，miR-122)短九个核苷酸。在其他实施方案中，微小RNA结合位点(例如，miR-122结合位点)比在5'末端或3'末端处的相应微小RNA(例如，miR-122)短十个核苷酸。在其他实施方案中，微小RNA结合位点(例如，miR-122结合位点)比在5'末端或3'末端处的相应微小RNA(例如，miR-122)短十一个核苷酸。在其他实施方案中，微小RNA结合位点(例如，miR-122结合位点)比在5'末端或3'末端处的相应微小RNA(例如，miR-122)短十二个核苷酸。比相应miRNA短的miRNA结合位点仍然能够降解并入一个或多个miRNA结合位点的mRNA或阻止所述mRNA翻译。
在一些实施方案中，微小RNA结合位点(例如，miR-122结合位点)与miRNA(例如，miR-122)具有足够互补性，以使得包含所述miRNA(例如，miR-122)的RISC复合物裂解包含所述微小RNA结合位点的多核苷酸。在其他实施方案中，微小RNA结合位点(例如，miR-122结合位点)具有不完全互补性，以使得包含所述miRNA(例如，miR-122)的RISC复合物诱导包含所述微小RNA结合位点的多核苷酸中的不稳定性。在另一个实施方案中，微小RNA结合位点(例如，miR-122结合位点)具有不完全互补性，以使得包含所述miRNA(例如，miR-122)的RISC复合物阻遏包含所述微小RNA结合位点的多核苷酸的转录。
与miRNA具有足够互补性的miRNA结合位点是指足以促进miRNA介导的多核糖核苷酸调控(例如miRNA介导的翻译阻遏或多核糖核苷酸降解)的互补程度。在本发明的示例性方面，与miRNA具有足够互补性的miRNA结合位点是指足以促进miRNA介导的多核糖核苷酸降解(例如miRNA引导的RNA诱导的沉默复合物(RISC)介导的mRNA裂解)的互补程度。miRNA结合位点可与例如19-25个核苷酸长的miRNA序列、19-23个核苷酸长的miRNA序列或22个核苷酸长的miRNA序列具有互补性。miRNA结合位点可仅与miRNA的一部分互补，例如与天然存在的miRNA序列的全长的少于1、2、3或4个核苷酸的部分互补，或与比天然存在的miRNA序列短少于1、2、3或4个核苷酸的部分互补(这种miRNA结合位点具有“不完全互补性”)。当所需的调控是mRNA降解时，优选完整或完全互补性(例如，天然存在的miRNA的长度的全部或显著部分上的完整互补性或完全互补性)。
在一个实施方案中，miRNA结合位点(例如，miR-122结合位点)与相应的miRNA(例如，miR-122)具有一个错配。在另一个实施方案中，miRNA结合位点与相应的miRNA具有两个错配。在其他实施方案中，miRNA结合位点与相应的miRNA具有三个错配。在其他实施方案中，miRNA结合位点与相应的miRNA具有四个错配。在一些实施方案中，miRNA结合位点与相应的miRNA具有五个错配。在其他实施方案中，miRNA结合位点与相应的miRNA具有六个错配。在某些实施方案中，miRNA结合位点与相应的miRNA具有七个错配。在其他实施方案中，miRNA结合位点与相应的miRNA具有八个错配。在其他实施方案中，miRNA结合位点与相应的miRNA具有九个错配。在其他实施方案中，miRNA结合位点与相应的miRNA具有十个错配。在其他实施方案中，miRNA结合位点与相应的miRNA具有十一个错配。在其他实施方案中，miRNA结合位点与相应的miRNA具有十二个错配。
在某些实施方案中，miRNA结合位点(例如，miR-122结合位点)具有与相应miRNA(例如，miR-122)的至少约十个连续核苷酸互补的至少约十个连续核苷酸、与相应miRNA的至少约十一个连续核苷酸互补的至少约十一个连续核苷酸、与相应miRNA的至少约十二个连续核苷酸互补的至少约十二个连续核苷酸、与相应miRNA的至少约十三个连续核苷酸互补的至少约十三个连续核苷酸或与相应miRNA的至少约十四个连续核苷酸互补的至少约十四个连续核苷酸。在一些实施方案中，miRNA结合位点具有与相应miRNA的至少约十五个连续核苷酸互补的至少约十五个连续核苷酸、与相应miRNA的至少约十六个连续核苷酸互补的至少约十六个连续核苷酸、与相应miRNA的至少约十七个连续核苷酸互补的至少约十七个连续核苷酸、与相应miRNA的至少约十八个连续核苷酸互补的至少约十八个连续核苷酸、与相应miRNA的至少约十九个连续核苷酸互补的至少约十九个连续核苷酸、与相应miRNA的至少约二十个连续核苷酸互补的至少约二十个连续核苷酸或与相应miRNA的至少约二十一个连续核苷酸互补的至少约二十一个连续核苷酸。
在一些实施方案中，多核苷酸包含编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的mRNA和至少一个miR-122结合位点、至少两个miR-122结合位点、至少三个miR-122结合位点、至少四个miR-122结合位点或至少五个miR-122结合位点。在一个方面，miRNA结合位点结合miR-122或与miR-122互补。在另一方面，miRNA结合位点结合至miR-122-3p或miR-122-5p。在特定方面，miRNA结合位点包含与SEQ ID NO:24至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的核苷酸序列，其中所述miRNA结合位点结合至miR-122。在另一个特定方面，miRNA结合位点包含与SEQ ID NO:26至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的核苷酸序列，其中所述miRNA结合位点结合至miR-122。这些序列在以下表2中示出。
表2.miR-122和miR-122结合位点
在一些实施方案中，miRNA结合位点(例如，miR-122结合位点)在多核苷酸的任何位置(例如，3'UTR)插入本公开的多核苷酸中；多核苷酸中的插入位点可以是多核苷酸中的任何地方，只要多核苷酸中的miRNA结合位点的插入在相应miRNA(例如，miR-122)不存在下不干扰功能性IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的翻译；并且在miRNA(例如，miR-122)存在下，多核苷酸中miRNA结合位点的插入以及miRNA结合位点与相应miRNA的结合能够降解多核苷酸或阻止多核苷酸的翻译。在一个实施方案中，miRNA结合位点被插入多核苷酸的3'UTR中。
在某些实施方案中，miRNA结合位点被插入编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的mRNA的终止密码子下游的至少约30个核苷酸中。在其他实施方案中，miRNA结合位点被插入多核苷酸(例如，编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的mRNA)的终止密码子下游的至少约10个核苷酸、至少约15个核苷酸、至少约20个核苷酸、至少约25个核苷酸、至少约30个核苷酸、至少约35个核苷酸、至少约40个核苷酸、至少约45个核苷酸、至少约50个核苷酸、至少约55个核苷酸、至少约60个核苷酸、至少约65个核苷酸、至少约70个核苷酸、至少约75个核苷酸、至少约80个核苷酸、至少约85个核苷酸、至少约90个核苷酸、至少约95个核苷酸或至少约100个核苷酸中。在其他实施方案中，miRNA结合位点被插入多核苷酸(例如，编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的mRNA)的终止密码子下游的约10个核苷酸至约100个核苷酸、约20个核苷酸至约90个核苷酸、约30个核苷酸至约80个核苷酸、约40个核苷酸至约70个核苷酸、约50个核苷酸至约60个核苷酸、约45个核苷酸至约65个核苷酸中。
IVT多核苷酸构造
在一些实施方案中，包含编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的mRNA的本公开的多核苷酸是IVT多核苷酸。传统上，mRNA分子的基本组分至少包括编码区、5’UTR、3’UTR、5’帽以及聚-A尾。本公开的IVT多核苷酸可充当mRNA，但在其功能和/或结构设计特征上不同于野生型mRNA，所述功能和/或结构设计特征用于克服使用基于核酸的治疗剂的有效多肽产生的现有问题。
IVT多核苷酸的初级构建体包含连接的核苷酸的第一区，所述第一区由第一侧翼区和第二侧翼区侧接。此第一区可包括但不限于编码的IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽。所述第一侧翼区可包括连接的核苷的序列，所述连接的核苷充当5'非翻译区(UTR)，如编码多肽的天然5'UTR的任何核酸的5'UTR或非天然5’UTR，如但不限于异源5'UTR或合成5'UTR。编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的IVT可在其5末端包含编码一个或多个信号序列的信号序列区。侧翼区可包含连接的核苷酸的包含一个或多个完整或不完整5'UTR序列的区。侧翼区还可包含5'末端帽。所述第二侧翼区可包含连接的核苷酸的包含一个或多个完整或不完整3'UTR的区，其可编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的天然3'UTR或非天然3'UTR，如但不限于异源3'UTR或合成3'UTR。所述侧翼区还可包含3’加尾序列。3'加尾序列可以是但不限于聚A尾、聚A-G四联体和/或茎环序列。
第一操作区使第一区的5’末端与第一侧翼区桥接。传统上，这个操作区包含起始密码子。所述操作区或者可包含含有起始密码子的任何翻译起始序列或信号。
第二操作区使第一区的3’末端与第二侧翼区桥接。传统上，这个操作区包含终止密码子。所述操作区或者可包含含有终止密码子的任何翻译起始序列或信号。多个连续终止密码子也可用于IVT多核苷酸中。在一些实施方案中，本公开的操作区可包含两个终止密码子。第一终止密码子可以是“TGA”或“UGA”，并且第二终止密码子可选自由“TAA”、“TGA”、“TAG”、“UAA”、“UGA”或“UAG”组成的组。
IVT多核苷酸初级构建体包含连接的核苷酸的第一区，所述第一区由第一侧翼区和第二侧翼区侧接。如本文所用，“第一区”可被称为“编码区”或“编码……的区”或简单地“第一区”。这个第一区可包括但不限于编码的目标多肽。在一个方面，所述第一区可包括但不限于编码至少一种目标多肽的开放阅读框。开放阅读框可全部或部分地进行密码子优化。侧翼区可包含连接的核苷酸的包含一个或多个完整或不完整5’UTR序列的区，所述序列可以是完全密码子优化的或部分密码子优化的。侧翼区可包含至少一个核酸序列，包括但不限于miR序列、TERZAKTM序列和翻译控制序列。侧翼区还可包含5’末端帽138。5’末端加帽区可包含天然存在的帽、合成帽或优化帽。第二侧翼区可包含连接核苷酸的包含一个或多个完整或不完整3'UTR的区。第二侧翼区可以是完全密码子优化的或部分密码子优化的。侧翼区可包含至少一个核酸序列，包括但不限于miR序列和翻译控制序列。在第二侧翼区之后，多核苷酸初级构建体可包含3'加尾序列。3’加尾序列可包含合成加尾区和/或链终止核苷。合成加尾区的非限制性实例包括聚A序列、聚C序列、聚A-G四联体。链终止核苷的非限制性实例包括2’-O甲基、F和锁核酸(LNA)。
第一操作区使第一区的5’末端与第一侧翼区桥接。传统上，这个操作区包含起始密码子。所述操作区或者可包含含有起始密码子的任何翻译起始序列或信号。
第二操作区使第一区的3’末端与第二侧翼区桥接。传统上，这个操作区包含终止密码子。所述操作区或者可包含含有终止密码子的任何翻译起始序列或信号。根据本公开，还可使用多个连续终止密码子。
在一些实施方案中，IVT多核苷酸的第一侧翼区和第二侧翼区的长度可独立地在15-1,000个核苷酸的范围内(例如，大于30、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、3,500、4,000、4,500、5,000、5,500个核苷酸，或至少30、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、3,500、4,000、4,500、5,000、5,500个核苷酸)。
在一些实施方案中，所述IVT多核苷酸的加尾序列的长度可在不存在至500个核苷酸的范围内(例如，至少60、70、80、90、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450或500个核苷酸)。在加尾区是聚A尾的情况下，所述长度可以聚A结合蛋白结合的单位或作为聚A结合蛋白结合的函数来确定。在这个实施方案中，聚A尾足够长以结合聚A结合蛋白的至少4个单体。聚A结合蛋白单体结合至大约38个核苷酸的段。如此，已观察到约80个核苷酸和160个核苷酸的聚A尾是功能性的。
在一些实施方案中，所述IVT多核苷酸的加帽区可包含单个帽或形成帽的一系列核苷酸。在这个实施方案中，加帽区的长度可以是1至10，例如2-9、3-8、4-7、1-5、5-10或至少2或10或更少个核苷酸。在一些实施方案中，帽不存在。
在一些实施方案中，所述IVT多核苷酸的第一操作区和第二操作区的长度可在3至40，例如5-30、10-20、15或至少4或30或更少个核苷酸范围内，并且除起始和/或终止密码子外还可包含一个或多个信号序列和/或限制序列。
在一些实施方案中，所述IVT多核苷酸可以是结构修饰的或化学修饰的。当IVT多核苷酸被化学和/或结构修饰时，所述多核苷酸可被称为“修饰的IVT多核苷酸”。
在一个实施方案中，如果IVT多核苷酸是化学修饰的，则它们可具有全部或任何同一核苷类型的均一化学修饰，或通过在全部或任何同一核苷类型中的相同起始修饰的仅仅向下滴定而产生的修饰群体，或全部或任何同一核苷类型的测量百分比的化学修饰但伴有随机并入，如其中所有尿苷被尿苷类似物(例如假尿苷或5-甲氧基尿苷)置换。在另一个实施方案中，所述IVT多核苷酸可在整个多核苷酸中具有两种、三种或四种同一核苷类型的均一化学修饰(如所有尿苷和所有胞嘧啶等以相同方式修饰)。
在一些实施方案中，所述IVT多核苷酸可包含本文所述的编码自裂解肽(如但不限于2A肽)的序列。所述IVT多核苷酸中的2A肽的多核苷酸序列可通过本文所述的方法修饰或密码子优化和/或是本领域中已知的。在一些实施方案中，此序列可用于分开IVT多核苷酸中的两个或更多个目标多肽的编码区。
嵌合多核苷酸构造
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸是嵌合多核苷酸。本文公开的嵌合多核苷酸或RNA构建体维持与IVT多核苷酸类似的模块组构，但嵌合多核苷酸包含赋予所述多核苷酸有用性质的一种或多种结构和/或化学修饰或改变。如此，为本公开的修饰的mRNA分子的嵌合多核苷酸被称为“嵌合修饰的mRNA”或“嵌合mRNA”。
嵌合多核苷酸具有在大小和/或化学修饰模式、化学修饰位置、化学修饰百分比或化学修饰群体以及前述的组合方面不同的部分或区域。
其中嵌合多核苷酸充当mRNA并编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的部分或区的实例包括但不限于非翻译区(UTR，如5’UTR或3’UTR)、编码区、帽区、聚A尾区、起始区、终止区、信号序列区以及其组合。连接其他区或位于其他区之间的区或部分也可被设计为具有亚区。
在一些实施方案中，本公开的嵌合多核苷酸具有包括式X的结构。
5’[An]x-L1-[Bo]y-L2-[Cp]z-L3 3’
式X
其中：
A和B各自独立地包含连接的核苷的区；
A或B或A和B两者均编码本文其他地方描述的IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽；
C是连接的核苷的任选区；
区A、B或C中的至少一个是定位修饰的，其中所述定位修饰的区包含腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷或尿苷中的一种或多种同一核苷类型的至少两个化学修饰的核苷，并且其中同一类型的核苷的化学修饰中的至少两种是不同的化学修饰；
n、o和p独立地是15-1000之间的整数；
x和y独立地是1-20；
z是0-5；
L1和L2独立地是任选的接头部分，所述接头部分是基于核酸的或基于非核酸的；并且
L3是任选的缀合物或任选的接头部分，所述接头部分是基于核酸的或基于非核酸的。
在一些实施方案中，A的连接的核苷的区中的至少一个包含连接的核苷的可充当5’非翻译区(UTR)的序列。所述连接的核苷的序列可以是天然的或合成的5’UTR。作为非限制性实例，嵌合多核苷酸可编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽，并且A的连接的核苷的序列可编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的天然5'UTR或非异源5'UTR，如但不限于合成UTR。
在另一个实施方案中，A的连接的核苷的区中的至少一个是帽区。所述帽区可位于A的连接的核苷的区的5’，从而充当5’UTR。所述帽区可包含至少一个帽，如但不限于帽0、帽1、ARCA、肌苷、N1-甲基-鸟苷、2'氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷、2-叠氮基-鸟苷、帽2以及帽4。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含帽1 5'UTR。在一些实施方案中，相较于包含不同5'UTR(例如，帽0、ARCA、肌苷、N1-甲基-鸟苷、2'氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷、2-叠氮基-鸟苷、帽2或帽4)的编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的多核苷酸，用于编码本文公开的IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的包含5'UTR序列(例如帽1)的多核苷酸增加IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的表达。在一些实施方案中，多核苷酸包含帽1 5'UTR，其中所述多核苷酸编码IL-23、IL-36-γ和/或OX40L多肽。在一些实施方案中，包含帽1 5'UTR的多核苷酸增加IL-23、IL-36-γ和/或OX40L多肽表达。
在一些实施方案中，B的连接的核苷的区中的至少一个包含编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的核酸序列的至少一个开放阅读框。所述核酸序列可以是密码子优化的和/或包含至少一种修饰。
在一些实施方案中，C的连接的核苷的区中的至少一个包含连接的核苷的可充当3'UTR的序列。所述连接的核苷的序列可以是天然的或合成的3’UTR。作为非限制性实例，嵌合多核苷酸可编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽，并且C的连接的核苷的序列可编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的天然3'UTR或非异源3'UTR，如但不限于合成UTR。
在一些实施方案中，A的连接的核苷的区中的至少一个包含连接的核苷的充当5'UTR的序列，并且C的连接的核苷的区中的至少一个包含连接的核苷的充当3'UTR的序列。在一个实施方案中，所述5'UTR和3'UTR可来自相同或不同物种。在另一个实施方案中，所述5'UTR和3'UTR可编码来自相同或不同物种的不同蛋白质的天然非翻译区。
本公开的嵌合多核苷酸(包括其部分或区)可被分类为半聚体(hemimer)、缺口聚体(gapmer)、翼聚体(wingmer)或嵌段聚体(blockmer)。
如本文所用，“半聚体”是包含区或部分的嵌合多核苷酸，所述区或部分包含一种或多种化学修饰的一种模式、百分比、位置或群体的一半和一种或多种化学修饰的第二模式、百分比、位置或群体的一半。本公开的嵌合多核苷酸还可包含半聚体亚区。在一些实施方案中，部分或区是一个部分或区的50％和另一个部分或区的50％。
在一些实施方案中，整个嵌合多核苷酸是一种多核苷酸的50％和另一种多核苷酸的50％。本公开的任何嵌合多核苷酸的任何区或部分可以是半聚体。半聚体的类型包括模式半聚体、群体半聚体或位置半聚体。按照定义，半聚体是50:50半聚体。
如本文所用，“缺口聚体”是具有至少三个部分或区且在所述部分或区之间具有缺口的嵌合多核苷酸。“缺口”可包含连接的核苷或单个核苷的区，所述区与侧接其的两个部分或区的嵌合性质不同。缺口聚体的两个部分或区可以是相同的或彼此不同的。
如本文所用，“翼聚体”是具有至少三个部分或区且在所述部分或区之间具有缺口的嵌合多核苷酸。不同于缺口聚体，围绕翼聚体中的缺口的两个侧翼部分或区在程度或种类上是相同的。这种相似性可以是在不同修饰的单位的长度或数量方面或在修饰的数量方面。翼聚体的翼可比缺口更长或更短。翼部分或区可在长度上比包含缺口的区长或短20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。
如本文所用，“嵌段聚体”是模式化多核苷酸，其中部分或区具有等效大小或修饰数量和类型。嵌段聚体中的区或亚区可以是50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61 62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或500个核苷长。
本公开的具有化学修饰模式的嵌合多核苷酸(包括其部分或区)被称为“模式嵌合体”。模式嵌合体还可被称为嵌段聚体。模式嵌合体是具有在区或部分内、跨区或部分或在区或部分之中的修饰模式的那些多核苷酸。
部分或区内的修饰模式是在限定区内起始和终止的那些。跨部分或区的修饰模式是在一个部分或区中起始且在另一个相邻部分或区中终止的那些模式。在部分或区之中的修饰模式是在一个部分或区中起始且终止并且在不同的部分或区中重复的那些，所述不同的部分或区不必与第一区或部分相邻。
模式嵌合体或嵌段聚体的区或亚区可具有简单交替模式，如ABAB[AB]n，其中每个“A”和每个“B”表示不同的化学修饰(碱基、糖或主链接头中的至少一种)、不同类型的化学修饰(例如，天然存在的和非天然存在的)、不同修饰百分比或不同修饰群体。所述模式可重复n次，其中n＝3-300。此外，每个A或B可表示所述模式中的1-2500个单位(例如，核苷)。模式还可以是交替多重，如AABBAABB[AABB]n(交替双重)或AAABBBAAABBB[AAABBB]n(交替三重)模式。所述模式可重复n次，其中n＝3-300。
不同模式还可混合在一起以形成二阶模式。例如，单一交替模式可与三重交替模式组合以形成二阶交替模式A’B’。一个实例将是[ABABAB][AAABBBAAABBB][ABABAB][AAABBBAAABBB][ABABAB][AAABBBAAABBB]，其中[ABABAB]是A’且[AAABBBAAABBB]是B’。以类似方式，这些模式可重复n次，其中n＝3-300。
模式可包括三种或更多种不同的修饰以形成ABCABC[ABC]n模式。这些三组分模式也可以是多重，如AABBCCAABBCC[AABBCC]n并且可被设计为与其他模式的组合如ABCABCAABBCCABCABCAABBCC，并且可以是更高阶模式。
位置、百分比和群体修饰的区或亚区不必反映来自每种修饰类型的相等贡献。它们可形成系列如“1-2-3-4”、“1-2-4-8”，其中每个整数表示特定修饰类型的单位数量。或者，它们可以是仅奇数‘1-3-3-1-3-1-5”或仅偶数“2-4-2-4-6-4-8”或奇数和偶数单位数量的混合物如“1-3-4-2-5-7-3-3-4”。
模式嵌合体可在其化学修饰程度(如以上所述的那些)或种类(例如，不同的修饰)方面不同。
本公开的具有至少一个区(所述至少一个区具有同一核苷类型(A、C、G、T或U)的两个或更多个核苷成员的两种或更多种不同的化学修饰)的嵌合多核苷酸(包括其部分或区)被称为“定位修饰的”嵌合体。定位修饰的嵌合体在本文还被称为“选择性放置”嵌合体或“选择性放置多核苷酸”。顾名思义，选择性放置是指凭借合成方法设计与本领域中的多核苷酸(其中对任何A、C、G、T或U的修饰是相同的)不同的多核苷酸可具有对多核苷酸或其区中的单个A、C、G、T或U的不同修饰。例如，在定位修饰的嵌合多核苷酸中，可存在对A、C、G、T或U的核苷类型中的任一种的两种或更多种不同的化学修饰。还可存在对同一核苷类型的任何两者或更多者的两种或更多种修饰的组合。例如，定位修饰的或选择性放置嵌合多核苷酸可包含对分子中的腺嘌呤群体的3种不同修饰并且还具有对构建体中的胞嘧啶群体的3种不同修饰——其全部可具有独特的、非随机的放置。
本公开的具有化学修饰百分比的嵌合多核苷酸(包括其部分或区)被称为“百分比嵌合体”。百分比嵌合体可具有包含至少1％、至少2％、至少5％、至少8％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％位置、模式或群体修饰的区或部分。或者，百分比嵌合体可以是关于修饰位置、模式或群体完全修饰的。百分比嵌合体的修饰百分比可在天然存在的修饰与非天然存在的修饰之间分配。
本公开的具有化学修饰群体的嵌合多核苷酸(包括其部分或区)被称为“群体嵌合体”。群体嵌合体可包含其中核苷(其碱基、糖或主链键联或其组合)具有选定修饰群体的区或部分。此类修饰可选自功能性群体，如诱导、改变或调节表型结果的修饰。例如，功能性群体可以是增加细胞因子的水平的化学修饰群体或选择。其他功能性群体可单独地或共同地作用来降低一种或多种细胞因子的水平。在嵌合多核苷酸中使用这些相似功能修饰的选择将因此构成“功能性群体嵌合体”。如本文所用，“功能性群体嵌合体”可以是其独特功能特征由如上所述的修饰群体定义的功能性群体嵌合体，或所述术语可适用于嵌合多核苷酸本身的总体功能。例如，总体上，所述嵌合多核苷酸可相较于未修饰的或非嵌合多核苷酸以不同或优异方式起作用。
应注意到，具有全部或任何同一核苷类型的均一化学修饰或通过在全部或任何同一核苷类型中的相同起始修饰的仅仅向下滴定而产生的修饰群体或全部或任何同一核苷类型的测量百分比的化学修饰但伴有随机并入，如其中所有尿苷被尿苷类似物(例如假尿苷或5-甲氧基尿苷)置换的多核苷酸不被认为是嵌合多核苷酸。同样，在整个多核苷酸中具有两种、三种或四种同一核苷类型的均一化学修饰(如所有尿苷和所有胞嘧啶等以相同方式修饰)的多核苷酸不被认为是嵌合多核苷酸。不为嵌合的多核苷酸的一个实例是典型假尿苷/5-甲基胞嘧啶修饰的多核苷酸。这些均一多核苷酸完全经由体外转录(IVT)酶合成达成；并且由于合成酶的限制，它们在多核苷酸中发现的同一核苷类型即腺苷(A)、胸苷(T)、鸟苷(G)、胞苷(C)或尿苷(U)中的每种的出现时仅包含一种修饰。此类多核苷酸可被表征为IVT多核苷酸。
本公开的嵌合多核苷酸可以是结构修饰的或化学修饰的。当本公开的嵌合多核苷酸被化学和/或结构修饰时，所述多核苷酸可被称为“修饰的嵌合多核苷酸”。
所述嵌合多核苷酸的区或部分可由接头或间隔区部分分开。此类接头或间隔区可以是基于核酸的或非核苷的。
在一个实施方案中，所述嵌合多核苷酸可包含本文所述的编码自裂解肽(如但不限于2A肽)的序列。所述嵌合多核苷酸中的2A肽的多核苷酸序列可通过本文所述的方法修饰或密码子优化和/或是本领域中已知的。
尽管如前所述，但本公开的嵌合多核苷酸可包含不为如本文定义的定位修饰的或嵌合的区或部分。例如，嵌合多核苷酸的区或部分可以是在一个或多个A、T、C、G或U处均一修饰的，但所述多核苷酸将不是在整个区或部分中均一修饰的。
本公开的嵌合多核苷酸可以是完全定位修饰的或部分定位修饰的。它们还可具有亚区，所述亚区可具有任何模式或设计。
在一些实施方案中，所述多核苷酸的区或亚区的长度可在不存在至500个核苷酸的范围内(例如，至少60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450或500个核苷酸)。在所述区是聚A尾的情况下，所述长度可以聚A结合蛋白结合的单位或作为聚A结合蛋白结合的函数来确定。在这个实施方案中，聚A尾足够长以结合聚A结合蛋白的至少4个单体。聚A结合蛋白单体结合至大约38个核苷酸的段。如此，已观察到约80个核苷酸至约160个核苷酸的聚A尾是功能性的。充当mRNA的本公开的嵌合多核苷酸不必包含聚A尾。
根据本公开，充当mRNA的嵌合多核苷酸可具有加帽区。所述加帽区可包含单个帽或形成帽的一系列核苷酸。在这个实施方案中，加帽区的长度可以是1至10，例如2-9、3-8、4-7、1-5、5-10或至少2或10或更少个核苷酸。在一些实施方案中，帽不存在。
本公开涵盖为环形或环状的嵌合多核苷酸。顾名思义，环形多核苷酸本质上是环形的，从而意味着末端以某种方式连接，无论是通过连接、共价键、与相同蛋白质或其他分子或复合物共同缔合或通过杂交。
还在国际专利申请号中PCT/US2014/53907描述了嵌合多核苷酸、包含嵌合多核苷酸的制剂和组合物以及制备、使用和施用嵌合多核苷酸的方法。
在一些实施方案中，嵌合多核苷酸编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽。在一些实施方案中，本公开的嵌合多核苷酸包含表1中列出的IL-23和/或IL-36-γ、IL-18核酸序列和/或表1a中列出的OX40L核酸序列中的任一种。在一些实施方案中，本公开的嵌合多核苷酸编码表1中列出的IL-23和/或IL-36-γ、IL-18和表1A中列出的OX40L多肽中的任一种。
环形多核苷酸
编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的多核苷酸(例如，mRNA)可以是环形的或环状的。如本文所用，“环形多核苷酸”或“circP”意指基本上如同RNA作用且具有RNA的性质的单链环形多核苷酸，。术语“环形”还意指涵盖circP的任何二级或三级构型。环形多核苷酸本质上是环形的，从而意味着末端以某种方式连接，无论是通过连接、共价键、与相同蛋白质或其他分子或复合物共同缔合或通过杂交。
环形多核苷酸、包含环形多核苷酸的制剂和组合物以及制备、使用和施用环形多核苷酸的方法也公开于国际专利申请号PCT/US2014/53904(公布为WO2015034925，还参见US 2016-0194368)中。
在一些实施方案中，环形多核苷酸编码IL-23多肽、IL-36-γ多肽或OX40L多肽。在一些实施方案中，本公开的环形多核苷酸包含表1中列出的IL-23、IL-36-γ、IL-18核酸序列或表1A中列出的OX40L核酸序列中的任一种。在一些实施方案中，本公开的环形多核苷酸编码表1中列出的IL-23多肽、IL-36-γ、IL-18多肽或表1A中列出的OX40L多肽中的任一种。在一些实施方案中，环形多核苷酸增加IL-23多肽、IL-36-γ多肽、IL-18或OX40L多肽表达。
多核苷酸的多聚体
在一些实施方案中，多种不同的嵌合多核苷酸和/或IVT多核苷酸可使用在3’-末端修饰的核苷酸通过3’-端连接在一起。化学缀合可用于控制递送至细胞中的化学计量学。这可通过使用一种多核苷酸物种上的3’-叠氮基封端的核苷酸和相对的多核苷酸物种上的含有C5-乙炔基或炔基的核苷酸化学连接嵌合多核苷酸和/或IVT多核苷酸进行控制。根据制造商的方案使用末端转移酶(New England Biolabs,Ipswich,MA)在转录后添加修饰的核苷酸。在添加3’-修饰的核苷酸之后，两种多核苷酸物种可在存在或不存在铜的情况下组合在水溶液中，以便经由如文献中所描述的点击化学机制形成新的共价键联。
在另一个实例中，可使用官能化的接头分子将多于两个嵌合多核苷酸和/或IVT多核苷酸连接在一起。例如，官能化的糖分子可被化学修饰成包含多个化学反应性基团(SH-、NH2-、N3等)以便与3'-官能化的mRNA分子上的同源部分(即3'-马来酰亚胺酯、3'-NHS-酯、炔基)反应。所修饰的糖上的反应性基团的数目可以化学计量方式进行控制，以便直接控制缀合的嵌合多核苷酸和/或IVT多核苷酸的化学计量比例。
在一些实施方案中，嵌合多核苷酸和/或IVT多核苷酸可以一种模式连接在一起。所述模式可以是简单交替模式如CD[CD]x，其中每个“C”和每个“D”表示嵌合多核苷酸、IVT多核苷酸、不同的嵌合多核苷酸或不同的IVT多核苷酸。所述模式可重复x次，其中x＝1-300。模式还可以是交替多重，如CCDD[CCDD]x(交替双重)或CCCDDD[CCCDDD]x(交替三重)模式。所述交替双重或交替三重可重复x次，其中x＝1-300。
多核苷酸的缀合物和组合
本公开的编码L-23多肽、IL-36-γ多肽、IL-18多肽或OX40L多肽的多核苷酸(例如，mRNA)可被设计成与以下缀合：其他多核苷酸、染料、嵌入剂(intercalating agent)(例如吖啶)、交联剂(例如补骨脂素(psoralene)、丝裂霉素C)、卟啉类(TPPC4、德克萨卟啉(texaphyrin)、噻啉(Sapphyrin))、多环芳香烃(例如吩嗪、二氢吩嗪)、人工内切核酸酶(例如EDTA)、烷化剂、磷酸酯、氨基、巯基、PEG(例如PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、取代的烷基、放射性标记的标志物、酶、半抗原(例如生物素)、转运/吸收促进剂(例如阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成核糖核酸酶、蛋白质(例如糖蛋白)或肽(例如具有针对共配体的特异性亲和力的分子)或抗体(例如结合至指定细胞类型如癌细胞、内皮细胞或骨细胞的抗体)、激素和激素受体，非肽物种如脂质、凝集素、碳水化合物、维生素、辅因子或药物。
缀合可产生增加的稳定性和/或半衰期并且可特别适用于使多核苷酸靶向细胞、组织或生物体中的特定位点。
本公开的编码IL-23多肽、IL-36-γ多肽、IL-18多肽或OX40L多肽的多核苷酸(例如，mRNA)还可包含编码一种或多种异源多肽的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述一种或多种异源多肽改进IL-23多肽、IL-36-γ多肽、IL-18多肽或OX40L多肽或编码IL-23多肽、IL-36-γ多肽、IL-18多肽或OX40L多肽的多核苷酸(例如，至少一种mRNA)的药代动力学性质或药效学性质。在另一个实施方案中，所述一种或多种异源多肽包含可延长IL-23多肽、IL-36-γ多肽、IL-18多肽或OX40L多肽的半衰期的多肽。
本公开的编码IL-23多肽、IL-36-γ多肽、IL-18多肽或OX40L多肽的多核苷酸(例如，mRNA)还可包含一个或多个充当或用作非翻译区的区或部分。按照定义，基因的野生型非翻译区(UTR)被转录但不被翻译。在mRNA中，5′UTR开始于转录起始位点并且继续至起始密码子但不包括起始密码子；而3′UTR紧随终止密码子开始并且继续直到转录终止信号。关于就核酸分子和翻译的稳定性而言UTR所起的调控作用存在越来越多的证据。UTR的调控特征可并入本发明的多核苷酸中以尤其增强分子的稳定性。在转录物被错误引导至所不希望的器官部位的情况下还可并入所述特定特征以确保转录物的受控下调。表3以及表4A和4B提供了可在本公开的多核苷酸中使用的示例性UTR的列表。
5′UTR和翻译起始
在某些实施方案中，本公开的编码IL-23多肽、IL-36-γ多肽、IL-18多肽或OX40L多肽的多核苷酸(例如，mRNA)还包含5'UTR和/或翻译起始序列。天然5′UTR携带在翻译起始中起作用的特征。它们拥有像Kozak序列的签名序列，所述Kozak序列通常已知在核糖体起始许多基因的翻译的过程中有所涉及。还已知5′UTR形成在延伸因子结合中所涉及的二级结构。
通过工程化通常在特定靶器官的丰富表达的基因中发现的特征，可增强本公开的多核苷酸的稳定性和蛋白质产生。例如，已知在癌症中上调的mRNA(如c-myc)的5'UTR的引入可用于增强癌细胞中的核酸分子(如多核苷酸)的表达。可用于设计和制造多核苷酸的非翻译区包括但不限于国际专利公布号WO 2014/164253(还参见US20160022840)中公开的那些。
表3中示出本公开的5’非翻译区的列表。可利用5’UTR的变体，其中一个或多个核苷酸被添加或移除至末端，包括A、U、C或G。
表3.5’非翻译区
其他非UTR序列也可用作所述多核苷酸内的区或亚区。例如，内含子或内含子序列的部分可并入所述多核苷酸的区中。并入内含子序列可增加蛋白质产生以及多核苷酸水平。
特征的组合可包括于侧翼区中并且可包含于其他特征内。例如，ORF可由可包含强Kozak翻译起始信号的5'UTR和/或可包括用于模板化添加聚-A尾的oligo(dT)序列的3'UTR侧接。5'UTR可包含来自相同和/或不同基因的第一多核苷酸片段和第二多核苷酸片段，如美国专利申请公布号2010-0293625中描述的5’UTR。
这些UTR或其部分可置于与它们所选自的转录物中相同的取向或可在取向或位置上有所改变。因此，5’或3’UTR可反转、缩短、延长、与一个或多个其他5’UTR或3’UTR一起制成。
在一些实施方案中，所述UTR序列可相对于参考序列以某种方式改变。例如，3′或5′UTR可通过如上所教导的取向或位置的变化而相对于野生型或天然UTR改变或可通过另外核苷酸的包含、核苷酸的缺失、核苷酸的交换或转位来改变。产生“改变的”UTR(无论是3’还是5’)的任何这些变化包含变体UTR。
在一些实施方案中，可使用双重、三重或四重UTR如5’或3’UTR。如本文所用，“双重”UTR是其中同一UTR的两个拷贝串联或大体上串联编码的一种UTR。例如，可如美国专利申请公布号2010-0129877中所述使用双β-珠蛋白3'UTR。
在一些实施方案中，侧翼区可以是异源的。在一些实施方案中，5'非翻译区可源自与3'非翻译区不同的物种。非翻译区还可包括翻译增强子元件(TEE)。作为非限制性实例，TEE可包括美国专利申请公布号2009-0226470中描述的那些。
3′UTR和富含AU的元件
在某些实施方案中，编码IL-23多肽、IL-36-γ多肽、IL-18多肽或OX40L多肽的多核苷酸(例如，mRNA)还包含3'UTR。3'-UTR是紧接在翻译终止密码子之后的mRNA区段，并且通常含有转录后影响基因表达的调控区。3'-UTR内的调控区可影响mRNA的聚腺苷酸化、翻译效率、定位和稳定性。在一个实施方案中，可用于本公开的3'-UTR包含调控性蛋白质或微小RNA的结合位点。在一些实施方案中，3'-UTR具有沉默子区，所述沉默子区与阻遏蛋白结合并抑制mRNA的表达。在其他实施方案中，3'-UTR包含富含AU的元件。蛋白质结合ARE以便以局部方式影响转录物的稳定性或衰变速率或影响翻译起始。在其他实施方案中，3'-UTR包含序列AAUAAA，其指导被称为聚(A)尾的数百个腺嘌呤残基添加至mRNA转录物的末端。
表4A示出可用于编码IL-23多肽、IL-36-γ多肽或OX40L多肽的mRNA的3'-非翻译区的列表。可利用3’UTR的变体，其中一个或多个核苷酸被添加或移除至末端，包括A、U、C或G。
表4A.示例性3’非翻译区
在某些实施方案中，可用于本公开的3'UTR序列包含与选自由SEQ ID NO:45-62以及其任何组合组成的组的序列至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的核苷酸序列。在特定实施方案中，3'UTR序列还包含miRNA结合位点，例如miR-122结合位点。在其他实施方案中，可用于本公开的3'UTR序列包含3'UTR-018(SEQ ID NO:62)。
在某些实施方案中，3'UTR序列包含一个或多个miRNA结合位点(例如miR-122结合位点)或者其中的任何其他异源核苷酸序列，而不破坏3'UTR的功能。表4B中列出了包含miRNA结合位点的3'UTR序列的一些实例。
表4B.具有miRNA结合位点的示例性3'UTR
*miRNA结合位点加框或加下划线。
在某些实施方案中，可用于本公开的3'UTR序列包含与如SEQID NO:63或64列出的序列至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的核苷酸序列。
具有5′帽的区
本公开的包含编码IL-23多肽、IL-36-γ多肽、IL-18多肽或OX40L多肽的mRNA的多核苷酸还可包含5'帽。适用于编码IL-23、IL-36-γ、IL-18多肽和/或OX40L多肽的mRNA的5'帽可结合mRNA帽结合蛋白(CBP)，从而增加mRNA稳定性。所述帽可在mRNA剪接过程中进一步帮助除去5’近端内含子。
在一些实施方案中，本公开的包含编码IL-23多肽、IL-36-γ多肽、IL-18多肽或OX40L多肽的mRNA的多核苷酸包含不可水解的帽结构，从而防止脱帽并因此增加mRNA半衰期。因为帽结构水解要求5’-ppp-5’磷酸二酯键联的裂解，所以可在加帽反应过程中使用修饰核苷酸。例如，来自New England Biolabs(Ipswich,MA)的牛痘加帽酶可根据制造商的说明书与α-硫代-鸟苷核苷酸一起使用以便在5’-ppp-5’帽中形成硫代磷酸酯键联。可使用另外修饰的鸟苷核苷酸，如α-甲基-膦酸酯和硒代-磷酸酯核苷酸。
在某些实施方案中，5'帽包含在糖环的2'-羟基上的5'-末端和/或5'-前末端核苷酸的核糖的2'-O-甲基化。在其他实施方案中，用于编码IL-23多肽、IL-36-γ多肽或OX40L多肽的mRNA的帽包括帽类似物，其在本文还被称为合成帽类似物、化学帽、化学帽类似物或结构或功能帽类似物，在其化学结构上与天然(即内源性、野生型或生理的)5’-帽不同，同时保留帽功能。帽类似物可以是化学(即非酶)或酶合成的和/或连接至本公开的多核苷酸。
例如，抗-反向帽类似物(ARCA)帽包含通过5′-5′-三磷酸酯基团连接的两个鸟嘌呤，其中一个鸟嘌呤包含N7甲基以及3′-O-甲基(即N7,3′-O-二甲基-鸟苷-5′-三磷酸酯-5′-鸟苷(m7G-3′mppp-G；其可等效地指定为3′O-Me-m7G(5')ppp(5')G)。另一未修饰鸟嘌呤的3′-O原子变成连接至加帽的多核苷酸的5′末端核苷酸。N7-和3′-O-甲基化的鸟嘌呤提供加帽的多核苷酸的末端部分。
另一种示例性帽是mCAP，其与ARCA类似但在鸟苷上具有2′-O-甲基(即N7,2′-O-二甲基-鸟苷-5′-三磷酸酯-5′-鸟苷，m7Gm-ppp-G)。
在一些实施方案中，所述帽是二核苷酸帽类似物。作为非限制性实例，二核苷酸帽类似物可在不同磷酸酯位置处用硼烷磷酸酯基团或硒代磷酸酯基团修饰，如在美国专利号US 8,519,110中描述的二核苷酸帽类似物。
在另一个实施方案中，所述帽是帽类似物，所述帽类似物是本领域中已知和/或本文描述的帽类似物的N7-(4-氯苯氧基乙基)取代的二核苷酸形式。帽类似物的N7-(4-氯苯氧基乙基)取代的二核苷酸形式的非限制性实例包括N7-(4-氯苯氧基乙基)-G(5')ppp(5')G和N7-(4-氯苯氧基乙基)-m3'-OG(5')ppp(5')G帽类似物。参见，例如，在Kore等人(2013)Bioorganic&Medicinal Chemistry 21:4570-4574中描述的各种帽类似物和合成帽类似物的方法。在另一个实施方案中，本公开的帽类似物是4-氯/溴苯氧基乙基类似物。
虽然帽类似物允许多核苷酸或其区在体外转录反应中的伴随加帽，但高达20％的转录物可仍保持未加帽。这种情况以及帽类似物与通过内源性细胞转录机器产生的核酸的内源性5’帽结构的结构差异可导致降低的翻译能力和降低的细胞稳定性。
本公开的编码mRNA的IL-23多肽、IL-36-γ多肽、IL-18多肽和/或OX40L多肽也可在制造后(无论是IVT还是化学合成)使用酶加帽，以产生更真实的5'-帽结构。如本文所用，短语“更真实的”是指在结构或功能上接近地反映或模拟内源性或野生型特征的特征。也就是说，“更真实的”特征是与现有技术的合成特征或类似物等相比，内源性、野生型、天然或生理细胞功能和/或结构的更好表示，或在一个或多个方面胜过对应的内源性、野生型、天然或生理特征的特征。
本公开的更真实的5’帽结构的非限制性实例是与本领域已知的合成5’帽结构(或与野生型、天然或生理5’帽结构)相比，除其他事项之外具有帽结合蛋白的增强的结合、增加的半衰期、对5’内切核酸酶减少的敏感性和/或减少的5’脱帽的那些实例。例如，重组牛痘病毒加帽酶和重组2′-O-甲基转移酶可在多核苷酸的5′-末端核苷酸与鸟嘌呤帽核苷酸之间形成规范的5′-5′-三磷酸酯键联，其中所述帽鸟嘌呤包含N7甲基化并且mRNA的5′-末端核苷酸包含2′-O-甲基。这种结构被称为帽1结构。这种帽导致与例如本领域已知的其他5′帽类似物结构相比更高的翻译能力和细胞稳定性以及减少的细胞促炎细胞因子的激活。帽结构包括但不限于，7mG(5')ppp(5')N,pN2p(帽0)、7mG(5')ppp(5')NlmpNp(帽1)以及7mG(5')-ppp(5')NlmpN2mp(帽2)。
根据本公开，5′末端帽可包括内源性帽或帽类似物。根据本公开，5’末端帽可包含鸟嘌呤类似物。有用的鸟嘌呤类似物包括但不限于，肌苷、N1-甲基-鸟苷、2′氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷以及2-叠氮基-鸟苷。
聚-A尾
在一些实施方案中，本公开的包含编码IL-23多肽、IL-36-γ多肽、IL-18多肽或OX40L多肽的mRNA的多核苷酸还包含聚A尾。在其他实施方案中，可并入聚-A尾上的末端基团以获得稳定化。在其他实施方案中，聚-A尾包含脱-3'羟基尾。如Li等人(2005)CurrentBiology 15:1501–1507所教导，有用的聚-A尾还可包括结构部分或2'-甲基修饰。
在一个实施方案中，当存在时，聚-A尾的长度大于30个核苷酸。在另一个实施方案中，聚-A尾的长度大于35个核苷酸(例如，至少或大于约35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500以及3,000个核苷酸)。
在一些实施方案中，多核苷酸或其区包含约30至约3,000个核苷酸(例如，30至50、30至100、30至250、30至500、30至750、30至1,000、30至1,500、30至2,000、30至2,500、50至100、50至250、50至500、50至750、50至1,000、50至1,500、50至2,000、50至2,500、50至3,000、100至500、100至750、100至1,000、100至1,500、100至2,000、100至2,500、100至3,000、500至750、500至1,000、500至1,500、500至2,000、500至2,500、500至3,000、1,000至1,500、1,000至2,000、1,000至2,500、1,000至3,000、1,500至2,000、1,500至2,500、1,500至3,000、2,000至3,000、2,000至2,500以及2,500至3,000)。
在一些实施方案中，相对于总体多核苷酸的长度或多核苷酸的特定区的长度来设计聚-A尾。这种设计可以是基于编码区的长度、特定特征或区的长度或基于从多核苷酸表达的最终产物的长度。
在这种背景下，聚-A尾可在长度上大于多核苷酸或其特征10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。聚-A尾还可被设计为它所属的多核苷酸的一部分。在这种背景下，聚-A尾可以是构建体、构建体区的总长度或构建体减去聚-A尾的总长度的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％或更多。此外，多核苷酸针对聚-A结合蛋白质的工程化的结合位点和缀合可增强表达。
另外，多个不同的多核苷酸可使用聚-A尾的3’末端处的修饰的核苷酸经由3’端一起连接至PABP(聚-A结合蛋白)。可在相关细胞系中进行转染实验并且可在转染后第12小时、第24小时、第48小时、第72小时和第7天通过ELISA测定蛋白质产生。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸被设计成包括聚A-G四联体区。G四联体是可通过DNA和RNA两者中的富含G的序列形成的四个鸟嘌呤核苷酸的环状氢键合阵列。在这个实施方案中，G四联体并入在聚-A尾的末端。在不同时间点针对稳定性、蛋白质产生和包括半衰期的其他参数来对所得多核苷酸进行测定。已发现聚A-G四联体使得来自mRNA的蛋白质产生等效于单独使用120个核苷酸的聚-A尾所观察到的蛋白质产生的至少75％。
起始密码子区
在一些实施方案中，本公开的包含编码IL-23多肽、IL-36-γ多肽、IL-18多肽或OX40L多肽的mRNA的多核苷酸还包含与起始密码子区类似或与起始密码子区类似起作用的区。
在一些实施方案中，多核苷酸的翻译起始于不为起始密码子AUG的密码子。多核苷酸的翻译可起始于替代起始密码子，如但不限于，ACG、AGG、AAG、CTG/CUG、GTG/GUG、ATA/AUA、ATT/AUU、TTG/UUG。参见Touriol等人(2003)Biology of the Cell 95:169-178以及Matsuda和Mauro(2010)PLoS ONE 5:11。作为非限制性实例，多核苷酸的翻译开始于替代起始密码子ACG。作为另一个非限制性实例，多核苷酸翻译开始于替代起始密码子CTG或CUG。作为另一个非限制性实例，多核苷酸的翻译开始于替代起始密码子GTG或GUG。
侧接起始翻译的密码子如但不限于起始密码子或替代起始密码子的核苷酸已知影响多核苷酸的翻译效率、长度和/或结构。参见例如，Matsuda和Mauro(2010)PLoS ONE 5:11。掩蔽侧接起始翻译的密码子的任何核苷酸可用于改变多核苷酸的翻译起始位置、翻译效率、长度和/或者结构。
在一些实施方案中，掩蔽剂在起始密码子或替代起始密码子附近使用以便掩蔽或隐蔽所述密码子以降低在所掩蔽的起始密码子或替代起始密码子处翻译起始的可能性。掩蔽剂的非限制性实例包括反义锁核酸(LNA)多核苷酸和外显子-连接复合物(EJC)。参见，例如，(2010)PLoS ONE 5:11，其描述了掩蔽剂LNA多核苷酸和EJC。
在另一个实施方案中，掩蔽剂用于掩蔽多核苷酸的起始密码子以便增加翻译将起始于替代起始密码子的可能性。在一些实施方案中，掩蔽剂用于掩蔽第一起始密码子或替代起始密码子，以便增加翻译将起始于所掩蔽的起始密码子或替代起始密码子下游的起始密码子或替代起始密码子的机会。
在一些实施方案中，起始密码子或替代起始密码子位于miR结合位点的完全补体内。miR结合位点的完全补体可类似于掩蔽剂帮助控制多核苷酸的翻译、长度和/或结构。作为非限制性实例，起始密码子或替代起始密码子位于miR-122结合位点的完全补体的中间中。起始密码子或替代起始密码子可位于第一核苷酸、第二核苷酸、第三核苷酸、第四核苷酸、第五核苷酸、第六核苷酸、第七核苷酸、第八核苷酸、第九核苷酸、第十核苷酸、第十一核苷酸、第十二核苷酸、第十三核苷酸、第十四核苷酸、第十五核苷酸、第十六核苷酸、第十七核苷酸、第十八核苷酸、第十九核苷酸、第二十核苷酸或第二十一核苷酸之后。
在另一个实施方案中，从多核苷酸序列中去除多核苷酸的起始密码子，以便使多核苷酸的翻译开始于不为起始密码子的密码子。多核苷酸的翻译可开始于所去除的起始密码子之后的密码子或下游起始密码子或替代起始密码子。在非限制性实例中，将作为多核苷酸序列的前3个核苷酸的起始密码子ATG或AUG去除，以便使翻译起始于下游起始密码子或替代起始密码子。去除起始密码子的多核苷酸序列还可包含至少一种用于下游起始密码子和/或替代起始密码子的掩蔽剂，以便控制或试图控制翻译的起始、多核苷酸的长度和/或多核苷酸的结构。
终止密码子区
在一些实施方案中，本公开的包含编码IL-23多肽、IL-36-γ多肽、IL-18多肽或OX40L多肽的mRNA的多核苷酸还可在3'非翻译区(UTR)之前包含至少一个终止密码子或至少两个终止密码子。终止密码子可选自UGA、UAA和UAG。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含终止密码子UGA和一个另外的终止密码子。在另一实施方案中，另外的终止密码子可以是UAA。在另一个实施方案中，本公开的多核苷酸包含三个终止密码子、四个终止密码子或更多。
X.制备多核苷酸的方法
本公开还提供了用于制备本文公开的多核苷酸或其补体的方法。在一些方面，可使用体外转录来构建本文公开并且编码IL-23多肽、IL-36-γ多肽或OX40L多肽的多核苷酸(例如，mRNA)。
在其他方面，可使用寡核苷酸合成仪通过化学合成来构建本文公开并且编码IL-23多肽、IL-36-γ多肽、IL-18多肽或OX40L多肽的多核苷酸(例如，mRNA)。在其他方面，通过使用宿主细胞来制备本文公开并且编码IL-23多肽、IL-36-γ多肽、IL-18多肽或OX40L多肽的多核苷酸(例如，mRNA)。在某些方面，通过IVT、化学合成、宿主细胞表达或本领域中已知的任何其他方法的一种或多种组合来制备本文公开并且编码IL-23多肽、IL-36-γ多肽、IL-18多肽或OX40L多肽的多核苷酸(例如，mRNA)。
天然存在的核苷、非天然存在的核苷或其组合可完全或部分置换候选核苷酸序列中天然存在的核苷并且可并入编码IL-23多肽、IL-36-γ多肽、IL-18多肽或OX40L多肽的序列优化的核苷酸序列(例如，mRNA)中。然后可针对所得mRNA产生蛋白质和/或产生治疗结果的能力对其进行检查。
体外转录-酶合成
本文公开的多核苷酸可使用体外转录(IVT)系统进行转录。所述系统通常包括转录缓冲液、核苷酸三磷酸(NTP)、RNA酶抑制剂和聚合酶。NTP可选自但不限于本文所描述的那些，包括天然和非天然(修饰的)NTP。聚合酶可选自但不限于T7RNA聚合酶、T3RNA聚合酶和突变体聚合酶如但不限于能够并入修饰核酸的聚合酶。参见美国公布号US2013-0259923。
所述IVT系统通常包括转录缓冲液、核苷酸三磷酸(NTP)、RNA酶抑制剂和聚合酶。NTP可选自但不限于本文所描述的那些，包括天然和非天然(修饰的)NTP。聚合酶可选自但不限于T7RNA聚合酶、T3RNA聚合酶和突变体聚合酶，如但不限于能够并入本文公开的多核苷酸的聚合酶。
任何数量的RNA聚合酶或变体可用于本公开的多核苷酸的合成中。
RNA聚合酶可通过插入或缺失RNA聚合酶序列的氨基酸来进行修饰。作为非限制性实例，对RNA聚合酶进行修饰以与未修饰的RNA聚合酶相比，表现出并入2'-修饰的核苷酸三磷酸的能增加力。参见国际公布WO2008078180和美国专利8,101,385。
可通过进化RNA聚合酶、优化RNA聚合酶氨基酸和/或核酸序列和/或通过使用本领域中已知的其他方法来获得变体。作为非限制性实例，T7RNA聚合酶变体可使用由Esvelt等人(2011)Nature472:499-503提出的连续定向进化系统进行进化，其中T7RNA聚合酶的克隆可编码至少一个突变，如但不限于，位置93处的赖氨酸取代为苏氨酸(K93T)、I4M、A7T、E63V、V64D、A65E、D66Y、T76N、C125R、S128R、A136T、N165S、G175R、H176L、Y178H、F182L、L196F、G198V、D208Y、E222K、S228A、Q239R、T243N、G259D、M267I、G280C、H300R、D351A、A354S、E356D、L360P、A383V、Y385C、D388Y、S397R、M401T、N410S、K450R、P451T、G452V、E484A、H523L、H524N、G542V、E565K、K577E、K577M、N601S、S684Y、L699I、K713E、N748D、Q754R、E775K、A827V、D851N或L864F。作为另一个非限制性实例，T7RNA聚合酶变体可编码如美国公布号20100120024和20070117112中所描述的至少一个突变。RNA聚合酶的变体还可包括但不限于，取代变体、保守氨基酸取代、插入变体、缺失变体和/或共价变体。
在一个方面，多核苷酸可被设计成由野生型或变体RNA聚合酶识别。这样做时，多核苷酸可被修饰成包含来自野生型或亲本嵌合多核苷酸的序列变化的位点或区。
多核苷酸或核酸合成反应可通过使用聚合酶的酶方法来进行。聚合酶催化多核苷酸或核酸链中的核苷酸之间的磷酸二酯键的形成。当前已知的DNA聚合酶可基于氨基酸序列比较和晶体结构分析分成不同的家族。DNA聚合酶I(pol I)或A聚合酶家族，包括大肠杆菌、芽孢杆菌DNA聚合酶I、栖热水生菌(Taq)DNA聚合酶以及T7RNA和DNA聚合酶的Klenow片段在这些家族中得到最好研究。另一个大家族是DNA聚合酶α(polα)或B聚合酶家族，包括所有真核复制DNA聚合酶和来自噬菌体T4和RB69的聚合酶。尽管它们采用类似的催化机制，但这些聚合酶家族在底物特异性、底物类似物并入效率、引物延伸的程度和速率、DNA合成模式、核酸外切酶活性和针对抑制剂的敏感性方面不同。
DNA聚合酶也基于它们所需的最佳反应条件，如反应温度、pH以及模板和引物浓度来进行选择。有时使用多于一种DNA聚合酶的组合来实现所需的DNA片段大小和合成效率。例如，Cheng等人增加pH，添加甘油和二甲亚砜，减少变性时间，增加延长时间，并且利用具有3'至5'外切核酸酶活性的二级热稳定DNA聚合酶来有效扩增来自克隆插入物和人基因组DNA的长靶标。Cheng等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:5695-5699。来自噬菌体T3、T7和SP6的RNA聚合酶已广泛用于制备用于生物化学和生物物理研究的RNA。RNA聚合酶、加帽酶和聚-A聚合酶公开于国际公布号WO2014028429中(还参见US 20150211039)。
在一个方面，可用于合成本文所述多核苷酸的RNA聚合酶是Syn5RNA聚合酶。参见Zhu等人(2013)Nucleic Acids Research288:3545-3552。Syn5RNA聚合酶最近由Zhu等人从海洋噬藻体Syn5表征，其中他们还鉴别了启动子序列。参见Zhu等人(2013)NucleicAcidsResearch 288:3545-3552。Zhu等人发现相较于T7RNA聚合酶，Syn5RNA聚合酶在更广泛的温度和盐度范围内催化RNA合成。此外，据发现对启动子处的启动核苷酸的需要对Syn5RNA聚合酶相较于T7RNA聚合酶不那么严格，从而使得Syn5RNA聚合酶有望用于RNA合成。
在一个方面，Syn5RNA聚合酶可用于本文所述的多核苷酸的合成中。作为非限制性实例，Syn5RNA聚合酶可用于需要精确3'-末端的多核苷酸的合成。
在一个方面，Syn5启动子可用于多核苷酸的合成。作为非限制性实例，Syn5启动子可以是如Zhu等人(2013)Nucleic Acids Research288:3545-3552所描述的5′-ATTGGGCACCCGTAAGGG-3′。
在一个方面，Syn5RNA聚合酶可用于包含本文所述和/或本领域中已知的至少一种化学修饰的多核苷酸的合成。(参见例如，描述于Zhu等人(2013)Nucleic Acids Research288:3545-3552中的假-UTP和5Me-CTP的并入。
在一个方面，本文所述的多核苷酸可使用Syn5RNA聚合酶合成，所述聚合酶已使用由Zhu等人(2013)Nucleic Acids Research288:3545-3552描述的修改的和改进的纯化程序进行纯化。
遗传工程化中的各种工具是基于充当模板的靶基因的酶扩增。为了研究单个基因或特定目标区域的序列和其他研究需求，有必要从多核苷酸或核酸的小样品中产生靶基因的多个拷贝。此类方法可用于制造本公开的多核苷酸。
聚合酶链式反应(PCR)在靶基因的快速扩增以及基因组定位和测序中具有广泛应用。用于合成DNA的关键组分包含作为模板的靶DNA分子、与靶DNA链的末端互补的引物、作为结构单元的脱氧核苷三磷酸(dNTP)以及DNA聚合酶。当PCR通过变性、退火和延伸步骤时，新产生的DNA分子可充当下一复制循环的模板，从而实现靶DNA的指数扩增。PCR需要加热和冷却循环以进行变性和退火。基本PCR的变化形式包括不对称PCR(Innis等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:9436-9440)、反向PCR(Ochman等人(1988)Genetics120:621-623)、逆转录PCR(RT-PCR)(Freeman等人(1999)BioTechniques 26:112-22,124-5)。在RT-PCR中，单链RNA是所需靶标并且首先通过逆转录酶转化为双链DNA。
已开发了各种等温体外核酸扩增技术作为PCR的替代或补充。例如，链置换扩增(SDA)是基于限制酶形成切口的能力。Walker等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:392-396，其内容以引用的方式整体并入本文。
将限制酶识别序列插入退火的引物序列中。将引物通过DNA聚合酶和dNTP延伸以形成双链体。将双链体的仅一条链通过限制酶裂解。然后每个单链链可用作后续合成的模板。SDA不需要PCR的复杂温度控制循环。
基于核酸序列的扩增(NASBA)(还称为转录介导的扩增(TMA))也是利用DNA聚合酶、逆转录酶、RNA酶H和T7RNA聚合酶的组合的等温扩增方法。Compton(1991)Nature 350:91-92。靶RNA用作模板，并且逆转录酶合成其互补DNA链。RNA酶H水解RNA模板，从而为DNA聚合酶提供空间以合成与第一DNA链互补的DNA链，所述第一DNA链与RNA靶标互补，从而形成DNA双链体。T7RNA聚合酶连续产生此DNA双链体的互补RNA链。这些RNA链充当DNA合成的新循环的模板，从而导致靶基因的扩增。
滚环扩增(RCA)扩增单链环形多核苷酸，并且涉及多轮等温酶合成，其中Ф29DNA聚合酶通过在多核苷酸环周围连续行进来延伸引物，以反复地复制其序列。因此，实现了环形模板的线性拷贝。然后可将引物与此线性拷贝退火，并且可合成其互补链。参见Lizardi等人(1998)Nature Genetics 19:225-232。单链环形DNA还可在RNA聚合酶存在下充当RNA合成的模板。Daubendiek等人(1995)JACS117:7818-7819。cDNA末端的反向快速扩增(RACE)RCA由Polidoros等人描述。将信使RNA(mRNA)逆转录成cDNA，随后进行RNA酶H处理以分离cDNA。然后将cDNA通过Circ连接酶环化成环形DNA。所得环形DNA的扩增用RCA实现。Polidoros等人(2006)BioTechniques 41:35-42。
任何前述方法可用于制造本公开的多核苷酸的一个或多个区。
还广泛使用了通过连接酶组装多核苷酸或核酸。DNA或RNA连接酶通过形成磷酸二酯键来促进多核苷酸链的5'和3'末端的分子间连接。连接酶链式反应(LCR)是一种有希望的诊断技术，所述技术基于两个相邻的多核苷酸探针与靶基因的一条链杂交且通过连接酶彼此偶联的原理。如果不存在靶基因，或者如果在靶基因处存在错配，如单核苷酸多态性(SNP)，则探针不能是连接酶Wiedmann等人(1994)PCR Methods and Application 3(4):s51-s64。LCR可与各种扩增技术组合以提高检测的灵敏度或者如果其用于合成多核苷酸和核酸则增加产物的量。
用于核酸的若干文库制备试剂盒现在可商购。它们包括酶和缓冲液以将少量核酸样品转化成用于下游应用的索引文库。例如，可将DNA片段置于NewEngland 的ULTRATMDNA文库制备试剂盒中以用于末端制备、连接、大小选择、净化、PCR扩增和最终净化。
正在进行持续开发以改进扩增技术。例如，Asada等人的美国专利8,367,328教导了利用反应增强剂来提高通过DNA聚合酶进行的DNA合成反应的效率。反应增强剂包含酸性物质或酸性物质的阳离子复合物。Kitabayashi等人的美国专利7.384,739教导了促进酶DNA合成的提供羧酸根离子的物质，其中所述提供羧酸根离子的物质选自草酸、丙二酸、草酸酯、丙二酸酯、丙二酸盐和马来酸酯。Sobek等人的美国专利7,378,262公开了提高DNA扩增的保真度的酶组合物。所述组合物包含一种具有3'核酸外切酶活性但不具有聚合酶活性的酶和另一种为聚合酶的酶。这两种酶均是热稳定的，并且被可逆地修饰成在较低温度下是无活性的。
Getts等人的美国专利7,550,264教导了有义RNA分子的多轮合成通过将寡脱氧核苷酸尾连接到cDNA分子的3'末端上并且使用RNA聚合酶起始RNA转录来进行。Rohayem的美国专利公布号2013/0183718教导了通过RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)进行的RNA合成，所述聚合酶在单链DNA模板上展示RNA聚合酶活性。具有非标准核苷酸的寡核苷酸可通过使包含非标准核苷酸的模板与同如在Benner的美国专利号6,617,106中公开的模板的核苷酸互补的核苷酸混合物接触、用酶聚合来合成。
化学合成
标准方法可用于合成编码IL-23多肽、IL-36-γ多肽、IL-18多肽和/或OX40L多肽的分离的多核苷酸序列。例如，可合成含有编码特定分离多肽的密码子优化的核苷酸序列的单一DNA或RNA寡聚体。在其他方面，可合成且然后连接几个编码所希望多肽部分的小寡核苷酸。在一些方面，单独的寡核苷酸典型地包含用于互补组件的5’或3’突出端。
本文公开的多核苷酸(例如，mRNA)可使用本领域中已知的化学合成方法和潜在的核碱基取代来化学合成。参见例如，国际公布号WO2014093924(还参见US20150307542)、WO2013052523(还参见US20130115272)；WO2013039857、WO2012135805(还参见US20120251618)、WO2013151671(还参见US20150044277)；美国公布号US20130115272；或美国专利号US8999380、US8710200。
纯化
本文所述的编码IL-23多肽、IL-36-γ多肽、IL-18多肽和/或OX40L多肽的多核苷酸(例如，mRNA)的纯化可包括但不限于多核苷酸净化、质量保证和质量控制。净化可通过本领域已知的方法如但不限于珠粒(Beckman Coulter Genomics,Danvers,MA)、聚-T珠粒、LNATM oligo-T捕获探针(Inc,Vedbaek,Denmark)，或基于HPLC的纯化方法如但不限于强阴离子交换HPLC、弱阴离子交换HPLC、反相HPLC(RP-HPLC)以及疏水相互作用HPLC(HIC-HPLC)来进行。术语“纯化的”当关于多核苷酸使用时如“纯化的多核苷酸”是指与至少一种污染物分离的多核苷酸。如本文所用，“污染物”是使另一种物质不适当、不纯或低品质的任何物质。因此，纯化的多核苷酸(例如DNA和RNA)以不同于在自然中发现它的形式或布置的形式或布置、或不同于在使它经受处理或纯化方法之前存在的形式或布置的形式或布置存在。
在一些实施方案中，纯化本公开的编码IL-23多肽、IL-36-γ多肽、IL-18多肽和/或OX40L多肽的多核苷酸(例如，mRNA)除去可减少或除去不想要的免疫应答，例如降低细胞因子活性的杂质。
在一些实施方案中，在施用之前使用柱色谱法(例如，强阴离子交换HPLC、弱阴离子交换HPLC、反相HPLC(RP-HPLC)和疏水相互作用HPLC(HIC-HPLC)或(LCMS))纯化本公开的编码IL-23多肽、IL-36-γ多肽、IL-18多肽和/或OX40L多肽的多核苷酸(例如，mRNA)。在一些实施方案中，相较于通过不同纯化方法纯化的编码IL-23多肽、IL-36-γ多肽、IL-18多肽和/或OX40L多肽的多核苷酸，柱色谱法(例如，强阴离子交换HPLC、弱阴离子交换HPLC、反相HPLC(RP-HPLC)和疏水相互作用HPLC(HIC-HPLC)或(LCMS))纯化的多核苷酸(其编码本文公开的IL-23多肽、IL-36-γ多肽、IL-18多肽和/或OX40L多肽)增加IL-23多肽、IL-36-γ多肽、IL-18多肽和/或OX40L多肽的表达。
在一些实施方案中，柱色谱法(例如，强阴离子交换HPLC、弱阴离子交换HPLC、反相HPLC(RP-HPLC)和疏水相互作用HPLC(HIC-HPLC)或(LCMS))纯化的多核苷酸编码哺乳动物IL-23多肽、哺乳动物IL-36-γ多肽、IL-18多肽和/或哺乳动物OX40L多肽。在一些实施方案中，所述纯化的多核苷酸编码IL-23多肽、IL-36-γ多肽、IL-18多肽和/或OX40L多肽。在一些实施方案中，所述纯化的多核苷酸编码人IL-23多肽、人IL-36-γ多肽、IL-18多肽和/或人OX40L多肽。
在一些实施方案中，所述纯化的多核苷酸是至少约80％纯、至少约85％纯、至少约90％纯、至少约95％纯、至少约96％纯、至少约97％纯、至少约98％纯、至少约99％纯或约100％纯。
质量保证和/或质量控制检查可使用诸如但不限于凝胶电泳、UV吸光度或分析型HPLC的方法来进行。
在另一个实施方案中，多核苷酸可通过包括但不限于逆转录酶PCR的方法来测序。
XI.化学修饰
如本文所用，在根据本公开的包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其组合中，术语“化学修饰”或在适当时“化学修饰的”是指相对于腺苷(A)、鸟苷(G)、尿苷(U)、胸苷(T)或胞苷(C)核糖核苷或脱氧核糖核苷在它们的位置、模式、百分比或群体中的一个或多个方面的修饰。一般来说，在本文中，这些术语不意图指天然存在的5′末端mRNA帽部分中的核糖核苷酸修饰。
在多肽中，术语“修饰”是指如与20个氨基酸的规范组相比的修饰。
所述修饰可以是各种不同的修饰。在一些实施方案中，所述区可含有一种、两种或更多种(任选不同的)核苷或核苷酸(核碱基)修饰。在一些实施方案中，引入至细胞的修饰的多核苷酸可表现出与未修饰的多核苷酸相比，细胞中的降解减少。在其他实施方案中，修饰是在核碱基和/或糖结构中。在其他实施方案中，修饰是在主链结构中。
化学修饰
本公开的一些实施方案提供包含编码IL-23多肽的mRNA的第一多核苷酸和包含编码IL-36-γ多肽或IL-18多肽的mRNA的第二多核苷酸或包含编码OX40L多肽的mRNA第三多核苷酸，其中所述mRNA包含至少一种化学修饰。
本公开的其他实施方案提供包含编码IL-23多肽的mRNA的第一多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽或IL-18多肽的mRNA的第二多核苷酸和包含编码OX40L多肽的mRNA第三多核苷酸，其中所述mRNA包含至少一种化学修饰。
在一些实施方案中，所述化学修饰是选自假尿苷、N1-甲基假尿苷、2-硫代尿苷、4’-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲基尿苷)、5-甲氧基尿苷以及2’-O-甲基尿苷。
如本文所用的“核苷”是指含有糖分子(例如，戊糖或核糖)或其衍生物与有机碱基(例如，嘌呤或嘧啶)或其衍生物(本文还被称为“核碱基”)的组合的化合物。如本文所用的“核苷酸”是指核苷，包括磷酸酯基团。修饰的核苷酸可通过任何有用的方法，例如像化学、酶促或重组地合成，以包括一个或多个修饰的或非天然的核苷。多核苷酸可包含连接的核苷的一个或多个区。此类区可具有可变主链键联。所述键联可以是标准磷酸二酯键联，在这种情况下多核苷酸将包含核苷酸的区。
修饰的核苷酸碱基配对不仅涵盖标准腺苷-胸腺嘧啶、腺苷-尿嘧啶或鸟苷-胞嘧啶碱基对，而且涵盖在核苷酸和/或包含非标准或修饰的碱基的修饰的核苷酸之间形成的碱基对，其中氢键供体和氢键受体的排列允许非标准碱基与标准碱基之间或两个互补的非标准碱基结构之间的氢键合。这种非标准碱基配对的一个实例是修饰核苷酸肌苷与腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶之间的碱基配对。碱/糖或接头的任何组合可并入本公开的多核苷酸中。
本领域技术人员将理解，除非另有说明，否则本申请中列出的多核苷酸序列将在代表性DNA序列中列举“T”，但是当序列代表RNA时，“T”将被取代为“U”。
可用于本公开的多核苷酸、组合物、方法和合成方法中的多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，如mRNA多核苷酸)的修饰包括但不限于以下核苷酸、核苷和核碱基：2-甲硫基-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷；2-甲硫基-N6-甲基腺苷；2-甲硫基-N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷；N6-甘氨酰基氨基甲酰基腺苷；N6-异戊烯基腺苷；N6-甲基腺苷；N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷；1,2′-O-二甲基腺苷；1-甲基腺苷；2′-O-甲基腺苷；2′-O-核糖基腺苷(磷酸酯)；2-甲基腺苷；2-甲硫基-N6异戊烯基腺苷；2-甲硫基-N6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基腺苷；2'-O-甲基腺苷；2'-O-核糖基腺苷(磷酸酯)；异戊烯基腺苷；N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷；N6,2′-O-二甲基腺苷；N6,2'-O-二甲基腺苷；N6,N6,2′-O-三甲基腺苷；N6,N6-二甲基腺苷；N6-乙酰基腺苷；N6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基腺苷；N6-甲基-N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷；2-甲基腺苷；2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷；7-脱氮-腺苷；N1-甲基-腺苷；N6,N6(二甲基)腺嘌呤；N6-顺式-羟基-异戊烯基-腺苷；α-硫代-腺苷；2(氨基)腺嘌呤；2(氨基丙基)腺嘌呤；2(甲硫基)N6(异戊烯基)腺嘌呤；2-(烷基)腺嘌呤；2-(氨基烷基)腺嘌呤；2-(氨基丙基)腺嘌呤；2-(卤代)腺嘌呤；2-(卤代)腺嘌呤；2-(丙基)腺嘌呤；2’-氨基-2’-脱氧-ATP；2’-叠氮基-2’-脱氧-ATP；2'-脱氧-2'-a-氨基腺苷TP；2'-脱氧-2'-a-叠氮基腺苷TP；6(烷基)腺嘌呤；6(甲基)腺嘌呤；6-(烷基)腺嘌呤；6-(甲基)腺嘌呤；7(脱氮)腺嘌呤；8(烯基)腺嘌呤；8(炔基)腺嘌呤；8(氨基)腺嘌呤；8(硫代烷基)腺嘌呤；8-(烯基)腺嘌呤；8-(烷基)腺嘌呤；8-(炔基)腺嘌呤；8-(氨基)腺嘌呤；8-(卤代)腺嘌呤；8-(羟基)腺嘌呤；8-(硫代烷基)腺嘌呤；8-(硫醇)腺嘌呤；8-叠氮基-腺苷；氮杂腺嘌呤；脱氮腺嘌呤；N6(甲基)腺嘌呤；N6-(异戊基)腺嘌呤；7-脱氮-8-氮杂-腺苷；7-甲基腺嘌呤；1-脱氮腺苷TP；2’氟-N6-Bz-脱氧腺苷TP；2’-OMe-2-氨基-ATP；2’O-甲基-N6-Bz-脱氧腺苷TP；2'-a-乙炔基腺苷TP；2-氨基腺嘌呤；2-氨基腺苷TP；2-氨基-ATP；2'-a-三氟甲基腺苷TP；2-叠氮基腺苷TP；2'-b-乙炔基腺苷TP；2-溴腺苷TP；2'-b-三氟甲基腺苷TP；2-氯腺苷TP；2'-脱氧-2',2'-二氟腺苷TP；2'-脱氧-2'-a-巯基腺苷TP；2'-脱氧-2'-a-硫代甲氧基腺苷TP；2'-脱氧-2'-b-氨基腺苷TP；2'-脱氧-2'-b-叠氮基腺苷TP；2'-脱氧-2'-b-溴腺苷TP；2'-脱氧-2'-b-氯腺苷TP；2'-脱氧-2'-b-氟腺苷TP；2'-脱氧-2'-b-碘腺苷TP；2'-脱氧-2'-b-巯基腺苷TP；2'-脱氧-2'-b-硫代甲氧基腺苷TP；2-氟腺苷TP；2-碘腺苷TP；2-巯基腺苷TP；2-甲氧基-腺嘌呤；2-甲硫基-腺嘌呤；2-三氟甲基腺苷TP；3-脱氮-3-溴腺苷TP；3-脱氮-3-氯腺苷TP；3-脱氮-3-氟腺苷TP；3-脱氮-3-碘腺苷TP；3-脱氮腺苷TP；4'-叠氮基腺苷TP；4'-碳环腺苷TP；4'-乙炔基腺苷TP；5'-Homo-腺苷TP；8-氮杂-ATP；8-溴-腺苷TP；8-三氟甲基腺苷TP；9-脱氮腺苷TP；2-氨基嘌呤；7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤；7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤；7-脱氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤；2,6-二氨基嘌呤；7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤,7-脱氮-2-氨基嘌呤；2-硫代胞苷；3-甲基胞苷；5-甲酰基胞苷；5-羟甲基胞苷；5-甲基胞苷；N4-乙酰基胞苷；2′-O-甲基胞苷；2'-O-甲基胞苷；5,2′-O-二甲基胞苷；5-甲酰基-2′-O-甲基胞苷；赖胞苷；N4,2′-O-二甲基胞苷；N4-乙酰基-2′-O-甲基胞苷；N4-甲基胞苷；N4,N4-二甲基-2’-OMe-胞苷TP；4-甲基胞苷；5-氮杂-胞苷；假-异-胞苷；吡咯并-胞苷；α-硫代-胞苷；2-(硫代)胞嘧啶；2’-氨基-2’-脱氧-CTP；2’-叠氮基-2’-脱氧-CTP；2'-脱氧-2'-a-氨基胞苷TP；2'-脱氧-2'-a-叠氮基胞苷TP；3(脱氮)5(氮杂)胞嘧啶；3(甲基)胞嘧啶；3-(烷基)胞嘧啶；3-(脱氮)5(氮杂)胞嘧啶；3-(甲基)胞苷；4,2'-O-二甲基胞苷；5(卤代)胞嘧啶；5(甲基)胞嘧啶；5(丙炔基)胞嘧啶；5(三氟甲基)胞嘧啶；5-(烷基)胞嘧啶；5-(炔基)胞嘧啶；5-(卤代)胞嘧啶；5-(丙炔基)胞嘧啶；5-(三氟甲基)胞嘧啶；5-溴-胞苷；5-碘-胞苷；5-丙炔基胞嘧啶；6-(偶氮)胞嘧啶；6-氮杂-胞苷；氮杂胞嘧啶；脱氮胞嘧啶；N4(乙酰基)胞嘧啶；1-甲基-1-脱氮-假异胞苷；1-甲基-假异胞苷；2-甲氧基-5-甲基-胞苷；2-甲氧基-胞苷；2-硫代-5-甲基-胞苷；4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷；4-甲氧基-假异胞苷；4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷；4-硫代-1-甲基-假异胞苷；4-硫代-假异胞苷；5-氮杂-泽布拉恩；5-甲基-泽布拉恩；吡咯并-假异胞苷；泽布拉恩；(E)-5-(2-溴-乙烯基)胞苷TP；2,2’-脱水-胞苷TP盐酸盐；2’氟-N4-Bz-胞苷TP；2’氟-N4-乙酰基-胞苷TP；2’-O-甲基-N4-乙酰基-胞苷TP；2’O-甲基-N4-Bz-胞苷TP；2'-a-乙炔基胞苷TP；2'-a-三氟甲基胞苷TP；2'-b-乙炔基胞苷TP；2'-b-三氟甲基胞苷TP；2'-脱氧-2',2'-二氟胞苷TP；2'-脱氧-2'-a-巯基胞苷TP；2'-脱氧-2'-a-硫代甲氧基胞苷TP；2'-脱氧-2'-b-氨基胞苷TP；2'-脱氧-2'-b-叠氮基胞苷TP；2'-脱氧-2'-b-溴胞苷TP；2'-脱氧-2'-b-氯胞苷TP；2'-脱氧-2'-b-氟胞苷TP；2'-脱氧-2'-b-碘胞苷TP；2'-脱氧-2'-b-巯基胞苷TP；2'-脱氧-2'-b-硫代甲氧基胞苷TP；2'-O-甲基-5-(1-丙炔基)胞苷TP；3'-乙炔基胞苷TP；4'-叠氮基胞苷TP；4'-碳环胞苷TP；4'-乙炔基胞苷TP；5-(1-丙炔基)ara-胞苷TP；5-(2-氯-苯基)-2-硫代胞苷TP；5-(4-氨基-苯基)-2-硫代胞苷TP；5-氨基烯丙基-CTP；5-氰基胞苷TP；5-乙炔基ara-胞苷TP；5-乙炔基胞苷TP；5'-Homo-胞苷TP；5-甲氧基胞苷TP；5-三氟甲基-胞苷TP；N4-氨基-胞苷TP；N4-苯甲酰基-胞苷TP；假异胞苷；7-甲基鸟苷；N2,2′-O-二甲基鸟苷；N2-甲基鸟苷；怀俄苷；1,2′-O-二甲基鸟苷；1-甲基鸟苷；2′-O-甲基鸟苷；2′-O-核糖基鸟苷(磷酸酯)；2'-O-甲基鸟苷；2'-O-核糖基鸟苷(磷酸酯)；7-氨基甲基-7-脱氮鸟苷；7-氰基-7-脱氮鸟苷；古嘌苷；甲基怀俄苷；N2,7-二甲基鸟苷；N2,N2,2′-O-三甲基鸟苷；N2,N2,7-三甲基鸟苷；N2,N2-二甲基鸟苷；N2,7,2'-O-三甲基鸟苷；6-硫代-鸟苷；7-脱氮-鸟苷；8-氧代-鸟苷；N1-甲基-鸟苷；α-硫代-鸟苷；2(丙基)鸟嘌呤；2-(烷基)鸟嘌呤；2’-氨基-2’-脱氧-GTP；2’-叠氮基-2’-脱氧-GTP；2'-脱氧-2'-a-氨基鸟苷TP；2'-脱氧-2'-a-叠氮基鸟苷TP；6(甲基)鸟嘌呤；6-(烷基)鸟嘌呤；6-(甲基)鸟嘌呤；6-甲基-鸟苷；7(烷基)鸟嘌呤；7(脱氮)鸟嘌呤；7(甲基)鸟嘌呤；7-(烷基)鸟嘌呤；7-(脱氮)鸟嘌呤；7-(甲基)鸟嘌呤；8(烷基)鸟嘌呤；8(炔基)鸟嘌呤；8(卤代)鸟嘌呤；8(硫代烷基)鸟嘌呤；8-(烯基)鸟嘌呤；8-(烷基)鸟嘌呤；8-(炔基)鸟嘌呤；8-(氨基)鸟嘌呤；8-(卤代)鸟嘌呤；8-(羟基)鸟嘌呤；8-(硫代烷基)鸟嘌呤；8-(硫醇)鸟嘌呤；氮杂鸟嘌呤；脱氮鸟嘌呤；N(甲基)鸟嘌呤；N-(甲基)鸟嘌呤；1-甲基-6-硫代-鸟苷；6-甲氧基-鸟苷；6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷；6-硫代-7-脱氮-鸟苷；6-硫代-7-甲基-鸟苷；7-脱氮-8-氮杂-鸟苷；7-甲基-8-氧代-鸟苷；N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟苷；N2-甲基-6-硫代-鸟苷；1-Me-GTP；2’氟-N2-异丁基-鸟苷TP；2’O-甲基-N2-异丁基-鸟苷TP；2'-a-乙炔基鸟苷TP；2'-a-三氟甲基鸟苷TP；2'-b-乙炔基鸟苷TP；2'-b-三氟甲基鸟苷TP；2'-脱氧-2',2'-二氟鸟苷TP；2'-脱氧-2'-a-巯基鸟苷TP；2'-脱氧-2'-a-硫代甲氧基鸟苷TP；2'-脱氧-2'-b-氨基鸟苷TP；2'-脱氧-2'-b-叠氮基鸟苷TP；2'-脱氧-2'-b-溴鸟苷TP；2'-脱氧-2'-b-氯鸟苷TP；2'-脱氧-2'-b-氟鸟苷TP；2'-脱氧-2'-b-碘鸟苷TP；2'-脱氧-2'-b-巯基鸟苷TP；2'-脱氧-2'-b-硫代甲氧基鸟苷TP；4'-叠氮基鸟苷TP；4'-碳环鸟苷TP；4'-乙炔基鸟苷TP；5'-Homo-鸟苷TP；8-溴-鸟苷TP；9-脱氮鸟苷TP；N2-异丁基-鸟苷TP；1-甲基肌苷；肌苷；1,2′-O-二甲基肌苷；2′-O-甲基肌苷；7-甲基肌苷；2'-O-甲基肌苷；环氧辫苷；半乳糖基-辫苷；甘露糖基辫苷；辫苷；烯丙基氨基-胸苷；氮杂胸苷；脱氮胸苷；脱氧-胸苷；2’-O-甲基尿苷；2-硫代尿苷；3-甲基尿苷；5-羧甲基尿苷；5-羟基尿苷；5-甲基尿苷；5-牛磺酸甲基-2-硫代尿苷；5-牛磺酸甲基尿苷；二氢尿苷；假尿苷；(3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷；1-甲基-3-(3-氨基-5-羧基丙基)假尿苷；1-甲基假尿苷；1-乙基-假尿苷；2′-O-甲基尿苷；2'-O-甲基假尿苷；2'-O-甲基尿苷；2-硫代-2′-O-甲基尿苷；3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷；3,2′-O-二甲基尿苷；3-甲基-假-尿苷TP；4-硫代尿苷；5-(羧基羟甲基)尿苷；5-(羧基羟甲基)尿苷甲酯；5,2′-O-二甲基尿苷；5,6-二氢-尿苷；5-氨基甲基-2-硫代尿苷；5-氨基甲酰基甲基-2′-O-甲基尿苷；5-氨基甲酰基甲基尿苷；5-羧基羟甲基尿苷；5-羧基羟甲基尿苷甲酯；5-羧甲基氨基甲基-2′-O-甲基尿苷；5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷；5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷；5-羧甲基氨基甲基尿苷；5-羧甲基氨基甲基尿苷；5-氨基甲酰基甲基尿苷TP；5-甲氧基羰基甲基-2′-O-甲基尿苷；5-甲氧基羰基甲基-2-硫代尿苷；5-甲氧基羰基甲基尿苷；5-甲基尿苷；5-甲氧基尿苷；5-甲基-2-硫代尿苷；5-甲基氨基甲基-2-硒代尿苷；5-甲基氨基甲基-2-硫代尿苷；5-甲基氨基甲基尿苷；5-甲基二氢尿苷；5-氧乙酸-尿苷TP；5-氧乙酸-甲酯-尿苷TP；N1-甲基-假-尿嘧啶；N1-乙基-假-尿嘧啶；尿苷5-氧乙酸；尿苷5-氧乙酸甲酯；3-(3-氨基-3-羧基丙基)-尿苷TP；5-(异-戊烯基氨基甲基)-2-硫代尿苷TP；5-(异-戊烯基氨基甲基)-2'-O-甲基尿苷TP；5-(异-戊烯基氨基甲基)尿苷TP；5-丙炔基尿嘧啶；α-硫代-尿苷；1(氨基烷基氨基-羰基乙烯基)-2(硫代)-假尿嘧啶；1(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-2,4-(二硫代)假尿嘧啶；1(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-4(硫代)假尿嘧啶；1(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-假尿嘧啶；1(氨基羰基乙烯基)-2(硫代)-假尿嘧啶；1(氨基羰基乙烯基)-2,4-(二硫代)假尿嘧啶；1(氨基羰基乙烯基)-4(硫代)假尿嘧啶；1(氨基羰基乙烯基)-假尿嘧啶；1取代的2(硫代)-假尿嘧啶；1取代的2,4-(二硫代)假尿嘧啶；1取代的4(硫代)假尿嘧啶；1取代的假尿嘧啶；1-(氨基烷基氨基-羰基乙烯基)-2-(硫代)-假尿嘧啶；1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷TP；1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假-UTP；1-甲基-假-UTP；1-乙基-假-UTP；2(硫代)假尿嘧啶；2'脱氧尿苷；2'氟尿苷；2-(硫代)尿嘧啶；2,4-(二硫代)假尿嘧啶；2’甲基、2’氨基、2’叠氮基、2’氟-鸟苷；2’-氨基-2’-脱氧-UTP；2’-叠氮基-2’-脱氧-UTP；2’-叠氮基-脱氧尿苷TP；2’-O-甲基假尿苷；2′脱氧尿苷；2′氟尿苷；2'-脱氧-2'-a-氨基尿苷TP；2'-脱氧-2'-a-叠氮基尿苷TP；2-甲基假尿苷；3(3氨基-3羧基丙基)尿嘧啶；4(硫代)假尿嘧啶；4-(硫代)假尿嘧啶；4-(硫代)尿嘧啶；4-硫代尿嘧啶；5(1,3-二唑-1-烷基)尿嘧啶；5(2-氨基丙基)尿嘧啶；5(氨基烷基)尿嘧啶；5(二甲基氨基烷基)尿嘧啶；5(胍烷基)尿嘧啶；5(甲氧基羰基甲基)-2-(硫代)尿嘧啶；5(甲氧基羰基-甲基)尿嘧啶；5(甲基)2(硫代)尿嘧啶；5(甲基)2,4(二硫代)尿嘧啶；5(甲基)4(硫代)尿嘧啶；5(甲基氨基甲基)-2(硫代)尿嘧啶；5(甲基氨基甲基)-2,4(二硫代)尿嘧啶；5(甲基氨基甲基)-4(硫代)尿嘧啶；5(丙炔基)尿嘧啶；5(三氟甲基)尿嘧啶；5-(2-氨基丙基)尿嘧啶；5-(烷基)-2-(硫代)假尿嘧啶；5-(烷基)-2,4(二硫代)假尿嘧啶；5-(烷基)-4(硫代)假尿嘧啶；5-(烷基)假尿嘧啶；5-(烷基)尿嘧啶；5-(炔基)尿嘧啶；5-(烯丙基氨基)尿嘧啶；5-(氰基烷基)尿嘧啶；5-(二烷基氨基烷基)尿嘧啶；5-(二甲基氨基烷基)尿嘧啶；5-(胍烷基)尿嘧啶；5-(卤代)尿嘧啶；5-(l,3-二唑-l-烷基)尿嘧啶；5-(甲氧基)尿嘧啶；5-(甲氧基羰基甲基)-2-(硫代)尿嘧啶；5-(甲氧基羰基-甲基)尿嘧啶；5-(甲基)2(硫代)尿嘧啶；5-(甲基)2,4(二硫代)尿嘧啶；5-(甲基)4(硫代)尿嘧啶；5-(甲基)-2-(硫代)假尿嘧啶；5-(甲基)-2,4(二硫代)假尿嘧啶；5-(甲基)-4(硫代)假尿嘧啶；5-(甲基)假尿嘧啶；5-(甲基氨基甲基)-2(硫代)尿嘧啶；5-(甲基氨基甲基)-2,4(二硫代)尿嘧啶；5-(甲基氨基甲基)-4-(硫代)尿嘧啶；5-(丙炔基)尿嘧啶；5-(三氟甲基)尿嘧啶；5-氨基烯丙基-尿苷；5-溴-尿苷；5-碘-尿苷；5-尿嘧啶；6(偶氮)尿嘧啶；6-(偶氮)尿嘧啶；6-氮杂-尿苷；烯丙基氨基-尿嘧啶；氮杂尿嘧啶；脱氮尿嘧啶；N3(甲基)尿嘧啶；假-UTP-1-2-乙酸；假尿嘧啶；4-硫代-假-UTP；1-羧甲基-假尿苷；1-甲基-1-脱氮-假尿苷；1-丙炔基-尿苷；1-牛磺酸甲基-1-甲基-尿苷；1-牛磺酸甲基-4-硫代-尿苷；1-牛磺酸甲基-假尿苷；2-甲氧基-4-硫代-假尿苷；2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷；2-硫代-1-甲基-假尿苷；2-硫代-5-氮杂-尿苷；2-硫代-二氢假尿苷；2-硫代-二氢尿苷；2-硫代-假尿苷；4-甲氧基-2-硫代-假尿苷；4-甲氧基-假尿苷；4-硫代-1-甲基-假尿苷；4-硫代-假尿苷；5-氮杂-尿苷；二氢假尿苷；(±)1-(2-羟基丙基)假尿苷TP；(2R)-1-(2-羟基丙基)假尿苷TP；(2S)-1-(2-羟基丙基)假尿苷TP；(E)-5-(2-溴-乙烯基)ara-尿苷TP；(E)-5-(2-溴-乙烯基)尿苷TP；(Z)-5-(2-溴-乙烯基)ara-尿苷TP；(Z)-5-(2-溴-乙烯基)尿苷TP；1-(2,2,2-三氟乙基)-假-UTP；1-(2,2,3,3,3-五氟丙基)假尿苷TP；1-(2,2-二乙氧基乙基)假尿苷TP；1-(2,4,6-三甲基苄基)假尿苷TP；1-(2,4,6-三甲基-苄基)假-UTP；1-(2,4,6-三甲基-苯基)假-UTP；1-(2-氨基-2-羧基乙基)假-UTP；1-(2-氨基-乙基)假-UTP；1-(2-羟基乙基)假尿苷TP；1-(2-甲氧基乙基)假尿苷TP；1-(3,4-双-三氟甲氧基苄基)假尿苷TP；1-(3,4-二甲氧基苄基)假尿苷TP；1-(3-氨基-3-羧基丙基)假-UTP；1-(3-氨基-丙基)假-UTP；1-(3-环丙基-丙-2-炔基)假尿苷TP；1-(4-氨基-4-羧基丁基)假-UTP；1-(4-氨基-苄基)假-UTP；1-(4-氨基-丁基)假-UTP；1-(4-氨基-苯基)假-UTP；1-(4-叠氮基苄基)假尿苷TP；1-(4-溴苄基)假尿苷TP；1-(4-氯苄基)假尿苷TP；1-(4-氟苄基)假尿苷TP；1-(4-碘苄基)假尿苷TP；1-(4-甲磺酰基苄基)假尿苷TP；1-(4-甲氧基苄基)假尿苷TP；1-(4-甲氧基-苄基)假-UTP；1-(4-甲氧基-苯基)假-UTP；1-(4-甲基苄基)假尿苷TP；1-(4-甲基-苄基)假-UTP；1-(4-硝基苄基)假尿苷TP；1-(4-硝基-苄基)假-UTP；1(4-硝基-苯基)假-UTP；1-(4-硫代甲氧基苄基)假尿苷TP；1-(4-三氟甲氧基苄基)假尿苷TP；1-(4-三氟甲基苄基)假尿苷TP；1-(5-氨基-戊基)假-UTP；1-(6-氨基-己基)假-UTP；1,6-二甲基-假-UTP；1-[3-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酰基]假尿苷TP；1-{3-[2-(2-氨基乙氧基)-乙氧基]-丙酰基}假尿苷TP；1-乙酰基假尿苷TP；1-烷基-6-(1-丙炔基)-假-UTP；1-烷基-6-(2-丙炔基)-假-UTP；1-烷基-6-烯丙基-假-UTP；1-烷基-6-乙炔基-假-UTP；1-烷基-6-homo烯丙基-假-UTP；1-烷基-6-乙烯基-假-UTP；1-烯丙基假尿苷TP；1-氨基甲基-假-UTP；1-苯甲酰基假尿苷TP；1-苄氧基甲基假尿苷TP；1-苄基-假-UTP；1-生物素基-PEG2-假尿苷TP；1-生物素基假尿苷TP；1-丁基-假-UTP；1-氰基甲基假尿苷TP；1-环丁基甲基-假-UTP；1-环丁基-假-UTP；1-环庚基甲基-假-UTP；1-环庚基-假-UTP；1-环己基甲基-假-UTP；1-环己基-假-UTP；1-环辛基甲基-假-UTP；1-环辛基-假-UTP；1-环戊基甲基-假-UTP；1-环戊基-假-UTP；1-环丙基甲基-假-UTP；1-环丙基-假-UTP；1-乙基-假-UTP；1-己基-假-UTP；1-Homo烯丙基假尿苷TP；1-羟甲基假尿苷TP；1-异-丙基-假-UTP；1-Me-2-硫代-假-UTP；1-Me-4-硫代-假-UTP；1-Me-α-硫代-假-UTP；1-甲磺酰基甲基假尿苷TP；1-甲氧基甲基假尿苷TP；1-甲基-6-(2,2,2-三氟乙基)假-UTP；1-甲基-6-(4-吗啉代)-假-UTP；1-甲基-6-(4-硫代吗啉代)-假-UTP；1-甲基-6-(取代的苯基)假-UTP；1-甲基-6-氨基-假-UTP；1-甲基-6-叠氮基-假-UTP；1-甲基-6-溴-假-UTP；1-甲基-6-丁基-假-UTP；1-甲基-6-氯-假-UTP；1-甲基-6-氰基-假-UTP；1-甲基-6-二甲基氨基-假-UTP；1-甲基-6-乙氧基-假-UTP；1-甲基-6-羧酸乙酯-假-UTP；1-甲基-6-乙基-假-UTP；1-甲基-6-氟-假-UTP；1-甲基-6-甲酰基-假-UTP；1-甲基-6-羟基氨基-假-UTP；1-甲基-6-羟基-假-UTP；1-甲基-6-碘-假-UTP；1-甲基-6-异-丙基-假-UTP；1-甲基-6-甲氧基-假-UTP；1-甲基-6-甲基氨基-假-UTP；1-甲基-6-苯基-假-UTP；1-甲基-6-丙基-假-UTP；1-甲基-6-叔-丁基-假-UTP；1-甲基-6-三氟甲氧基-假-UTP；1-甲基-6-三氟甲基-假-UTP；1-吗啉代甲基假尿苷TP；1-戊基-假-UTP；1-苯基-假-UTP；1-新戊酰基假尿苷TP；1-炔丙基假尿苷TP；1-丙基-假-UTP；1-丙炔基-假尿苷；1-对-甲苯基-假-UTP；1-叔-丁基-假-UTP；1-硫代甲氧基甲基假尿苷TP；1-硫代吗啉代甲基假尿苷TP；1-三氟乙酰基假尿苷TP；1-三氟甲基-假-UTP；1-乙烯基假尿苷TP；2,2’-脱水-尿苷TP；2’-溴-脱氧尿苷TP；2’-F-5-甲基-2’-脱氧-UTP；2’-OMe-5-Me-UTP；2’-OMe-假-UTP；2'-a-乙炔基尿苷TP；2'-a-三氟甲基尿苷TP；2'-b-乙炔基尿苷TP；2'-b-三氟甲基尿苷TP；2'-脱氧-2',2'-二氟尿苷TP；2'-脱氧-2'-a-巯基尿苷TP；2'-脱氧-2'-a-硫代甲氧基尿苷TP；2'-脱氧-2'-b-氨基尿苷TP；2'-脱氧-2'-b-叠氮基尿苷TP；2'-脱氧-2'-b-溴尿苷TP；2'-脱氧-2'-b-氯尿苷TP；2'-脱氧-2'-b-氟尿苷TP；2'-脱氧-2'-b-碘尿苷TP；2'-脱氧-2'-b-巯基尿苷TP；2'-脱氧-2'-b-硫代甲氧基尿苷TP；2-甲氧基-4-硫代-尿苷；2-甲氧基尿苷；2'-O-甲基-5-(1-丙炔基)尿苷TP；3-烷基-假-UTP；4'-叠氮基尿苷TP；4'-碳环尿苷TP；4'-乙炔基尿苷TP；5-(1-丙炔基)ara-尿苷TP；5-(2-呋喃基)尿苷TP；5-氰基尿苷TP；5-二甲基氨基尿苷TP；5'-Homo-尿苷TP；5-碘-2’-氟-脱氧尿苷TP；5-苯基乙炔基尿苷TP；5-三氘代代甲基-6-氘代尿苷TP；5-三氟甲基-尿苷TP；5-乙烯基ara尿苷TP；6-(2,2,2-三氟乙基)-假-UTP；6-(4-吗啉代)-假-UTP；6-(4-硫代吗啉代)-假-UTP；6-(取代的-苯基)-假-UTP；6-氨基-假-UTP；6-叠氮基-假-UTP；6-溴-假-UTP；6-丁基-假-UTP；6-氯-假-UTP；6-氰基-假-UTP；6-二甲基氨基-假-UTP；6-乙氧基-假-UTP；6-羧酸乙酯-假-UTP；6-乙基-假-UTP；6-氟-假-UTP；6-甲酰基-假-UTP；6-羟基氨基-假-UTP；6-羟基-假-UTP；6-碘-假-UTP；6-异-丙基-假-UTP；6-甲氧基-假-UTP；6-甲基氨基-假-UTP；6-甲基-假-UTP；6-苯基-假-UTP；6-苯基-假-UTP；6-丙基-假-UTP；6-叔-丁基-假-UTP；6-三氟甲氧基-假-UTP；6-三氟甲基-假-UTP；Α-硫代-假-UTP；假尿苷1-(4-甲基苯磺酸)TP；假尿苷1-(4-甲基苯甲酸)TP；假尿苷TP 1-[3-(2-乙氧基)]丙酸；假尿苷TP 1-[3-{2-(2-[2-(2-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基)-乙氧基}]丙酸；假尿苷TP 1-[3-{2-(2-[2-{2(2-乙氧基)-乙氧基}-乙氧基]-乙氧基)-乙氧基}]丙酸；假尿苷TP1-[3-{2-(2-[2-乙氧基]-乙氧基)-乙氧基}]丙酸；假尿苷TP 1-[3-{2-(2-乙氧基)-乙氧基}]丙酸；假尿苷TP 1-甲基膦酸；假尿苷TP 1-甲基膦酸二乙酯；假-UTP-N1-3-丙酸；假-UTP-N1-4-丁酸；假-UTP-N1-5-戊酸；假-UTP-N1-6-己酸；假-UTP-N1-7-庚酸；假-UTP-N1-甲基-对-苯甲酸；假-UTP-N1-对-苯甲酸；怀丁苷；羟基怀丁苷；异怀俄苷；过氧怀丁苷；修饰不足的羟基怀丁苷；4-脱甲基怀俄苷；2,6-(二氨基)嘌呤；1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基；1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-l-基；1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基；1,3,5-(三氮杂)-2,6-(二氧杂)-萘；2(氨基)嘌呤；2,4,5-(三甲基)苯基；2‘甲基、2’氨基、2’叠氮基、2’氟-胞苷；2’甲基、2’氨基、2’叠氮基、2’氟-腺嘌呤；2’甲基、2’氨基、2’叠氮基、2’氟-尿苷；2'-氨基-2'-脱氧核糖；2-氨基-6-氯-嘌呤；2-氮杂-肌苷基；2'-叠氮基-2'-脱氧核糖；2'氟-2'-脱氧核糖；2'-氟-修饰的碱基；2'-O-甲基-核糖；2-氧代-7-氨基吡啶并嘧啶-3-基；2-氧代-吡啶并嘧啶-3-基；2-吡啶酮；3硝基吡咯；3-(甲基)-7-(丙炔基)异喹诺酮基；3-(甲基)异喹诺酮基；4-(氟)-6-(甲基)苯并咪唑；4-(甲基)苯并咪唑；4-(甲基)吲哚基；4,6-(二甲基)吲哚基；5硝基吲哚；5取代的嘧啶；5-(甲基)异喹诺酮基；5-硝基吲哚；6-(氮杂)嘧啶；6-(偶氮)胸腺嘧啶；6-(甲基)-7-(氮杂)吲哚基；6-氯-嘌呤；6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；7-(氨基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-l-基；7-(氨基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基；7-(氨基烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基；7-(氨基烷基羟基)-l,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基；7-(氨基烷基羟基)-l,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基；7-(氮杂)吲哚基；7-(胍烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-基；7-(胍烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基；7-(胍烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基；7-(胍烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基；7-(胍烷基-羟基)-l,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基；7-(胍烷基羟基)-l,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基；7-(丙炔基)异喹诺酮基；7-(丙炔基)异喹诺酮基；丙炔基-7-(氮杂)吲哚基；7-脱氮-肌苷基；7-取代的1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基；7-取代的1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基；9-(甲基)-咪唑并吡啶基；氨基吲哚基；蒽基；双-邻-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；双-邻-取代的-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；二氟甲苯基；次黄嘌呤；咪唑并吡啶基；肌苷基；异喹诺酮基；异鸟苷；N2-取代的嘌呤；N6-甲基-2-氨基-嘌呤；N6-取代的嘌呤；N-烷基化衍生物；萘基；硝基苯并咪唑基；硝基咪唑基；硝基吲唑基；硝基吡唑基；水粉蕈素；O6-取代的嘌呤；O-烷基化衍生物；邻-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；邻-取代的-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；氧代间型霉素TP；对-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；对-取代的-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；并五苯基；菲基；苯基；丙炔基-7-(氮杂)吲哚基；芘基；吡啶并嘧啶-3-基；吡啶并嘧啶-3-基,2-氧代-7-氨基-吡啶并嘧啶-3-基；吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；吡咯并嘧啶基；吡咯并吡嗪基；茋基；取代的1,2,4-三唑；并四苯基；杀结核菌素；黄嘌呤；黄嘌呤核苷-5’-TP；2-硫代-泽布拉恩；5-氮杂-2-硫代-泽布拉恩；7-脱氮-2-氨基-嘌呤；吡啶-4-酮核糖核苷；2-氨基-核苷-TP；间型霉素A TP；间型霉素B TP；Pyrrolosine TP；2'-OH-ara-腺苷TP；2'-OH-ara-胞苷TP；2'-OH-ara-尿苷TP；2'-OH-ara-鸟苷TP；5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷TP；以及N6-(19-氨基-五氧杂十九烷基)腺苷TP。
在一些实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合包含上述修饰的核碱基中的至少两种(例如，2、3、4或更多种)的组合。
在一些实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合中的修饰的核碱基是选自由以下组成的组：假尿苷(ψ)、2-硫代尿苷、4’-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲基尿苷)、5-甲氧基尿苷、2'-O-甲基尿苷1-甲基-假尿苷(m1ψ)、1-乙基-假尿苷(e1ψ)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-甲基-胞苷(m5C)、α-硫代-鸟苷、α-硫代-腺苷、5-氰基尿苷、4'-硫代尿苷7-脱氮腺嘌呤、1-甲基-腺苷(m1A)、2-甲基-腺嘌呤(m2A)、N6-甲基-腺苷(m6A)和2,6-二氨基嘌呤、(I)、1-甲基-肌苷(m1I)、怀俄苷(imG)、甲基怀俄苷(mimG)、7-脱氮-鸟苷、7-氰基-7-脱氮-鸟苷(preQ0)、7-氨基甲基-7-脱氮-鸟苷(preQ1)、7-甲基-鸟苷(m7G)、1-甲基-鸟苷(m1G)、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、2,8-二甲基腺苷、2-香叶基硫代尿苷、2-赖胞苷、2-硒代尿苷、3-(3-氨基-3-羧丙基)-5,6-二氢尿苷、3-(3-氨基-3-羧丙基)假尿苷、3-甲基假尿苷、5-(羧基羟甲基)-2'-O-甲基尿苷甲酯、5-氨基甲基-2-香叶基硫代尿苷、5-氨基甲基-2-硒代尿苷、5-氨基甲基尿苷、5-氨基甲酰基羟甲基尿苷、5-氨基甲酰基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基-2-香叶基硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基-2-硒代尿苷、5-氰基甲基尿苷、5-羟基胞苷、5-甲基氨基甲基-2-香叶基硫代尿苷、7-氨基羧基丙基-去甲基怀俄苷、7-氨基羧基丙基怀俄苷、7-氨基羧基丙基怀俄苷甲酯、8-甲基腺苷、N4,N4-二甲基胞苷、N6-甲酰基腺苷、N6-羟甲基腺苷、胍丁胺基胞苷(agmatidine)、环状N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷、谷氨酰基-辫苷、甲基化未修饰的羟基怀丁苷、N4,N4,2'-O-三甲基胞苷、香叶基化5-甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、香叶基化5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、Qbase、preQ0base、preQ1base以及它们的两种或更多种组合。在一些实施方案中，所述至少一个化学修饰的核苷是选自由以下组成的组：假尿苷、1-甲基-假尿苷、1-乙基-假尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲氧基尿苷以及其组合。在一些实施方案中，多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，如mRNA多核苷酸)包括上述修饰的核碱基中的至少两种(例如，2、3、4或更多种)的组合。
碱基修饰
在某些实施方案中，化学修饰在多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，如mRNA多核苷酸)中的核碱基处。在一些实施方案中，所述多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，如mRNA多核苷酸)中的修饰的核碱基是选自由以下组成的组：1-甲基-假尿苷(m1ψ)、1-乙基-假尿苷(e1ψ)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-甲基-胞苷(m5C)、假尿苷(ψ)、α-硫代-鸟苷以及α-硫代-腺苷。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含上述修饰的核碱基中的至少两种(例如，2、3、4或更多种)的组合。
在一些实施方案中，所述多核苷酸(例如RNA多核苷酸，如mRNA多核苷酸)包含假尿苷(ψ)和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，所述多核苷酸(例如RNA多核苷酸，如mRNA多核苷酸)包含1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些实施方案中，所述多核苷酸(例如RNA多核苷酸，如mRNA多核苷酸)包含1-乙基-假尿苷(e1ψ)。在一些实施方案中，所述多核苷酸(例如RNA多核苷酸，如mRNA多核苷酸)包含1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，所述多核苷酸(例如RNA多核苷酸，如mRNA多核苷酸)包含1-乙基-假尿苷(e1ψ)和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，所述多核苷酸(例如RNA多核苷酸，如mRNA多核苷酸)包含2-硫代尿苷(s2U)。在一些实施方案中，所述多核苷酸(例如RNA多核苷酸，如mRNA多核苷酸)包含2-硫代尿苷和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，所述多核苷酸(例如RNA多核苷酸，如mRNA多核苷酸)包含甲氧基-尿苷(mo5U)。在一些实施方案中，所述多核苷酸(例如RNA多核苷酸，如mRNA多核苷酸)包含5-甲氧基-尿苷(mo5U)和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，所述多核苷酸(例如RNA多核苷酸，如mRNA多核苷酸)包含2'-O-甲基尿苷。在一些实施方案中，所述多核苷酸(例如RNA多核苷酸，如mRNA多核苷酸)包含2'-O-甲基尿苷和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，所述多核苷酸(例如RNA多核苷酸，如mRNA多核苷酸)包含N6-甲基-腺苷(m6A)。在一些实施方案中，所述多核苷酸(例如RNA多核苷酸，如mRNA多核苷酸)包含N6-甲基-腺苷(m6A)和5-甲基-胞苷(m5C)。
在一些实施方案中，对于特定修饰，对多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，如mRNA多核苷酸)进行均一修饰(例如，完全修饰，在整个序列中修饰)。例如，可用5-甲基-胞苷(m5C)均一修饰多核苷酸，这意味着mRNA序列中的所有胞嘧啶残基都被5-甲基-胞苷(m5C)置换。类似地，可通过用修饰的残基(如以上列出的那些中的任一种)置换针对序列中存在的任何类型的核苷残基均一地修饰多核苷酸。
在一些实施方案中，开放阅读框中的化学修饰的核苷是选自由以下组成的组：尿苷、腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤以及其任何组合。
在一些实施方案中，修饰的核碱基是修饰的胞嘧啶。具有修饰的胞嘧啶的核碱基和核苷的实例包括N4-乙酰基-胞苷(ac4C)、5-甲基-胞苷(m5C)、5-卤代-胞苷(例如，5-碘-胞苷)、5-羟甲基-胞苷(hm5C)、1-甲基-假异胞苷、2-硫代-胞苷(s2C)、2-硫代-5-甲基-胞苷。
在一些实施方案中，修饰的核碱基是修饰的尿苷。具有修饰的尿苷的示例性核碱基和核苷包括5-氰基尿苷或4'-硫代尿苷。
在一些实施方案中，修饰的核碱基是修饰的腺嘌呤。具有修饰的腺嘌呤的示例性核碱基和核苷包括7-脱氮腺嘌呤、1-甲基-腺苷(m1A)、2-甲基-腺嘌呤(m2A)、N6-甲基-腺嘌呤(m6A)和2,6-二氨基嘌呤。
在一些实施方案中，修饰的核碱基是修饰的鸟嘌呤。具有修饰的鸟嘌呤的示例性核碱基和核苷包括肌苷(I)、1-甲基-肌苷(m1I)、怀俄苷(imG)、甲基怀俄苷(mimG)、7-脱氮-鸟苷、7-氰基-7-脱氮-鸟苷(preQ0)、7-氨基甲基-7-脱氮-鸟苷(preQ1)、7-甲基-鸟苷(m7G)、1-甲基-鸟苷(m1G)、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷。
在一些实施方案中，所述多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，如mRNA多核苷酸)中的核碱基修饰的核苷酸是5-甲氧基尿苷。
在一些实施方案中，所述多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，如mRNA多核苷酸)包含至少两种(例如，2、3、4或更多种)修饰的核碱基的组合。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸(例如，编码IL-23多肽、IL-36-γ多肽、IL-18多肽和/或OX40L多肽的mRNA多核苷酸)中至少95％的核碱基类型(例如，尿嘧啶)是修饰的核碱基。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸(例如，编码IL-23多肽、IL-36-γ多肽、IL-18多肽和/或OX40L多肽的mRNA多核苷酸)中至少95％的尿嘧啶是5-甲氧基尿嘧啶。
在一些实施方案中，所述多核苷酸(例如RNA多核苷酸，如mRNA多核苷酸)包含5-甲氧基尿苷(5mo5U)和5-甲基-胞苷(m5C)。
在一些实施方案中，对于特定修饰，对多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，如mRNA多核苷酸)进行均一修饰(例如，完全修饰，在整个序列中修饰)。例如，可用5-甲氧基尿苷均一修饰多核苷酸，这意味着mRNA序列中基本上所有的尿苷残基都被5-甲氧基尿苷置换。类似地，可通过用修饰的残基(如以上列出的那些中的任一种)置换针对序列中存在的任何类型的核苷残基均一地修饰多核苷酸。
在一些实施方案中，修饰的核碱基是修饰的胞嘧啶。
在一些实施方案中，修饰的核碱基是修饰的尿嘧啶。具有修饰的尿嘧啶的示例性核碱基和核苷包括5-甲氧基尿嘧啶。
在一些实施方案中，修饰的核碱基是修饰的腺嘌呤。
在一些实施方案中，修饰的核碱基是修饰的鸟嘌呤。
在一些实施方案中，编码IL-23多肽、IL-36-γ多肽、OX40L多肽或其任何组合的开放阅读框中的核碱基、糖、主链或其任何组合被化学修饰至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％。
在一些实施方案中，编码IL-23多肽、IL-36-γ多肽、OX40L多肽或其任何组合的开放阅读框中的尿苷核苷被化学修饰至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％。
在一些实施方案中，编码IL-23多肽、IL-36-γ多肽、IL-18多肽、OX40L多肽或其任何组合的开放阅读框中的腺苷核苷被化学修饰至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％。
在一些实施方案中，编码IL-23多肽、IL-36-γ多肽、IL-18多肽、OX40L多肽或其任何组合的开放阅读框中的胞苷核苷被化学修饰至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％。
在一些实施方案中，编码IL-23多肽、IL-36-γ多肽、IL-18多肽、OX40L多肽或其任何组合的开放阅读框中的鸟苷核苷被化学修饰至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％。
在一些实施方案中，所述多核苷酸可包含在所述核苷之间的任何有用的接头。可用于本公开组合物中的此类接头(包括主链修饰)包括但不限于以下：3'-亚烷基膦酸酯、3'-氨基氨基磷酸酯、含烯烃的主链、氨基烷基氨基磷酸酯、氨基烷基磷酸三酯、硼烷磷酸酯、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-、-CH2-NH-CH2-、手性膦酸酯、手性硫代磷酸酯、甲酰基和硫代甲酰基主链、亚甲基(甲基亚氨基)、亚甲基甲酰基和硫代甲酰基主链、亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链、吗啉代键联、-N(CH3)-CH2-CH2-、具有杂原子核苷间键联的寡核苷、次膦酸酯、氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代磷酸酯核苷间键联、硫代磷酸酯、磷酸三酯、PNA、硅氧烷主链、氨基磺酸酯主链、硫化亚砜和砜主链、磺酸酯和磺酰胺主链、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯以及硫羰基氨基磷酸酯。
在一些实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽或IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合中的修饰的核碱基是选自由以下组成的组：1-甲基-假尿苷(m1ψ)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-甲基-胞苷(m5C)、假尿苷(ψ)、α-硫代-鸟苷和α-硫代-腺苷。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含上述修饰的核碱基中的至少两种(例如，2、3、4或更多种)的组合。
在一些实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽或IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合包含假尿苷(ψ)和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，所述多核苷酸(例如RNA多核苷酸，如mRNA多核苷酸)包含1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合包含1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-胞苷(m5C)。
在一些实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合包含2-硫代尿苷(s2U)。在一些实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合包含2-硫代尿苷和5-甲基-胞苷(m5C)。
在一些实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合包含甲氧基-尿苷(mo5U)。在一些实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合包含5-甲氧基-尿苷(mo5U)和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，所述多核苷酸(例如RNA多核苷酸，如mRNA多核苷酸)包含2'-O-甲基尿苷。
在一些实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合包含2'-O-甲基尿苷和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合包含N6-甲基-腺苷(m6A)。在一些实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合包含N6-甲基-腺苷(m6A)和5-甲基-胞苷(m5C)。
在一些实施方案中，对于特定修饰，对包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合进行均一修饰(例如，完全修饰，在整个序列中修饰)。例如，可用5-甲基-胞苷(m5C)均一修饰多核苷酸，这意味着mRNA序列中的所有胞嘧啶残基都被5-甲基-胞苷(m5C)置换。类似地，可通过用修饰的残基(如以上列出的那些中的任一种)置换针对序列中存在的任何类型的核苷残基均一地修饰多核苷酸。
在一些实施方案中，修饰的核碱基是修饰的胞嘧啶。具有修饰的胞嘧啶的核碱基和核苷的实例包括N4-乙酰基-胞苷(ac4C)、5-甲基-胞苷(m5C)、5-卤代-胞苷(例如，5-碘-胞苷)、5-羟甲基-胞苷(hm5C)、1-甲基-假异胞苷、2-硫代-胞苷(s2C)、2-硫代-5-甲基-胞苷。
在一些实施方案中，修饰的核碱基是修饰的尿苷。具有修饰的尿苷的示例性核碱基和核苷包括5-氰基尿苷或4'-硫代尿苷。
在一些实施方案中，修饰的核碱基是修饰的腺嘌呤。具有修饰的腺嘌呤的示例性核碱基和核苷包括7-脱氮腺嘌呤、1-甲基-腺苷(m1A)、2-甲基-腺嘌呤(m2A)、N6-甲基-腺苷(m6A)和2,6-二氨基嘌呤。
在一些实施方案中，修饰的核碱基是修饰的鸟嘌呤。具有修饰的鸟嘌呤的示例性核碱基和核苷包括肌苷(I)、1-甲基-肌苷(m1I)、怀俄苷(imG)、甲基怀俄苷(mimG)、7-脱氮-鸟苷、7-氰基-7-脱氮-鸟苷(preQ0)、7-氨基甲基-7-脱氮-鸟苷(preQ1)、7-甲基-鸟苷(m7G)、1-甲基-鸟苷(m1G)、8-氧代-鸟苷或7-甲基-8-氧代-鸟苷。
可用于本公开的包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸和/或包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸中的其他修饰列于表5中。
表5.另外的修饰类型
本公开的包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸和/或包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸可在核苷间包含任何有用的接头。此类接头(包括主链修饰)在表6中给出。
表6.接头修饰
名称 类型
3'-亚烷基膦酸酯 接头
3-氨基氨基磷酸酯 接头
含烯烃的主链 接头
氨基烷基氨基磷酸酯 接头
氨基烷基磷酸三酯 接头
硼烷磷酸酯 接头
-CH2-0-N(CH3)-CH2- 接头
-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2- 接头
-CH2-NH-CH2- 接头
手性膦酸酯 接头
手性硫代磷酸酯 接头
甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主链 接头
亚甲基(甲基亚氨基) 接头
亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主链 接头
亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链 接头
吗啉代键联 接头
-N(CH3)-CH2-CH2- 接头
具有杂原子核苷间键联的寡核苷酸 接头
次膦酸酯 接头
氨基磷酸酯 接头
二硫代磷酸酯 接头
硫代磷酸酯核苷间键联 接头
硫代磷酸酯 接头
磷酸三酯 接头
PNA 接头
硅氧烷主链 接头
氨基磺酸酯主链 接头
硫化物、亚砜和砜主链 接头
磺酸酯和磺酰胺主链 接头
硫代羰基烷基膦酸酯 接头
硫代羰基烷基磷酸三酯 接头
硫代羰基氨基磷酸酯 接头
本公开的包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸和/或包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合可包含任何有用的修饰，如对糖、核碱基或核苷间键联(例如对连接磷酸酯/对磷酸二酯键联/对磷酸二酯主链)的修饰。嘧啶核碱基的一个或多个原子可被任选取代的氨基、任选取代的硫醇、任选取代的烷基(例如甲基或乙基)或卤代(例如氯或氟)置换或取代。在某些实施方案中，修饰(例如，一个或多个修饰)可存在于糖和核苷间键联中的每个中。根据本公开的修饰可以是核糖核酸(RNA)修饰成脱氧核糖核酸(DNA)、苏糖核酸(TNA)、乙二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、己糖醇核酸(HNA)或其杂合体。另外的修饰在本文进行描述。修饰的核酸及其合成公开于国际专利公布号WO2013052523(还参见US20130115272)中。
在一些实施方案中，本公开的包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合基本上不诱导mRNA所引入至其中的细胞的先天性免疫应答。诱导的先天性免疫应答的特征包括1)增加的促炎性细胞因子的表达，2)细胞内PRR(RIG-I、MDA5等)的活化，和/或3)蛋白质翻译的终止或减少。
本公开的包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合的任何区可如本文所教导或如国际专利公布号WO2013052523(还参见US20130115272)中所教导进行化学修饰。
在一些实施方案中，本公开的修饰的多核苷酸(例如，包含本文所述的至少一种修饰的mRNA)编码IL-23、IL-36-γ，所述多核苷酸包含编码IL-18多肽和/或或OX40L的mRNA。在一些实施方案中，本发明的修饰的多核苷酸(例如，包含本文所述的至少一种修饰的mRNA)编码人IL-23、IL-36-γ、IL18和/或OX40L。
在一些实施方案中，本发明的修饰的多核苷酸(例如，包含本文所述的至少一种修饰的mRNA)编码包含表1中列出的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，本发明的修饰的多核苷酸(例如，包含本文所述的至少一种修饰的mRNA)编码包含表1中列出的氨基酸序列的多肽。
在一些实施方案中，本发明的修饰的多核苷酸(例如，包含本文所述的至少一种修饰的mRNA)编码至少一种IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L突变体、其片段或变体，例如IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L的IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L功能性片段。
在一些实施方案中，本公开的修饰的多核苷酸(例如，包含本文所述的至少一种修饰的mRNA)是选自表1中列出的IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L核酸序列。
本公开的包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA、编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸和包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸还可包含多核苷酸分子的结构单元，例如修饰的核糖核苷和修饰的核糖核苷酸。例如，这些结构单元可适用于制备本公开的多核苷酸。此类结构单元在国际专利公布号WO2013052523(还参见US20130115272)和国际申请公布号WO2014093924(还参见US20150307542)中进行了教导。
糖上的修饰
可并入本公开的包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸(例如，RNA或mRNA，如本文所述)、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA、编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸(例如，RNA或mRNA，如本文所述)或包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸(例如，RNA或mRNA，如本文所述)中的修饰的核苷和核苷酸(例如，结构单元分子)可在核糖核酸的糖上进行修饰。
例如，2′羟基(OH)可以被多个不同的取代基修饰或置换。2′-位置处的示例性取代包括但不限于H、卤代、任选取代的C1-6烷基；任选取代的C1-6烷氧基；任选取代的C6-10芳氧基；任选取代的C3-8环烷基；任选取代的C3-8环烷氧基；任选取代的C6-10芳氧基；任选取代的C6-10芳基-C1-6烷氧基，任选取代的C1-12(杂环基)氧基；糖(例如，核糖、戊糖或本文所描述的任何糖)；聚乙二醇(PEG)，-O(CH2CH2O)nCH2CH2OR，其中R是H或任选取代的烷基，并且n是0至20(例如，0至4、0至8、0至10、0至16、1至4、1至8、1至10、1至16、1至20、2至4、2至8、2至10、2至16、2至20、4至8、4至10、4至16以及4至20)的整数；“锁”核酸(LNA)，其中2′-羟基通过C1-6亚烷基或C1-6杂亚烷基桥连接至同一核糖的4’-碳，其中示例性桥包括亚甲基、亚丙基、醚或氨基桥；如本文所定义的氨基烷基；如本文所定义的氨基烷氧基；如本文所定义的氨基；以及如本文所定义的氨基酸。
一般来说，RNA包括糖基核糖，所述糖基核糖是具有氧的5元环。示例性、非限制性的修饰核苷酸包括核糖中的氧的置换(例如，用S、Se或亚烷基如亚甲基或亚乙基置换)；添加双键(例如，以便用环戊烯基或环己烯基置换核糖)；核糖的环缩反应(例如，以便形成环丁烷或环氧丙烷的4元环)；核糖的扩环反应(例如，以便形成具有额外碳或杂原子的也具有氨基磷酸酯主链的6元或7元环，如对于失水己糖醇、阿卓糖醇、甘露醇、环己烷基、环己烯基以及吗啉代来说)；多环形式(例如，三环；以及“非锁定”形式，如乙二醇核酸(GNA)(例如，R-GNA或S-GNA，其中核糖被连接至磷酸二酯键的乙二醇单元置换)、苏糖核酸(TNA，其中核糖被α-L-苏型呋喃糖基-(3′→2′)置换)，和肽核酸(PNA，其中2-氨基-乙基-甘氨酸键联置换核糖和磷酸二酯主链)。糖基还可包含具有与核糖中对应碳的立体化学构型相反的立体化学构型的一个或多个碳。因此，多核苷酸分子可包括含有例如阿拉伯糖作为糖的核苷酸。此类糖修饰在国际专利公布号WO2013052523(还参见US20130115272)和国际申请公布号WO2014093924(还参见US20150307542)中进行了教导。
修饰的糖、核碱基和核苷间键联的组合
本公开的包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸和/或包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合可包含对糖、核碱基和/或核苷间键联的修饰的组合。这些组合可包括本文所描述的任何一个或多个修饰。
修饰的核苷酸和修饰的核苷酸组合的实例提供在以下表7中。这些修饰的核苷酸的组合可用于形成本公开的多核苷酸。除非另外指明，否则修饰的核苷酸可完全取代本公开的多核苷酸的天然核苷酸。作为非限制性实例，天然核苷酸尿苷可被本文所描述的修饰核苷取代。在另一个非限制性实例中，天然核苷酸尿苷可被本文所公开的至少一种修饰核苷部分地取代(例如，约0.1％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99.9％)。碱/糖或接头的任何组合可并入本公开的多核苷酸中，并且此类修饰在国际专利公布号WO2013052523(还参见US20130115272)和国际申请公布号WO2014093924(还参见US20150307542)中进行了教导。
表7.组合
修饰的核苷酸和修饰的核苷酸组合的另外实例提供在以下表8中。
表8.另外的组合
XII.药物组合物：配制、施用、递送和给药
本公开提供了包含本文公开的任何组合物的药物制剂，所述组合物例如，包含编码包含IL-23多肽的第一蛋白质的mRNA的第一多核苷酸、包含编码包含IL-36-γ多肽的第二蛋白质的mRNA的第二多核苷酸或包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸和/或包含编码第三蛋白质的mRNA的第三多核苷酸，其中所述第三蛋白质包含如本文其他地方所述的OX40L多肽。
在本公开的一些实施方案中，将多核苷酸与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合配制成组合物和复合物。药物组合物可任选地包含一种或多种另外活性物质，例如治疗和/或预防活性物质。本公开的药物组合物可以是无菌的和/或无热原的。在配制和/或制造药物剂方面的一般考虑因素可见于例如Remington:The Science and Practice ofPharmacy第21版,Lippincott Williams&Wilkins,2005中。
在一些实施方案中，向人、人患者或受试者施用组合物。出于本公开的目的，短语“活性成分”通常是指如本文所述递送的多核苷酸。
虽然本文提供的药物组合物的描述主要涉及适用于向人施用的药物组合物，但是熟练的业内人士将理解此类组合物通常适用于向任何其他动物例如向非人动物(例如非人哺乳动物)施用。改变适用于向人施用的药物组合物以便使得组合物适用于向各种动物施用是众所周知的，并且普通兽医药理学家可仅仅通过普通实验(如果存在)来设计和/或进行此种改变。考虑施用所述药物组合物的受试者包括但不限于人和/或其他灵长类动物；哺乳动物。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸被配制用于皮下、静脉内、腹膜内、肿瘤内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内、颅内、脑室内、经口、吸入喷雾、局部、直肠、经鼻、经颊、阴道、肿瘤内或植入的储库肌肉内、皮下、肿瘤内或皮内递送。在其他实施方案中，所述多核苷酸被配制用于肿瘤内、腹膜内或静脉内递送。在特定实施方案中，本公开的多核苷酸被配制用于肿瘤内递送。
本文描述的药物组合物的制剂可通过药理学领域中已知或此后开发的任何方法来制备。通常，此类制备方法包括以下步骤：使活性成分与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分缔合，并且然后如果必要和/或希望，使产品划分、成形和/或包装为所需的单剂量或多剂量单位。
根据本公开的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何另外成分的相对量将取决于所治疗的受试者的身份、尺寸和/或病状并且进一步取决于待施用组合物的途径而改变。作为举例，组合物可包含0.1％与100％之间，例如0.5％与50％之间、1％与30％之间、5％与80％之间或至少80％(w/w)的活性成分。
制剂
本公开的包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸和/或包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸可使用一种或多种赋形剂进行配制。
所述一种或多种赋形剂的功能是例如：(1)增加稳定性；(2)增加细胞转染；(3)容许持续或延迟释放(例如，从多核苷酸的储库制剂释放)；(4)改变生物分布(例如，使多核苷酸靶向特定组织或细胞类型)；(5)增加体内编码的蛋白质的翻译；和/或(6)改变体内编码的蛋白质的释放概况。除了传统赋形剂如任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂之外，本公开的赋形剂可包括但不限于类脂质(lipidoid)、脂质体、脂质纳米颗粒、聚合物、脂质复合物、核-壳纳米颗粒、肽、蛋白质、用多核苷酸转染的细胞(例如，用于移植到受试者中)、透明质酸酶、纳米颗粒模拟物以及其组合。因此，本公开的制剂可包括各自以一定的量存在的一种或多种赋形剂，所述量一起增加多核苷酸的稳定性、增加由多核苷酸进行的细胞转染、增加多核苷酸编码的蛋白质的表达和/或改变多核苷酸编码的蛋白质的释放概况。此外，本公开的多核苷酸可使用自组装核酸纳米颗粒来配制。
本文描述的药物组合物的制剂可通过药理学领域中已知或此后开发的任何方法来制备。通常，此类制备方法包括使活性成分与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分缔合的步骤。
根据本公开的药物组合物可以单一单位剂量和/或以多个单一单位剂量大批量制备、包装和/或销售。如本文所使用，“单位剂量”是指包含预先确定的量的活性成分的药物组合物的个别量。活性成分的量通常等于将要向受试者施用的活性成分的剂量和/或这种剂量的合宜分数，例如像这种剂量的一半或三分之一。
根据本公开的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何另外成分的相对量可取决于所治疗的受试者的身份、尺寸和/或病状并且进一步取决于待施用组合物的途径而改变。例如，组合物可包含0.1％与99％(w/w)之间的活性成分。作为举例，组合物可包含0.1％与100％之间，例如.5％与50％之间、1％-30％之间、5％-80％之间、至少80％(w/w)的活性成分。
在一些实施方案中，本文描述的制剂含有至少一种多核苷酸。作为非限制性实例，所述制剂可含有1、2、3、4或5种多核苷酸。在其他实施方案中，本公开的多核苷酸被配制用于肿瘤内递送在有需要的患者的肿瘤中。
药物制剂可另外包含药学上可接受的赋形剂，如本文所使用的赋形剂包括但不限于适合于所需的具体剂型的任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂等。用于配制药物组合物的各种赋形剂和用于制备所述组合物的技术是本领域中已知的(参见Remington:The Science andPractice of Pharmacy,第21版,A.R.Gennaro,Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006)。常规赋形剂介质的使用可涵盖在本公开的范围内，除了如通过产生任何不希望的生物作用或另外以有害的方式与药物组合物的任何其他组分相互作用而可能与物质或其衍生物不相容的任何常规赋形剂介质。
在一些实施方案中，增加和/或减小脂质纳米颗粒的粒度。粒度的变化可能够帮助抵消生物反应例如但不限于炎症或可增加递送至哺乳动物的修饰mRNA的生物作用。
在药物组合物的制造中使用的药学上可接受的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂、表面活性剂和/或乳化剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂和/或油。此类赋形剂可任选地包括在本公开的药物制剂中。
在一些实施方案中，所述多核苷酸在纳米结构中或与纳米结构一起施用、在纳米结构中配制或与纳米结构一起递送，所述纳米结构可螯合诸如胆固醇的分子。这些纳米结构的非限制性实例和制备这些纳米结构的方法描述于美国专利公布号US20130195759中。这些纳米结构的示例性结构在美国专利公布号US20130195759中示出，并且可包括核和围绕所述核的壳。
类脂质
包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸和/或包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸可与类脂质一起配制。已广泛描述了类脂质的合成并且含有这些化合物的制剂特别适用于递送多核苷酸(参见Mahon等人,Bioconjug Chem.201021:1448-1454；Schroeder等人,JIntern Med.2010 267:9-2 1；Akinc等人,Nat Biotechnol.2008 26:561-569；Love等人,Proc Natl Acad Sci U S A.2010 107:1864-1869；Siegwart等人,Proc Natl Acad Sci US A.2011108:12996-3001)。
虽然这些类脂质已用来在啮齿动物和非人灵长类动物体内有效递送双链小干扰RNA分子(参见Akinc等人,Nat Biotechnol.200826:561-569；Frank-Kamenetsky等人,ProcNatl Acad Sci U S A.2008105:11915-11920；Akinc等人,Mol Ther.2009 17:872-879；Love等人,Proc Natl Acad Sci U S A.2010 107:1864-1869；Leuschner等人,NatBiotechnol.2011 29:1005-1010)，但是本公开描述了其配制和在递送多核苷酸中的用途。
复合物、胶束、脂质体或颗粒可制备成含有这些类脂质并且因此可产生多核苷酸的有效递送，如经由局部和/或系统施用途径注射类脂质制剂之后产生编码的蛋白质所判断的。多核苷酸的类脂质复合物可通过各种方式施用，包括但不限于静脉内、腹膜内、肿瘤内、肌肉内或皮下途径。
核酸的体内递送可受许多参数包括但不限于制剂组成、颗粒PEG化的性质、负载程度、多核苷酸与脂质比率以及生物物理参数如但不限于粒度所影响(Akinc等人,MolTher.2009 17:872-879)。作为一个实例，聚(乙二醇)(PEG)脂质的锚链长度的小变化可对体内功效产生显著影响。可测试具有不同类脂质的制剂的体内活性，所述类脂质包括但不限于五[3-(1-月桂基氨基丙酰基)]-三亚乙基四胺盐酸盐(TETA-5LAP；又名98N12-5，参见Murugaiah等人,Analytical Biochemistry,401:61(2010))、C12-200(包括衍生物和变体)和MD1。
本文称为“98N12-5”的类脂质由Akinc等人,Mol Ther.(2009)17:872-879公开。
本文称为“C12-200”的类脂质由Love等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2010)107:1864-1869以及Liu和Huang(2010)Molecular Therapy.2010:669-670公开。类脂质制剂可包括除了多核苷酸之外还包含3或4种或更多种组分的颗粒。
类脂质和包含类脂质的多核苷酸制剂描述于国际申请公布号WO2014093924(还参见US20150307542)中。
脂质体、脂质复合物和脂质纳米颗粒
可使用一种或多种脂质体、脂质复合物或脂质纳米颗粒来配制本公开的多核苷酸。在一个实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸和/或包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸的药物组合物包含脂质体。脂质体是人工制备的囊泡，其可主要由脂质双层组成并且可用作用于施用药物制剂的递送媒介物。脂质体可具有不同大小，例如但不限于直径可为数百纳米并且可含有被狭窄含水区室分开的一系列同心双层的多层囊泡(MLV)、直径可小于50nm的小单细胞囊泡(SUV)以及直径可在50nm与500nm之间的大单细胞囊泡(LUV)。脂质体设计可包括但不限于调理素或配体，以便改进脂质体对不健康组织的附着或启动诸如但不限于胞吞的事件。脂质体可含有低或高pH以便改进药物制剂的递送。
脂质体的形成可取决于物理化学特征，例如但不限于包埋的药物制剂和脂质体成分、其中分散脂质囊泡的介质的性质、所包埋物质的有效浓度和其潜在毒性、在囊泡的施加和/或递送过程中涉及的任何另外过程、用于预期应用的囊泡的优化大小、多分散性和保质期，以及大规模生产安全有效的脂质体产品的批与批之间的再现性和可能性。
作为非限制性实例，脂质体如合成膜囊泡通过在美国专利公布号US20130177638、US20130177637、US20130177636、US20130177635、US20130177634、US20130177633、US20130183375、US20130183373和US20130183372中描述的方法、设备和装置来制备。
在一个实施方案中，本文描述的药物组合物包括但不限于脂质体，如由以下物质形成的那些：1,2-二油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DODMA)脂质体、来自Marina Biotech(Bothell,WA)的DiLa2脂质体、1,2-二亚油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-DMA)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧杂环戊烷(DLin-KC2-DMA)和MC3(如US20100324120中所描述)，以及可递送小分子药物的脂质体，如但不限于来自JanssenBiotech,Inc.(Horsham,PA)的
在一个实施方案中，本文描述的药物组合物可包括但不限于脂质体，如从合成先前已描述并且示出适用于体外和体内寡核苷酸递送的稳定质粒-脂质颗粒(SPLP)或稳定核酸脂质颗粒(SNALP)而形成的那些(参见Wheeler等人Gene Therapy.1999 6:271-281；Zhang等人GeneTherapy.1999 6:1438-1447；Jeffs等人Pharm Res.2005 22:362-372；Morrissey等人,Nat Biotechnol.2005 2:1002-1007；Zimmermann等人,Nature.2006 441:111-114；Heyes等人J Contr Rel.2005 107:276-287；Semple等人Nature Biotech.201028:172-176；Judge等人J Clin Invest.2009 119:661-673；deFougerolles Hum GeneTher.2008 19:125-132；美国专利公布号US20130122104)。Wheeler等的原始制造方法为清洁剂透析方法，其后来被Jeffs等改进并且称为自发囊泡形成方法。除了多核苷酸之外，脂质体制剂主要由3至4种脂质组分组成。作为一个实例，脂质体可含有但不限于如Jeffs等所述的55％胆固醇、20％二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、10％PEG-S-DSG以及15％1,2-二油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DODMA)。作为另一个实例，某些脂质体制剂可含有但不限于如Heyes等所述的48％胆固醇、20％DSPC、2％PEG-c-DMA以及30％可电离脂质，其中可电离脂质可以是1,2-二硬脂氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DSDMA)、DODMA、DLin-DMA或1,2-二亚麻酰基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)。
在一些实施方案中，脂质体制剂可包含约25.0％胆固醇至约40.0％胆固醇、约30.0％胆固醇至约45.0％胆固醇、约35.0％胆固醇至约50.0％胆固醇和/或约48.5％胆固醇至约60％胆固醇。在其他实施方案中，制剂包含选自由28.5％、31.5％、33.5％、36.5％、37.0％,、38.5％、39.0％和43.5％组成的组的胆固醇百分比。在一些实施方案中，制剂包含约5.0％至约10.0％DSPC和/或约7.0％至约15.0％DSPC。
在一个实施方案中，药物组合物包含脂质体，所述脂质体被成形以递送包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸和/或包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸。
所述多核苷酸可被脂质体包封和/或它可包含在含水核心中，其然后可通过脂质体包封。参见国际公布号WO2012031046(还参见US20130189351)、WO2012031043(还参见US20130202684)、WO2012030901(还参见US20130195969)和WO2012006378(还参见US20130171241)以及美国专利公布号US20130189351、US20130195969和US20130202684)。
在另一个实施方案中，脂质体被配制用于靶向递送。作为非限制性实例，脂质体被配制用于靶向递送至肝脏。用于靶向递送的脂质体可包括但不限于在美国专利公布号US20130195967中描述的脂质体和制备脂质体的方法。
在另一个实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸和/或包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸被配制在阳离子型水包油乳剂中，其中乳剂颗粒包含油核和阳离子脂质，所述阳离子脂质可与所述多核苷酸相互作用，从而将分子锚定至乳剂颗粒。参见国际公布号WO2012006380(还参见US20160256541)。
在一个实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸和/或包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸被配制在包含其中分散有亲水相的连续疏水相的油包水乳剂中。作为非限制性实例，乳剂可通过在国际公布号WO2013087791(还参见US20140294904)中描述的方法来制备。
在另一个实施方案中，脂质制剂可至少包含可电离脂质、可增强转染的脂质以及含有连接至脂质部分的亲水性头基的至少一种脂质。参见国际公布号WO2011076807和美国公布号20110200582。在另一个实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸和/或包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸被配制在脂质囊泡中，所述脂质囊泡可在官能化的脂质双层之间具有交联(参见美国公布号20120177724)。
在一个实施方案中，所述多核苷酸被配制在如国际专利公布号WO2013086526(还参见US20140356416)中描述的脂质体中。可使用如在国际专利公布号WO2013086526中描述的反向pH梯度和/或优化的内部缓冲液组合物来将多核苷酸包封在脂质体中。
在一个实施方案中，多核苷酸药物组合物被配制在脂质体中，如但不限于DiLa2脂质体(Marina Biotech,Bothell,WA)、(Marina Biotech,Bothell,WA)、基于DOPC(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)的中性脂质体(例如，用于卵巢癌的siRNA递送(Landen等人Cancer Biology&Therapy 2006 5(12)1708-1713))以及透明质酸涂覆的脂质体(Quiet Therapeutics,Israel)。
在一个实施方案中，阳离子脂质是低分子量阳离子脂质，如在美国专利申请号20130090372中描述的那些。在另一个实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸和/或包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸被配制在脂质囊泡中，所述脂质囊泡可在官能化的脂质双层之间具有交联。
在其他实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸和/或包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸被配制在包含阳离子脂质的脂质体中。脂质体的阳离子脂质中的氮原子与多核苷酸中的磷酸酯的摩尔比(N:P比)可在1:1与20:1之间，如在国际公布号WO2013006825中所描述。在另一个实施方案中，脂质体的N:P比可大于20:1或小于1:1。
在一个实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸和/或包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸被配制在脂质-聚阳离子复合物中。脂质-聚阳离子复合物的形成可通过本领域中已知和/或如在美国公布号20120178702中所述的方法来完成。作为非限制性实例，聚阳离子包括阳离子肽或多肽，如但不限于聚赖氨酸、聚鸟氨酸和/或聚精氨酸以及在国际公布号WO2012013326或美国公布号US20130142818中描述的阳离子肽。在另一个实施方案中，所述多核苷酸被配制在脂质-聚阳离子复合物中，所述脂质-聚阳离子复合物还可包含非阳离子脂质，如但不限于胆固醇或二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)。
在一个实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸和/或包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸被配制在氨基醇类脂质中。可用于本公开中的氨基醇类脂质可通过美国专利号8,450,298中描述的方法来制备。
脂质体制剂可受(但不限于)以下因素影响：可电离脂质组分的选择、可电离脂质饱和度、PEG化的性质、所有组分比率以及生物物理参数如大小。在Semple等人(Semple等人Nature Biotech.201028:172-176)的一个实例中，脂质体制剂由57.1％可电离脂质、7.1％二棕榈酰磷脂酰胆碱、34.3％胆固醇以及1.4％PEG-c-DMA组成。作为另一个实例，改变可电离脂质的组成可更有效地将siRNA递送至各种抗原呈递细胞(Basha等人Mol Ther.201119:2186-2200)。在一些实施方案中，脂质体制剂包含约35％至约45％可电离脂质、约40％至约50％可电离脂质、约50％至约60％可电离脂质和/或约55％至约65％可电离脂质。在一些实施方案中，脂质体中脂质与mRNA的比率是约5:1至约20:1、约10:1至约25:1、约15:1至约30:1和/或至少30:1。
在一些实施方案中，增加或减小脂质纳米颗粒(LNP)制剂中的PEG比率和/或将PEG脂质的碳链长度从C14修改至C18以改变LNP制剂的药物代谢动力学和/或生物分布。作为非限制性实例，LNP制剂相较于可电离脂质、DSPC和胆固醇包含约0.5％至约3.0％、约1.0％至约3.5％、约1.5％至约4.0％、约2.0％至约4.5％、约2.5％至约5.0％和/或约3.0％至约6.0％的PEG-c-DOMG(R-3-[(ω-甲氧基-聚(乙二醇)2000)氨基甲酰基)]-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺)(在本文还称为PEG-DOMG)的脂质摩尔比。在另一个实施方案中，PEG-c-DOMG可被PEG脂质替代，所述PEG脂质如但不限于PEG-DSG(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇)、PEG-DMG(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油)和/或PEG-DPG(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇)。可电离脂质可选自本领域中已知的任何脂质，如但不限于DLin-MC3-DMA、DLin-DMA、C12-200和DLin-KC2-DMA。
在一个实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸和/或包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸被配制在脂质纳米颗粒中，如在国际公布号WO2012170930(还参见US20140294938)中描述的脂质纳米颗粒。
在一个实施方案中，包含一种或多种多核苷酸的制剂是可包含至少一种脂质的纳米颗粒。所述脂质可选自但不限于DLin-DMA、DLin-K-DMA、98N12-5、C12-200、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、DODMA、PLGA、PEG、PEG-DMG、PEG化脂质以及氨基醇脂质。在另一方面，所述脂质是阳离子脂质，如但不限于DLin-DMA、DLin-D-DMA、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、DODMA以及氨基醇脂质。氨基醇阳离子脂质可以是在美国专利公布号US20130150625中描述的脂质和/或通过在所述专利公布中描述的方法制备的脂质。作为非限制性实例，阳离子脂质可以是2-氨基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]-2-{[(9Z,2Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]甲基}丙-1-醇(US20130150625中的化合物1)；2-氨基-3-[(9Z)-十八碳-9-烯-1-基氧基]-2-{[(9Z)-十八碳-9-烯-1-基氧基]甲基}丙-1-醇(US20130150625中的化合物2)；2-氨基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]-2-[(辛基氧基)甲基]丙-1-醇(US20130150625中的化合物3)；以及2-(二甲基氨基)-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]-2-{[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]甲基}丙-1-醇(US20130150625中的化合物4)；或其任何药学上可接受的盐或立体异构体。
本公开提供了具有有利性质的药物组合物。特别地，本申请提供了药物组合物，所述药物组合物包含：
(i)包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸；或
(ii)包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸或包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸；或
(iii)包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸和包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸或包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸；或
(iv)包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸和包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸；或
(v)包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸或包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸和包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸；或
(vi)包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸或包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸和包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸；
以及，
(b)递送剂。
在一些实施方案中，所述递送剂包含具有式(I)的化合物
其中，
R1是选自由以下组成的组：C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR"、-YR"和-R"M'R'；
R2和R3独立地选自由以下组成的组：H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR"、-YR"和-R*OR"，或者R2和R3与它们所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4是选自由以下组成的组：C3-6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2以及未取代的C1-6烷基，其中Q是选自碳环、杂环、-OR、O(CH2)nN(R)2、C(O)OR、OC(O)R、CX3、CX2H、CXH2、CN、-N(R)2、C(O)N(R)2、N(R)C(O)R、N(R)S(O)2R、N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(＝NR9)N(R)2、-N(R)C(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(＝NR9)N(R)2、-N(OR)C(＝CHR9)N(R)2、-C(＝NR9)N(R)2、-C(＝NR9)R、-C(O)N(R)OR以及C(R)N(R)2C(O)OR，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；
每个R5独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R6独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
M和M'独立地选自C(O)O、OC(O)、C(O)N(R')、N(R')C(O)、C(O)-、C(S)、C(S)S、SC(S)、CH(OH)、P(O)(OR')O、S(O)2、-S-S-、芳基以及杂芳基；
R7是选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
R8是选自由以下组成的组：C3-6碳环和杂环；
R9是选自由以下组成的组：H、CN、NO2、C1-6烷基、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6烯基、C3-6碳环和杂环；
每个R独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R'独立地选自由以下组成的组：C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR"、YR"以及H；
每个R"独立地选自由以下组成的组：C3-14烷基和C3-14烯基；
每个R*独立地选自由以下组成的组：C1-12烷基和C2-12烯基；
每个Y独立地是C3-6碳环；
每个X独立地选自由以下组成的组：F、Cl、Br和I；并且m是选自5、6、7、8、9、10、11、12和13，
或其盐或立体异构体。
在一些实施方案中，式(I)化合物的子集包括以下那些，其中
R1是选自由以下组成的组：C5-20烷基、C5-20烯基、R*YR”、YR”和R”M’R’；
R2和R3独立地选自由以下组成的组：H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、YR”和R*OR”，或者R2和R3与它们所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4是选自由以下组成的组：C36碳环、(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、CHQR、CQ(R)2以及未取代的C16烷基，其中Q是选自碳环、杂环、OR、O(CH2)nN(R)2、C(O)OR、OC(O)R、CX3、CX2H、-CXH2、CN、N(R)2、C(O)N(R)2、N(R)C(O)R、N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、N(R)C(S)N(R)2以及C(R)N(R)2C(O)OR，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；
每个R5独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R6独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
M和M'独立地选自C(O)O、OC(O)、C(O)N(R’)、N(R’)C(O)、C(O)-、C(S)、C(S)S、SC(S)、CH(OH)、P(O)(OR’)O、S(O)2、芳基以及杂芳基；
R7是选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R'独立地选自由以下组成的组：C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、YR”以及H；
每个R”独立地选自由以下组成的组：C3-14烷基和C3-14烯基；
每个R*独立地选自由以下组成的组：C1-12烷基和C2-12烯基；
每个Y独立地是C3-6碳环；
每个X独立地选自由以下组成的组：F、Cl、Br和I；并且m是选自5、6、7、8、9、10、11、12和13，
或其盐或立体异构体，其中烷基和烯基可以是直链的或支链的。
在一些实施方案中，式(I)化合物的子集包括以下那些，其中当R4是(CH2)nQ、(CH2)nCHQR、CHQR或CQ(R)2时，则(i)当n是1、2、3、4或5时，Q不是N(R)2，或者(ii)当n是1或2时，Q不是5、6或7元杂环烷基。
在另一个实施方案中，式(I)化合物的另一子集包括以下那些，其中
R1是选自由以下组成的组：C5-30烷基、C5-20烯基、R*YR"、YR"和R"M'R'；
R2和R3独立地选自由以下组成的组：H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR"、YR"和R*OR"，或者R2和R3与它们所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4是选自由以下组成的组：C36碳环(CH2)nQ、(CH2)nCHQR、-CHQR、CQ(R)2以及未取代的C16烷基，其中Q是选自C36碳环、具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂芳基、OR、-O(CH2)nN(R)2、C(O)OR、OC(O)R、CX3、CX2H、CXH2、CN、C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、N(R)S(O)2R、N(R)C(O)N(R)2、N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)OR、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(＝NR9)N(R)2、-N(R)C(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(＝NR9)N(R)2、-N(OR)C(＝CHR9)N(R)2、-C(＝NR9)N(R)2、-C(＝NR9)R、-C(O)N(R)OR以及具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂环烷基，所述杂环烷基被一个或多个选自氧代(＝O)、OH、氨基以及C13烷基的取代基取代，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；
每个R5独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R6独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
M和M'独立地选自C(O)O、OC(O)、C(O)N(R')、N(R')C(O)、C(O)-、C(S)、C(S)S、SC(S)、CH(OH)、P(O)(OR')O、S(O)2、-S-S-、芳基以及杂芳基；
R7是选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
R8是选自由以下组成的组：C3-6碳环和杂环；
R9是选自由以下组成的组：H、CN、NO2、C1-6烷基、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6烯基、C3-6碳环和杂环；
每个R独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R'独立地选自由以下组成的组：C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR"、YR"以及H；
每个R"独立地选自由以下组成的组：C3-14烷基和C3-14烯基；
每个R*独立地选自由以下组成的组：C1-12烷基和C2-12烯基；
每个Y独立地是C3-6碳环；
每个X独立地选自由以下组成的组：F、Cl、Br和I；并且
m是选自5、6、7、8、9、10、11、12和13，
或其盐或立体异构体。
在另一个实施方案中，式(I)化合物的另一子集包括以下那些，其中
R1是选自由以下组成的组：C5-20烷基、C5-20烯基、R*YR”、YR”和R”M’R’；
R2和R3独立地选自由以下组成的组：H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、YR”和R*OR”，或者R2和R3与它们所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4是选自由以下组成的组：C36碳环、(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、CHQR、CQ(R)2以及未取代的C16烷基，其中Q是选自C36碳环、具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂芳基、OR、O(CH2)nN(R)2、C(O)OR、OC(O)R、CX3、CX2H、CXH2、-CN、C(O)N(R)2、N(R)C(O)R、N(R)S(O)2R、N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、CRN(R)2C(O)OR以及具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂环烷基，所述杂环烷基被一个或多个选自氧代(＝O)、OH、氨基以及C13烷基的取代基取代，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；
每个R5独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R6独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
M和M'独立地选自C(O)O、OC(O)、C(O)N(R’)、N(R’)C(O)、C(O)-、C(S)、C(S)S、SC(S)、CH(OH)、P(O)(OR’)O、S(O)2、芳基以及杂芳基；
R7是选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R'独立地选自由以下组成的组：C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、YR”以及H；
每个R”独立地选自由以下组成的组：C3-14烷基和C3-14烯基；
每个R*独立地选自由以下组成的组：C1-12烷基和C2-12烯基；
每个Y独立地是C3-6碳环；
每个X独立地选自由以下组成的组：F、Cl、Br和I；并且
m是选自5、6、7、8、9、10、11、12和13，
或其盐或立体异构体。
在另一个实施方案中，式(I)化合物的另一子集包括以下那些，其中
R1是选自由以下组成的组：C5-30烷基、C5-20烯基、R*YR"、YR"和R"M'R'；
R2和R3独立地选自由以下组成的组：H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR"、YR"和R*OR"，或者R2和R3与它们所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4是选自由以下组成的组：C36碳环、(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、CHQR、CQ(R)2以及未取代的C16烷基，其中Q是选自C36碳环、具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂环、OR、O(CH2)nN(R)2、C(O)OR、OC(O)R、CX3、CX2H、CXH2、CN、-C(O)N(R)2、N(R)C(O)R、N(R)S(O)2R、N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、CRN(R)2C(O)OR、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(＝NR9)N(R)2、-N(R)C(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(＝NR9)N(R)2、-N(OR)C(＝CHR9)N(R)2、-C(＝NR9)R、-C(O)N(R)OR以及-C(＝NR9)N(R)2，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；并且当Q是5至14元杂环且(i)R4是(CH2)nQ，其中n是1或2，或者(ii)R4是(CH2)nCHQR，其中n是1，或者(iii)R4是CHQR和CQ(R)2时，则Q是5至14元杂芳基或8至14元杂环烷基；
每个R5独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R6独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
M和M'独立地选自C(O)O、OC(O)、C(O)N(R')、N(R')C(O)、C(O)-、C(S)、C(S)S、SC(S)、CH(OH)、P(O)(OR')O、S(O)2、-S-S-、芳基以及杂芳基；
R7是选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
R8是选自由以下组成的组：C3-6碳环和杂环；
R9是选自由以下组成的组：H、CN、NO2、C1-6烷基、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6烯基、C3-6碳环和杂环；
每个R独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R'独立地选自由以下组成的组：C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR"、YR"以及H；
每个R"独立地选自由以下组成的组：C3-14烷基和C3-14烯基；
每个R*独立地选自由以下组成的组：C1-12烷基和C2-12烯基；
每个Y独立地是C3-6碳环；
每个X独立地选自由以下组成的组：F、Cl、Br和I；并且
m是选自5、6、7、8、9、10、11、12和13，
或其盐或立体异构体。
在另一个实施方案中，式(I)化合物的另一子集包括以下那些，其中
R1是选自由以下组成的组：C5-20烷基、C5-20烯基、R*YR”、YR”和R”M’R’；
R2和R3独立地选自由以下组成的组：H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、YR”和R*OR”，或者R2和R3与它们所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4是选自由以下组成的组：C36碳环、(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、CHQR、CQ(R)2以及未取代的C16烷基，其中Q是选自C36碳环、具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂环、OR、O(CH2)nN(R)2、C(O)OR、OC(O)R、CX3、CX2H、CXH2、CN、-C(O)N(R)2、N(R)C(O)R、N(R)S(O)2R、N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、CRN(R)2C(O)OR，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；并且当Q是5至14元杂环且(i)R4是(CH2)nQ，其中n是1或2，或者(ii)R4是(CH2)nCHQR，其中n是1，或者(iii)R4是CHQR和CQ(R)2时，则Q是5至14元杂芳基或8至14元杂环烷基；
每个R5独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R6独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
M和M'独立地选自C(O)O、OC(O)、C(O)N(R’)、N(R’)C(O)、C(O)-、C(S)、C(S)S、SC(S)、CH(OH)、P(O)(OR’)O、S(O)2、芳基以及杂芳基；
R7是选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R'独立地选自由以下组成的组：C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、YR”以及H；
每个R”独立地选自由以下组成的组：C3-14烷基和C3-14烯基；
每个R*独立地选自由以下组成的组：C1-12烷基和C2-12烯基；
每个Y独立地是C3-6碳环；
每个X独立地选自由以下组成的组：F、Cl、Br和I；并且
m是选自5、6、7、8、9、10、11、12和13，
或其盐或立体异构体。
在另一个实施方案中，式(I)化合物的另一子集包括以下那些，其中
R1是选自由以下组成的组：C5-30烷基、C5-20烯基、R*YR"、YR"和R"M'R'；
R2和R3独立地选自由以下组成的组：H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR"、YR"和R*OR"，或者R2和R3与它们所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4是选自由以下组成的组：C36碳环、(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、CHQR、CQ(R)2以及未取代的C16烷基，其中Q是选自C36碳环，具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂芳基、-OR、O(CH2)nN(R)2、C(O)OR、OC(O)R、CX3、CX2H、CXH2、-CN、C(O)N(R)2、N(R)C(O)R、N(R)S(O)2R、N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、CRN(R)2C(O)OR、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(＝NR9)N(R)2、-N(R)C(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(＝NR9)N(R)2、-N(OR)C(＝CHR9)N(R)2、-C(＝NR9)R、-C(O)N(R)OR以及-C(＝NR9)N(R)2，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；
每个R5独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R6独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
M和M'独立地选自C(O)O、OC(O)、C(O)N(R')、N(R')C(O)、C(O)-、C(S)、C(S)S、SC(S)、CH(OH)、P(O)(OR')O、S(O)2、-S-S-、芳基以及杂芳基；
R7是选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
R8是选自由以下组成的组：C3-6碳环和杂环；
R9是选自由以下组成的组：H、CN、NO2、C1-6烷基、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6烯基、C3-6碳环和杂环；
每个R独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R'独立地选自由以下组成的组：C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR"、YR"以及H；
每个R"独立地选自由以下组成的组：C3-14烷基和C3-14烯基；
每个R*独立地选自由以下组成的组：C1-12烷基和C2-12烯基；
每个Y独立地是C3-6碳环；
每个X独立地选自由以下组成的组：F、Cl、Br和I；并且
m是选自5、6、7、8、9、10、11、12和13，
或其盐或立体异构体。
在另一个实施方案中，式(I)化合物的另一子集包括以下那些，其中
R1是选自由以下组成的组：C5-30烷基、C5-20烯基、R*YR”、YR”和R”M’R’；
R2和R3独立地选自由以下组成的组：H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、YR”和R*OR”，或者R2和R3与它们所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4是选自由以下组成的组：C36碳环、(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、CHQR、CQ(R)2以及未取代的C16烷基，其中Q是选自C36碳环、具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂芳基、-OR、O(CH2)nN(R)2、C(O)OR、OC(O)R、CX3、CX2H、CXH2、-CN、C(O)N(R)2、N(R)C(O)R、N(R)S(O)2R、N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、CRN(R)2C(O)OR，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；
每个R5独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R6独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
M和M'独立地选自C(O)O、OC(O)、C(O)N(R’)、N(R’)C(O)、C(O)-、C(S)、C(S)S、SC(S)、CH(OH)、P(O)(OR’)O、S(O)2、芳基以及杂芳基；
R7是选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R'独立地选自由以下组成的组：C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、YR”以及H；
每个R”独立地选自由以下组成的组：C3-14烷基和C3-14烯基；
每个R*独立地选自由以下组成的组：C1-12烷基和C2-12烯基；
每个Y独立地是C3-6碳环；
每个X独立地选自由以下组成的组：F、Cl、Br和I；并且
m是选自5、6、7、8、9、10、11、12和13，
或其盐或立体异构体。
在另一个实施方案中，式(I)化合物的另一子集包括以下那些，其中
R1是选自由以下组成的组：C5-30烷基、C5-20烯基、R*YR"、YR"和R"M'R'；
R2和R3独立地选自由以下组成的组：H、C2-14烷基、C2-14烯基、-R*YR"、YR"和R*OR"，或者R2和R3与它们所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4是(CH2)nQ或(CH2)nCHQR，其中Q是N(R)2，并且n是选自3、4和5；
每个R5独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R6独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
M和M'独立地选自C(O)O、OC(O)、C(O)N(R')、N(R')C(O)、C(O)-、C(S)、C(S)S、SC(S)、CH(OH)、P(O)(OR')O、S(O)2、-S-S-、芳基以及杂芳基；
R7是选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R'独立地选自由以下组成的组：C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR"、YR"以及H；
每个R"独立地选自由以下组成的组：C3-14烷基和C3-14烯基；
每个R*独立地选自由以下组成的组：C1-12烷基和C1-12烯基；
每个Y独立地是C3-6碳环；
每个X独立地选自由以下组成的组：F、Cl、Br和I；并且
m是选自5、6、7、8、9、10、11、12和13，
或其盐或立体异构体。
在另一个实施方案中，式(I)化合物的另一子集包括以下那些，其中
R1是选自由以下组成的组：C5-20烷基、C5-20烯基、R*YR”、YR”和R”M’R’；
R2和R3独立地选自由以下组成的组：H、C2-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、YR”和R*OR”，或者R2和R3与它们所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4是(CH2)nQ或(CH2)nCHQR，其中Q是N(R)2，并且n是选自3、4和5；
每个R5独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R6独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
M和M'独立地选自C(O)O、OC(O)、C(O)N(R’)、N(R’)C(O)、C(O)-、C(S)、C(S)S、SC(S)、CH(OH)、P(O)(OR’)O、S(O)2、芳基以及杂芳基；
R7是选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R’独立地选自由以下组成的组：C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、YR”以及H；
每个R”独立地选自由以下组成的组：C3-14烷基和C3-14烯基；
每个R*独立地选自由以下组成的组：C1-12烷基和C1-12烯基；
每个Y独立地是C3-6碳环；
每个X独立地选自由以下组成的组：F、Cl、Br和I；并且
m是选自5、6、7、8、9、10、11、12和13，
或其盐或立体异构体。
在其他实施方案中，式(I)化合物的另一子集包括以下那些，其中
R1是选自由以下组成的组：C5-30烷基、C5-20烯基、R*YR"、YR"和R"M'R'；
R2和R3独立地选自由以下组成的组：C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR"、YR"和R*OR"，或者R2和R3与它们所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4是选自由以下组成的组：(CH2)nQ、(CH2)nCHQR、CHQR和-CQ(R)2，其中Q是N(R)2，并且n是选自1、2、3、4和5；
每个R5独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R6独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
M和M'独立地选自C(O)O、OC(O)、C(O)N(R')、N(R')C(O)、C(O)-、C(S)、C(S)S、SC(S)、CH(OH)、P(O)(OR')O、S(O)2、-S-S-、芳基以及杂芳基；
R7是选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R'独立地选自由以下组成的组：C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR"、YR"以及H；
每个R"独立地选自由以下组成的组：C3-14烷基和C3-14烯基；
每个R*独立地选自由以下组成的组：C1-12烷基和C1-12烯基；
每个Y独立地是C3-6碳环；
每个X独立地选自由以下组成的组：F、Cl、Br和I；并且
m是选自5、6、7、8、9、10、11、12和13，
或其盐或立体异构体。
在其他实施方案中，式(I)化合物的另一子集包括以下那些，其中
R1是选自由以下组成的组：C5-20烷基、C5-20烯基、R*YR”、YR”和R”M’R’；
R2和R3独立地选自由以下组成的组：C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、YR”和R*OR”，或者R2和R3与它们所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4是选自由以下组成的组：(CH2)nQ、(CH2)nCHQR、CHQR和-CQ(R)2，其中Q是N(R)2，并且n是选自1、2、3、4和5；
每个R5独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R6独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
M和M'独立地选自C(O)O、OC(O)、C(O)N(R’)、N(R’)C(O)、C(O)-、C(S)、C(S)S、SC(S)、CH(OH)、P(O)(OR’)O、S(O)2、芳基以及杂芳基；
R7是选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R’独立地选自由以下组成的组：C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、YR”以及H；
每个R”独立地选自由以下组成的组：C3-14烷基和C3-14烯基；
每个R*独立地选自由以下组成的组：C1-12烷基和C1-12烯基；
每个Y独立地是C3-6碳环；
每个X独立地选自由以下组成的组：F、Cl、Br和I；并且
m是选自5、6、7、8、9、10、11、12和13，
或其盐或立体异构体。
在某些实施方案中，式(I)化合物的子集包括式(IA)的那些：
或其盐或立体异构体，其中l是选自1、2、3、4和5；m是选自5、6、7、8和9；M1是键或M'；R4是未取代的C13烷基或(CH2)nQ，其中Q是OH、NHC(S)N(R)2、NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(＝NR9)N(R)2、-NHC(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、杂芳基或杂环烷基；M和M'独立地选自C(O)O、OC(O)、C(O)N(R')、P(O)(OR')O、-S-S-、芳基以及杂芳基；并且
R2和R3独立地选自由以下组成的组：H、C114烷基和C214烯基。
在一些实施方案中，式(I)化合物的子集包括式(IA)的那些，或其盐或立体异构体，
其中
l是选自1、2、3、4和5；m是选自5、6、7、8和9；
M1是键或M’；
R4是未取代的C13烷基或(CH2)nQ，其中Q是OH、NHC(S)N(R)2或NHC(O)N(R)2；
M和M’独立地选自C(O)O、OC(O)、C(O)N(R’)、P(O)(OR’)O、芳基以及杂芳基；并且
R2和R3独立地选自由以下组成的组：H、C114烷基和C214烯基。
在某些实施方案中，式(I)化合物的子集包括式(II)的那些：
或其盐或立体异构体，其中l是选自1、2、3、4和5；M1是键或M'；R4是未取代的C13烷基或(CH2)nQ，其中n是2、3或4，并且Q是OH、NHC(S)N(R)2、NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(＝NR9)N(R)2、-NHC(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、杂芳基或杂环烷基；M和M'独立地选自C(O)O、OC(O)-、C(O)N(R')、P(O)(OR')O、-S-S-、芳基以及杂芳基；并且
R2和R3独立地选自由以下组成的组：H、C114烷基和C214烯基。
在一些实施方案中，式(I)化合物的子集包括式(II)的那些，或其盐或立体异构体，其中
l是选自1、2、3、4和5；
M1是键或M’；
R4是未取代的C13烷基或(CH2)nQ，其中n是2、3或4，并且Q是OH、NHC(S)N(R)2或NHC(O)N(R)2；
M和M’独立地选自C(O)O、OC(O)、C(O)N(R’)、P(O)(OR’)O、芳基以及杂芳基；并且
R2和R3独立地选自由以下组成的组：H、C114烷基和C214烯基。
在一些实施方案中，式(I)化合物具有式(IIa)，
或其盐，其中R4如上文所描述。
在一些实施方案中，式(I)化合物具有式(IIb)，
或其盐，其中R4如上文所描述。
在一些实施方案中，式(I)化合物具有式(IIc)，
或其盐，其中R4如上文所描述。
在一些实施方案中，式(I)化合物具有式(IIe)：
或其盐，其中R4如上文所描述。
在一些实施方案中，式(IIa)、(IIb)、(IIc)或(IIe)的化合物包含R4，其是选自(CH2)nQ和(CH2)nCHQR，其中Q、R和n如上文所定义。
在一些实施方案中，Q是选自由以下组成的组：OR、OH、-O(CH2)nN(R)2、OC(O)R、CX3、CN、N(R)C(O)R、N(H)C(O)R、-N(R)S(O)2R、N(H)S(O)2R、N(R)C(O)N(R)2、N(H)C(O)N(R)2、-N(H)C(O)N(H)(R)、N(R)C(S)N(R)2、N(H)C(S)N(R)2、N(H)C(S)N(H)(R)以及杂环，其中R如上文所定义。在一些方面，n是1或2。在一些实施方案中，Q是OH、NHC(S)N(R)2或NHC(O)N(R)2。
在一些实施方案中，式(I)化合物具有式(IId)，
或其盐，其中R2和R3独立地选自由以下组成的组：C5-14烷基和C5-14烯基，n是选自2、3和4，并且R'、R"、R5、R6和m如上文所定义。
在式(IId)化合物的一些方面，R2是C8烷基。在式(IId)化合物的一些方面，R3是C5C9烷基。在式(IId)化合物的一些方面，m是5、7或9。在式(IId)化合物的一些方面，每个R5是H。在式(IId)化合物的一些方面，每个R6是H。
在另一方面，本申请提供了一种脂质组合物(例如，脂质纳米颗粒(LNP))，其包含：(1)具有式(I)的化合物；(2)任选的辅助脂质(例如磷脂)；(3)任选的结构脂质(例如固醇)；(4)任选的脂质缀合物(例如PEG-脂质)；以及(5)任选的季胺化合物。在示例性实施方案中，脂质组合物(例如，LNP)还包含：包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其组合，例如包封在其中的一种或多种多核苷酸。
在一个特定实施方案中，脂质组合物(例如，LNP)还包含：包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸或包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸。在另一个特定实施方案中，脂质组合物(例如，LNP)还包含：包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸和包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸。
如本文所用，术语“烷基(alkyl)”或“烷基(alkyl group)”是指包含一个或多个碳原子(例如，一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九、二十个或更多个碳原子)的直链或支链饱和烃。
符号“C114烷基”是指包含1-14个碳原子的直链或支链饱和烃。烷基可任选地被取代。
如本文所用，术语“烯基(alkenyl)”或“烯基(alkenyl group)”是指包含两个或更多个碳原子(例如，二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九、二十个或更多个碳原子)和至少一个双键的直链或支链饱和烃。
符号“C214烯基”是指包含2-14个碳原子和至少一个双键的直链或支链饱和烃。烯基可包含一个、两个、三个、四个或更多个双键。例如，C18烯基可包含一个或多个双键。包含两个双键的C18烯基可以是亚油基。烯基可任选地被取代。
如本文所用，术语“碳环”或“碳环基团”是指包含碳原子的一个或多个环的单环或多环系统。环可以是三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五元环。
符号“C36碳环”是指包含具有3-6个碳原子的单环的碳环。碳环可包含一个或多个双键，并且可以是芳族的(例如芳基)。碳环的实例包括环丙基、环戊基、环己基、苯基、萘基和1,2-二氢萘基。碳环可被任选地取代。
如本文所用，术语“杂环”或“杂环基团”是指包含一个或多个环的单环或多环系统，其中至少一个环包含至少一个杂原子。杂原子可以是例如氮、氧或硫原子。环可以是三、四、五、六、七、八、九、十、十一或十二元环。杂环可包含一个或多个双键，并且可以是芳族的(例如，杂芳基)。杂环的实例包括咪唑基、咪唑烷基、噁唑基、噁唑烷基、噻唑基、噻唑烷基、吡唑烷基、吡唑基、异噁唑烷基、异噁唑基、异噻唑烷基、异噻唑基、吗啉基、吡咯基、吡咯烷基、呋喃基、四氢呋喃基、苯硫基、吡啶基、哌啶基、喹啉基和异喹啉基。杂环可任选地被取代。
如本文所用，“可生物降解的基团”是可促进脂质灶受试者中更快代谢的基团。可生物降解的基团可以是但不限于C(O)O、OC(O)、-C(O)N(R')、N(R')C(O)、C(O)、C(S)、C(S)S、SC(S)、CH(OH)、P(O)(OR')O-、S(O)2、芳基和杂芳基。
如本文所用，“芳基”是包含一个或多个芳环的碳环基团。芳基的实例包括苯基和萘基。
如本文所用，“杂芳基”是包含一个或多个芳环的杂环基团。杂芳基的实例包括吡咯基、呋喃基、苯硫基、咪唑基、噁唑基和噻唑基。芳基和杂芳基均可任选地被取代。例如，M和M'可选自由任选取代的苯基、噁唑和噻唑组成的非限制性组。在本文的式中，M和M'可独立地选自上述可生物降解基团的列表。
除非另有说明，否则烷基、烯基和环基(例如，碳环基和杂环基)可任选地被取代。任选的取代基可选自由以下组成的组：但不限于卤素原子(例如氯、溴、氟或碘基团)、羧酸(例如C(O)OH)、醇(例如，羟基、OH)、酯(例如，C(O)OR或OC(O)R)、醛(例如，C(O)H)、羰基(例如，C(O)R，或者由C＝O表示)、酰基卤(例如，C(O)X，其中X是选自溴化物、氟化物、氯化物和碘化物的卤化物)、碳酸根(例如，-OC(O)OR)、烷氧基(例如，OR)、缩醛(例如，C(OR)2R"，其中每个OR是可相同或不同的烷氧基，并且R"是烷基或烯基)、磷酸根(例如，P(O)4 3)、硫醇(例如，SH)、亚砜(例如，S(O)R)、亚磺酸(例如，S(O)OH)、磺酸(例如，S(O)2OH)、硫醛(例如，C(S)H)、硫酸根(例如，S(O)4 2)、磺酰基(例如，S(O)2)、酰胺(例如，C(O)NR2或N(R)C(O)R)、叠氮基(例如，N3)、硝基(例如，NO2)、氰基(例如，CN)、异氰基(例如，NC)、酰氧基(例如，OC(O)R)、氨基(例如，NR2、NRH或NH2)、氨基甲酰基(例如，OC(O)NR2、OC(O)NRH或OC(O)NH2)、磺酰胺(例如，-S(O)2NR2、S(O)2NRH、S(O)2NH2、N(R)S(O)2R、N(H)S(O)2R、-N(R)S(O)2H或N(H)S(O)2H)、烷基、烯基和环基(例如，碳环基或杂环基)。
在前述任一项中，R是如本文所定义的烷基或烯基。在一些实施方案中，取代基本身可进一步被例如一个、两个、三个、四个、五个或六个如本文定义的取代基取代。例如，C16烷基可进一步被一个、两个、三个、四个、五个或六个如本文所述的取代基取代。
当适用时，式(I)、(IA)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)和(IIe)中任一个的化合物包含以下特征中的一种或多种。
在一些实施方案中，R4是选自由以下组成的组：C36碳环、-(CH2)nQ、CH2)nCHQR、CHQR以及CQ(R)2，其中Q是选自C36碳环、具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元芳族或非芳族杂环、OR、O(CH2)nN(R)2、C(O)OR、OC(O)R、CX3、CX2H、CXH2、-CN、N(R)2、C(O)N(R)2、N(R)C(O)R、N(R)S(O)2R、N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2以及C(R)N(R)2C(O)OR，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5。
在另一个实施方案中，R4是选自由以下组成的组：C36碳环、-CH2)nQ、CH2)nCHQR、CHQR和CQ(R)2，其中Q是选自C36碳环、具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂芳基、OR、-O(CH2)nN(R)2、C(O)OR、OC(O)R、CX3、CX2H、CXH2、CN、C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、N(R)S(O)2R、N(R)C(O)N(R)2、N(R)C(S)N(R)2、-C(R)N(R)2C(O)OR以及具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂环烷基，所述杂环烷基被一个或多个选自氧代(＝O)、OH、氨基以及C13烷基的取代基取代，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5。
在另一个实施方案中，R4是选自由以下组成的组：C36碳环、-CH2)nQ、CH2)nCHQR、CHQR和CQ(R)2，其中Q是选自C36碳环、具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂环、OR、-O(CH2)nN(R)2、C(O)OR、OC(O)R、CX3、CX2H、CXH2、CN、C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、N(R)S(O)2R、N(R)C(O)N(R)2、N(R)C(S)N(R)2、-C(R)N(R)2C(O)OR，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；并且当Q是5至14元杂环且(i)R4是(CH2)nQ，其中n是1或2，或者(ii)R4是(CH2)nCHQR，其中n是1，或者(iii)R4是CHQR和CQ(R)2时，则Q是5至14元杂芳基或8至14元杂环烷基。
在另一个实施方案中，R4是选自由以下组成的组：C36碳环、-(CH2)nQ、(CH2)nCHQR、CHQR和CQ(R)2，其中Q是选自C36碳环、具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂芳基、OR、-O(CH2)nN(R)2、C(O)OR、OC(O)R、CX3、CX2H、CXH2、CN、C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、N(R)S(O)2R、N(R)C(O)N(R)2、N(R)C(S)N(R)2、-C(R)N(R)2C(O)OR，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5。
在另一个实施方案中，R4是未取代的C14烷基，例如未取代的甲基。
在某些实施方案中，本公开提供了一种具有式(I)的化合物，其中R4是CH2)nQ或CH2)nCHQR，其中Q是N(R)2，并且n是选自3、4和5。
在某些实施方案中，本公开提供了一种具有式(I)的化合物，其中R4是选自由以下组成的组：CH2)nQ、CH2)nCHQR、CHQR和CQ(R)2，其中Q是N(R)2，并且n是选自1、2、3、4和5。
在某些实施方案中，本公开提供了一种具有式(I)的化合物，其中R2和R3独立地选自由以下组成的组：C214烷基、C214烯基、R*YR"、-YR"和R*OR"，或者R2和R3与它们所连接的原子一起形成杂环或碳环，并且R4是CH2)nQ或CH2)nCHQR，其中Q是N(R)2，并且n是选自3、4和5。
在某些实施方案中，R2和R3独立地选自由以下组成的组：C2-14烷基、C2-14烯基、R*YR"、YR"和R*OR"，或者R2和R3与它们所连接的原子一起形成杂环或碳环。
在一些实施方案中，R1是选自由C520烷基和C520烯基组成的组。
在其他实施方案中，R1是选自由R*YR"、YR"和R"M'R'组成的组。
在某些实施方案中，R1是选自R*YR"和YR"。在一些实施方案中，Y是环丙基。在一些实施方案中，R*是C8烷基或C8烯基。在某些实施方案中，R"是C312烷基。例如，R"可以是C3烷基。例如，R"可以C48烷基(例如，C4、C5、C6、C7或C8烷基)。
在一些实施方案中，R1是C520烷基。在一些实施方案中，R1是C6烷基。在一些实施方案中，R1是C8烷基。在其他实施方案中，R1是C9烷基。在某些实施方案中，R1是C14烷基。在其他实施方案中，R1是C18烷基。
在一些实施方案中，R1是C520烯基。在某些实施方案中，R1是C18烯基。在一些实施方案中，R1是亚油基。
在某些实施方案中，R1是支链的(例如，癸-2-基、十一烷-3-基、十二烷-4-基、十三烷-5-基、十四烷-6-基、2-甲基十一烷-3-基、2-甲基癸-2-基、3-甲基十三烷-3-基、4-甲基十二烷-4-基或十七碳-9-基)。在某些实施方案中，R1是
在某些实施方案中，R1是未取代的C520烷基或C520烯基。在某些实施方案中，R'是取代的C520烷基或C520烯基(例如，被C36碳环如1-环丙基壬基取代)。
在其他实施方案中，R1是R"M'R'。
在一些实施方案中，R'是选自R*YR"和YR"。在一些实施方案中，Y是C38环烷基。在一些实施方案中，Y是C610芳基。在一些实施方案中，Y是环丙基。在一些实施方案中，Y是环己基。在某些实施方案中，R*是C1烷基。
在一些实施方案中，R"是选自由C3-12烷基和C312烯基组成的组。在一些实施方案中，邻近Y的是R"是C1烷基。在一些实施方案中，邻近Y的是R"是C49烷基(例如，C4、C5、C6、C7或C8或C9烷基)。
在一些实施方案中，R'是选自C4烷基和C4烯基。在某些实施方案中，R'是选自C5烷基和C5烯基。在一些实施方案中，R'是选自C6烷基和C6烯基。在一些实施方案中，R'是选自C7烷基和C7烯基。在一些实施方案中，R'是选自C9烷基和C9烯基。
在其他实施方案中，R'是选自C11烷基和C11烯基。在其他实施方案中，R'是选自C12烷基、C12烯基、C13烷基、C13烯基、C14烷基、C14烯基、C15烷基、C15烯基、C16烷基、C16烯基、C17烷基、C17烯基、C18烷基和C18烯基。在某些实施方案中，R'是支链的(例如，癸-2-基、十一烷-3-基、十二烷-4-基、十三烷-5-基、十四烷-6-基、2-甲基十一烷-3-基、2-甲基癸-2-基、3-甲基十三烷-3-基、4-甲基十二烷-4-基或十七碳-9-基)。在某些实施方案中，R’是
在某些实施方案中，R’是未取代的C118烷基。在某些实施方案中，R'是取代的C118烷基(例如，被C36碳环如1-环丙基壬基取代的C115烷基)。
在一些实施方案中，R"是选自由C314烷基和C314烯基组成的组。在一些实施方案中，R"是C3烷基、C4烷基、C5烷基、C6烷基、C7烷基或C8烷基。在一些实施方案中，R"是C9烷基、C10烷基、C11烷基、C12烷基、C13烷基或C14烷基。
在一些实施方案中，M'是C(O)O。在一些实施方案中，M’是-OC(O)。
在其他实施方案中，M'是芳基或杂芳基。例如，M'可选自由苯基、噁唑和噻唑组成的组。
在一些实施方案中M是C(O)O。在一些实施方案中，M是OC(O)-。在一些实施方案中，M是C(O)N(R')。在一些实施方案中，M是-P(O)(OR')O。
在其他实施方案中，M是芳基或杂芳基。例如，M可选自由苯基、噁唑和噻唑组成的组。
在一些实施方案中，M与M'相同。在其它实施方案中，M与M'不同。
在一些实施方案中，每个R5是H。在一些实施方案中，每个R6也是H。
在一些实施方案中，R7是H。在其他实施方案中，R7是C13烷基(例如，甲基、乙基、丙基或异丙基)。
在一些实施方案中，R2和R3独立地是C514烷基或C514烯基。
在一些实施方案中，R2和R3是相同的。在一些实施方案中，R2和R3是C8烷基。在某些实施方案中，R2和R3是C2烷基。在其他实施方案中，R2和R3是C3烷基。在一些实施方案中，R2和R3是C4烷基。在某些实施方案中，R2和R3是C5烷基。在其他实施方案中，R2和R3是C6烷基。在一些实施方案中，R2和R3是C7烷基。
在其他实施方案中，R2和R3是不同的。在某些实施方案中，R2是C8烷基。在一些实施方案中，R3是C17(例如，C1、C2、C3、C4、C5、C6或C7烷基)或C9烷基。
在一些实施方案中，R7和R3是H。
在某些实施方案中，R2是H。
在一些实施方案中，m是5、7或9。
在一些实施方案中，R4是选自(CH2)nQ和(CH2)nCHQR。
在一些实施方案中，Q是选自由以下组成的组：OR、OH、-O(CH2)nN(R)2、OC(O)R、CX3、CN、N(R)C(O)R、N(H)C(O)R、-N(R)S(O)2R、N(H)S(O)2R、N(R)C(O)N(R)2、N(H)C(O)N(R)2、-N(H)C(O)N(H)(R)、N(R)C(S)N(R)2、N(H)C(S)N(R)2、-N(H)C(S)N(H)(R)、C(R)N(R)2C(O)OR、碳环以及杂环。
在某些实施方案中，Q是OH。
在某些实施方案中，Q是取代的或未取代的5至10元杂芳基，例如，Q是咪唑、嘧啶、嘌呤、2-氨基-1,9-二氢-6H-嘌呤-6-酮-9-基(或鸟嘌呤-9-基)、腺嘌呤-9-基、胞嘧啶-1-基或尿嘧啶-1-基。在某些实施方案中，Q是取代的5至14元杂环烷基，例如被一个或多个选自氧代(＝O)、OH、氨基和C1-3烷基的取代基取代。例如，Q是4-甲基哌嗪基、4-(4-甲氧基苄基)哌嗪基或异吲哚啉-2-基-1,3-二酮。
在某些实施方案中，Q是未取代的或取代的C610芳基(如苯基)或C36环烷基。
在一些实施方案中，n是1。在其他实施方案中，n是2。在其他实施方案中，n是3。在某些其他实施方案中，n是4。例如，R4可以是(CH2)2OH。例如，R4可以是(CH2)3OH。例如，R4可以是(CH2)4OH。例如，R4可以是苄基。例如，R4可以是4-甲氧基苄基。
在一些实施方案中，R4是C36碳环。在一些实施方案中，R4是C36环烷基。例如，R4可以是任选地被例如OH、卤代、C16烷基等取代的环己基。例如，R4可以是2-羟基环己基。
在一些实施方案中，R是H。
在一些实施方案中，R是未取代的C13烷基或未取代的C23烯基。例如，R4可以是CH2CH(OH)CH3或CH2CH(OH)CH2CH3。
在一些实施方案中，R是取代的C13烷基，例如，CH2OH。例如，R4可以是CH2CH(OH)CH2OH。
在一些实施方案中，R2和R3与它们所连接的原子一起形成杂环或碳环。在一些实施方案中，R2和R3与它们所连接的原子一起形成具有一个或多个选自N、O、S和P的杂原子的5至14元芳族或非芳族杂环。在一些实施方案中，R2和R3与它们所连接的原子一起形成任选取代的C320碳环(例如，C318碳环、C315碳环、C312碳环或C310碳环)，所述碳环是芳族或非芳族的。在一些实施方案中，R2和R3与它们所连接的原子一起形成C36碳环。在其他实施方案中，R2和R3与它们所连接的原子一起形成C6碳环，如环己基或苯基。在某些实施方案中，杂环或C36碳环被一个或多个烷基取代(例如，在相同环原子处或在相邻或不相邻的环原子处)。例如，R2和R3与它们所连接的原子一起可形成带有一个或多个C5烷基取代的环己基或苯基。在某些实施方案中，由R2和R3形成的杂环或C36碳环被碳环基团取代。例如，R2和R3与它们所连接的原子一起可形成环己基或被环己基取代的苯基。在其他实施方案中，R2和R3与它们所连接的原子一起形成C715碳环，如环庚基、环十五烷基或萘基。
在一些实施方案中，R4是选自(CH2)nQ和(CH2)nCHQR。在一些实施方案中，Q是选自由以下组成的组：OR、OH、O(CH2)nN(R)2、-OC(O)R、CX3、CN、N(R)C(O)R、N(H)C(O)R、N(R)S(O)2R、-N(H)S(O)2R、N(R)C(O)N(R)2、N(H)C(O)N(R)2、-N(H)C(O)N(H)(R)、N(R)C(S)N(R)2、N(H)C(S)N(R)2、N(H)C(S)N(H)(R)以及杂环。在其他实施方案中，Q是选自由咪唑、嘧啶和嘌呤组成的组。
在一些实施方案中，R2和R3与它们所连接的原子一起形成杂环或碳环。在一些实施方案中，R2和R3与它们所连接的原子一起形成C36碳环，如苯基。在某些实施方案中，杂环或C36碳环被一个或多个烷基取代(例如，在相同环原子处或在相邻或不相邻的环原子处)。例如，R2和R3与它们所连接的原子一起可形成带有一个或多个C5烷基取代的苯基。
在一些实施方案中，本公开的药物组合物，式(I)化合物是选自由以下组成的组：
以及其盐或立体异构体。
在其他实施方案中，式(I)化合物是选自由化合物1-化合物147、或其盐或立体异构体组成的组。
本文公开的脂质化合物的胺部分可在某些条件下质子化。例如，根据式(I)的脂质的中心胺部分通常在低于氨基部分的pKa的pH下质子化(即带正电)，并且在高于pKa的pH下基本上不带电。此类脂质可被称为可电离氨基脂质。在一些实施方案中，可电离脂质是可电离氨基脂质，在本领域中有时称为“可电离阳离子脂质”。
在一些实施方案中，可电离氨基脂质(例如式(I)化合物)在脂质组合物中的量在约1mol％至99mol％的范围内。
在一个实施方案中，可电离氨基脂质，例如式(I)化合物在脂质组合物中的量是至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99mol％。
在一个实施方案中，可电离氨基脂质(例如式(I)化合物)在脂质组合物中的量在约30mol％至约70mol％、约35mol％至约65mol％、约40mol％至约60mol％以及约45mol％至约55mol％的范围内。
在一个具体实施方案中，可电离氨基脂质(例如，式(I)化合物)在脂质组合物中的量是约50mol％。
除可电离氨基脂质(例如式I化合物)外，本文公开的药物组合物的脂质组合物还可包含额外组分，如磷脂、结构脂质、季胺化合物、PEG-脂质以及其任何组合。
脂质组合物中的额外组分
A.磷脂
本文公开的药物组合物的脂质组合物可包含一种或多种磷脂，例如，一种或多种饱和或(多)不饱和磷脂或其组合。一般来说，磷脂包含磷脂部分和一个或多个脂肪酸部分。例如，磷脂可以是根据式(VII)的脂质：
其中Rp代表磷脂部分，并且R1和R2代表可相同或不同的具有或不具有不饱和度的脂肪酸部分。
磷脂部分可选自，例如，由以下组成的非限制性组：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、2-溶血磷脂酰胆碱和鞘磷脂。
脂肪酸部分可选自，例如，由以下组成的非限制性组：月桂酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻脑酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、芥酸、植烷酸、花生酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、山嵛酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。
特定磷脂可促进与膜的融合。例如，阳离子磷脂可与膜(例如，细胞或细胞内膜)的一种或多种带负电荷的磷脂相互作用。磷脂与膜的融合可允许含脂质组合物(例如，LNP)的一种或多种要素(例如，治疗剂)穿过所述膜，从而允许例如将一种或多种要素递送至靶组织(例如，肿瘤组织)。
还考虑了非天然磷脂物质，包括具有修饰和取代(包括支化、氧化、环化和炔烃)的天然物种。例如，磷脂可用一种或多种炔烃官能化或交联(例如，其中一个或多个双键被三键置换的烯基)。在适当反应条件下，炔烃基团可在暴露于叠氮化物时经历铜催化的环加成反应。此类反应可用于官能化纳米颗粒组合物的脂质双层以促进膜渗透或细胞识别或将纳米颗粒组合物与有用组分如靶向或成像部分(例如染料)缀合。
磷脂包括但不限于甘油磷脂，如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和磷脂酸。磷脂还包括鞘磷脂(phosphosphingolipid)，如鞘磷脂(sphingomyelin)。在一些实施方案中，本文公开的用于肿瘤内递送的药物组合物可包含多于一种磷脂。当使用多于一种磷脂时，此类磷脂可属于相同的磷脂类别(例如，MSPC和DSPC)或不同的类别(例如，MSPC和MSPE)。
磷脂可以是对称或不对称类型。如本文所用，术语“对称磷脂”包括具有匹配的脂肪酸部分和鞘脂的甘油磷脂，其中可变脂肪酸部分和鞘氨醇主链的烃链包含相当数量的碳原子。如本文所用，术语“不对称磷脂”包括溶血脂质，具有不同脂肪酸部分的甘油磷脂(例如，具有不同碳原子数和/或不饱和度(例如，双键)的脂肪酸部分)和其中可变脂肪酸部分和鞘氨醇主链的烃链包含不同数量的碳原子的鞘脂(例如，可变脂肪酸部分包含比烃链多至少两个碳原子或少至少两个碳原子)。
在一些实施方案中，本文公开的药物组合物的脂质组合物包含至少一种对称磷脂。对称磷脂可选自由以下组成的非限制性组：
1,2-二丙酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(03:0PC)、
1,2-二丁酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(04:0PC)、
1,2-二戊酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(05:0PC)、
1,2-二己酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(06:0PC)、
1,2-二庚酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(07:0PC)、
1,2-二辛酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(08:0PC)、
1,2-二壬酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(09:0PC)、
1,2-二癸酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(10:0PC)、
1,2-双十一烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(11:0PC，DUPC)、
1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(12:0PC)、
1,2-双十三烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(13:0PC)、
1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(14:0PC，DMPC)、
1,2-双十五烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(15:0PC)、
1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(16:0PC，DPPC)、
1,2-二植烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(4ME 16:0PC)、
1,2-双十七烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(17:0PC)、
1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:0PC，DSPC)、
1,2-双十九烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(19:0PC)、
1,2-双二十烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(20:0PC)、
1,2-双二十一烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(21:0PC)、
1,2-二山嵛酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(22:0PC)、
1,2-双二十三烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(23:0PC)、
1,2-双二十四烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(24:0PC)、
1,2-二肉豆蔻脑酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(14:1(Δ9-顺式)PC)、
1,2-二反肉豆蔻脑酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(14:1(Δ9-反式)PC)、
1,2-二棕榈油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(16:1(Δ9-顺式)PC)、
1,2-二反棕榈油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(16:1(Δ9-反式)PC)、
1,2-二异岩芹酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:1(Δ6-顺式)PC)、
1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:1(Δ9-顺式)PC，DOPC)、
1,2-二反油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:1(Δ9-反式)PC)、
1,2-二亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:2(顺式)PC，DLPC)、
1,2-二亚麻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:3(顺式)PC，DLnPC)、
1,2-双二十碳烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(20:1(顺式)PC)、
1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(20:4(顺式)PC，DAPC)、
1,2-二瓢儿菜基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(22:1(顺式)PC)、
1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(22:6(顺式)PC，DHAPC)、
1,2-二神经酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(24:1(顺式)PC)、
1,2-二己酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(06:0PE)、
1,2-二辛酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(08:0PE)、
1,2-二癸酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(10:0PE)、
1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(12:0PE)、
1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(14:0PE)、
1,2-双十五烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(15:0PE)、
1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(16:0PE)、
1,2-二植烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(4ME 16:0PE)、
1,2-双十七烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(17:0PE)、
1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(18:0PE，DSPE)、
1,2-二棕榈油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(16:1PE)、
1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(18:1(Δ9-顺式)PE，DOPE)、
1,2-二反油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(18:1(Δ9-反式)PE)、
1,2-二亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(18:2PE，DLPE)、
1,2-二亚麻酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(18:3PE，DLnPE)、
1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(20:4PE，DAPE)、
1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(22:6PE，DHAPE)、
1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:0二醚PC)、
1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸-外消旋-(1-甘油)钠盐(DOPG)以及
其任何组合。
在一些实施方案中，本文公开的药物组合物的脂质组合物包含至少一种选自由以下组成的非限制性组的对称磷脂：DLPC、DMPC、DOPC、DPPC、DSPC、DUPC、18:0二醚PC、DLnPC、DAPC、DHAPC、DOPE、4ME 16:0PE、DSPE、DLPE、DLnPE、DAPE、DHAPE、DOPG以及其任何组合。
在一些实施方案中，本文公开的药物组合物的脂质组合物包含至少一种不对称磷脂。不对称磷脂可选自由以下组成的非限制性组：
1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(14:0-16:0PC，MPPC)、
1-肉豆蔻酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(14:0-18:0PC，MSPC)、
1-棕榈酰基-2-乙酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(16:0-02:0PC)、
1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(16:0-14:0PC，PMPC)、
1-棕榈酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(16:0-18:0PC，PSPC)、
1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(16:0-18:1PC，POPC)、
1-棕榈酰基-2-亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(16:0-18:2PC，PLPC)、
1-棕榈酰基-2-花生四烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(16:0-20:4PC)、
1-棕榈酰基-2-二十二碳六烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(14:0-22:6PC)、
1-硬脂酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:0-14:0PC，SMPC)、
1-硬脂酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:0-16:0PC，SPPC)、
1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:0-18:1PC，SOPC)、
1-硬脂酰基-2-亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:0-18:2PC)、
1-硬脂酰基-2-花生四烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:0-20:4PC)、
1-硬脂酰基-2-二十二碳六烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:0-22:6PC)、
1-油酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:1-14:0PC，OMPC)、
1-油酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:1-16:0PC，OPPC)、
1-油酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:1-18:0PC，OSPC)、
1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(16:0-18:1PE，POPE)、
1-棕榈酰基-2-亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(16:0-18:2PE)、
1-棕榈酰基-2-花生四烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(16:0-20:4PE)、
1-棕榈酰基-2-二十二碳六烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(16:0-22:6PE)、
1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(18:0-18:1PE)、
1-硬脂酰基-2-亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(18:0-18:2PE)、
1-硬脂酰基-2-花生四烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(18:0-20:4PE)、
1-硬脂酰基-2-二十二碳六烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(18:0-22:6PE)、
1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(OChemsPC)以及
其任何组合。
可用于脂质组合物中的不对称脂质也可以是溶血脂质。溶血脂质可选自由以下组成的非限制性组：
1-己酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(06:0Lyso PC)、
1-庚酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(07:0Lyso PC)、
1-辛酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(08:0Lyso PC)、
1-壬酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(09:0Lyso PC)、
1-癸酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(10:0Lyso PC)、
1-十一烷酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(11:0Lyso PC)、
1-月桂酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(12:0Lyso PC)、
1-十三烷酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(13:0Lyso PC)、
1-肉豆蔻酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(14:0Lyso PC)、
1-十五烷酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(15:0Lyso PC)、
1-棕榈酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(16:0Lyso PC)、
1-十七烷酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(17:0Lyso PC)、
1-硬脂酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:0Lyso PC)、
1-油酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:1Lyso PC)、
1-十九烷酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(19:0Lyso PC)、
1-二十烷酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(20:0Lyso PC)、
1-山嵛酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(22:0Lyso PC)、
1-二十四烷酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(24:0Lyso PC)、
1-二十六烷酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(26:0Lyso PC)、
1-肉豆蔻酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(14:0Lyso PE)、
1-棕榈酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(16:0Lyso PE)、
1-硬脂酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(18:0Lyso PE)、
1-油酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(18:1Lyso PE)、
1-十六烷基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(C16Lyso PC)以及
其任何组合。
在一些实施方案中，本文公开的药物组合物的脂质组合物包含至少一种选自由以下组成的组的不对称磷脂：MPPC、MSPC、PMPC、PSPC、SMPC、SPPC以及其任何组合。在一些实施方案中，不对称磷脂是1-肉豆蔻酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(MSPC)。
在一些实施方案中，本文公开的脂质组合物可含有一种或多种对称磷脂、一种或多种不对称磷脂或其组合。当存在多种磷脂时，它们可以等摩尔比或非等摩尔比存在。
在一个实施方案中，本文公开的药物组合物的脂质组合物包含在所述脂质组合物中总量在约1mol％至约20mol％、约5mol％至约20mol％、约10mol％至约20mol％、约15mol％至约20mol％、约1mol％至约15mol％、约5mol％至约15mol％、约10mol％至约15mol％、约5mol％至约10mol％范围内的磷脂(例如，MSPC)。在一个实施方案中，在脂质组合物中磷脂的量是约8mol％至约15mol％。在一个实施方案中，在脂质组合物中磷脂(例如，MSPC)的量是约10mol％。
在一些方面，在脂质组合物中特定磷脂(例如，MSPC)的量是至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20mol％。
B.季胺化合物
本文公开的药物组合物的脂质组合物可包含一种或多种季胺化合物(例如，DOTAP)。术语“季胺化合物”用于包括具有一个或多个季胺基团(例如，三烷基氨基)并且永久带有正电荷并以盐的形式存在的那些化合物。例如，一个或多个季胺基团可存在于脂质或聚合物(例如，PEG)中。在一些实施方案中，季胺化合物包含(1)季胺基团和(2)至少一个疏水性尾基，所述疏水性尾基包含(i)直链或支链、饱和或不饱和的烃链和(ii)在所述季胺基团与所述烃链之间的任选的醚、酯、羰基或缩酮键联。在一些实施方案中，季胺基团可以是三甲基铵基团。在一些实施方案中，季胺化合物包含两条相同的烃链。在一些实施方案中，季胺化合物包含两条不同的烃链。
在一些实施方案中，本文公开的药物组合物的脂质组合物包含至少一种季胺化合物。季胺化合物可选自由以下组成的非限制性组：
1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、
N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、
1-[2-(油酰基氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羟乙基)咪唑啉鎓氯化物(DOTIM)、
2,3-二油基氧基-N-[2(精胺甲酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸酯(DOSPA)、
N,N-二硬脂酰基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、
N-(1,2-二肉豆蔻酰基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)、
N-(1,2-二油酰基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DORIE)、
N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、
1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(DLePC)、
1,2-二硬脂酰基-3-三甲基铵-丙烷(DSTAP)、
1,2-二棕榈酰基-3-三甲基铵-丙烷(DPTAP)、
1,2-二亚油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DLTAP)、
1,2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵-丙烷(DMTAP)
1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(DSePC)
1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(DPePC)、
1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(DMePC)、
1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(DOePC)、
1,2-二-(9Z-十四烯酰基)-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(14:1EPC)、
1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(16:0-18:1EPC)、
以及其任何组合。
在一个实施方案中，季胺化合物是1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)。
季胺化合物是本领域中已知的，如美国专利申请公布号US2013/0245107和US2014/0363493、美国专利号8,158,601以及国际公布号WO2015/123264和WO2015/148247中描述的那些，所述专利以引用的方式整体并入本文。
在一个实施方案中，本文公开的脂质组合物中的季胺化合物(例如，DOTAP)的量在约0.01mol％至约20mol％的范围内。
在一个实施方案中，本文公开的脂质组合物中的季胺化合物(例如，DOTAP)的量在约0.5mol％至约20mol％、约0.5mol％至约15mol％、约0.5mol％至约10mol％、约1mol％至约20mol％、约1mol％至约15mol％、约1mol％至约10mol％、约2mol％至约20mol％、约2mol％至约15mol％、约2mol％至约10mol％、约3mol％至约20mol％、约3mol％至约15mol％、约3mol％至约10mol％、约4mol％至约20mol％、约4mol％至约15mol％、约4mol％至约10mol％、约5mol％至约20mol％、约5mol％至约15mol％、约5mol％至约10mol％、约6mol％至约20mol％、约6mol％至约15mol％、约6mol％至约10mol％、约7mol％至约20mol％、约7mol％至约15mol％、约7mol％至约10mol％、约8mol％至约20mol％、约8mol％至约15mol％、约8mol％至约10mol％、约9mol％至约20mol％、约9mol％至约15mol％、约9mol％至约10mol％的范围内。
在一个实施方案中，本文公开的脂质组合物中的季胺化合物(例如，DOTAP)的量在约5mol％至约10mol％的范围内。
在一个实施方案中，本文公开的脂质组合物中的季胺化合物(例如，DOTAP)的量是约5mol％。在一个实施方案中，本文公开的脂质组合物中的季胺化合物(例如，DOTAP)的量是约10mol％。
在一些实施方案中，在本文公开的脂质组合物中季胺化合物(例如，DOTAP)的量是0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5或20mol％。
在一些实施方案中，本文公开的药物组合物的脂质组合物包含式(I)化合物。在一个实施方案中，式(I)化合物(例如，化合物18、25、26或48)与季胺化合物(例如，DOTA)的摩尔比是约100:1至约2.5:1。在一个实施方案中，式(I)化合物(例如，化合物18、25、26或48)与季胺化合物(例如，DOTAP)的摩尔比是约90:1、约80:1、约70:1、约60:1、约50:1、约40:1、约30:1、约20:1、约15:1、约10:1、约9:1、约8:1、约7:1、约6:1、约5:1或约2.5:1。在一个实施方案中，在本文公开的脂质组合物中式(I)化合物(例如，化合物18、25、26或48)与季胺化合物(例如，DOTAP)的摩尔比是约10:1。
在一些方面，本文公开的药物组合物的脂质组合物不包含季胺化合物。在一些方面，本文公开的药物组合物的脂质组合物不包含DOTAP。
C.结构脂质
本文公开的药物组合物的脂质组合物可包含一种或多种结构脂质。如本文所用，术语“结构脂质”是指固醇以及含固醇部分的脂质。在一些实施方案中，结构脂质是选自由以下组成的组：胆固醇、粪固醇(fecosterol)、谷固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇、菜籽固醇、番茄碱、番茄苷、熊果酸、α-生育酚以及其混合物。在一些实施方案中，结构脂质是胆固醇。
在一个实施方案中，本文公开的药物组合物的脂质组合物中的结构脂质(例如，固醇，如胆固醇)的量在约20mol％至约60mol％、约25mol％至约55mol％、约30mol％至约50mol％或约35mol％至约45mol％的范围内。
在一个实施方案中，本文公开的脂质组合物中的结构脂质(例如，固醇，如胆固醇)的量在约25mol％至约30mol％、约30mol％至约35mol％或约35mol％至约40mol％的范围内。
在一个实施方案中，本文公开的脂质组合物中的结构脂质(例如，固醇，如胆固醇)的量是约23.5mol％、约28.5mol％、约33.5mol％或约38.5mol％。
在一些实施方案中，本文公开的脂质组合物中的结构脂质(例如，固醇，如胆固醇)的量是至少约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60mol％。
在一些方面，公开的用于肿瘤内递送的药物组合物的脂质组合物组分不包含胆固醇。
D.聚乙二醇(PEG)-脂质
本文公开的药物组合物的脂质组合物可包含一种或多种聚乙二醇(PEG)脂质。
如本文所用，术语“PEG-脂质”是指聚乙二醇(PEG)修饰的脂质。PEG-脂质的非限制性实例包括PEG-修饰的磷脂酰乙醇胺和磷脂酸、PEG-神经酰胺缀合物(例如，PEG-CerC14或PEG-CerC20)、PEG-修饰的二烷基胺和PEG-修饰的1,2-二酰氧基丙-3-胺。此类脂质也称为PEG化脂质。例如，PEG脂质可以是PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC或PEG-DSPE脂质。
在一些实施方案中，PEG-脂质包括但不限于1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)](PEG-DSPE)、PEG-二甾醇基甘油(PEG-DSG)、PEG-二棕榈油基、PEG-二油基、PEG-二硬脂基、PEG-二酰基甘油酰胺(PEG-DAG)、PEG-二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DPPE)或PEG-l,2-二肉豆蔻酰基氧基丙基-3-胺(PEG-c-DMA)。
在一个实施方案中，PEG-脂质是选自由以下组成的组：PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油以及其混合物。
在一些实施方案中，PEG-脂质的脂质部分包括长度为约C14至约C22、优选约C14至约C16的那些。在一些实施方案中，PEG部分(例如mPEG-NH2)具有约1000、2000、5000、10,000、15,000或20,000道尔顿的大小。在一个实施方案中，PEG-脂质是PEG2k-DMG。
在一个实施方案中，本文所述的脂质纳米颗粒可包含PEG脂质，其是非扩散性PEG。非扩散性PEG的非限制性实例包括PEG-DSG和PEG-DSPE。
PEG-脂质是本领域中已知的，如美国专利号8158601和国际公布号WO2015/130584中描述的那些，所述专利以引用的方式整体并入本文。
在一个实施方案中，本文公开的药物组合物的脂质组合物中的PEG-脂质的量在约0.1mol％至约5mol％、约0.5mol％至约5mol％、约1mol％至约5mol％、约1.5mol％至约5mol％、约2mol％至约5mol％mol％、约0.1mol％至约4mol％、约0.5mol％至约4mol％、约1mol％至约4mol％、约1.5mol％至约4mol％、约2mol％至约4mol％、约0.1mol％至约3mol％、约0.5mol％至约3mol％、约1mol％至约3mol％、约1.5mol％至约3mol％、约2mol％至约3mol％、约0.1mol％至约2mol％、约0.5mol％至约2mol％、约1mol％至约2mol％、约1.5mol％至约2mol％、约0.1mol％至约1.5mol％、约0.5mol％至约1.5mol％或约1mol％至约1.5mol％的范围内。
在一个实施方案中，本文公开的脂质组合物中的PEG-脂质的量是约1.5mol％。
在一个实施方案中，本文公开的脂质组合物中的PEG-脂质的量是至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5mol％。
在一些方面，本文公开的药物组合物的脂质组合物不包含PEG-脂质。
在一些实施方案中，本文公开的脂质组合物包含可电离氨基脂质(例如式(I)化合物)和不对称磷脂。在一些实施方案中，所述脂质组合物包含化合物18和MSPC。
在一些实施方案中，本文公开的脂质组合物包含可电离氨基脂质(例如式(I)化合物)和季胺化合物。在一些实施方案中，所述脂质组合物包含化合物18和DOTAP。
在一些实施方案中，本文公开的脂质组合物包含可电离氨基脂质(例如式(I)化合物)、不对称磷脂和季胺化合物。在一些实施方案中，所述脂质组合物包含化合物18、MSPC和DOTAP。
在一个实施方案中，所述脂质组合物包含约50mol％的式(I)化合物(例如，化合物18、25、26或48)、约10mol％的DSPC或MSPC、约33.5mol％的胆固醇、约1.5mol％的PEG-DMG以及约5mol％的DOTAP。在一个实施方案中，所述脂质组合物包含约50mol％的式(I)化合物(例如，化合物18、25、26或48)、约10mol％的DSPC或MSPC、约28.5mol％的胆固醇、约1.5mol％的PEG-DMG以及约10mol％的DOTAP。
可基于所需结果定制脂质纳米颗粒的组分以最佳递送多核苷酸。作为非限制性实例，所述脂质纳米颗粒可包含40-60mol％的可电离氨基脂质(例如，式(I)化合物)、8-16mol％的磷脂、30-45mol％的胆固醇、1-5mol％PEG脂质以及任选的1-15mol％季胺化合物。
在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒可包含45-65mol％的可电离氨基脂质(例如，式(I)化合物)、5-10mol％的磷脂、25-40mol％的胆固醇、0.5-5mol％PEG脂质以及任选的1-15mol％季胺化合物。
核酸脂质颗粒的非限制性实例公开于美国专利公布号20140121263中，其以引用的方式整体并入本文。
E.其他可电离氨基脂质
除了根据式(I)的脂质外，本文公开的药物组合物的脂质组合物还可包含一种或多种可电离氨基脂质。
-可电离脂质可选自由以下组成的非限制性组：3-(双十二烷基氨基)-N1,N1,4-三十二烷基-1-哌嗪乙胺(KL10)、N1-[2-(双十二烷基氨基)乙基]-N1,N4,N4-三十二烷基-1,4-哌嗪二乙胺(KL22)、14,25-双十三烷基-15,18,21,24-四氮杂-三十八烷(KL25)、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLin-DMA)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、庚三十碳-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、1,2-二油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DODMA)、(13Z,165Z)-N,N-二甲基-3-壬二十二碳-13-16-二烯-1-胺(L608)、2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA)、(2R)-2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA(2R))以及(2S)-2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA(2S))。除这些之外，可电离氨基脂质还可以是包含环胺基团的脂质。
可电离脂质还可以是国际公布号WO2015/199952(还参见US20150376115)中公开的化合物，所述公布以引用的方式并入本文。例如，可电离氨基脂质包括但不限于：
以及其任何组合。
F.其他脂质组合物组分
除了上述那些之外，本文公开的药物组合物的脂质组合物还可包含一种或多种组分。例如，所述脂质组合物可包含一种或多种渗透性增强剂分子、碳水化合物、聚合物、表面改变剂(例如表面活性剂)或其他组分。例如，渗透性增强剂分子可以是美国专利申请公布号2005/0222064中描述的分子。碳水化合物可包括单糖(例如，葡萄糖)和多糖(例如，糖原及其衍生物和类似物)。所述脂质组合物可包含缓冲液，如但不限于pH为7的柠檬酸盐或磷酸盐，盐和/或糖。盐和/或糖可包括在本文所述的制剂中以获得等渗性。
聚合物可包含于本文公开的药物组合物(例如，脂质纳米颗粒形式的药物组合物)和/或用于包封或部分包封所述药物组合物。
聚合物可以是生物可降解的和/或生物相容的。聚合物可选自但不限于聚胺、聚醚、聚酰胺、聚酯、聚氨基甲酸酯、聚脲、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚酰亚胺、聚砜、聚氨酯、聚乙炔、聚乙烯、聚乙烯亚胺、聚异氰酸酯、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯腈以及聚芳酯。
脂质组合物与多核苷酸之间的比例在约10:1至约60:1(wt/wt)的范围内。
在一些实施方案中，脂质组合物与多核苷酸之间的比例可以是10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1、42:1、43:1、44:1、45:1、46:1、47:1、48:1、49:1、50:1、51:1、52:1、53:1、54:1、55:1、56:1、57:1、58:1、59:1或60:1(wt/wt)。在一些实施方案中，脂质组合物与包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸或包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸的wt/wt比例是约20:1或约15:1。
在一些实施方案中，本文公开的药物组合物可含有超过一种多肽，例如两种、三种或更多种多肽。例如，本文公开的药物组合物可含有两种、三种或更多种多核苷酸(例如，mRNA)。
在一个实施方案中，本文描述的脂质纳米颗粒可包含处于以下脂质:多核苷酸重量比的多核苷酸(例如，mRNA)：5:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1或70:1，或这些比例的范围或任一者，如但不限于5:1至约10:1、约5:1至约15:1、约5:1至约20:1、约5:1至约25:1、约5:1至约30:1、约5:1至约35:1、约5:1至约40:1、约5:1至约45:1、约5:1至约50:1、约5:1至约55:1、约5:1至约60:1、约5:1至约70:1、约10:1至约15:1、约10:1至约20:1、约10:1至约25:1、约10:1至约30:1、约10:1至约35:1、约10:1至约40:1、约10:1至约45:1、约10:1至约50:1、约10:1至约55:1、约10:1至约60:1、约10:1至约70:1、约15:1至约20:1、约15:1至约25:1、约15:1至约30:1、约15:1至约35:1、约15:1至约40:1、约15:1至约45:1、约15:1至约50:1、约15:1至约55:1、约15:1至约60:1或约15:1至约70:1。
在一个实施方案中，本文所述的脂质纳米颗粒可包含浓度为大约0.1mg/ml至2mg/ml，如但不限于0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml、1.0mg/ml、1.1mg/ml、1.2mg/ml、1.3mg/ml、1.4mg/ml、1.5mg/ml、1.6mg/ml、1.7mg/ml、1.8mg/ml、1.9mg/ml、2.0mg/ml或大于2.0mg/ml的多核苷酸。
在一个实施方案中，包含本文所述的多核苷酸和脂质纳米颗粒的制剂可包含0.15mg/ml至2mg/ml的本文所述的多核苷酸(例如，mRNA)。在一些实施方案中，所述制剂还可包含10mM柠檬酸盐缓冲液，并且所述制剂可另外包含至多10％w/w的蔗糖(例如，至少1％w/w、至少2％w/w/、至少3％w/w、至少4％w/w、至少5％w/w、至少6％w/w、至少7％w/w、至少8％w/w、至少9％w/w or 10％w/w)。
纳米颗粒组合物
在一些实施方案中，本文公开的药物组合物被配制为脂质纳米颗粒(LNP)。因此，本公开还提供纳米颗粒组合物，其包含(i)包含递送剂(如本文所述的式(I)化合物)的脂质组合物，和(ii)包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合。在这种纳米颗粒组合物中，本文公开的脂质组合物可包封包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合。
在一个特定实施方案中，(i)包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸以及包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸分开包封(即，包封在两个纳米颗粒群体中)。在另一个特定实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸以及包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸分开包封(即，包封在三个纳米颗粒群体中)。在一个特定实施方案中，(i)包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸和包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸或包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、(ii)包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸和包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸、或(iii)包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸和包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸被包封在一起(即，包封在单个纳米颗粒群体中)。在另一个特定实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸或包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸以及包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸被包封在一起(即，包封在单个纳米颗粒群体中)。
纳米颗粒组合物的尺寸通常为近似微米或更小，并且可包括脂质双层。纳米颗粒组合物涵盖脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体(例如，脂质囊泡)和脂质复合物。例如，纳米颗粒组合物可以是具有直径为500nm或更小的脂质双层的脂质体。
纳米颗粒组合物包括例如脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体和脂质复合物。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物是包含一个或多个脂质双层的囊泡。在某些实施方案中，纳米颗粒组合物包含被水性区室分开的两个或更多个同心双层。脂质双层可彼此官能化和/或交联。脂质双层可包括一种或多种配体、蛋白质或通道。
本公开的纳米颗粒组合物包含至少一种根据式(I)的化合物。例如，纳米颗粒组合物可包含化合物1-147中的一种或多种，或化合物1-232中的一种或多种。纳米颗粒组合物还可包含各种其他组分。例如，除了根据式(I)、(II)或(IIa)-(IId)的脂质外，纳米颗粒组合物还可包含一种或多种其他脂质，如(i)至少一种磷脂、(ii)至少一种季胺化合物、(iii)至少一种结构脂质、(iv)至少一种PEG-脂质或(v)其任何组合。
在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含式(I)化合物(例如，化合物18、25、26或48)。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含式(I)化合物(例如，化合物18、25、26或48)和磷脂(例如，DSPC或MSPC)。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含式(I)化合物(例如，化合物18、25、26或48)、磷脂(例如，DSPC或MSPC)和季胺化合物(例如，DOTAP)。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含式(I)化合物(例如，化合物18、25、26或48)和季胺化合物(例如，DOTAP)。
在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含由或基本上由式(I)化合物(例如，化合物18、25、26或48)组成的脂质组合物。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含脂质组合物，所述纸质组合物由或基本上由式(I)化合物(例如，化合物18、25、26或48)和磷脂(例如，DSPC或MSPC)组成。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含脂质组合物，所述脂质组合物由或基本上由式(I)化合物(例如，化合物18、25、26或48)、磷脂(例如，DSPC或MSPC)和季胺化合物(例如，DOTAP)组成。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含脂质组合物，所述脂质组合物由或基本上由式(I)化合物(例如，化合物18、25、26或48)和季胺化合物(例如，DOTAP)组成。
在一个实施方案中，纳米颗粒组合物包含(1)脂质组合物，所述脂质组合物包含约50mole％的式(I)化合物(例如，化合物18、25、26或48)；约10mole％的DSPC或MSPC；约33.5mole％的胆固醇；约1.5mole％的PEG-DMG(例如，PEG2k-DMG)；约5mole％的DOTAP；以及(2)多核苷酸。
在一个实施方案中，纳米颗粒组合物包含(1)脂质组合物，所述脂质组合物包含约50mole％的式(I)化合物(例如，化合物18、25、26或48)；约10mole％的DSPC或MSPC；约28.5mole％的胆固醇；约1.5mole％的PEG-DMG(例如，PEG2k-DMG)；约10mole％的DOTAP；以及(2)多核苷酸。
在一个实施方案中，纳米颗粒组合物包含(1)脂质组合物，所述脂质组合物包含约50mole％的式(I)化合物(例如，化合物18、25、26或48)；约10mole％的DSPC或MSPC；约23.5mole％的胆固醇；约1.5mole％的PEG-DMG(例如，PEG2k-DMG)；约15mole％的DOTAP；以及(2)多核苷酸。
如本文一般定义，术语“脂质”是指具有疏水或两亲性质的小分子。脂质可以是天然存在的或合成的。脂质的实例包括但不限于脂肪、蜡、含固醇的代谢物、维生素、脂肪酸、甘油脂质、甘油磷脂、鞘脂、糖脂和聚酮化合物以及异戊烯醇脂质。在一些情况下，一些脂质的两亲性质使得它们在水性介质中形成脂质体、囊泡或膜。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒(LNP)可包含可电离脂质。如本文所用，术语“可电离脂质”具有其在本领域中的普通含义，并且可指包含一个或多个带电荷的部分的脂质。在一些实施方案中，可电离脂质可带正电或带负电。可电离脂质可带正电，在这种情况下，它可被称为“阳离子脂质”。例如，可电离分子可包含胺基团，称为可电离氨基脂质。如本文所用，“带电荷的部分”是携带形式电子电荷的化学部分，例如，单价(+1或-1)、二价(+2或-2)、三价(+3或-3)等。带电荷部分可以是阴离子的(即带负电的)或阳离子的(即带正电的)。带正电的部分的实例包括胺基团(例如伯胺、仲胺和/或叔胺)、铵基团、吡啶鎓基团、胍基和咪唑鎓基团。在特定实施方案中，带电荷的部分包含胺基团。带负电的基团或其前体的实例包括羧酸根基团、磺酸根基团、硫酸根基团、膦酸根基团、磷酸根基团、羟基等。在一些情况下，带电荷的部分的电荷可随环境条件而变化，例如，pH的变化可改变所述部分的电荷，和/或使所述部分变得带电或不带电。通常，可根据需要选择分子的电荷密度。
应理解，术语“带电荷”或“带电荷的部分”不是指分子上的“部分负电荷”或“部分正电荷”。术语“部分负电荷”和“部分正电荷”以其本领域中的普通含义给出。当官能团包含被极化的键以使得电子密度被拉向键的一个原子、从而在原子上产生部分负电荷时，可能产生“部分负电荷”。一般来说，本领域普通技术人员将认识到可以这种方式变得极化的键。
在一些实施方案中，可电离脂质是可电离氨基脂质，在本领域中有时称为“可电离阳离子脂质”。在一个实施方案中，可电离氨基脂质可具有经由接头结构连接的带正电的亲水头和疏水尾。
纳米颗粒组合物可通过多种方法进行表征。例如，显微镜(例如，透射电子显微镜或扫描电子显微镜)可用于检查纳米颗粒组合物的形态和尺寸分布。动态光散射或电位测定法(例如电位滴定)可用于测量ζ电位。动态光散射也可用于确定粒度。诸如ZetasizerNano ZS(Malvern Instruments Ltd,Malvern,Worcestershire,UK)的仪器也可用于测量纳米颗粒组合物的多种特征，如粒度、多分散性指数和ζ电位。
纳米颗粒的尺寸可帮助抵消生物反应，如但不限于炎症或可增加多核苷酸的生物作用。
如本文所用，纳米颗粒组合物背景下的“尺寸”或“平均尺寸”是指纳米颗粒组合物的平均直径。
在一个实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸和包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸被配制在在脂质纳米颗粒中。在一些方面，所述脂质纳米颗粒的直径为约10至约100nm，如但不限于约10至约20nm、约10至约30nm、约10至约40nm、约10至约50nm、约10至约60nm、约10至约70nm、约10至约80nm、约10至约90nm、约20至约30nm、约20至约40nm、约20至约50nm、约20至约60nm、约20至约70nm、约20至约80nm、约20至约90nm、约20至约100nm、约30至约40nm、约30至约50nm、约30至约60nm、约30至约70nm、约30至约80nm、约30至约90nm、约30至约100nm、约40至约50nm、约40至约60nm、约40至约70nm、约40至约80nm、约40至约90nm、约40至约100nm、约50至约60nm、约50至约70nm、约50至约80nm、约50至约90nm、约50至约100nm、约60至约70nm、约60至约80nm、约60至约90nm、约60至约100nm、约70至约80nm、约70至约90nm、约70至约100nm、约80至约90nm、约80至约100nm和/或约90至约100nm。
在一个实施方案中，所述纳米颗粒具有约10至500nm的直径。在一个实施方案中，所述纳米颗粒具有大于100nm、大于150nm、大于200nm、大于250nm、大于300nm、大于350nm、大于400nm、大于450nm、大于500nm、大于550nm、大于600nm、大于650nm、大于700nm、大于750nm、大于800nm、大于850nm、大于900nm、大于950nm或大于1000nm的直径。
在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的最大尺寸是1μm或更短(例如，1μm、900nm、800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、200nm、175nm、150nm、125nm、100nm、75nm、50nm或更短)。
纳米颗粒组合物可以是相对均匀的。多分散性指数可用于指示纳米颗粒组合物的均匀性，例如纳米颗粒组合物的粒度分布。小的(例如，小于0.3的)多分散性指数通常指示窄的粒度分布。纳米颗粒组合物可具有约0至约0.25，如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25的多分散性指数。在一些实施方案中，本文公开的纳米颗粒组合物的多分散性指数可以是约0.10至约0.20。
纳米颗粒组合物的ζ电位可用于指示组合物的电动势。例如，ζ电位可描述纳米颗粒组合物的表面电荷。通常希望具有相对低的正或负电荷的纳米颗粒组合物，因为带更高电荷的物质可能与体内的细胞、组织和其他元件不期望地相互作用。在一些实施方案中，本文公开的纳米颗粒组合物的ζ电位可以是约-10mV至约+20mV、约-10mV至约+15mV、约10mV至约+10mV、约-10mV至约+5mV、约-10mV至约0mV、约-10mV至约-5mV、约-5mV至约+20mV、约-5mV至约+15mV、约-5mV至约+10mV、约-5mV至约+5mV、约-5mV至约0mV、约0mV至约+20mV、约0mV至约+15mV、约0mV至约+10mV、约0mV至约+5mV、约+5mV至约+20mV、约+5mV至约+15mV或约+5mV至约+10mV。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒的ζ电位可以是约0mV至约100mV、约0mV至约90mV、约0mV至约80mV、约0mV至约70mV、约0mV至约60mV、约0mV至约50mV、约0mV至约40mV、约0mV至约30mV、约0mV至约20mV、约0mV至约10mV、约10mV至约100mV、约10mV至约90mV、约10mV至约80mV、约10mV至约70mV、约10mV至约60mV、约10mV至约50mV、约10mV至约40mV、约10mV至约30mV、约10mV至约20mV、约20mV至约100mV、约20mV至约90mV、约20mV至约80mV、约20mV至约70mV、约20mV至约60mV、约20mV至约50mV、约20mV至约40mV、约20mV至约30mV、约30mV至约100mV、约30mV至约90mV、约30mV至约80mV、约30mV至约70mV、约30mV至约60mV、约30mV至约50mV、约30mV至约40mV、约40mV至约100mV、约40mV至约90mV、约40mV至约80mV、约40mV至约70mV、约40mV至约60mV以及约40mV至约50mV。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒的ζ电位可以是约10mV至约50mV、约15mV至约45mV、约20mV至约40mV以及约25mV至约35mV。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒的ζ电位可以是约10mV、约20mV、约30mV、约40mV、约50mV、约60mV、约70mV、约80mV、约90mV以及约100mV。
术语多核苷酸的“包封效率”描述了相对于所提供的初始量，在制备后由纳米颗粒组合物包封或以其他方式与纳米颗粒组合物缔合的多核苷酸的量。如本文所用，“包封”可指完全、实质或部分封住、约束、包围或包住。
期望封装效率高(例如，接近100％)。可例如通过比较在用一种或多种有机溶剂或洗涤剂破碎纳米颗粒组合物之前和之后含有纳米颗粒组合物的溶液中的多核苷酸的量来测量包封效率。
荧光可用于测量溶液中的游离多核苷酸的量。对于本文所述的纳米颗粒组合物，多核苷酸的包封效率可以是至少50％，例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，包封效率可以是至少80％。在某些实施方案中，包封效率可以是至少90％。
本文公开的药物组合物中存在的多核苷酸的量可取决于多种因素，如多核苷酸的大小、所需的靶标和/或应用或纳米颗粒组合物的其他性质以及多核苷酸。
例如，可用于纳米颗粒组合物的mRNA的量可取决于mRNA的大小(表示为长度或分子量)、序列和其他特征。纳米颗粒组合物中的多核苷酸的相对量也可变化。
可根据功效和耐受性的考虑来优化存在于本公开的脂质纳米颗粒组合物中的脂质组合物和多核苷酸的相对量。对于包含mRNA作为多核苷酸的组合物，N:P比可充当有用的度量。
由于纳米颗粒组合物的N:P比控制表达和耐受性，因此需要具有低N:P比和强表达的纳米颗粒组合物。N:P比根据纳米颗粒组合物中脂质与RNA的比例而变化。
一般来说，较低的N:P比是优选的。可选择一种或多种RNA、脂质及其量以提供约2:1至约30:1，如2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、12:1、14:1、16:1、18:1、20:1、22:1、24:1、26:1、28:1或30:1的N:P比。在某些实施方案中，N:P比可以是约2:1至约8:1。在其他实施方案中，N:P比是约5:1至约8:1。在某些实施方案中，N:P比是5:1至6:1。在一个具体方面，N:P比是约5.67:1。
除了提供纳米颗粒组合物外，本公开还提供了包括包封多核苷酸的产生脂质纳米颗粒的方法。这种方法包括使用本文公开的药物组合物中的任一种并根据本领域中已知的脂质纳米颗粒的产生方法来产生脂质纳米颗粒。参见例如，Wang(等人2015)Adv.DrugDeliv.Rev.87:68-80；Silva等人(2015)Curr.Pharm.Technol.16:940-954；Naseri等人(2015)Adv.Pharm.Bull.5:305-13；Silva等人(2015)Curr.Pharm.Biotechnol.16:291-302以及其中引用的参考文献。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸被配制在脂质纳米颗粒中，其中所述多核苷酸包含表1中公开的mRNA。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸被配制在脂质纳米颗粒中，其中所述多核苷酸包含表1中列出的序列。
脂质纳米颗粒制剂通常包含脂质，特别地，可电离氨基脂质，例如2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)或二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L319)，并且还包含中性脂质、固醇以及能够减少颗粒聚集的分子，例如PEG或PEG修饰的脂质。
在一个实施方案中，脂质纳米颗粒制剂基本上由以下各项组成：(i)至少一种选自由以下组成的组的脂质：2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)和二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L319)；(ii)选自DSPC、DPPC、POPC、DOPE和SM的中性脂质；(iii)固醇，例如胆固醇；以及(iv)PEG-脂质，例如PEG-DMG或PEG-cDMA，处于约20％-60％可电离氨基脂质:5％-25％中性脂质:25％-55％固醇；0.5％-15％PEG-脂质的摩尔比。
在一个实施方案中，所述制剂包含按摩尔计约25％至约75％的选自以下的可电离氨基脂质：2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)和二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L319)，例如按摩尔计约35％至约65％、约45％至约65％、约60％、约57.5％、约50％或约40％。
在一个实施方案中，所述制剂包含按摩尔计约0.5％至约15％的中性脂质，例如按摩尔计约3％至约12％、约5％至约10％或约15％、约10％或约7.5％。示例性中性脂质包括但不限于DSPC、POPC、DPPC、DOPE和SM。在一个实施方案中，所述制剂包含按摩尔计约5％至约50％的固醇(例如，按摩尔计约15％至约45％、约20％至约40％、约40％、约38.5％、约35％或约31％。示例性固醇是胆固醇。在一个实施方案中，所述制剂包含按摩尔计约0.5％至约20％的PEG或PEG修饰的脂质(例如，按摩尔计约0.5％至约10％、约0.5％至约5％、约1.5％、约0.5％、约1.5％、约3.5％或约5％。在一个实施方案中，PEG或PEG修饰的脂质包含平均分子量为2,000Da的PEG分子。在其他实施方案中，PEG或PEG修饰的脂质包含平均分子量小于2,000(例如，大约1,500Da、大约1,000Da或大约500Da)的PEG分子。示例性PEG修饰的脂质包括但不限于PEG-二硬脂酰基甘油(PEG-DMG)(在本文还称为PEG-C14或C14-PEG)、PEG-cDMA(在Reyes等人(2005)J.Controlled Release 107:276-287中进一步论述)。
在一个实施方案中，本公开的制剂包含按摩尔计25％-75％的选自以下的可电离氨基脂质：2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)和二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L319)；0.5％-15％的中性脂质；5％-50％的固醇；以及0.5％-20％的PEG或PEG修饰的脂质。
在一个实施方案中，本公开的制剂包含按摩尔计35％-65％的选自以下的可电离氨基脂质：2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)和二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L319)；3％-12％的中性脂质；15％-45％的固醇；以及0.5％-10％的PEG或PEG修饰的脂质。
在一个实施方案中，本公开的制剂包含按摩尔计45％-65％的选自以下的可电离氨基脂质：2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)和二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L319)；5％-10％的中性脂质；25％-40％的固醇；以及0.5％-10％的PEG或PEG修饰的脂质。
在一个实施方案中，本公开的制剂包含按摩尔计约60％的选自以下的可电离氨基脂质：2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)和二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L319)；约7.5％的中性脂质；约31％的固醇；以及约1.5％的PEG或PEG修饰的脂质。
在一个实施方案中，本公开的制剂包含按摩尔计约50％的选自以下的可电离氨基脂质：2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)和二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L319)；约10％的中性脂质；约38.5％的固醇；以及约1.5％的PEG或PEG修饰的脂质。
在一个实施方案中，本公开的制剂包含按摩尔计约50％的选自以下的可电离氨基脂质：2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)和二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L319)；约10％的中性脂质；约35％的固醇；约4.5％或约5％的PEG或PEG修饰的脂质；以及约0.5％的靶向脂质。
在一个实施方案中，本公开的制剂包含按摩尔计约40％的选自以下的可电离氨基脂质：2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)和二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L319)；约15％的中性脂质；约40％的固醇；以及约5％的PEG或PEG修饰的脂质。
在一个实施方案中，本公开的制剂包含按摩尔计约57.2％的选自以下的可电离氨基脂质：2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)和二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L319)；约7.1％的中性脂质；约34.3％的固醇；以及约1.4％的PEG或PEG修饰的脂质。
在一个实施方案中，本公开的制剂包含按摩尔计约57.5％的选自为PEG-cDMA的PEG脂质的可电离氨基脂质(PEG-cDMA在Reyes等人(2005)J.Controlled Release 107:276-287中进一步论述)、约7.5％的中性脂质、约31.5％的固醇以及约3.5％的PEG或PEG修饰的脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒制剂基本上由处于约20％-70％可电离氨基脂质:5％-45％中性脂质:20％-55％胆固醇:0.5％-15％PEG修饰的脂质的摩尔比；例如处于约20％-60％可电离氨基脂质:5％-25％中性脂质:25％-55％胆固醇:0.5％-15％PEG修饰的脂质的摩尔比的脂质混合物组成。
在具体实施方案中，摩尔脂质比率是大约50/10/38.5/1.5(mol％可电离氨基脂质/中性脂质(例如DSPC)/Chol/PEG修饰的脂质(例如PEG-DMG、PEG-DSG或PEG-DPG))、57.2/7.1134.3/1.4(mol％可电离氨基脂质/中性脂质(例如DPPC)/Chol/PEG修饰的脂质(例如PEG-cDMA))、40/15/40/5(mol％可电离氨基脂质/中性脂质(例如DSPC)/Chol/PEG修饰的脂质(例如PEG-DMG))、50/10/35/4.5/0.5(mol％可电离氨基脂质/中性脂质(例如DSPC)/Chol/PEG修饰的脂质(例如PEG-DSG))、50/10/35/5(可电离氨基脂质/中性脂质(例如DSPC)/Chol/PEG修饰的脂质(PEG-DMG))、40/10/40/10(mol％可电离氨基脂质/中性脂质(例如，DSPC)/Chol/PEG修饰的脂质(例如PEG-DMG或PEG-cDMA))、35/15/40/10(mol％可电离氨基脂质/中性脂质(例如DSPC)/Chol/PEG修饰的脂质(例如PEG-DMG或PEG-cDMA))或52/13/30/5(mol％可电离氨基脂质/中性脂质(例如DSPC)/Chol/PEG修饰的脂质(例如，PEG-DMG或PEG-cDMA))。
示例性脂质纳米颗粒组合物和制备所述组合物的方法描述于例如Semple等人(2010)Nat.Biotechnol.28:172-176；Jayarama等人(2012)Angew.Chem.Int.Ed.51:8529–8533；以及Maier等人(2013)Molecular Therapy 21:570-1578中。
在一个实施方案中，本文所述的脂质纳米颗粒制剂包含可电离氨基脂质、PEG脂质和结构脂质并且任选地包含非阳离子脂质。作为非限制性实例，脂质纳米颗粒包含约40％-60％的可电离氨基脂质、约5％-15％的非阳离子脂质、约1％-2％的PEG脂质以及约30％-50％的结构脂质。作为另一个非限制性实例，脂质纳米颗粒可包含约50％可电离氨基脂质、约10％非阳离子脂质、约1.5％PEG脂质以及约38.5％结构脂质。作为另一个非限制性实例，脂质纳米颗粒可包含约55％可电离氨基脂质、约10％非阳离子脂质、约2.5％PEG脂质以及约32.5％结构脂质。在一个实施方案中，可电离氨基脂质是本文所述的任何可电离氨基脂质，如但不限于DLin-KC2-DMA、DLin-MC3-DMA和L319。
在一个实施方案中，本文所述的脂质纳米颗粒制剂是4组分脂质纳米颗粒。脂质纳米颗粒可包含可电离氨基脂质、非阳离子脂质、PEG脂质和结构脂质。作为非限制性实例，脂质纳米颗粒可包含约40％-60％的可电离氨基脂质、约5％-15％的非阳离子脂质、约1％-2％的PEG脂质以及约30％-50％的结构脂质。作为另一个非限制性实例，脂质纳米颗粒可包含约50％可电离氨基脂质、约10％非阳离子脂质、约1.5％PEG脂质以及约38.5％结构脂质。作为另一个非限制性实例，脂质纳米颗粒可包含约55％可电离氨基脂质、约10％非阳离子脂质、约2.5％PEG脂质以及约32.5％结构脂质。在一个实施方案中，可电离氨基脂质可以是本文所述的任何可电离氨基脂质，如但不限于DLin-KC2-DMA、DLin-MC3-DMA和L319。
在一个实施方案中，本文所述的脂质纳米颗粒制剂包含可电离氨基脂质、非阳离子脂质、PEG脂质和结构脂质。作为非限制性实例，脂质纳米颗粒包含约50％的可电离氨基脂质DLin-KC2-DMA、约10％的非阳离子脂质DSPC、约1.5％的PEG脂质PEG-DOMG以及约38.5％的结构脂质胆固醇。作为非限制性实例，脂质纳米颗粒包含约50％的可电离氨基脂质DLin-MC3-DMA、约10％的非阳离子脂质DSPC、约1.5％的PEG脂质PEG-DOMG以及约38.5％的结构脂质胆固醇。作为非限制性实例，脂质纳米颗粒包含约50％的可电离氨基脂质DLin-MC3-DMA、约10％的非阳离子脂质DSPC、约1.5％的PEG脂质PEG-DMG以及约38.5％的结构脂质胆固醇。作为另一个非限制性实例，脂质纳米颗粒包含约55％的可电离氨基脂质L319、约10％的非阳离子脂质DSPC、约2.5％的PEG脂质PEG-DMG以及约32.5％的结构脂质胆固醇。
在一个实施方案中，脂质是可裂解的脂质，如在国际公布号WO2012170889中描述的那些。在另一个实施方案中，脂质是阳离子脂质，如但不限于美国专利申请号US20130064894的式(I)。
在一个实施方案中，脂质通过本领域中已知和/或如在国际公布号WO2012040184、WO2011153120、WO2011149733、WO2011090965、WO2011043913、WO2011022460、WO2012061259、WO2012054365、WO2012044638、WO2010080724、WO201021865、WO2013086373以及WO2013086354中描述的方法来合成。
在另一个实施方案中，阳离子脂质是三烷基阳离子脂质。三烷基阳离子脂质以及制备和使用三烷基阳离子脂质的方法的非限制性实例描述于国际专利公布号WO2013126803中。
在一个实施方案中，多核苷酸的LNP制剂含有3％脂质摩尔比的PEG-c-DOMG。在另一个实施方案中，多核苷酸的LNP制剂含有1.5％脂质摩尔比的PEG-c-DOMG。
在一个实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸和/或包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸的药物组合物包含包含在国际公布号WO2012099755中描述的PEG化脂质中的至少一种。
在一个实施方案中，LNP制剂含有PEG-DMG 2000(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000)。在一个实施方案中，LNP制剂可含有PEG-DMG2000、本领域中已知的可电离氨基脂质以及至少一种其他组分。在另一个实施方案中，LNP制剂含有PEG-DMG 2000、本领域中已知的可电离氨基脂质、DSPC以及胆固醇。作为非限制性实例，LNP制剂含有PEG-DMG 2000、DLin-DMA、DSPC以及胆固醇。作为另一个非限制性实例，LNP制剂含有处于2:40:10:48摩尔比的PEG-DMG 2000、DLin-DMA、DSPC以及胆固醇(参见例如，Geall等人(2012)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 109:14604-9)。
在一个实施方案中，LNP制剂通过在国际公布号WO2011127255或WO2008103276中描述的方法来配制。作为非限制性示例，本文所述的包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸和/或包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸被包封在如在WO2011127255和/或WO2008103276中描述的LNP制剂中，还参见，美国专利申请公布号US20130037977和US20100015218，所述专利以引用的方式整体并入本文。
在一个实施方案中，本文所述的包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸和/或包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸被配制在如美国专利申请公布号US20120207845中描述的待通过胃肠外途径递送的纳米颗粒中。
在一个实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸和/或包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸被配制在通过美国专利公布号US20130156845或国际公布号WO2013093648或WO2012024526中描述的方法制备的脂质纳米颗粒中。
本文所述的脂质纳米颗粒可在无菌环境中通过美国专利申请公布号US20130164400中描述的系统和/或方法来制备。
在一个实施方案中，所述LNP制剂被配制在纳米颗粒中，如美国专利号8,492,359中描述的核酸-脂质颗粒。作为非限制性实例，脂质颗粒包含一种或多种活性剂或治疗剂；构成存在于所述颗粒中的总脂质的约50mol％至约85mol％的一种或多种可电离氨基脂质；构成存在于所述颗粒中的总脂质的约13mol％至约49.5mol％的一种或多种非阳离子脂质；以及构成存在于所述颗粒中的总脂质的约0.5mol％至约2mol％的一种或多种抑制颗粒聚集的缀合的脂质。纳米颗粒中的核酸可以是本文所述和/或本领域中已知的多核苷酸。
在一个实施方案中，LNP制剂通过在国际公布号WO2011127255或WO2008103276中描述的方法来配制。作为非限制性实例，本文描述的修饰的RNA被包封在如WO2011127255和/或WO2008103276中描述的LNP制剂中。
在一个实施方案中，本文所述的LNP制剂包含聚阳离子组合物。作为非限制性实例，聚阳离子组合物是选自美国专利公布号US20050222064的式1-60。在另一个实施方案中，包含聚阳离子组合物的LNP制剂用于在体内和/或在体外递送本文所述的修饰的RNA。
在一个实施方案中，本文所述的LNP制剂另外包含渗透性增强剂分子。非限制性渗透性增强剂分子描述于美国专利申请公布号US20050222064中。
在一个实施方案中，多核苷酸药物组合物被配制在脂质体中，如但不限于DiLa2脂质体(Marina Biotech,Bothell,WA)、(Marina Biotech,Bothell,WA)、基于DOPC(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)的中性脂质体(例如，用于卵巢癌的siRNA递送(Landen等人(2006)Cancer Biology&Therapy 5:1708-1713)以及透明质酸涂覆的脂质体(Quiet Therapeutics,Israel)。
在一个实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸和包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸被配制于如在美国专利公布号US2012060293中描述的冻干凝胶相脂质体组合物中。
纳米颗粒制剂可包含磷酸酯缀合物。磷酸酯缀合物可增加体内循环时间和/或增加纳米颗粒的靶向递送。用于本公开的磷酸盐缀合物可通过国际申请号WO2013033438或美国专利申请公布号US20130196948中描述的方法来制备。作为非限制性实例，磷酸酯缀合物可包括在国际申请号WO2013033438中描述的式中的任一个的化合物，还参见美国专利申请公布号US20130066086。
纳米颗粒制剂可包含聚合物缀合物。所述聚合物缀合物可以是水溶性缀合物。聚合物缀合物可具有美国专利申请公布号20130059360中所描述的结构。在一个实施方案中，具有本公开的包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸和/或包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸的聚合物缀合物可使用美国专利申请申请公布号20130072709中描述的方法和/或分段的聚合物试剂来制备。在另一个实施方案中，所述聚合物缀合物可具有包含环部分的侧基，所述环部分如但不限于在美国专利申请公布号US20130196948中描述的聚合物缀合物。
纳米颗粒制剂可包含缀合物以增强本公开的纳米颗粒在受试者中的递送。此外，所述缀合物可抑制纳米颗粒在受试者中的吞噬细胞清除。在一个实施方案中，所述缀合物是从人膜蛋白CD47设计的“自身”肽，例如，由Rodriguez等人(2013)Science 339:971-975描述的“自身”颗粒。如由Rodriguez等人所示，所述自身肽延迟巨噬细胞介导的纳米颗粒的清除，这增强纳米颗粒的递送。在另一个实施方案中，所述缀合物是膜蛋白CD47。参见例如，Rodriguez等人(2013)Science339:971-975。Rodriguez等人表明，与“自身”肽类似，CD47可相较于乱序肽和PEG包被的纳米颗粒增加受试者中的循环颗粒比率。
在一个实施方案中，本公开的包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸和/或包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸被配制在纳米颗粒中，所述纳米颗粒包含缀合物以增强本公开的纳米颗粒在受试者中的递送。所述缀合物可以是CD47膜蛋白或所述缀合物可来源于CD47膜蛋白，如先前所述的“自身”肽。在另一方面，纳米颗粒可包含PEG以及CD47的缀合物或其衍生物。在另一方面，纳米颗粒包含以上所述的“自身”肽和膜蛋白CD47两者。
在另一方面，“自身”肽和/或CD47蛋白缀合至如本文所述的病毒样颗粒或假病毒粒子以用于递送本公开的多核苷酸。
在另一个实施方案中，包含本公开的包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸和/或包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸的药物组合物可包含具有可降解键联的接头。缀合物的非限制性实例包括包含可电离的氢原子的芳香族部分、间隔基部分以及水溶性聚合物。作为非限制性实例，包含具有可降解键联的缀合物的药物组合物以及用于递送此类药物组合物的方法描述于美国专利公布号US20130184443中。
纳米颗粒制剂可以是包含碳水化合物载体和多核苷酸的碳水化合物纳米颗粒。作为一个非限制性实例，碳水化合物载体包括但不限于酸酐修饰的植物糖原或糖原型材料、辛烯基琥珀酸植物糖原、植物糖原β-糊精、酸酐修饰的植物糖原β-糊精。参见例如，国际公布号WO2012109121；还参见美国专利申请公布号US20140066363。
本公开的纳米颗粒制剂可涂覆有表面活性剂或聚合物以便改进所述颗粒的递送。在一个实施方案中，纳米颗粒涂覆有亲水性涂层，如但不限于PEG涂层和/或具有中性表面电荷的涂层。亲水性涂层可有助于递送具有较大有效负载的纳米颗粒，如但不限于中枢神经系统内的多核苷酸。作为非限制性实例，包含亲水涂层的纳米颗粒和制备此类纳米颗粒的方法描述于美国专利申请公布号US20130183244中。
在一个实施方案中，本公开的脂质纳米颗粒是亲水性聚合物颗粒。亲水性聚合物颗粒的非限制性实例和制备亲水性聚合物颗粒的方法描述于美国专利申请公布号US20130210991中。
在另一个实施方案中，本公开的脂质纳米颗粒是疏水性聚合物颗粒。可通过用称为快速消除型脂质纳米颗粒(reLNP)的生物可降解可电离阳离子脂质替代所述可电离阳离子脂质来改进脂质纳米颗粒制剂。已显示可电离的阳离子脂质如但不限于DLinDMA、DLin-KC2-DMA和DLin-MC3-DMA随时间推移在血浆和组织中积累并且可为潜在的毒性来源。快速消除型脂质的快速代谢可使脂质纳米颗粒在大鼠中的耐受性和治疗指数提高从1mg/kg剂量至10mg/kg剂量的数量级。包括酶促降解的酯键可改进阳离子组分的降解和代谢概况，同时仍维持reLNP制剂的活性。酯键可位于脂质链的内部或它可位于脂质链的终端上。内酯键可替代脂质链中的任何碳。
在一个实施方案中，内酯键位于饱和碳的任一侧上。
在一个实施方案中，通过递送可包括纳米种类、聚合物和免疫原的脂质纳米颗粒来引发免疫应答。参见例如，美国专利申请公布号US20120189700和国际公布号WO2012099805。聚合物可包封纳米种类或部分地包封纳米种类。免疫原可以是重组蛋白、修饰的RNA和/或包含编码本文所述的IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸或包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸和/或包含编码本文所述的OX40L多肽的mRNA的多核苷酸。
可对脂质纳米颗粒工程化以改变颗粒的表面性质，使得脂质纳米颗粒可穿透粘膜屏障。粘液位于粘膜组织上，例如但不限于口腔(例如，口腔和食道膜和扁桃体组织)、眼、胃肠(例如，胃、小肠、大肠、结肠、直肠)、鼻、呼吸道(例如，鼻、咽、气管和支气管膜)、生殖器(例如，阴道、宫颈和尿道膜)的粘膜组织。优选用于较高药物包封效率和能够提供广泛药物持续递送的大于10-200nm的纳米颗粒已被认为太大而不能快速扩散穿过粘膜屏障。粘液连续分泌、流出、丢弃或消化和再循环，所以大多数捕获的颗粒可在几秒内或在几小时内从粘膜组织上除去。已密集涂覆有低分子量聚乙二醇(PEG)的大聚合物纳米颗粒(直径为200nm-500nm)仅以低于相同颗粒在水中扩散程度的4至6倍的程度扩散穿过粘液(Lai等人(2007)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 104:1482-487；Lai等人(2009)Adv.Drug Deliv.Rev.61:158-171)。可使用穿透速率和/或荧光显微镜技术确定纳米颗粒的转运，所述技术包括但不限于荧光漂白恢复(FRAP)和高分辨率多颗粒追踪(MPT)。作为非限制性实例，可穿透粘膜屏障的组合物可如美国专利号8,241,670或国际专利公布号WO2013110028(还参见美国专利申请公布号US20150297531)中所描述制备。
工程化以穿透粘液的脂质纳米颗粒可包含聚合物材料(即聚合物核)和/或聚合物-维生素缀合物和/或三嵌段共聚物。聚合物材料可包括但不限于聚胺、聚醚、聚酰胺、聚酯、聚氨基甲酸酯、聚脲、聚碳酸酯、聚(苯乙烯)、聚酰亚胺、聚砜、聚氨酯、聚乙炔、聚乙烯、聚乙烯亚胺、聚异氰酸酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯腈以及聚芳酯。聚合物材料可为生物可降解和/或生物相容的。生物相容聚合物的非限制性实例在国际专利公布号WO2013116804中描述；还参见美国专利申请公布号US20130203713，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。聚合物材料可另外受到辐射。作为非限制性示例，聚合物材料可受到γ辐射。参见例如，国际申请号WO2012082165；还参见，美国专利申请公布号US20130101609，其以引用的方式整体并入本文。
具体聚合物的非限制性实例包括聚(己内酯)(PCL)、乙烯乙酸乙烯酯聚合物(EVA)、聚(乳酸)(PLA)、聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(L-乳酸-共-乙醇酸)(PLLGA)、聚(D,L-丙交酯)(PDLA)、聚(L-丙交酯)(PLLA)、聚(D,L-丙交酯-共-己内酯)、聚(D,L-丙交酯-共-己内酯-共-乙交酯)、聚(D,L-丙交酯-共-PEO-共-D,L-丙交酯)、聚(D,L-丙交酯-共-PPO-共-D,L-共)、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚氨酯、聚-L-赖氨酸(PLL)、甲基丙烯酸羟丙酯(HPMA)、聚乙二醇、聚-L-谷氨酸、聚(羟基酸)、聚酸酐、聚原酸酯、聚(酯酰胺)、聚酰胺、聚(酯醚)、聚碳酸酯、聚烯烃如聚乙烯和聚丙烯、聚亚烷基二醇如聚(乙二醇)(PEG)、聚环氧烷(PEO)、聚对苯二甲酸亚烷基酯如聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯醚、聚乙烯酯如聚(乙酸乙烯酯)、聚乙烯卤化物如聚(氯乙烯)(PVC)、聚乙烯吡咯烷酮、聚硅氧烷、聚苯乙烯(PS)、聚氨酯、衍生的纤维素如烷基纤维素、羟基烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、丙烯酸的聚合物如聚((甲基)丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚((甲基)丙烯酸乙酯)、聚((甲基)丙烯酸丁酯)、聚((甲基)丙烯酸异丁酯)、聚((甲基)丙烯酸己酯)、聚((甲基)丙烯酸异癸酯)、聚((甲基)丙烯酸月桂酯)、聚((甲基)丙烯酸苯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八烷基酯)及其共聚物和混合物、聚二氧杂环己酮和其共聚物、聚羟基烷羧酸酯、聚丙二醇富马酸酯、聚甲醛、泊洛沙姆(poloxamer)、聚(原酸)酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-己内酯)、PEG-PLGA-PEG以及三亚甲基碳酸酯、聚乙烯吡咯烷酮。脂质纳米颗粒可涂覆有共聚物或与其缔合，如但不限于嵌段共聚物(如在国际公布号WO2013012476中描述的支链聚醚-聚酰胺嵌段共聚物)和(聚(乙二醇))-(聚(环氧丙烷))-(聚(乙二醇))三嵌段共聚物。参见例如，美国专利申请公布号US20120121718和US20100003337以及美国专利号8,263,665。
共聚物可为一般认为安全的(GRAS)聚合物并且脂质纳米颗粒的形成可以没有新化学实体产生的方式进行。例如，脂质纳米颗粒可包含涂覆PLGA纳米颗粒而没有形成新化学实体的泊洛沙姆，其仍然能够快速穿透人粘液。Yang等人(2011)Angew.Chem.Int.Ed.50:2597-2600。用于产生可穿透人粘液的纳米颗粒的非限制性可规模化方法由Xu等人(2013)J.Control Release 170:279-86描述。
聚合物-维生素缀合物的维生素可以是维生素E。缀合物的维生素部分可被其他合适的组分取代，如但不限于维生素A、维生素E、其他维生素、胆固醇、疏水部分或其他表面活性剂的疏水组分(例如，固醇链、脂肪酸、烃链和环氧烷链)。
工程化以穿透粘液的脂质纳米颗粒可包括表面改变剂如但不限于多核苷酸、阴离子蛋白质(例如，牛血清白蛋白)、表面活性剂(例如，阳离子表面活性剂例如像二甲基双十八烷基溴化铵)、糖或糖衍生物(例如，环糊精)、核酸、聚合物(例如，肝素、聚乙二醇和泊洛沙姆)、粘液溶解剂(例如，N-乙酰半胱氨酸、艾蒿、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、龙吐珠(clerodendrum)、乙酰半胱氨酸、溴己新(bromhexine)、羧甲司坦(carbocisteine)、依普拉酮(eprazinone)、美司钠(mesna)、氨溴索(ambroxol)、索布瑞醇(sobrerol)、多米奥醇(domiodol)、来托司坦(letosteine)、司替罗宁(stepronin)、硫普罗宁(tiopronin)、凝溶胶蛋白、胸腺素β4阿法链道酶、奈替克新(neltenexine)、厄多司坦(erdosteine))以及各种DNA酶包括rhDNA酶。表面改变剂可包埋或嵌入在颗粒的表面中或安置(例如，通过涂覆、吸附、共价连接或其他方法)在脂质纳米颗粒的表面上。参见例如，美国专利申请公布号US20100215580、US20080166414和US20130164343。
在一个实施方案中，粘液穿透脂质纳米颗粒包含至少一种本文所述的多核苷酸。多核苷酸可包封在脂质纳米颗粒中和/或安置在颗粒的表面上。多核苷酸可共价偶联至脂质纳米颗粒。粘液穿透脂质纳米颗粒的制剂可包含多个纳米颗粒。此外，制剂可含有可与粘液相互作用并且改变周围粘液的结构和/或粘着性质以减少粘膜粘附的颗粒，从而可增加粘液穿透脂质纳米颗粒向粘膜组织递送。
在另一个实施方案中，粘液穿透脂质纳米颗粒是包含粘膜穿透增强涂层的低渗制剂。所述制剂对它所递送至的上皮而言可以是低渗的。低渗制剂的非限制性实例可在国际专利公布号WO2013110028中找到，还参见美国专利申请公布号US20150297531，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。
在一个实施方案中，为了增强通过粘膜屏障的递送，多核苷酸制剂包含或是低渗溶液。发现低渗溶液增加粘膜细胞颗粒(如但不限于粘液穿透颗粒)能够到达阴道上皮表面的速率。参见例如，Ensign等人(2013)Biomaterials 34:6922-9。
在一个实施方案中，所述多核苷酸被配制为脂质复合物，如但不限于ATUPLEXTM系统、DACC系统、DBTC系统和来自Silence Therapeutics(London,United Kingdom)的其他siRNA-脂质复合物技术；来自(Cambridge,MA)的STEMFECTTM以及基于聚乙烯亚胺(PEI)或鱼精蛋白的靶向和非靶向核酸递送。参见Aleku等人(2008)CancerRes.68:9788-9798；Strumberg等人(2012)Int.J.Clin.Pharmacol.Ther.50:76-78；Santel等人(2006)Gene Ther.13:1222-1234；Santel等人(2006)Gene Ther.13:1360-1370；Gutbier等人(2010)Pulm.Pharmacol.Ther.23:334-344；Kaufmann等人(2010)Microvasc.Res.80:286-293；Weide等人(2009)J.Immunother.32:498-507；Weide等人(2008)J.Immunother.31:180-188；Pascolo(2004)Expert Opin.Biol.Ther.4:1285-1294；Fotin-Mleczek等人(2011)J.Immunother.34:1-15；Song等人(2005)NatureBiotechnol.23:709-717；Peer等人(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 6:104:4095-4100；deFougerolles(2008)Hum.Gene Ther.19:125-132)。
在一个实施方案中，此类制剂还构建为或组合物改变为使得其在体内被动或主动指向不同细胞类型，所述细胞类型包括但不限于肝细胞、免疫细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、抗原呈递细胞以及白细胞(Akinc等人(2010)Mol.Ther.18:1357-1364；Song等人(2005)Nat.Biotechnol.23:709-717；Judge等人(2009)J.Clin.Invest.119:661-673；Kaufmann等人(2010)Microvasc.Res.80:286-293；Santel等人(2006)Gene Ther.13:1222-1234；Santel等人(2006)Gene Ther.13:1360-1370；Gutbier等人(2010)Pulm.Pharmacol.Ther.23:334-344；Basha等人(2011)Mol.Ther.19:2186-2200；Fenske和Cullis(2008)Expert Opin.Drug Deliv.5:25-44；Peer等人(2008)Science 319:627-630；Peer和Lieberman(2011)Gene Ther.18:1127-1133)。制剂被动靶向肝脏细胞的一个实例包括基于DLin-DMA、DLin-KC2-DMA和DLin-MC3-DMA的脂质纳米颗粒制剂，其已显示可结合载脂蛋白E并且在体内促进这些制剂结合和吸收到肝细胞中(Akinc等人(2010)Mol.Ther.18:1357-1364)。
制剂还可通过其表面上不同配体的表达而选择性靶向，例如但不限于通过叶酸、转铁蛋白、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)以及抗体靶向的方法所例示。参见例如，Kolhatkar等人,Curr Drug Discov Technol.2011 8:197-206；Musacchio和Torchilin,FrontBiosci.201116:1388-1412；Yu等人,Mol Membr Biol.2010 27:286-298；Patil等人,CritRev Ther Drug Carrier Syst.2008 25:1-61；Benoit等人,Biomacromolecules.2011 12:2708-2714；Zhao等人,Expert Opin Drug Deliv.2008 5:309-319；Akinc等人,MolTher.2010 18:1357-1364；Srinivasan等人,Methods Mol Biol.2012 820:105-116；Ben-Arie等人,Methods Mol Biol.2012 757:497-507；Peer 2010J Control Release.20:63-68；Peer等人,Proc Natl Acad Sci U S A.2007 104:4095-4100；Kim等人,Methods MolBiol.2011 721:339-353；Subramanya等人,Mol Ther.2010 18:2028-2037；Song等人,NatBiotechnol.2005 23:709-717；Peer等人,Science.2008 319:627-630；以及Peer和Lieberman,Gene Ther.2011 18:1127-1133；所有所述参考文献均以引用的方式整体并入本文。
在一个实施方案中，本公开的包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸和包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸被配制为固体脂质纳米颗粒。
固体脂质纳米颗粒(SLN)可为球形的，其中平均直径在10nm至1,000nm之间。SLN拥有可使亲脂分子溶解并且可用表面活性剂和/或乳化剂稳定的固体脂质核基质。在另外实施方案中，脂质纳米颗粒可以是自组装脂质-聚合物纳米颗粒。参见Zhang等人(2008)ACSNano 2:1696–1702。作为非限制性示例，SLN可以是国际公布号WO2013105101中描述的SLN。作为另一个非限制性实例，SLN可通过在国际专利公布号WO2013105101中描述的方法或过程来制备。
脂质体、脂质复合物或脂质纳米颗粒可用来改进包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸以及其任何组合的功效，因为这些制剂可能能够增加由多核苷酸进行的细胞转染；和/或增加编码的IL-23、IL-36、IL-18和OX40L的翻译。一个这样的实例涉及使用脂质包封以实现聚合复合质粒DNA的有效全身递送。参见Heyes等人(2007)Mol.Ther.15:713-720。脂质体、脂质复合物或脂质纳米颗粒还可用来增加多核苷酸的稳定性。
在一个实施方案中，本公开的包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸和/或包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸被配制用于控制释放和/或靶向递送。
如本文所使用，“控制释放”是指遵循用于实现治疗结果的具体释放模式的药物组合物或化合物释放概况。在一个实施方案中，多核苷酸被包封至本文描述和/或本领域中已知用于控制释放和/或靶向递送的递送剂中。如本文所使用，术语“包封”是指封住、包围或包住。在它涉及本公开化合物的制剂时，包封可为基本上的、完全的或部分的。术语“基本上包封”是指至少大于50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.9％或大于99.999％的本公开的药物组合物或化合物可在递送剂内封住、包围或包住。“部分包封”是指小于10％、10％、20％、30％、40％、50％或更少的本公开的药物组合物或化合物可在递送剂内封住、包围或包住。有利地，可通过使用荧光和/或电子显微照片测量本公开的药物组合物或化合物的逸出或活性来确定包封。例如，至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或大于99.99％的本公开的药物组合物或化合物包封在递送剂中。
在一个实施方案中，控制释放制剂包括但不限于三嵌段共聚物。作为非限制性实例，所述制剂包含两种不同类型的三嵌段共聚物。参见WO2012131104和WO2012131106；还参见美国专利申请公布号US20140219923和US20150165042，其以引用的方式整体并入本文。
在另一个实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸和/或包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸被包封到脂质纳米颗粒或快速消除的脂质纳米颗粒中，并且然后可将脂质纳米颗粒或快速消除的脂质纳米颗粒包封到本文所述和/或本领域已知的聚合物、水凝胶和/或外科密封剂中。作为非限制性实例，聚合物、水凝胶或外科密封剂是PLGA、乙烯乙酸乙烯酯(EVAc)、泊洛沙姆、(Nanotherapeutics,Alachua,Inc.FL)、(Halozyme Therapeutics,San Diego CA)，外科密封剂如纤维蛋白原聚合物(Ethicon Inc.Cornelia,GA)、(Baxter International,Deerfield,Inc,IL)、基于PEG的密封剂或(Baxter International,Deerfield Inc,IL)。
在另一个实施方案中，脂质纳米颗粒被包封到本领域中已知的当注射到受试者中时可形成凝胶的任何聚合物中。作为另一个非限制性实例，脂质纳米颗粒被包封到可生物可降解的聚合物基质中。
在一个实施方案中，用于控制释放和/或靶向递送的制剂含有包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸和/或包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸，还包含至少一种控制释放图层。
控制释放涂层包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、EUDRAGITEUDRAGIT以及纤维素衍生物如乙基纤维素水性分散体和
在一个实施方案中，多核苷酸控制释放和/或靶向递送制剂包含至少一种可含有聚阳离子侧链的可降解聚酯。可降解聚酯包括但不限于聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)以及其组合。在另一个实施方案中，可降解聚酯可包括PEG缀合以形成PEG化的聚合物。
在一个实施方案中，包含至少一种多核苷酸的多核苷酸控制释放和/或靶向递送制剂包含至少一种如美国专利号8,404,222中所描述的PEG和/或PEG相关的聚合物衍生物。
在另一个实施方案中，包含至少一种多核苷酸的多核苷酸控制释放递送制剂是美国专利申请公布号US20130130348中描述的控制释放聚合物系统。
在一个实施方案中，本公开的包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸和包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸或包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸被包封在治疗性纳米颗粒中。
治疗性纳米颗粒可通过本文描述和本领域中已知的方法来配制，如但不限于国际公布号WO2010005740、WO2010030763、WO2010005721、WO2010005723、WO2012054923，美国专利申请公布号US20110262491、US20100104645、US20100087337、US20100068285、US20110274759、US20100068286、US20120288541、US20130123351和US20130230567以及美国专利号8,206,747、8,293,276、8,318,208和8,318,211。在另一个实施方案中，治疗性聚合物纳米颗粒可通过美国专利申请公布号US20120140790中描述的方法来鉴别。
在一个实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸或包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸和/或包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸被配制用于持续释放。
如本文所使用，“持续释放”是指在特定时间段内遵循释放速率的药物组合物或化合物。时间段可包括但不限于几小时、几天、几周、几个月以及几年。作为非限制性实例，持续释放纳米颗粒包含聚合物和治疗剂，如但不限于本公开的包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸和包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸或包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸。。参见国际公布号WO2010075072和美国专利申请公布号US20100216804、US20110217377和US20120201859。在另一个非限制性实例中，持续释放制剂包含允许持久生物利用度的剂，如但不限于晶体、大分子凝胶和/或微粒悬浮液。参见美国专利申请公布号US20130150295。
在一个实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸和/或包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸可被配制被靶标特异性的。
作为非限制性实例，治疗性纳米颗粒包括皮质类固醇。参见国际公布号WO2011084518。作为非限制性实例，治疗性纳米颗粒被配制在国际公布号WO2008121949、WO2010005726、WO2010005725、WO2011084521和美国专利申请公布号US20100069426、US20120004293和US20100104655中描述的纳米颗粒中。
在一个实施方案中，本公开的纳米颗粒可包含聚合物基质。作为一个非限制性实例，纳米颗粒包含两种或更多种聚合物，例如但不限于聚乙烯、聚碳酸酯、聚酸酐、聚羟基酸、聚富马酸丙酯、聚己内酯、聚酰胺、聚缩醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚赖氨酸、聚(乙烯亚胺)、聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)或其组合。
在一个实施方案中，治疗性纳米颗粒包含二嵌段共聚物。在一个实施方案中，二嵌段共聚物包含PEG与聚合物组合，所述聚合物例如但不限于聚乙烯、聚碳酸酯、聚酸酐、聚羟基酸、聚富马酸丙酯、聚己内酯、聚酰胺、聚缩醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚赖氨酸、聚(乙烯亚胺)、聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)或其组合。在另一个实施方案中，二嵌段共聚物是高X二嵌段共聚物，如在国际专利公布号WO2013120052中描述的那些，还参见美国专利申请公布号US20150337068，所述专利以引用的方式整体并入本文。
作为非限制性实例，治疗性纳米颗粒包含PLGA-PEG嵌段共聚物。参见美国专利申请公布号US20120004293和美国专利号8,236,330。在另一个非限制性实例中，治疗性纳米颗粒是包含PEG和PLA或PEG和PLGA的二嵌段共聚物的隐形(stealth)纳米颗粒。参见美国专利号8,246,968和国际公布号WO2012166923。在另一个非限制性实例中，治疗性纳米颗粒是如在美国专利公布号US20130172406中描述的隐形纳米颗粒或靶标特异性隐形纳米颗粒。
在一个实施方案中，治疗性纳米颗粒包含多嵌段共聚物。参见例如，美国专利号8,263,665和8,287,910以及美国专利申请公布号US20130195987。在另一个非限制性实例中，脂质纳米颗粒包含嵌段共聚物PEG-PLGA-PEG。参见例如，Lee等人(2003)PharmaceuticalResearch 20:1995-2000；Li等人(2003)Pharmaceutical Research 20:884-888；以及Chang等人(2007)J.Controlled Release.118:245-253。
本公开的包含编码IL-23、IL-36-γ和/或OX40L多肽的mRNA的多核苷酸可配制于包含PEG-PLGA-PEG嵌段共聚物的脂质纳米颗粒中。
在一个实施方案中，治疗性纳米颗粒包含多嵌段共聚物。参见例如，美国专利号8,263,665和8,287,910以及美国专利申请公布号US20130195987。
在一个实施方案中，本文描述的嵌段共聚物包括在聚离子复合物中，所述聚离子复合物包含非聚合物胶束和嵌段共聚物。参见例如，美国专利申请公布号US20120076836。
在一个实施方案中，治疗性纳米颗粒包含至少一种丙烯酸聚合物。丙烯酸聚合物包括但不限于丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧基乙酯、甲基丙烯酸氰基乙酯、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚氰基丙烯酸酯以及其组合。
在一个实施方案中，治疗性纳米颗粒包含至少一种聚(乙烯基酯)聚合物。聚(乙烯基酯)聚合物可以是诸如无规共聚物的共聚物。作为非限制性实例，无规共聚物具有如国际申请号WO2013032829或美国专利申请公布号US20130121954中描述的那些的结构。一方面，聚(乙烯基酯)聚合物可缀合至本文所述的多核苷酸。
在一个实施方案中，治疗性纳米颗粒包含至少一种二嵌段共聚物。二嵌段共聚物可以是但不限于聚(乳酸)-聚(乙二醇)共聚物。参见例如，国际专利公布号WO2013044219。
作为非限制性实例，治疗性纳米颗粒用于治疗癌症。参见国际公布号WO2013044219；还参见美国专利申请公布号US20150017245，其以引用的方式整体并入本文。
在一个实施方案中，治疗性纳米颗粒包含至少一种本文描述和/或本领域中已知的阳离子聚合物。
在一个实施方案中，治疗性纳米颗粒包含至少一种含胺聚合物，如但不限于聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚(酰胺基胺)树枝状聚合物、聚(β-氨基酯)以及其组合。参见例如，美国专利号8,287,849。
在另一个实施方案中，本文所述的纳米颗粒包含胺阳离子脂质，如在国际专利申请号WO2013059496中描述的那些。在一个方面，阳离子脂质具有氨基-胺或氨基-酰胺部分。
在一个实施方案中，治疗性纳米颗粒包含至少一种可含有聚阳离子侧链的可降解聚酯。可降解聚酯包括但不限于聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)以及其组合。在另一个实施方案中，可降解聚酯可包括PEG缀合以形成PEG化的聚合物。
在另一个实施方案中，治疗性纳米颗粒包括至少一个靶向配体的缀合。靶向配体可为本领域中已知的任何配体，例如但不限于单克隆抗体。参见Kirpotin等人(2006)Cancer Res.66:6732-6740。
在一个实施方案中，治疗性纳米颗粒被配制在可用于靶向癌症的水溶液中(参见国际公布号WO2011084513和美国专利申请公布号US20110294717)。
在一个实施方案中，使用美国专利号8,404,799中描述的方法来配制包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其组合。
在一个实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其组合被包封在合成纳米载体中、连接至所述合成纳米载体和/或与其缔合。
合成纳米载体包括但不限于在国际公布号WO2010005740、WO2010030763、WO201213501、WO2012149252、WO2012149255、WO2012149259、WO2012149265、WO2012149268、WO2012149282、WO2012149301、WO2012149393、WO2012149405、WO2012149411、WO2012149454和WO2013019669以及美国专利申请公布号US20110262491、US20100104645、US20100087337和US20120244222中描述的那些。可使用本领域中已知和/或本文描述的方法配制合成纳米载体。作为非限制性实例，合成纳米载体可通过国际公布号WO2010005740、WO2010030763和WO201213501以及美国专利申请公布号US20110262491、US20100104645、US20100087337和US2012024422中描述的方法来配制。在另一个实施方案中，合成纳米载体制剂可通过描述于国际公布号WO2011072218和美国专利号8,211,473中的方法来冻干。在另一个实施方案中，本公开的制剂，包括但不限于合成纳米载体，可通过美国专利申请公布号US20130230568中描述的方法冻干或重构。
在一个实施方案中，合成纳米载体含有反应性基团以释放本文所述的多核苷酸(参见国际公布号WO20120952552和美国专利申请公布号US20120171229)。
在一个实施方案中，合成纳米载体含有增强来自合成纳米载体递送的免疫应答的免疫刺激剂。作为非限制性实例，合成纳米载体可包含可增强免疫系统的基于Th1的应答的Th1免疫刺激剂(参见国际公布号WO2010123569和美国专利申请公布号US20110223201)。
在一个实施方案中，合成纳米载体被配制用于靶向释放。在一个实施方案中，合成纳米载体被配制成在指定pH下和/或在所需时间间隔后释放多核苷酸。作为非限制性实例，合成纳米颗粒被配制成在24小时后和/或在pH4.5下释放多核苷酸(参见国际公布号WO2010138193和WO2010138194以及美国专利申请公布号US20110020388和US20110027217)。
在一个实施方案中，合成纳米载体被配制用于控制释放和/或持续释放本文描述的多核苷酸。作为一个非限制性实例，用于持续释放的合成纳米载体通过本领域中已知、本文描述和/或如在国际公布号WO2010138192和美国专利申请公布号20100303850中所述的方法来配制，所述专利两者均以引用的方式整体并入本文。
在一个实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其组合被配制用于控制和/或持续释放，其中制剂包含至少一种为结晶侧链(CYSC)聚合物的聚合物。CYSC聚合物描述于美国专利号8,399,007中。
在一个实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其组合被包封在两性离子型脂质中、连接至所述两性离子型脂质和/或与其缔合。两性离子型脂质的非限制性实例和使用两性离子型脂质的方法描述于美国专利申请公布号US20130216607中。一方面，两性离子型脂质可用于本文所述的脂质体和脂质纳米颗粒中。
在一个实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其组合被配制在如美国专利申请公布US20130197100号中描述的胶体纳米载体中。
在一个实施方案中，纳米颗粒被优化用于经口施用。纳米颗粒可包含至少一种阳离子生物聚合物，例如但不限于壳聚糖或其衍生物。作为非限制性实例，纳米颗粒可通过美国申请公布专利号US20120282343中描述的方法来配制。
在一些实施方案中，LNP包含脂质KL52(在美国专利申请公布号US2012/0295832中公开的氨基-脂质)。LNP施用的活性和/或安全性(如通过检查ALT/AST、白细胞计数和细胞因子诱导中的一种或多种所测量)可通过并入此类脂质来改进。包含KL52的LNP可静脉内和/或以一个或多个剂量施用。在一些实施方案中，相较于包含MC3的LNP，施用包含KL52的LNP产生相等或改进的mRNA和/或蛋白质表达。
在一些实施方案中，使用较小LNP递送包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合。此类颗粒可包含在0.1um以下直至100nm的直径，如但不限于小于0.1um、小于1.0um、小于5um、小于10um、小于15um、小于20um、小于25um、小于30um、小于35um、小于40um、小于50um、小于55um、小于60um、小于65um、小于70um、小于75um、小于80um、小于85um、小于90um、小于95um、小于100um、小于125um、小于150um、小于175um、小于200um、小于225um、小于250um、小于275um、小于300um、小于325um、小于350um、小于375um、小于400um、小于425um、小于450um、小于475um、小于500um、小于525um、小于550um、小于575um、小于600um、小于625um、小于650um、小于675um、小于700um、小于725um、小于750um、小于775um、小于800um、小于825um、小于850um、小于875um、小于900um、小于925um、小于950um或小于975um。
在另一个实施方案中，使用较小LNP递送包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合，所述LNP可包含约1nm至约100nm、约1nm至约10nm、约1nm至约20nm、约1nm至约30nm、约1nm至约40nm、约1nm至约50nm、约1nm至约60nm、约1nm至约70nm、约1nm至约80nm、约1nm至约90nm、约5nm至约100nm、约5nm至约10nm、约5nm至约20nm、约5nm至约30nm、约5nm至约40nm、约5nm至约50nm、约5nm至约60nm、约5nm至约70nm、约5nm至约80nm、约5nm至约90nm、约10至约50nM、约20至约50nm、约30至约50nm、约40至约50nm、约20至约60nm、约30至约60nm、约40至约60nm、约20至约70nm、约30至约70nm、约40至约70nm、约50至约70nm、约60至约70nm、约20至约80nm、约30至约80nm、约40至约80nm、约50至约80nm、约60至约80nm、约20至约90nm、约30至约90nm、约40至约90nm、约50至约90nm、约60至约90nm和/或约70至约90nm的直径。
在一些实施方案中，此类LNP使用包括微流体混合器的方法来合成。示例性微流体混合器可包括但不限于狭缝交指式微混合器，包括但不限于由Microinnova(Allerheiligen bei Wildon,Austria)制造的那些；和/或交错鲱鱼骨式微混合器(SHM)。参见Zhigaltsev等人(2012)Langmuir 28:3633-40；Belliveau等人(2012)MolecularTherapy-Nucleic Acids 1:e37；Chen等人(2012)J.Am.Chem.Soc.134:6948-51。
在一些实施方案中，包括SHM的LNP产生方法还包括混合至少两个输入流，其中混合通过微结构诱导的混乱平流(MICA)发生。根据这种方法，流体流流过鲱鱼骨图案中存在的通道，从而引起旋转流动并且使流体围绕彼此折叠。这种方法还可包括用于流体混合的表面，其中所述表面在流体循环期间改变取向。使用SHM产生LNP的方法包括在美国专利申请公布号US2004/0262223和US2012/0276209中公开的那些。
在一个实施方案中，本公开的包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其组合被配制在使用微混合器如但不限于狭缝交指式微结构化混合器(SIMM-V2)或标准狭缝交指式微混合器(SSIMM)或卡特彼勒(CPMM)或来自Institutfür Mikrotechnik Mainz GmbH,Mainz Germany)的冲击射流(IJMM)产生的脂质纳米颗粒中。
在一个实施方案中，本公开的包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其组合被配制在使用微流体技术产生的脂质纳米颗粒中。参见Whitesides(2006)Nature 442:368-373；和Abraham等人(2002)Science 295:647-651。作为非限制性实例，受控微流体配制包括用于在低雷诺数下在微通道中混合稳定压力驱动流的多个流的被动方法。参见例如Abraham等人(2002)Science 295:647-651。
在一个实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其组合可配制在使用微混合器芯片，如但不限于来自Harvard Apparatus(Holliston,MA)或Dolomite Microfluidics(Royston,UK)的那些产生的脂质纳米颗粒中。微混合器芯片可用于使用分流和重组机制快速混合两个或更多个流体流。
在一个实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合被配制用于使用国际专利公布号WO2013063468或美国专利号8,440,614中描述的药物包封微球递送。微球可包含如国际专利公布号WO2013063468中描述的式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的化合物。另一方面，氨基酸、肽、多肽、脂质(APPL)适用于将本发明的多核苷酸递送至细胞。参见国际专利公布号WO2013063468；还参见美国专利申请公布号US20130158021，其以引用的方式整体并入本文。
在一个实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合被配制在脂质纳米颗粒中，所述脂质纳米颗粒的直径为约10至约100nm，如但不限于约10至约20nm、约10至约30nm、约10至约40nm、约10至约50nm、约10至约60nm、约10至约70nm、约10至约80nm、约10至约90nm、约20至约30nm、约20至约40nm、约20至约50nm、约20至约60nm、约20至约70nm、约20至约80nm、约20至约90nm、约20至约100nm、约30至约40nm、约30至约50nm、约30至约60nm、约30至约70nm、约30至约80nm、约30至约90nm、约30至约100nm、约40至约50nm、约40至约60nm、约40至约70nm、约40至约80nm、约40至约90nm、约40至约100nm、约50至约60nm、约50至约70nm、约50至约80nm、约50至约90nm、约50至约100nm、约60至约70nm、约60至约80nm、约60至约90nm、约60至约100nm、约70至约80nm、约70至约90nm、约70至约100nm、约80至约90nm、约80至约100nm和/或约90至约100nm。
在一个实施方案中，脂质纳米颗粒具有约10至500nm的直径。在一个实施方案中，脂质纳米颗粒具有大于100nm、大于150nm、大于200nm、大于250nm、大于300nm、大于350nm、大于400nm、大于450nm、大于500nm、大于550nm、大于600nm、大于650nm、大于700nm、大于750nm、大于800nm、大于850nm、大于900nm、大于950nm或大于1000nm的直径。
在一方面，脂质纳米颗粒是国际专利公布号WO2013059922中描述的极限大小脂质纳米颗粒(还参见美国专利公布号US20140328759，其以引用的方式整体并入本文)。极限大小脂质纳米颗粒可包含围绕水性核心或疏水核心的脂质双层；其中所述脂质双层可包含磷脂，如但不限于二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、二氢鞘磷脂、脑磷脂、脑苷脂、C8-C20脂肪酸二酰基磷脂酰胆碱以及1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱(POPC)。另一方面，极限大小脂质纳米颗粒可包含聚乙二醇-脂质，如但不限于DLPE-PEG、DMPE-PEG、DPPC-PEG和DSPE-PEG。
在一个实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或任何其组合使用国际专利公布号WO2013063530中描述的递送方法递送、定位和/或集中在特定位置中。还参见美国专利申请公布号US20140323907，以引用的方式整体并入本文。作为非限制性实例，可在将多核苷酸递送至受试者之前、同时或之后向受试者施用空聚合物颗粒。空聚合物颗粒一旦与受试者接触就经历体积变化，并且变得嵌入、包埋、固定或截留在受试者中的特定位置处。
在一个实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合被配制在活性物质释放系统中(参见例如，美国专利申请公布号US20130102545)。活性物质释放系统可包括1)至少一种键合至与催化活性核酸杂交的寡核苷酸抑制剂链的纳米颗粒；和2)键合至至少一种与治疗活性物质(例如本文所述的多核苷酸)键合的底物分子的化合物，其中所述治疗活性物质通过底物分子经由催化活性核酸裂解而释放。
在一个实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合被配制在纳米颗粒中，所述纳米颗粒包含含有非细胞材料的内核和含有细胞膜的外表面。细胞膜可来源于细胞或源自病毒的膜。作为非限制性实例，纳米颗粒可通过描述于国际专利公布号WO2013052167中的方法来制备。作为另一个非限制性实例，在国际专利公布号WO2013052167中描述的纳米颗粒可用于递送本文所述的多核苷酸。还参见美国专利申请公布号US20130337066，其以引用的方式整体并入本文。
在一个实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合被配制在多孔纳米颗粒支撑的脂质双层(原始细胞)中。原始细胞在国际专利公布号WO2013056132中描述(还参见美国专利公布号US20150272885，其以引用的方式整体并入本文)。
在一个实施方案中，本文描述的包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合被配制在如美国专利号8,420,123和8,518,963以及欧洲专利号EP2073848B1中描述的聚合物纳米颗粒或通过所述专利中描述的方法制备的聚合物纳米颗粒中。作为非限制性实例，聚合物纳米颗粒具有高玻璃化转变温度，如在美国专利号8,518,963中描述的纳米颗粒或通过所述专利中描述的方法制备的纳米颗粒。作为另一个非限制性实例，用于口服和胃肠外制剂的聚合物纳米颗粒通过在欧洲专利号EP2073848B1中描述的方法来制备。
在另一个实施方案中，本文描述的包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合被配制在用于成像的纳米颗粒中。纳米颗粒可以是脂质体纳米颗粒，如在美国专利申请公布号US20130129636中描述的那些。作为非限制性实例，脂质体可包含2-{4,7-双-羧甲基-10-[(N,N-二硬脂基酰胺基甲基-N′-酰胺基-甲基]-1,4,7,10-四-氮杂环十二烷-1-基}-乙酸钆(III)和中性、完全饱和的磷脂组分(参见例如，美国专利申请公布号US20130129636)。
在一个实施方案中，可用于本公开的纳米颗粒通过美国专利申请公布号US20130130348中描述的方法形成。
本公开的纳米颗粒还可包含营养物，如但不限于缺乏可导致从贫血至神经管缺陷的健康危害的营养物。参见例如，在国际专利申请公布号WO2013072929中描述的纳米颗粒；还参见美国专利申请公布号US20150224035，其以引用的方式整体并入本文)。作为非限制性实例，营养物是呈亚铁、铁盐或元素铁形式的铁、碘、叶酸、维生素或微量营养素。
在一个实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合被配制在可溶胀的纳米颗粒中。可溶胀的纳米颗粒可以是但不限于在美国专利号8,440,231中描述的那些。作为非限制性实施方案，可溶胀的纳米颗粒用于将本发明的多核苷酸递送至肺部系统(参见例如，美国专利号8,440,231)。
包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合被配制在聚酸酐纳米颗粒中，如但不限于在美国专利号8,449,916中描述的那些。
本公开的纳米颗粒和微颗粒可进行几何工程化以调节巨噬细胞和/或免疫应答。一方面，几何工程化颗粒可具有改变的形状、大小和/或表面电荷，以便并入用于靶向递送(如但不限于肺部递送)的本公开的多核苷酸(参见例如，国际公布号WO2013082111)。几何工程化颗粒可具有的其他物理特征包括但不限于开窗部、成角度的臂、不对称性和表面粗糙度、能够改变与细胞和组织的相互作用的电荷。作为非限制性实例，本公开的纳米颗粒通过在国际公布号WO2013082111中描述的方法来制备(还参见美国专利申请公布号US20150037428)。
在一个实施方案中，本公开的纳米颗粒是水溶性纳米颗粒，如但不限于在国际公布号WO2013090601中描述的那些(还参见美国专利申请公布号US20130184444)。纳米颗粒可以是具有紧密和两性离子配体的无机纳米颗粒，以便展示良好水溶性。纳米颗粒还可具有较小流体动力学直径(HD)，关于时间、pH和盐度的稳定性以及低水平的非特异性蛋白质结合。
在一个实施方案中，本公开的纳米颗粒通过美国专利申请公布号US20130172406中描述的方法形成。
在一个实施方案中，本公开的纳米颗粒是隐形纳米颗粒或靶标特异性隐形纳米颗粒，如但不限于在美国专利申请公布号US20130172406中描述的那些。本公开的纳米颗粒可通过美国专利申请公布号US20130172406中描述的方法来制备。
在另一个实施方案中，隐形或靶标特异性隐形纳米颗粒包含聚合物基质。聚合物基质可包含两种或更多种聚合物，如但不限于聚乙烯、聚碳酸酯、聚酸酐、聚羟基酸、聚富马酸丙酯、聚己内酯、聚酰胺、聚缩醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚酯、聚酸酐、聚醚、聚氨酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯或其组合。
在一个实施方案中，纳米颗粒是具有高密度核酸层的纳米颗粒-核酸杂合体结构。作为非限制性实例，纳米颗粒-核酸杂合体结构通过在美国专利申请公布号US20130171646中描述的方法来制备。纳米颗粒可包含核酸，如但不限于本文所述和/或本领域中已知的多核苷酸。
本公开的至少一种纳米颗粒可包埋在纳米结构的核心中或涂覆有低密度多孔3-D结构或涂层，所述结构或涂层能够在纳米结构的表面内或表面上携带至少一种有效负载或与其缔合。包含至少一种纳米颗粒的纳米结构的非限制性实例描述于国际专利公布号WO2013123523中。还参见美国专利申请公布号US20150037249，其以引用的方式整体并入本文。
透明质酸酶
包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合的肌肉内、肿瘤内或皮下局部注射液可包含催化透明质酸水解的透明质酸酶。
通过催化间质屏障的组分透明质酸的水解，透明质酸酶降低了透明质酸的粘度，从而增加组织穿透性(Frost,Expert Opin.Drug Deliv.(2007)4:427-440)。加速由转染的细胞产生的编码蛋白质的分散和系统分布是有用的。或者，透明质酸酶可用来增加暴露于肌肉内、肿瘤内或皮下施用的本公开的多核苷酸的细胞数目。
纳米颗粒模拟物
包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合可包封在纳米颗粒模拟物内和/或吸收至纳米颗粒模拟物。纳米颗粒模拟物可模拟生物体或颗粒诸如但不限于病原体、病毒、细菌、真菌、寄生虫、朊病毒以及细胞的递送功能。作为非限制性实例，本公开的多核苷酸可包封在可模拟病毒的递送功能的非病毒体颗粒中(参见国际公布号WO2012006376和美国专利申请公布号US20130171241和US20130195968)。
纳米管
包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合可附着或以另外的方式结合至至少一种纳米管，如但不限于蔷薇状纳米管、具有双碱基接头的蔷薇状纳米管、碳纳米管和/或单壁碳纳米管。多核苷酸可通过力诸如但不限于空间力、离子力、共价力和/或其他力结合到纳米管。包含多核苷酸的纳米管和纳米管制剂描述于国际专利申请号PCT/US2014/027077(公布为WO2014152211)中。
自组装纳米颗粒
包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合可配制在自组装纳米颗粒中。核酸自组装纳米颗粒描述于国际专利申请号PCT/US2014/027077(公布为WO2014152211)中，如段落[000740]–[000743]中。基于聚合物的自组装纳米颗粒描述于国际专利申请号PCT/US2014/027077中。还参见美国专利申请公布号US20160038612，其以引用的方式整体并入本文。
自组装大分子
包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合可配制在两亲性大分子(AM)中以用于递送。AM包含具有与聚(乙二醇)共价连接的烷基化糖主链的生物相容性两亲聚合物。在水溶液中，AM自组装以形成胶束。形成AM的方法和AM的非限制性示例描述于美国专利申请公布号US20130217753中。
无机纳米颗粒
包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合可配制在无机纳米颗粒中(美国专利号8,257,745)。无机纳米颗粒可包括但不限于水可溶胀的粘土物质。作为非限制性实例，无机纳米颗粒包括由简单硅酸盐制得的合成蒙脱石粘土(参见例如美国专利号5,585,108和8,257,745)。
在一些实施方案中，无机纳米颗粒包含本文公开的多核苷酸的核以及聚合物壳。聚合物壳可为本文描述的任何聚合物并且为本领域所已知。在另一实施方案中，聚合物壳可用来保护核中的多核苷酸。
半导电纳米颗粒和金属纳米颗粒
包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合可配制在包含半导电材料或金属材料的水可分散纳米颗粒中(美国专利申请公布号US20120228565)或在磁性纳米颗粒中形成(美国专利申请公布号US20120265001和US20120283503)。水可分散纳米颗粒可为疏水纳米颗粒或亲水纳米颗粒。
在一些实施方案中，半导电纳米颗粒和/或金属纳米颗粒可包含本文公开的多核苷酸的核以及聚合物壳。聚合物壳可为本文描述的任何聚合物并且为本领域所已知。在另一实施方案中，聚合物壳可用来保护核中的多核苷酸。
外科密封剂：凝胶和水凝胶
在一些实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其组合被包封至本领域中已知的当注射至受试者中时可形成凝胶的任何水凝胶中。外科密封剂如凝胶和水凝胶描述于国际专利申请号PCT/US2014/027077中。
混悬液制剂
在一些实施方案中，提供了包含多核苷酸、水不混溶油储库、表面活性剂和/或共表面活性剂和/或共溶剂的混悬液制剂。油和表面活性剂的组合可实现具有多核苷酸的混悬液制剂。在水不混溶储库中递送多核苷酸可用于通过mRNA从储库持续释放至周围生理环境中来提高生物利用度并且防止多核苷酸被核酸酶降解。
在一些实施方案中，可使用多核苷酸、基于油的溶液和表面活性剂的组合来制备mRNA的混悬液制剂。此类制剂可被制备为两部分系统，所述系统包含含有多核苷酸的水相以及含有油和表面活性剂的油基相。用于混悬液制剂的示例性油可包括但不限于芝麻油和Miglyol(包含饱和椰子油和棕榈仁油衍生的辛酸和癸酸脂肪酸与甘油或丙二醇的酯)、玉米油、大豆油、花生油、蜂蜡和/或棕榈籽油。示例性表面活性剂可包括但不限于聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor)、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、聚乙二醇、二乙二醇单乙基醚(transcutol)、labrasol、肉豆蔻酸异丙酯和/或司盘80。在一些实施方案中，混悬液可包含共溶剂，包括但不限于乙醇、甘油和/或丙二醇。
混悬液可通过首先制备包含多核苷酸的水溶液以及含有一种或多种表面活性剂的油基相的多核苷酸制剂而形成。混悬液形成由于混合两种相(水基和油基)而发生。在一些实施方案中，可将这种混悬液递送至水相以形成水包油乳剂。在一些实施方案中，将混悬液递送至水相导致形成水包油乳剂，其中包含多核苷酸的油基相形成大小可在从纳米大小的微滴至微米大小的微滴范围内的微滴。在一些实施方案中，油、表面活性剂、共表面活性剂和/或共溶剂的特定组合可用于在油相中悬浮多核苷酸和/或在递送至水性环境中时形成水包油乳剂。
在一些实施方案中，混悬液提供多核苷酸释放至周围环境中的调节。在此类实施方案中，多核苷酸释放可通过从水不混溶的储库扩散、随后再溶解至周围环境(例如水性环境)中来进行调节。
在一些实施方案中，水不混溶储库(例如悬浮在油相内)内的多核苷酸产生改变的多核苷酸稳定性(例如，改变的由核酸酶进行的降解)。
在一些实施方案中，可配制包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合以使得在注射后，乳液自发形成(例如当递送至水相时)。这种颗粒形成可提供高表面积与体积比以用于将多核苷酸从油相释放至水相。
在一些实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合被配制在纳米乳剂中，如但不限于在美国专利号8,496,945中描述的纳米乳剂。纳米乳剂可包含本文所述的纳米颗粒。作为非限制性实例，纳米颗粒可包含可被脂质或表面活性剂层包围或涂覆的液体疏水核。脂质或表面活性剂层可包含至少一种膜整合肽并且还可包含靶向配体(参见例如，美国专利号8,496,945)。
阳离子和阴离子
包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合的制剂可包含阳离子和阴离子。在一些实施方案中，制剂包含金属阳离子，如但不限于Zn2+、Ca2+、Cu2+、Mg2+以及其组合。作为非限制性实例，制剂包含聚合物以及与金属阳离子复合的多核苷酸(参见例如，美国专利号6,265,389和6,555,525)。
在一些实施方案中，包含二价阳离子与单价阳离子的组合的阳离子纳米颗粒与多核苷酸一起配制。此类纳米颗粒可在给定时期(例如数小时、数天等)内在溶液中自发形成。此类纳米颗粒不会在单独二价阳离子存在下或在单独单价阳离子存在下形成。在阳离子纳米颗粒或在一个或多个包含阳离子纳米颗粒的储库中递送多核苷酸可通过充当长效储库和/或降低被核酸酶降解的速率来提高多核苷酸生物利用度。
模制的纳米颗粒和微粒
包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合可配制在纳米颗粒和/或微粒中。作为一个实例，可使用LIQUIDA(Morrisville,NC)的技术制得纳米颗粒和/或微粒(参见例如国际公布号WO2007024323)。
在一些实施方案中，纳米颗粒包含本文公开的多核苷酸的核以及聚合物壳。聚合物壳可为本文描述的任何聚合物并且为本领域所已知。在另一实施方案中，聚合物壳可用来保护核中的多核苷酸。
在一些实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合被配制在微粒中。微粒可包含多核苷酸的核以及生物相容和/或生物可降解聚合物的表层。作为非限制性实例，可与本公开一起使用的微粒可以是美国专利号8,460,709、美国专利申请公布号US20130129830和国际专利公布号WO2013075068中描述的那些。作为另一个非限制性实例，微粒可被设计成在所需的时间段内延长本公开的多核苷酸的释放(参见例如，美国专利公布号US20130129830中的治疗性蛋白质的延长释放)。
纳米夹克(NanoJacket)和纳米脂质体
包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合可配制在Keystone Nano(State College,PA)的纳米夹克和纳米脂质体中。纳米夹克由天然存在于身体中的化合物包括钙、磷酸盐制成，并且还可包括少量硅酸盐。纳米夹克的大小可在5nm至50nm范围内，并且可用来递送亲水和疏水化合物如但不限于多核苷酸。
纳米脂质体由脂质制成，例如但不限于天然存在于身体中的脂质。纳米脂质体的大小可在60nm至80nm范围内，并且可用来递送亲水和疏水化合物如但不限于多核苷酸。在一个方面，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸和/或包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸被配制在纳米脂质体，如但不限于神经酰胺纳米脂质体中。
微细胞
在一个方面，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合可配制在细菌微细胞中。作为非限制性实例，细菌微细胞是国际公布号WO2013088250或美国专利公布号US20130177499中描述的那些。包含治疗剂如本文所述的多核苷酸的细菌微细胞可用于将治疗剂递送至脑肿瘤。
半固体组合物
在一些实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合与疏水性基质一起配制以形成半固体组合物。作为非限制性实例，半固体组合物或糊状组合物可通过国际专利公布号WO201307604中描述的方法来制备。半固体组合物可以是如国际专利公布号WO201307604中描述的持续释放制剂。
在另一个实施方案中，半固体组合物具有在组合物周围形成的微孔膜或生物可降解聚合物(参见例如，国际专利公布号WO201307604)。
使用包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合的半固体组合物可具有如国际专利公布号WO201307604中描述的半固体混合物的特征(例如，至少10-4N·mm-2的弹性模量和/或至少100mPa·s的粘度)。
外来体
在一些实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合被配制在外来体中。外来体可负载有至少一种多核苷酸并且被递送至细胞、组织和/或生物体。作为非限制性示例，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合可负载于国际公布号WO2013084000中描述的外来体中。
基于丝的递送
在一些实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合被配制在在持续释放基于丝的递送系统中。基于丝的递送系统可通过使丝纤蛋白溶液与治疗剂接触而形成，所述治疗剂如但不限于包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合。作为非限制性实例，可用于本发明的持续释放基于丝的递送系统和制备这种系统的方法描述于美国专利公布号20130177611中。
微粒
在一些实施方案中，含有包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合的制剂包含微粒。微粒可包含本文所述和/或本领域中已知的聚合物，如但不限于聚(α-羟基酸)、聚羟基丁酸、聚己内酯、聚原酸酯和聚酸酐。微粒可具有吸附表面以吸附生物活性分子如多核苷酸。作为非限制性实例，用于与本公开一起使用的微粒和制备微粒的方法描述于美国专利公布号US2013195923和US20130195898以及美国专利号8,309,139和8,206,749中。
在另一个实施方案中，制剂是包含微粒和多核苷酸的微乳剂。作为非限制性实例，包含微粒的微乳剂描述于美国专利公布号2013195923和20130195898以及美国专利号8,309,139和8,206,749中。
氨基酸脂质
在一些实施方案中，包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合被配制在氨基酸脂质中。氨基酸脂质是包含氨基酸残基和一个或多个亲脂性尾部的亲脂性化合物。美国专利号8,501,824中描述了氨基酸脂质的非限制性实例和制备氨基酸脂质的方法。
在一些实施方案中，氨基酸脂质具有亲水性部分和亲脂性部分。亲水性部分可以是氨基酸残基，并且亲脂性部分可包含至少一个亲脂性尾部。
在一些实施方案中，氨基酸脂质制剂用于将多核苷酸递送至受试者。
在另一个实施方案中，氨基酸脂质制剂递送呈包含结合和释放多核苷酸的氨基酸脂质的可释放形式的多核苷酸。作为非限制性实例，多核苷酸的释放可通过酸不稳定接头提供，所述接头如但不限于美国专利号7,098,032、6,897,196、6,426,086、7,138,382、5,563,250和5,505,931中描述的那些。
微囊泡
在一些实施方案中，包含编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的多核苷酸被配制在微泡中。微囊泡的非限制性示例包括描述于US20130209544中的那些。
在一些实施方案中，微囊泡是ARRDC1介导的微囊泡(ARMM)。ARMM的非限制性实例和制备ARMM的方法描述于国际专利公布号WO2013119602中。
聚电解质间复合物
在一些实施方案中，包含编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的mRNA的多核苷酸被配制在聚电解质间复合物中。当电荷动态聚合物与一种或多种阴离子分子复合时形成聚电解质间复合物。电荷动态聚合物和聚电解质间复合物以及制备聚电解质间复合物的方法的非限制性实例描述于美国专利号8,524,368中。
晶体聚合物系统
在一些实施方案中，包含编码IL-23、IL-36-γ、Il-18和/或OX40L多肽的多核苷酸被配制在晶体聚合物系统中。晶体聚合物系统是具有晶体部分和/或包含晶体部分的末端单元的聚合物。具有晶体部分和/或包含晶体部分的末端单元的被称为“CYC聚合物”的聚合物、晶体聚合物系统以及制备此类聚合物和系统的方法的非限制性实例描述于美国专利号US 8,524,259中。
赋形剂
药物制剂可另外包含药学上可接受的赋形剂，如本文所用的赋形剂包括但不限于适合于所需的特定剂型的任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、渗透压调节剂、pH调节剂等。用于配制药物组合物的各种赋形剂和用于制备所述组合物的技术是本领域中已知的(参见Remington:The Science and Practice ofPharmacy,第21版,A.R.Gennaro(Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006)。常规赋形剂介质的使用可涵盖在本公开的范围内，除了如通过产生任何不希望的生物作用或另外以有害的方式与药物组合物的任何其他组分相互作用而与物质或其衍生物不相容的任何常规赋形剂介质，其用途预期在本公开的范围内。
在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂为至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％纯净。在一些实施方案中，赋形剂被批准用于人和用于兽医使用。在一些实施方案中，赋形剂可由美国食品与药品管理局批准。在一些实施方案中，赋形剂可具有药用级。在一些实施方案中，赋形剂可满足美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、英国药典和/或国际药典的标准。
用于药用组合物的制造中的药学上可接受的赋形剂包括但不限于，惰性稀释剂、分散和/或造粒剂、表面活性剂和/或乳化剂、崩解剂、粘合剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂和/或油。此类赋形剂可任选包含在药物组合物中。组合物还可包含赋形剂(如可可脂和栓剂蜡)、着色剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和/或芳香剂。
示例性稀释剂包括但不限于碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠、乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉、糖粉等和/或其组合。
示例性成粒剂和/或分散剂包括但不限于土豆淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、羟乙酸淀粉钠、粘土、海藻酸、瓜尔胶、柑橘浆、琼脂、膨润土、纤维素和木材产品、天然海绵、阳离子交换树脂、碳酸钙、硅酸盐、碳酸钠、交联聚(乙烯吡咯烷酮)(交聚维酮)、羧甲基淀粉钠(羟乙酸淀粉钠)、羟甲基纤维素、交联羟甲基纤维素钠(交联羧甲纤维素)、甲基纤维素、预胶凝淀粉(淀粉1500)、微晶淀粉、水不可溶淀粉、羧甲基纤维素钙、硅酸镁铝月桂基硫酸钠、季铵化合物等和/或其组合。
示例性表面活性剂和/或乳化剂包括但不限于天然乳化剂(例如，阿拉伯树胶、琼脂、海藻酸、海藻酸钠、黄芪胶、角叉菜属(chondrux)、胆固醇、黄原胶、果胶、明胶、蛋黄、酪蛋白、羊毛脂、胆固醇、蜡以及卵磷脂)、胶状粘土(例如膨润土[硅酸铝]和[硅酸镁铝])、长链氨基酸衍生物、高分子量醇类(例如硬脂醇、鲸蜡醇、油醇、单硬脂酸三乙酸甘油酯、乙二醇二硬脂酸酯、单硬脂酸甘油酯、以及丙二醇单硬脂酸酯、聚乙烯醇)、卡波姆(例如羧基聚亚甲基、聚丙烯酸、丙烯酸聚合物、以及羧乙烯聚合物)、卡拉胶、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素钠、粉末状纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素)、脱水山梨糖醇脂肪酸酯(例如，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯[20]、聚氧乙烯脱水山梨糖醇[60]、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯[80]、脱水山梨糖醇单棕榈酸酯[40]、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯[60]、脱水山梨糖醇三硬脂酸酯[65]、单油酸甘油酯、脱水山梨糖醇单油酸酯[80])、聚氧乙烯酯(例如聚氧乙烯单硬脂酸酯[45]、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚乙氧基化蓖麻油、聚甲醛硬脂酸酯、以及)、蔗糖脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯(例如)、聚氧乙烯醚(例如聚氧乙烯月桂基醚[30])、聚(乙烯基-吡咯烷酮)、二乙二醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、油酸钠、油酸钾、油酸乙酯、油酸、月桂酸乙酯、月桂基硫酸钠、F 68、188、溴化十六烷基三甲基铵、氯化十六烷基吡啶、苯扎氯铵、多库酯钠等、和/或其组合。
示例性粘合剂包括但不限于淀粉(例如玉米淀粉和淀粉糊)；明胶；糖(例如蔗糖、葡萄糖、右旋糖、糊精、糖蜜、乳糖、乳糖醇、甘露醇)；氨基酸(例如，甘氨酸)；天然和合成的树胶(例如阿拉伯树胶、海藻酸钠、角叉菜提取物、panwar树胶、印度树胶、isapol皮的粘液质、羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、乙酸纤维素、聚(乙烯吡咯烷酮)、硅酸镁铝以及落叶松阿拉伯半乳聚糖)；海藻酸盐；聚环氧乙烷；聚乙二醇；无机钙盐；硅酸；聚甲基丙烯酸酯；蜡；水；醇等；以及其组合。
示例性防腐剂可包括但不限于抗氧化剂、螯合剂、抗微生物防腐剂、抗真菌防腐剂、醇防腐剂、酸性防腐剂和/或其他防腐剂。氧化是mRNA的潜在降解途径，特别是对于液体mRNA制剂而言。为了防止氧化，可将抗氧化剂添加至制剂。示例性抗氧化剂包括但不限于α生育酚、抗坏血酸、棕榈酸抗坏血酸酯、苯甲醇、丁羟茴醚、EDTA、间甲酚、蛋氨酸、丁羟甲苯、单硫代甘油、焦亚硫酸钾、丙酸、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫代甘油和/或亚硫酸钠。示例性螯合剂包括乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸单水合物、依地酸二钠、依地酸二钾、依地酸、富马酸、苹果酸、磷酸、依地酸钠、酒石酸和/或依地酸三钠。示例性抗微生物防腐剂包括但不限于苯扎氯铵、苯索氯铵、苯甲醇、溴硝丙二醇、西曲溴铵、氯化十六烷基吡啶、氯己定、氯丁醇、氯甲酚、氯二甲苯酚、甲酚、乙醇、甘油、海克替啶、咪脲、苯酚、苯氧乙醇、苯乙醇、硝酸苯汞、丙二醇和/或硫柳汞。示例性抗真菌防腐剂包括但不限于对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯甲酸钾、山梨酸钾、苯甲酸钠、丙酸钠和/或山梨酸。示例性醇防腐剂包括但不限于乙醇、聚乙二醇、苯酚、酚类化合物、双酚、氯丁醇、羟基苯甲酸酯和/或苯乙醇。示例性酸性防腐剂包括但不限于维生素A、维生素C、维生素E、β-胡萝卜素、柠檬酸、乙酸、脱氢乙酸、抗坏血酸、山梨酸和/或植酸。其他防腐剂包括但不限于，生育酚、生育酚乙酸酯、甲磺酸去铁敏、溴化十六烷基三甲铵、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、乙二胺、月桂基硫酸钠(SLS)、月桂基乙醚硫酸钠(SLES)、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钾、焦亚硫酸钾、GLYDANT 对羟基苯甲酸甲酯、115、II、NEOLONETM、KATHONTM和/或
在一些实施方案中，多核苷酸溶液的pH维持在pH 5与pH 8之间以提高稳定性。用于控制pH的示例性缓冲剂可包括但不限于磷酸钠、柠檬酸钠、琥珀酸钠、组氨酸(或组氨酸-HCl)、碳酸钠和/或苹果酸钠。在另一个实施方案中，以上列出的示例性缓冲剂可与另外的单价抗衡离子(包括但不限于钾)一起使用。二价阳离子也可用作缓冲抗衡离子；然而，由于复合物形成和/或mRNA降解，这些不是优选的。
示例性缓冲剂还可包括但不限于柠檬酸盐缓冲溶液、乙酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、氯化铵、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、葡乳醛酸钙、葡庚糖酸钙、葡糖酸钙、D-葡糖酸、甘油磷酸钙、乳酸钙、丙酸、乙酰丙酸钙、戊酸、磷酸氢钙、磷酸、磷酸三钙、羟基磷酸钙、乙酸钾、氯化钾、葡糖酸钾、钾混合物、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸钾混合物、乙酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、柠檬酸钠、乳酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钠混合物、氨基丁三醇、氢氧化镁、氢氧化铝、海藻酸、无热原水、等渗盐水、林格氏液、乙醇等和/或其组合。
示例性润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、二氧化硅、滑石、麦芽、山嵛酸甘油酯、氢化植物油、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠、亮氨酸、月桂基硫酸镁、月桂基硫酸钠等以及其组合。
示例性油包括但不限于扁桃、杏仁、鳄梨、巴巴苏椰子、佛手柑、黑加仑籽、琉璃苣、杜松、洋甘菊、芥花、葛缕子、棕榈蜡、蓖麻、肉桂、可可脂、椰子、鱼肝、咖啡、玉米、棉籽、鸸鹋、桉树、月见草、鱼、亚麻籽、香茅醇、葫芦、葡萄籽、榛子、海索草、肉豆蔻酸异丙酯、西蒙德木、夏威夷核果、杂薰衣草、薰衣草、柠檬、山苍子、澳洲坚果、锦葵、芒果籽、白芒花籽、水貂、肉豆蔻、橄榄、柑橘、橙连鳍鲑、棕榈、棕榈仁、桃仁、花生、罂粟籽、南瓜籽、油菜籽、米糠、迷迭香、红花、檀香木、山茶花、塔花、沙棘、芝麻、牛油树脂、硅酮、大豆、向日葵、茶树、蓟、椿、岩兰草、胡桃以及小麦胚芽油。示例性油包括但不限于硬脂酸丁酯、辛酸甘油三酯、癸酸甘油三酯、环甲硅油、癸二酸二乙酯、聚二甲基硅氧烷360、肉豆蔻酸异丙酯、矿物油、辛基十二烷醇、油醇、硅油和/或其组合。
根据配制者的判断，赋形剂如可可脂和栓剂蜡、着色剂、涂覆剂、甜味剂、调味剂和/或芳香剂可存在于组合物中。
示例性添加剂包括生理上生物相容性缓冲剂(例如，三甲胺盐酸盐)，螯合剂(例如像，DTPA或DTPA-双酰胺)或钙螯合物复合物(例如像，钙DTPA、CaNaDTPA-双酰胺)的添加，或任选地钙或钠盐(例如，氯化钙、抗坏血酸钙、葡萄糖酸钙或乳酸钙)的添加。此外，可使用抗氧化剂和悬浮剂。
用于mRNA的低温保护剂
在一些实施方案中，所述多核苷酸制剂包含低温保护剂。如本文所用，术语“低温保护剂”是指当与给定物质组合时，有助于减少或消除在冷冻时发生的对所述物质的损害的一种或多种试剂。在一些实施方案中，将低温保护剂与多核苷酸组合以便在冷冻期间使其稳定。在-20℃与-80℃之间冷冻储存mRNA对于多核苷酸的长期(例如36个月)稳定性可以是有利的。在一些实施方案中，低温保护剂包含于多核苷酸制剂中以通过冷冻/解冻循环和在冷冻储存条件下稳定多核苷酸。本公开的低温保护剂可包括但不限于蔗糖、海藻糖、乳糖、甘油、右旋糖、棉子糖和/或甘露醇。海藻糖由食品与药品管理局列为一般认为安全的(GRAS)，并且通常用于商业药物制剂中。
填充剂
在一些实施方案中，多核苷酸制剂可包含填充剂。如本文所用，术语“填充剂”是指包含在制剂中以赋予制剂所需的稠度和/或制剂组分的稳定的一种或多种试剂。在一些实施方案中，填充剂包含于冻干的多核苷酸制剂中以产生“药学上优良”的饼状物，从而在长期(例如36个月)储存期间稳定冻干的多核苷酸。本公开的填充剂可包括但不限于蔗糖、海藻糖、甘露醇、甘氨酸、乳糖和/或棉子糖。在一些实施方案中，可包含低温保护剂和填充剂(例如蔗糖/甘氨酸或海藻糖/甘露醇)的组合以在冷冻期间稳定多核苷酸并且提供用于冻干的填充剂。
用于配制本公开的多核苷酸的制剂和方法的非限制性实例也提供于2012年12月14日提交的国际公布号WO2013090648中。
裸露的递送
包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其组合可递送至裸露的细胞(例如，肿瘤细胞)。如本文所用，“裸露的”是指递送不含促进转染的试剂的多核苷酸。例如，递送至细胞(例如，肿瘤细胞)的多核苷酸可不含有修饰。包含编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的mRNA的裸露的多核苷酸可使用本领域中已知和本文所述的施用途径(例如，肿瘤内施用)递送至肿瘤细胞。
胃肠外和注射施用
用于胃肠外施用(例如，肿瘤内)的液体剂型包括但不限于药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、混悬液、糖浆剂和/或酏剂。除了活性成分以外，液体剂型可包含在本领域中通常使用的惰性稀释剂，例如像水或其他溶剂、溶解剂和乳化剂如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别为棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯以及其混合物。除了惰性稀释剂以外，经口组合物可包括佐剂如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂和/或芳香剂。在用于胃肠外施用的某些实施方案中，组合物与溶解剂如醇、油、改性油、二醇类、聚山梨醇酯、环糊精、聚合物和/或其组合混合。
用于胃肠外施用(例如，肿瘤内施用)的药物组合物可包含至少一种非活性成分。所使用的任何或没有非活性成分可能已经由美国食品与药品管理局(FDA)批准。用于在用以胃肠外施用的药物组合物中使用的非活性成分的非详尽列表包括盐酸、甘露醇、氮、乙酸钠、氯化钠和氢氧化钠。
可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性混悬液可根据已知技术使用合适的分散剂、润湿剂和/或悬浮剂配制。无菌可注射制剂可以是非毒性胃肠外可接受的稀释剂和/或溶剂中的无菌可注射溶液、混悬液和/或乳剂，如在1,3-丁二醇中的溶液。在这些可接受的媒介物或溶剂中可以使用的是水、林格氏溶液(U.S.P.)以及等渗的氯化钠溶液。无菌不挥发油常规用作溶剂或悬浮介质。出于这个目的，可采用任何温和固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸如油酸可用于可注射剂的制备中。无菌制剂还可包含佐剂，如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂。
可注射制剂(例如，肿瘤内)可例如通过滤过细菌滞留过滤器和/或通过在使用之前可溶解或分散于无菌水或其他无菌可注射介质中的无菌固体组合物中加入灭菌剂来灭菌。
可注射制剂(例如，肿瘤内)可用于直接注射至组织、器官和/或受试者的区域(例如肿瘤)中。
为了延长活性成分的作用，常常希望减缓对来自肿瘤内注射的活性成分的吸收。这可通过使用水溶性低的结晶或非晶材料的液体混悬液来实现。这样，药物的吸收速率取决于其溶解速率，而溶解速率又取决于晶体大小以及晶型。可替代地，胃肠外给予的药物形式的延迟吸收还可通过将该药物溶解或悬浮在油媒介物中而实现。可注射储库形式通过在生物可降解聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯中形成药物的微胶囊基质来制得。取决于药物与聚合物的比率以及所使用的特定聚合物的性质，可对药物释放的速率进行控制。其他生物可降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。储库可注射制剂通过将药物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备。
剂型
本文描述的药物组合物可配制成本文描述的剂型，如局部的、鼻内的、气管内的或可注射的(例如，静脉内、肿瘤内、眼内、玻璃体内、肌肉内、心脏内、腹膜内、皮下)。
液体剂型
用于胃肠外施用(例如，肿瘤内)的液体剂型包括但不限于药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、混悬液、糖浆剂和/或酏剂。除了活性成分以外，液体剂型可包含在本领域中通常使用的惰性稀释剂，包括但不限于水或其他溶剂、溶解剂和乳化剂如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别为棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯以及其混合物。在用于胃肠外施用的某些实施方案中，组合物可与溶解剂如醇、油、改性油、二醇类、聚山梨醇酯、环糊精、聚合物和/或其组合混合。
可注射剂
可注射制剂(例如，肿瘤内)例如无菌可注射水性或油性混悬液可根据已知技术配制并且可包括合适的分散剂、润湿剂和/或悬浮剂。无菌可注射制剂可以是非毒性胃肠外可接受的稀释剂和/或溶剂中的无菌可注射溶液、混悬液和/或乳剂，例如在1,3-丁二醇中的溶液。可采用的可接受的媒介物和溶剂包括但不限于水、林格氏液(U.S.P.)以及等渗氯化钠溶液。无菌不挥发油常规用作溶剂或悬浮介质。出于这个目的，可采用任何温和固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸如油酸可用于可注射剂的制备中。
可注射制剂可例如通过滤过细菌滞留过滤器和/或通过在使用之前可溶解或分散于无菌水或其他无菌可注射介质中的无菌固体组合物中加入灭菌剂来灭菌。
为了延长活性成分的作用，可希望减缓对来自皮下注射或肌肉内注射的活性成分的吸收。这可通过使用水溶性低的结晶或非晶材料的液体混悬液来实现。这样，多核苷酸的吸收速率取决于其溶解速率，而溶解速率又取决于晶体大小以及晶型。或者，胃肠外施用的多核苷酸的延迟吸收可通过将多核苷酸溶解于或混悬于油性媒介物中来实现。可注射储库形式通过在生物可降解聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯中形成多核苷酸的微胶囊基质来制得。根据多核苷酸与聚合物的比率和所采用的特定聚合物的性质，可控制多核苷酸的释放速率。其他生物可降解聚合物的实例包括但不限于聚(原酸酯)和聚(酸酐)。可通过将多核苷酸包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备长效可注射制剂。
肿瘤内递送的方法
本文公开的药物组合物适合施用于肿瘤。术语“肿瘤”在本文中以广义使用，并且是指组织的任何异常新生长，所述生长不具有生理功能并且由不受控制的通常快速的细胞增殖引起。如本文所用的术语“肿瘤”涉及良性肿瘤和恶性肿瘤。
在某些实施方案中，本公开提供了一种将包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其组合递送至肿瘤的方法，所述方法包括将所述多核苷酸配制在本文所述的药物组合物(例如呈脂质纳米颗粒形式)中，以及将所述药物组合物施用于肿瘤。可使用本领域中已知的任何方法(例如，弹丸式注射、输注、手术植入等)进行将药物组合物施用于肿瘤。
使用本文公开的用于肿瘤内施用的药物组合物将包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸或包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸单独或组合递送至肿瘤可：
(i)增加多核苷酸在肿瘤中的保留；
(ii)与肿瘤周围组织中表达的多肽的水平相比，提高肿瘤中表达的多肽的水平；
(iii)减少多核苷酸或表达的产物向脱靶组织(例如肿瘤周围组织或远端位置，例如肝组织)的渗漏；或
(iv)其任何组合，
其中对于某种性质观察到的增加或减少是相对于相应的参考组合物(例如，其中式(I)化合物不存在或已经被另一种可电离氨基脂质(例如MC3)取代的组合物)。
在一个实施方案中，渗漏的减少可量化为肿瘤中的多肽表达与非肿瘤组织(如肿瘤周围组织)或另一组织或器官(例如，肝组织)中的多肽表达的比率的增加。
将包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其组合递送至肿瘤涉及将包含编码IL-23、IL-36-γ、IL-18和/或OX40L多肽的多核苷酸的本文公开的药物组合物(例如呈纳米颗粒形式)施用于受试者，其中施用所述药物组合物包括使肿瘤与所述组合物接触。
在包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸以及包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸是mRNA的情况下，在使肿瘤中的细胞与药物组合物接触后，可翻译的mRNA可在所述细胞中翻译以产生目标多肽。然而，基本上不可翻译的mRNA也可递送至肿瘤。基本上不可翻译的mRNA可用作疫苗和/或可隔离细胞的翻译组分以减少细胞中其他物质的表达。
本文公开的药物组合物可增加特异性递送。如本文所用，术语“特异性递送”是指与脱靶组织(例如，哺乳动物肝脏)相比，通过本文公开的药物组合物(例如，呈纳米颗粒形式)将更多(例如，多至少1.5倍、多至少2倍、多至少3倍、多至少4倍、多至少5倍、多至少6倍、多至少7倍、多至少8倍、多至少9倍、多至少10倍)的包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸或包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸递送至目标靶组织(例如，肿瘤)。
可例如通过以下方式来测量纳米颗粒至特定组织的递送水平
(i)将组织中从包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸或包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸表达的蛋白质的量与所述组织的重量进行比较；
(ii)将组织中的多核苷酸的量与所述组织的重量进行比较；或者
(iii)将组织中从包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸或包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸或包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸表达的蛋白质的量与所述组织中的总蛋白质的量进行比较。
向肿瘤或肿瘤中的特定类别的细胞特异性递送意味着在向受试者施用药物组合物时，相对于其他脱靶目的地，更高比例的包含编码IL-23、IL-36-γ和/或OX40L多肽的多核苷酸的药物组合物被递送至靶目的地(例如，靶组织)。
用于改进的肿瘤内递送的方法
本公开还提供了在向肿瘤施用本文公开的药物组合物(例如，呈纳米颗粒形式)时，实现包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸和/或包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸的改进的肿瘤内递送的方法。例如，递送的改进可能是由于
(i)包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸和/或包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸在肿瘤中的保留增加；
(ii)与肿瘤周围组织中表达的多肽的水平相比，肿瘤中表达的多肽的水平提高；
(iii)多核苷酸或表达的产物向脱靶组织(例如肿瘤周围组织或远端位置，例如肝组织)的渗漏减少；或
(iv)其任何组合，
其中对于某种性质观察到的增加或减少是相对于相应的参考组合物(例如，其中式(I)化合物不存在或已经被另一种可电离氨基脂质(例如MC3)取代的组合物)。
在一个实施方案中，渗漏的减少可量化为肿瘤中的多肽表达与非肿瘤组织(如肿瘤周围组织)或另一组织或器官(例如，肝组织)中的多肽表达的比率的增加。
由于使用本文公开的药物组合物引起的递送的另一种改进是相对于在使用其他脂质组分来递送相同的治疗剂或编码治疗剂的多核苷酸时观察到的免疫应答，免疫应答降低。
因此，本公开提供了一种增加治疗剂(例如，作为药物组合物的一部分施用的多肽)在受试者的肿瘤组织中的保留的方法，所述方法包括向肿瘤组织肿瘤内施用本文公开的药物组合物，其中治疗剂在肿瘤组织中的保留与在施用相应参考组合物后治疗剂在肿瘤组织中的保留相比增加。
还提供了一种增加多核苷酸在受试者的肿瘤组织中的保留的方法，所述方法包括向肿瘤组织肿瘤内施用本文公开的药物组合物，其中多核苷酸在肿瘤组织中的保留与在施用相应参考组合物后多核苷酸在肿瘤组织中的保留相比增加。
还提供了一种增加表达的多肽在受试者的肿瘤组织中的保留的方法，所述方法包括向肿瘤组织施用本文公开的药物组合物，其中所述药物组合物包含编码所述表达的多肽的多核苷酸，并且其中与在施用相应参考组合物后多肽在肿瘤组织中的保留相比，多肽在肿瘤组织中的保留增加。
本公开还提供了一种降低肿瘤内施用于有需要的受试者的多核苷酸的表达渗漏的方法，所述方法包括将所述多核苷酸作为本文公开的药物组合物肿瘤内施用于肿瘤组织，其中所述多肽在非肿瘤组织中的表达水平与在施用相应参考组合物后多肽在非肿瘤组织中的表达水平相比降低。
还提供了一种降低肿瘤内施用于有需要的受试者的治疗剂(例如，作为药物组合物的一部分施用的多肽)的表达渗漏的方法，所述方法包括将所述治疗剂作为本文公开的药物组合物肿瘤内施用于肿瘤组织，其中非肿瘤组织中的治疗剂的量与在施用相应参考组合物后非肿瘤组织中的治疗剂的量相比减少。
还提供了一种降低表达的多肽在受试者的肿瘤中的表达渗漏的方法，所述方法包括向肿瘤组织施用本文公开的药物组合物，其中所述药物组合物包含编码所述表达的多肽的多核苷酸，并且其中非肿瘤组织中表达的多肽的量与在施用相应参考组合物后非肿瘤组织中表达的多肽的量相比减少。
在一些实施方案中，非肿瘤组织是肿瘤周围组织。在其他实施方案中，非肿瘤组织是肝组织。
本公开还提供了一种通过用式(I)化合物替代这种组合物中的一种或所有脂质来降低或预防由肿瘤内施用药物组合物(例如包含本领域肿已知的脂质的药物组合物)引起的免疫应答的方法。例如，通过施用包含MC3(或本领域中已知的其他脂质)的药物组合物中的包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸和/或包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸引起的免疫应答可通过用式(I)化合物(例如，化合物18)替代MC3来预防(避免)或改善。
在一些实施方案中，在本文公开的药物组合物中施用包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合后观察到的免疫应答与在磷酸盐缓冲盐水(PBS)或另一种生理缓冲溶液(例如，林格氏溶液、台氏液(Tyrode'ssolution)、汉克氏平衡盐溶液等)中施用治疗剂或包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合时观察到的免疫应答相比未升高。
在本文公开的药物组合物中施用治疗剂或包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合后观察到的免疫应答与单独施用PBS或另一种生理缓冲溶液时观察到的免疫应答相比未升高。
在一些实施方案中，当将本文公开的药物组合物肿瘤内施用于受试者时，未观察到免疫应答。
因此，本公开还提供了一种将治疗剂或包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸和/或包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸至有需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者肿瘤内施用本文公开的药物组合物，其中由施用所述药物组合物引起的免疫应答与肿瘤内施用以下各项引起的免疫应答相比未升高：
(i)单独PBS或另一种生理缓冲溶液(例如，林格氏溶液、台氏液、汉克氏平衡盐溶液等)；
(ii)在PBS或另一种生理缓冲液中施用治疗剂或包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸和包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸；或者在PBS或另一种生理缓冲液中施用治疗剂或包含编码IL-23多核苷酸的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸和包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸；或
(iii)相应参考组合物，即其中式(I)化合物被另一种可电离氨基脂质(例如MC3)取代的相同药物组合物。
XIII.药盒和装置
药盒
本公开提供了用于方便和/或有效进行本公开的方法或组合物的各种药盒。通常药盒将包括足够量和/或数目的组分以允许使用者进行一名或多名受试者的多次治疗和/或进行多个实验。
在一方面，本公开提供了一种包括本公开的多核苷酸的药盒。在一些实施方案中，药盒包含一种或多种多核苷酸。
药盒可用于蛋白质产生，包括包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸和/或包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸。药盒还可包括包装和说明书和/或形成制剂组合物的递送剂。递送剂可包括盐水、缓冲溶液、类脂质或本文公开的任何递送剂。
在一些方面，本公开提供了一种药盒，所述药盒包括容器，所述容器包括如本文公开的多核苷酸(例如，mRNA)组合物或包含多核苷酸(例如，mRNA)的脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体；以及包装插入物，所述包装插入物包括用于施用所述脂质纳米颗粒或药物组合物以用于治疗个体的癌症或延迟个体的癌症进展的说明书。在一些方面，所述包装插入物还包括用于与包含检查点抑制剂多肽和任选的药学上可接受的载体的组合物组合施用所述药物组合物以用于治疗个体的癌症或延迟个体的癌症进展的说明书。
在其他方面，本公开提供了一种药盒，所述药盒包括药物，所述药物包含脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含如本文公开的多核苷酸(例如，mRNA)和任选的药学上可接受的载体；以及包装插入物，所述包装插入物包括用于单独施用或与包含检查点抑制剂多肽和任选的药学上可接受的载体的组合物组合施用所述药物以用于治疗个体的癌症或延迟个体的癌症进展的说明书。在一些方面，所述药盒还包括包装插入物，所述包装插入物包括用于施用第一药物和第二药物以用于治疗个体的癌症或延迟个体的癌症进展的说明书。
在相关方面，所述检查点抑制剂多肽抑制PD1、PD-L1、CTLA4或其组合。在一些方面，所述检查点抑制剂多肽是抗体，如特异性地结合CTLA4的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段、特异性地结合PD1的抗PD1抗体或其抗原结合片段、特异性地结合PD-L1的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段以及其组合。在一些方面，检查点抑制剂多肽是选自阿特珠单抗、阿维鲁单抗或德瓦鲁单抗的抗PD-L1抗体。在一些方面，检查点抑制剂多肽是选自曲美木单抗或伊匹单抗的抗CTLA-4抗体。在一些方面，检查点抑制剂多肽是选自纳武单抗或派姆单抗的抗PD1抗体。
在一些实施方案中，药盒包括缓冲溶液，所述缓冲溶液包括氯化钠、氯化钙、磷酸盐和/或EDTA。在另一个实施方案中，缓冲溶液包括但不限于盐水、具有2mM钙的盐水、5％蔗糖、具有2mM钙的5％蔗糖、5％甘露醇、具有2mM钙的5％甘露醇、林格氏乳酸盐、氯化钠、具有2mM钙的氯化钠以及甘露糖(参见例如，美国公布号20120258046)。在另外的实施方案中，缓冲溶液是沉淀的或它是冻干的。可改变每种组分的量以实现一致的、可再现的更高浓度的盐水或样品缓冲制剂。还可改变组分以便增加经过一段时间和/或在各种条件下修饰的RNA在缓冲溶液中的稳定性。一方面，本公开提供了用于蛋白质产生的药盒，所述药盒包括：包含可翻译区的多核苷酸，其以有效于在引入到靶细胞中时产生所需量的由可翻译区编码的蛋白质的量提供；包含抑制性核酸的第二多核苷酸，其以有效于基本上抑制细胞的先天性免疫应答的量提供；以及包装和说明书。
在一个方面，本公开提供了用于蛋白质产生的药盒，所述药盒包括包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸和/或包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸表现出被细胞核酸酶降解降低；以及包装和说明书。
在一些实施方案中，单一多核苷酸包含(i)编码IL-23多肽的mRNA和编码IL-36-γ多肽的mRNA或包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸；(ii)编码IL-23多肽的mRNA和编码OX40L多肽的mRNA；或(iii)编码IL-36-γ多肽的mRNA或包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸和编码OX40L多肽的mRNA。在一些实施方案中，单一多核苷酸包含编码IL-23多肽的mRNA、编码IL-36-γ多肽的mRNA或包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、编码第三蛋白质(例如，OX40L多肽)的mRNA或其任何组合。
装置
本公开提供了装置，所述装置可并入包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸。例如，所述装置可并入包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸或其任何组合。这些装置含有处于稳定制剂中的试剂，所述试剂用于合成可供立即递送至有需要的受试者如人患者的制剂形式的多核苷酸。在一些实施方案中，单一多核苷酸包含编码IL-23多肽的mRNA和编码IL-36-γ多肽的mRNA或包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸。在一些实施方案中，单一多核苷酸包含编码IL-23多肽的mRNA、编码IL-36-γ多肽的mRNA或包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸、编码OX40L多肽的mRNA或其任何组合。
可采用用于施用的装置根据本文教导的单次、多次或分次给药方案来递送包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸和包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的多核苷酸、包含编码IL-18多肽的mRNA的多核苷酸和包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸。此类装置在例如国际公布号WO 2013151666A2中进行了教导。
设想到本领域中已知的用于向细胞、器官和组织多次施用的方法和装置与本文公开的方法和组合物结合使用作为本公开的实施方案。这些包括例如具有多个针的那些方法和装置、采用例如管腔或导管的混合型装置以及使用热、电流或辐射驱动机制的装置。
根据本公开，可使用这些多次施用装置来递送本文考虑的单次剂量、多次剂量或分次剂量。此类装置例如在国际公布号WO2013151666A2中进行了教导。
本公开的其他实施方案
E1.一种在有需要的受试者中减小或缩减肿瘤大小和/或抑制肿瘤生长的方法，所述方法包括向所述受试者施用组合的至少两种多核苷酸，其中所述至少两种多核苷酸是选自编码包含白细胞介素-23(IL-23)多肽的第一蛋白质的第一多核苷酸、编码包含白细胞介素-36-γ(IL-36-γ)多肽的第二蛋白质的第二多核苷酸和编码包含OX40L多肽的第三蛋白质第三多核苷酸。
E2.如实施方案1所述的方法，所述至少两种多核苷酸包含(i)所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸；(ii)所述第一多核苷酸和所述第三多核苷酸；(iii)所述第二多核苷酸和所述第三多核苷酸；或(iv)所述第一多核苷酸、所述第二多核苷酸和所述第三多核苷酸。
E3.如实施方案1所述的方法，所述至少两种多核苷酸包含所述第一多核苷酸、所述第二多核苷酸和所述第三多核苷酸。
E4.如实施方案1所述的方法，其中所述施用减小或缩减肿瘤大小或抑制肿瘤生长与(i)施用所述编码第一蛋白质的第一多核苷酸；(ii)施用所述编码第二蛋白质的第二多核苷酸或(iii)施用所述编码第三蛋白质的第三多核苷酸相比好至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍或至少5倍。
E5.如实施方案1或4所述的方法，其中所述第一多核苷酸包含编码所述第一蛋白质的mRNA。
E6.如实施方案1至5中任一项所述的方法，其中所述第二多核苷酸包含编码所述第二蛋白质的mRNA。
E7.如实施方案1至6中任一项所述的方法，其中所述第三多核苷酸包含编码所述第三蛋白质的mRNA。
E8.如实施方案1至7中任一项所述的方法，其中所述第一多核苷酸、所述第二多核苷酸和/或所述第三多核苷酸包含至少一个化学修饰的核苷。
E9.如实施方案8所述的方法，其中所述至少一个化学修饰的核苷是选自由章节XI中列出的那些中的任一者以及其组合组成的组。
E10.如实施方案8或9所述的方法，其中所述至少一个化学修饰的核苷是选自由以下组成的组：假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲氧基尿苷以及其组合。
E11.如实施方案1至10中任一项所述的方法，其中所述第一多核苷酸、所述第二多核苷酸和/或所述第三多核苷酸中的核苷被化学修饰至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％。
E12.如实施方案8至11中任一项所述的方法，其中所述第一多核苷酸、第二多核苷酸和/或第三多核苷酸中的化学修饰的核苷是选自由尿苷、腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤以及其任何组合组成的组。
E13.如实施方案1至12中任一项所述的方法，其中所述第一多核苷酸、所述第二多核苷酸和/或所述第三多核苷酸中的尿苷核苷被化学修饰至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％。
E14.如实施方案1至13中任一项所述的方法，其中所述第一多核苷酸、所述第二多核苷酸和/或所述第三多核苷酸中的腺苷核苷被化学修饰至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％。
E15.如实施方案1至14中任一项所述的方法，其中所述第一多核苷酸、所述第二多核苷酸和/或所述第三多核苷酸中的胞苷核苷被化学修饰至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％。
E16.如实施方案1至15中任一项所述的方法，其中所述第一多核苷酸、所述第二多核苷酸和/或所述第三多核苷酸中的鸟苷核苷被化学修饰至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％。
E17.如实施方案5至16中任一项所述的方法，其中所述编码第一蛋白质的mRNA、所述编码第二蛋白质的mRNA和所述编码第三蛋白质的mRNA中的每一种包含开放阅读框。
E18.如实施方案1至17中任一项所述的方法，其中所述IL-23多肽包含IL-12p40亚基，所述IL-12p40亚基包含与表1中列出的序列至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列能够结合至IL-23p19亚基并形成IL-23，所述氨基酸序列具有IL-23活性。
E19.如实施方案18所述的方法，其中所述IL-12p40亚基由与表1中列出的序列至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的核酸序列编码。
E20.如实施方案1至19中任一项所述的方法，其中所述IL-23多肽包含IL-23p19亚基，所述IL-23p19亚基包含与表1中列出的序列至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列能够结合至IL-23p40亚基并形成IL-23，所述氨基酸序列具有IL-23活性。
E21.如实施方案20所述的方法，其中所述IL-23p19亚基由与表1中列出的序列至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的核酸序列编码。
E22.如实施方案20或21所述的方法，其中所述IL-12p40亚基和所述IL-23P19亚基是在单一多肽链或两条不同的链上。
E23.如实施方案20或21所述的方法，其中所述IL-12p40亚基和所述IL-23p19亚基通过接头融合。
E24.如实施方案23所述的方法，其中所述接头包含(GS)接头。
E25.如实施方案24所述的方法，其中所述(GS)接头包含(GnS)m，其中n是1-10并且m是1-100。
E26.如实施方案24所述的方法，其中所述(GS)接头包括GGS、GGGS、GGGGS(SEQ IDNO:136)、GGGGGS(SEQ ID NO:137)、GGGGGGS(SEQ ID NO:138)或GGGGGGGS(SEQ ID NO:139)。
E27.如实施方案1至26中任一项所述的方法，其中所述IL-23多肽包含与表1中列出的序列至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列能够具有至少一种IL-23活性。
E28.如实施方案27所述的方法，其中所述IL-23多肽由与表1中列出的序列至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的核酸序列编码。
E29.如实施方案1至28中任一项所述的方法，其中所述IL-36-γ多肽包含与表1中列出的序列至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列能够具有IL-36-γ活性。
E30.如实施方案29所述的方法，其中所述IL-36-γ多肽由与表1中列出的序列至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的核酸序列编码。
E31.如实施方案1至30中任一项所述的方法，其中所述OX40L多肽包含与表1A中列出的序列至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列能够具有OX40L活性。
E32.如实施方案31所述的方法，其中所述OX40L多肽由与表1A中列出的序列至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的核酸序列编码。
E33.如实施方案1至32中任一项所述的方法，其中所述第一多核苷酸、所述第二多核苷酸和/或所述第三多核苷酸还包含含有miRNA结合位点的核酸序列。
E34.如实施方案33所述的方法，其中所述miRNA结合位点结合至miR-122。
E35.如实施方案33或34所述的方法，其中所述miRNA结合位点结合至miR-122-3p或miR-122-5p。
E36.如实施方案34所述的方法，其中所述miRNA结合位点包含与aacgccauuaucacacuaaa ua(SEQ ID NO:23至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的核苷酸序列，其中所述miRNA结合位点结合至miR-122。
E37.如实施方案34所述的方法，其中所述miRNA结合位点包含与uggagugugacaaugguguu ug(SEQ ID NO:25)至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的核苷酸序列，其中所述miRNA结合位点结合至miR-122。
E38.如实施方案33至中任一项所述的方法，其中所述第一多核苷酸、所述第二多核苷酸和所述第三多核苷酸包含不同的miRNA结合位点或相同的miRNA结合位点。
E39.如实施方案17至38中任一项所述的方法，其中所述第一多核苷酸、所述第二多核苷酸和/或所述第三多核苷酸还包含5'非翻译区(UTR)。
E40.如实施方案39所述的方法，其中所述5'UTR包含与表3中列出的序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列。
E41.如实施方案17至40中任一项所述的方法，其中所述第一多核苷酸和/或所述第二多核苷酸和/或所述第三多核苷酸包含3'非翻译区(UTR)。
E42.如实施方案41所述的方法，其中所述3'UTR包含与表4A或4B中列出的序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列。
E43.如实施方案40或41所述的方法，其中所述miRNA结合位点插入所述3'UTR中。
E44.如实施方案43所述的方法，其中所述第一多核苷酸和/或所述第二多核苷酸和/或所述第三多核苷酸还包含与所述miRNA结合位点融合的间隔区序列。
E45.如实施方案44所述的方法，其中所述间隔区序列包含至少约10个核苷酸、至少约20个核苷酸、至少约30个核苷酸、至少约40个核苷酸、至少约50个核苷酸、至少约60个核苷酸、至少约70个核苷酸、至少约80个核苷酸、至少约90个核苷酸或至少约100个核苷酸。
E46.如实施方案17至45中任一项所述的方法，其中所述第一多核苷酸和/或所述第二多核苷酸和/或所述第三多核苷酸还包含5'末端帽。
E47.如实施方案46所述的方法，其中所述5'末端帽是帽0、帽1、ARCA、肌苷、N1-甲基-鸟苷、2'氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷、2-叠氮基鸟苷、帽2、帽4、5'甲基G帽或其类似物。
E48.如实施方案17至47中任一项所述的方法，其中所述第一多核苷酸和/或所述第二多核苷酸和/或所述第三多核苷酸还包含3'聚A尾。
E49.如实施方案33至48中任一项所述的方法，其中所述第一多核苷酸和/或所述第二多核苷酸和/或所述第三多核苷酸包含至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个miRNA结合位点。
E50.如实施方案1至49中任一项所述的方法，其中所述第一多核苷酸和/或所述第二多核苷酸和/或所述第三多核苷酸是密码子优化的。
E51.如实施方案1至50中任一项所述的方法，其中所述第一多核苷酸和/或所述第二多核苷酸和/或所述第三多核苷酸是体外转录的(IVT)。
E52.如实施方案1至51中任一项所述的方法，其中所述第一多核苷酸和/或所述第二多核苷酸和/或所述第三多核苷酸是嵌合的。
E53.如实施方案1至51中任一项所述的方法，其中所述第一多核苷酸和/或所述第二多核苷酸和/或所述第三多核苷酸是环形的。
E54.如实施方案18至53中任一项所述的方法，其中所述IL-12p40亚基、所述IL-23p19亚基、所述IL-36-γ多肽和/或所述OX40L多肽与异源多肽融合。
E55.如实施方案1至54中任一项所述的方法，其中所述第一多核苷酸包含与表1的IL-23编码序列或hIL-23_miR-122构建体(SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:71)至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
E56.如实施方案1至55中任一项所述的方法，其中所述第二多核苷酸包含与表1的IL-36编码序列或hIL-36_miR-122构建体(SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:94)至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
E57.如实施方案1至56中任一项所述的方法，其中所述第三多核苷酸包含与表1的OX40L编码序列或OX40L_miR-122构建体(SEQ ID NO:116)至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
E58.如实施方案1至57中任一项所述的方法，其还包括施用第四蛋白质或编码所述第四蛋白质的第四多核苷酸。
E59.如实施方案58所述的方法，其中所述第四多核苷酸包含编码所述第四蛋白质的mRNA。
E60.如实施方案1至59中任一项所述的方法，其中所述第一多核苷酸、所述第二多核苷酸、所述第三多核苷酸和/或所述第四多核苷酸与递送剂一起配制。
E61.如实施方案60所述的方法，其中所述递送剂包括类脂质、脂质体、脂质复合物、脂质纳米颗粒、聚合化合物、肽、蛋白质、细胞、纳米颗粒模拟物、纳米管或缀合物。
E62.如实施方案60所述的方法，其中所述递送剂是脂质纳米颗粒。
E63.如实施方案62所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒包含选自由以下组成的组的脂质：DLin-DMA、DLin-K-DMA、98N12-5、C12-200、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、DODMA、PLGA、PEG、PEG-DMG、PEG化脂质、氨基醇脂质、KL22以及其组合。
E64.如实施方案60至63或80中任一项所述的方法，其中所述递送剂包含具有式(I)的化合物
或是其盐或立体异构体，其中
R1是选自由以下组成的组：C5-20烷基、C5-20烯基、-R*YR"、-YR"和-R"M’R’；
R2和R3独立地选自由以下组成的组：H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR"、-YR"和-R*OR"，或者R2和R3与它们所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4是选自由以下组成的组：C3-6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、
-CHQR、-CQ(R)2和未取代的C1-6烷基，其中Q是选自碳环、杂环、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-N(R)2、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2以及–C(R)N(R)2C(O)OR，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；
每个R5独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R6独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
M和M'独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R')-、
-N(R')C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR')O-、-S(O)2-、芳基以及杂芳基；
R7是选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R'独立地选自由以下组成的组：C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR"、-YR"以及H；
每个R"独立地选自由以下组成的组：C3-14烷基和C3-14烯基；
每个R*独立地选自由以下组成的组：C1-12烷基和C2-12烯基；
每个Y独立地是C3-6碳环；
每个X独立地选自由以下组成的组：F、Cl、Br和I；并且
m是选自5、6、7、8、9、10、11、12和13；并且
其限制条件是当R4是-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、–CHQR或-CQ(R)2时，则(i)当n是1、2、3、4或5时，Q不是-N(R)2，或者(ii)当n是1或2时，Q不是5、6或7元杂环烷基。
E65.如实施方案64所述的方法，其中所述化合物具有式(IA)：
或是其盐或立体异构体，其中
l是选自1、2、3、4和5；
m是选自5、6、7、8和9；
M1是键或M’；
R4是未取代的C1-3烷基或-(CH2)nQ，其中n是1、2、3、4或5，并且Q是OH、-NHC(S)N(R)2或-NHC(O)N(R)2；
M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R')-、-P(O)(OR')O-、芳基以及杂芳基；并且
R2和R3独立地选自由以下组成的组：H、C1-14烷基和C2-14烯基。
E66.如实施方案64至66中任一项所述的方法，其中m是5、7或9。
E67.如实施方案64所述的方法，其中所述化合物具有式(II)：
或是其盐或立体异构体，其中
l是选自1、2、3、4和5；
M1是键或M’；
R4是未取代的C1-3烷基或-(CH2)nQ，其中n是2、3或4，并且Q是OH、-NHC(S)N(R)2或-NHC(O)N(R)2；
M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R')-、-P(O)(OR')O-、芳基以及杂芳基；并且
R2和R3独立地选自由以下组成的组：H、C1-14烷基和C2-14烯基。
E68.如实施方案64至67中任一项所述的方法，其中所述化合物是选自化合物1至化合物147以及其盐和立体异构体。
E69.如实施方案64所述的方法，其中所述化合物具有式(IIa)，
或其盐或立体异构体。
E70.如实施方案64所述的方法，其中所述化合物具有式(IIb)，
或其盐或立体异构体。
E71.如实施方案64或65所述的方法，其中所述化合物具有式(IIc)或(IIe)，
或其盐或立体异构体。
E72.如实施方案64所述的方法，其中R4是选自-(CH2)nQ和-(CH2)nCHQR，其中Q、R和n如以上权利要求64中所定义。
E73.如实施方案64所述的方法，其中所述化合物具有式(IId)，
或其盐或立体异构体，
其中R2和R3独立地选自由以下组成的组：C5-14烷基和C5-14烯基，n是选自2、3和4，并且R'、R"、R5、R6和m如权利要求64中所定义。
E74.如实施方案73所述的方法，其中R2是C8烷基。
E75.如实施方案73或74所述的方法，其中R3是C5烷基、C6烷基、C7烷基、C8烷基或C9烷基。
E76.如实施方案73至75中任一项所述的方法，其中m是5、7或9。
E77.如实施方案73至76中任一项所述的方法，其中R5是H。
E78.如实施方案77所述的方法，其中每个R6是H。
E79.如实施方案60至63中任一项所述的方法，其中所述递送剂包含具有式(I)的化合物
或其盐或立体异构体，其中
R1是选自由以下组成的组：C530烷基、C520烯基、R*YR”、YR”以及R”M’R’；
R2和R3独立地选自由以下组成的组：H、C114烷基、C214烯基、R*YR”、YR”和R*OR”，或者R2和R3与它们所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4是选自由以下组成的组：C36碳环、(CH2)nQ、(CH2)nCHQR、-CHQR、CQ(R)2以及未取代的C16烷基，其中Q是选自碳环、杂环、-OR、O(CH2)nN(R)2、C(O)OR、OC(O)R、CX3、CX2H、CXH2、CN、-N(R)2、C(O)N(R)2、N(R)C(O)R、N(R)S(O)2R、N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(＝NR9)N(R)2、-N(R)C(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(＝NR9)N(R)2、-N(OR)C(＝CHR9)N(R)2、-C(＝NR9)N(R)2、-C(＝NR9)R、-C(O)N(R)OR以及C(R)N(R)2C(O)OR，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；
每个R5独立地选自由以下组成的组：C13烷基、C23烯基和H；
每个R6独立地选自由以下组成的组：C13烷基、C23烯基和H；
M和M’独立地选自C(O)O、OC(O)、C(O)N(R’)、N(R’)C(O)、C(O)-、C(S)、C(S)S、SC(S)、CH(OH)、P(O)(OR’)O、S(O)2、-S-S-、芳基以及杂芳基；
R7是选自由以下组成的组：C13烷基、C23烯基和H；
R8是选自由以下组成的组：C3-6碳环和杂环；
R9是选自由以下组成的组：H、CN、NO2、C1-6烷基、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6烯基、C3-6碳环和杂环；
每个R独立地选自由以下组成的组：C13烷基、C23烯基和H；
每个R'独立地选自由以下组成的组：C118烷基、C218烯基、-R*YR”、YR”和H；
每个R”独立地选自由以下组成的组：C314烷基和C314烯基；
每个R*独立地选自由以下组成的组：C112烷基和C212烯基；
每个Y独立地是C36碳环；
每个X独立地选自由以下组成的组：F、Cl、Br和I；并且m是选自5、6、7、8、9、10、11、12和13；并且
其限制条件是当R4是-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、–CHQR或-CQ(R)2时，则(i)当n是1、2、3、4或5时，Q不是-N(R)2，或者(ii)当n是1或2时，Q不是5、6或7元杂环烷基。
E80.如实施方案79所述的组合物，其中所述递送剂包含具有式(IA)的化合物：
或其盐或立体异构体，其中
l是选自1、2、3、4和5；
m是选自5、6、7、8和9；
M1是键或M’；
R4是未取代的C13烷基或(CH2)nQ，其中Q是OH、NHC(S)N(R)2或NHC(O)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(＝NR9)N(R)2、-NHC(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、杂芳基或杂环烷基；
M和M’独立地选自C(O)O、OC(O)、C(O)N(R’)、P(O)(OR’)O、-S-S-、芳基以及杂芳基；并且
R2和R3独立地选自由以下组成的组：H、C114烷基和C214烯基。
E81.如权利要求79或80所述的组合物，其中m是5、7或9。
E82.如实施方案79至81中任一项所述的组合物，其中所述化合物具有式(II)
或其盐或立体异构体，其中
l是选自1、2、3、4和5；
M1是键或M’；
R4是未取代的C13烷基或(CH2)nQ，其中n是2、3或4，并且Q是OH、NHC(S)N(R)2或NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(＝NR9)N(R)2、-NHC(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、杂芳基或杂环烷基；
M和M’独立地选自C(O)O、OC(O)、C(O)N(R’)、P(O)(OR’)O、-S-S-、芳基以及杂芳基；并且
R2和R3独立地选自由以下组成的组：H、C114烷基和C214烯基。
E83.如实施方案80至82中任一项所述的组合物，其中M1是M’。
E84.如权利要求83所述的组合物，其中M和M’独立地是-C(O)O-或-OC(O)-。
E85.如实施方案80至84中任一项所述的组合物，其中l是1、3或5。
E86.如实施方案79所述的组合物，其中所述化合物是选自由以下组成的组：化合物1至化合物232、其盐和立体异构体以及其任何组合。
E87.如实施方案60至86中任一项所述的方法，其中所述递送剂还包含磷脂。
E88.如实施方案87所述的方法，其中所述磷脂是选自由以下组成的组：1,2-二亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-双十一烷酰基-sn-甘油基-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:0二醚PC)、1-油酰基-2-固醇基半琥珀酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱,1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(ME 16:0PE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸-外消旋-(1-甘油基)钠盐(DOPG)、鞘磷脂以及其混合物。
E89.如实施方案87所述的方法，其中所述磷脂是选自由以下组成的组：1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(14:0-16:0PC，MPPC)、
1-肉豆蔻酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(14:0-18:0 PC，MSPC)、
1-棕榈酰基-2-乙酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(16:0-02:0PC)、
1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(16:0-14:0 PC，PMPC)、
1-棕榈酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(16:0-18:0 PC，PSPC)、
1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(16:0-18:1 PC，POPC)、
1-棕榈酰基-2-亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(16:0-18:2 PC，PLPC)、
1-棕榈酰基-2-花生四烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(16:0-20:4 PC)、
1-棕榈酰基-2-二十二碳六烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(14:0-22:6PC)、
1-硬脂酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:0-14:0 PC，SMPC)、
1-硬脂酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:0-16:0 PC，SPPC)、
1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:0-18:1 PC，SOPC)、
1-硬脂酰基-2-亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:0-18:2PC)、
1-硬脂酰基-2-花生四烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:0-20:4 PC)、
1-硬脂酰基-2-二十二碳六烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:0-22:6 PC)、
1-油酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:1-14:0 PC，OMPC)、
1-油酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:1-16:0 PC，OPPC)、
1-油酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:1-18:0 PC，OSPC)、
1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(16:0-18:1 PE，POPE)、
1-棕榈酰基-2-亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(16:0-18:2 PE)、
1-棕榈酰基-2-花生四烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(16:0-20:4 PE)、
1-棕榈酰基-2-二十二碳六烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(16:0-22:6 PE)、
1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(18:0-18:1 PE)、
1-硬脂酰基-2-亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(18:0-18:2 PE)、
1-硬脂酰基-2-花生四烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(18:0-20:4 PE)、
1-硬脂酰基-2-二十二碳六烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(18:0-22:6 PE)、
1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(OChemsPC)以及
其任何组合。
E90.如实施方案60至89中任一项所述的方法，其中所述递送剂还包含结构脂质。
E91.如实施方案90所述的方法，其中所述结构脂质是选自由以下组成的组：胆固醇、粪固醇、谷固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇、菜籽固醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚以及其混合物。
E92.如实施方案60至91中任一项所述的方法，其中所述递送剂还包含PEG脂质。
E93.如实施方案92所述的方法，其中所述PEG-脂质是选自由以下组成的组：PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油以及其混合物。
E94.如实施方案60至93中任一项所述的方法，其中所述递送剂还包含选自由以下组成的组的可电离脂质：3-(双十二烷基氨基)-N1,N1,4-三十二烷基-1-哌嗪乙胺(KL10)、N1-[2-(双十二烷基氨基)乙基]-N1,N4,N4-三十二烷基-1,4-哌嗪二乙胺(KL22)、14,25-双十三烷基-15,18,21,24-四氮杂-三十八烷(KL25)、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLin-DMA)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、庚三十碳-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、1,2-二油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DODMA)、2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA)、(2R)-2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA(2R))以及(2S)-2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA(2S))。
E95.如实施方案60至94中任一项所述的方法，其中所述递送剂还包含季胺化合物。
E96.如实施方案95所述的方法，其中所述季胺化合物是选自由以下组成的组：
1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、
N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、
1-[2-(油酰基氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羟乙基)咪唑啉鎓氯化物(DOTIM)、
2,3-二油基氧基-N-[2(精胺甲酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸酯(DOSPA)、
N,N-二硬脂酰基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、
N-(1,2-二肉豆蔻酰基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)、
N-(1,2-二油酰基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DORIE)、
N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、
1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(DLePC)、
1,2-二硬脂酰基-3-三甲基铵-丙烷(DSTAP)、
1,2-二棕榈酰基-3-三甲基铵-丙烷(DPTAP)、
1,2-二亚油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DLTAP)、
1,2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵-丙烷(DMTAP)、
1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(DSePC)、
1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(DPePC)、
1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(DMePC)、
1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(DOePC)、
1,2-二-(9Z-十四烯酰基)-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(14:1EPC)、
1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(16:0-18:1EPC)、
以及其任何组合。
E97.一种组合物，其包含在根据实施方案60至96中任一项所述的递送剂中配制的根据实施方案1至57中任一项所述的第一多核苷酸或根据实施方案1至57中任一项所述的第一多核苷酸。
E98.一种组合物，其包含在根据实施方案60至96中任一项所述的递送剂中配制的根据实施方案1至59中任一项所述的第二多核苷酸或根据实施方案1至57中任一项所述的第二多核苷酸。
E99.一种组合物，其包含在根据实施方案60至96中任一项所述的递送剂中配制的根据实施方案1至57中任一项所述的第三多核苷酸和根据实施方案1至57中任一项所述的第三多核苷酸。
E100.一种组合物，其包含(i)根据实施方案1至59中任一项所述的第一多核苷酸和根据实施方案1至57中任一项所述的第二多核苷酸，(ii)根据实施方案1至57中任一项所述的第一多核苷酸和根据实施方案1至57中任一项所述的第三多核苷酸，(iii)根据实施方案1至57中任一项所述的第二多核苷酸和根据实施方案1至57中任一项所述的第三多核苷酸，或(iv)根据实施方案1至57中任一项所述的第一多核苷酸、根据实施方案1至57中任一项所述的第二多核苷酸和根据实施方案1至59中任一项所述的第三多核苷酸。
E101.如权利要求93所述的组合物，其包含根据实施方案1至57中任一项所述的第一多核苷酸、根据实施方案1至57中任一项所述的第二多核苷酸和根据实施方案1至57中任一项所述的第三多核苷酸。
E102.如实施方案101所述的组合物，其还包含递送剂。
E103.如实施方案102所述的组合物，其中所述递送剂包括类脂质、脂质体、脂质复合物、脂质纳米颗粒、聚合化合物、肽、蛋白质、细胞、纳米颗粒模拟物、纳米管或缀合物。
E104.如实施方案102所述的组合物，其中所述递送剂包括根据实施方案64至104中任一项所述的递送剂。
E105.如实施方案87至104中任一项所述的组合物，其用于在有需要的受试者中减小或缩减肿瘤大小或抑制肿瘤生长。
E106.如实施方案97所述的组合物与如实施方案98所述的组合物的组合，其用于在有需要的受试者中减小或缩减肿瘤大小或抑制肿瘤生长。
E107.如实施方案1至96中任一项所述的方法或如实施方案97至106中任一项所述的组合物，其中所述第一多核苷酸、所述第二多核苷酸和/或所述第三多核苷酸被配制用于体内递送。
E108.如实施方案107所述的方法或组合物，其中所述第一多核苷酸和/或所述第二多核苷酸和/或所述第三多核苷酸被配制用于肌肉内、皮下、肿瘤内或皮内递送。
E109A.如实施方案1至96、107和108中任一项所述的方法或如实施方案97至108中任一项所述的组合物，其中皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内、颅内、脑室内、口服、通过吸入喷雾、局部、直肠、经鼻、经颊、阴道或经由植入的储库施用所述第一多核苷酸和/或所述第二多核苷酸。
E110.如实施方案1至96、107和108中任一项所述的方法或如实施方案97至109中任一项所述的组合物，其中所述施用治疗癌症。
E111.如实施方案110所述的方法，其中所述癌症是选自由以下组成的组：肾上腺皮质癌、晚期癌症、肛门癌、再生障碍性贫血、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨转移、脑肿瘤、脑癌、乳腺癌、儿童癌症、原发灶不明癌症、卡斯尔曼氏病、宫颈癌、结肠/直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、尤文氏家族肿瘤、眼癌、胆囊癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道间质瘤、妊娠滋养细胞疾病、霍奇金疾病、卡波济肉瘤、肾细胞癌、喉癌和下咽癌、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、慢性粒单核细胞白血病、肝癌、肝细胞癌(HCC)、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺类癌瘤、皮肤淋巴瘤、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、口腔和口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体瘤、前列腺癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、成人软组织肉瘤、基底和鳞状细胞皮肤癌、黑素瘤、小肠癌、胃癌、睾丸癌、喉癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、维尔姆斯瘤、由癌症治疗引起的继发性癌症以及其任何组合。
E112.如实施方案1至96和107至111中任一项所述的方法或如实施方案97中任一项所述的组合物，其中所述所述第一多核苷酸、所述第二多核苷酸和/或所述第三多核苷酸通过以下递送：包括泵、贴片、药物储库、短针装置、单针装置、多针装置、微型针装置、喷射注射装置、弹道粉末/颗粒输递送装置、导管、管腔、低温探针、套管、微套管的装置，或利用热、RF能量、电流的装置，或其任何组合。
E113.如实施方案1至96和107至112中任一项所述的方法或如实施方案97至112中任一项所述的组合物，其中有效量是介于约0.10mg/kg至约1,000mg/kg之间。
E114.如实施方案1至96和107至113中任一项所述的方法或如实施方案97至113中任一项所述的组合物，其中所述受试者是人。
E115.一种药盒，其包括如实施方案107至113中任一项所述的组合物和根据如实施方案1至97和107至115中任一项所述的方法使用的说明书。
E116.如实施方案1至96或107至113中任一项所述的方法、如实施方案97至115所述的组合物或如实施方案123所述的药盒，其中所述多核苷酸施用至所述受试者使得：
在施用双联体或三联体后从所述受试者获得的一种或多种样品中的粒细胞水平相对于阈值水平或相对于在施用编码IL-23、IL-36-γ或OX40L多肽的单一多核苷酸后的水平增加；或
在施用双联体或三联体后从所述受试者获得的一种或多种样品中的交叉呈递树突状细胞水平相对于阈值水平或相对于在施用编码IL-23、IL-36-γ或OX40L多肽的单一多核苷酸后的水平增加；或
在施用双联体或三联体后从所述受试者获得的一种或多种样品中的效应与抑制T细胞比率相对于阈值水平或相对于在施用编码OX40L多肽的单一多核苷酸后的比率增加；
在施用双联体或三联体后从所述受试者获得的一种或多种样品中的效应记忆T细胞水平相对于阈值水平或相对于在施用编码OX40L多肽的单一多核苷酸后的水平增加；
在施用双联体或三联体后从所述受试者获得的一种或多种样品中的PDL1表达水平相对于阈值水平或相对于在施用编码IL-23、IL-36-γ或OX40L多肽的单一多核苷酸后的水平增加；或
其组合。
E117.一种在有需要的受试者中减小或缩减肿瘤大小或抑制肿瘤生长的方法，所述方法包括向所述受试者施用组合物，所述组合物包含：
组合的两种多核苷酸(双联体)，其中第一多核苷酸编码包含白细胞介素-23多肽(IL-23)的第一蛋白质，并且第二多核苷酸编码包含白细胞介素-36-γ多肽(IL-36-γ)的第二蛋白质；或
组合的三种多核苷酸(三联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽的第二蛋白质，并且第三多核苷酸编码包含OX40L多肽(OX40L)的第三蛋白质，
其中向所述受试者施用所述双联体或三联体使得：
在施用双联体或三联体后从所述受试者获得的一种或多种样品中的粒细胞水平相对于阈值水平或相对于在施用编码IL-23、IL-36-γ或OX40L多肽的单一多核苷酸后的水平增加；或
在施用双联体或三联体后从所述受试者获得的一种或多种样品中的交叉呈递树突状细胞水平相对于阈值水平或相对于在施用编码IL-23、IL-36-γ或OX40L多肽的单一多核苷酸后的水平增加；或
在施用双联体或三联体后从所述受试者获得的一种或多种样品中的效应与抑制T细胞比率相对于阈值水平或相对于在施用编码OX40L多肽的单一多核苷酸后的比率增加；
在施用双联体或三联体后从所述受试者获得的一种或多种样品中的效应记忆T细胞水平相对于阈值水平或相对于在施用编码OX40L多肽的单一多核苷酸后的水平增加；
在施用双联体或三联体后从所述受试者获得的一种或多种样品中的PDL1表达水平相对于阈值水平或相对于在施用编码IL-23、IL-36-γ或OX40L多肽的单一多核苷酸后的水平增加；或
其组合。
E118.如实施方案117所述的方法，其中所述粒细胞水平的增加被定量为
(i)粒细胞占CD45+细胞的百分比，或
(ii)每mg肿瘤的粒细胞数。
E119.如实施方案117所述的方法，其中所述交叉呈递树突状细胞是CD103+细胞。
E120.如实施方案117所述的方法，其中所述交叉呈递树突状细胞水平的增加被定量为
(i)每mg肿瘤的交叉呈递树突状细胞数，
(ii)肿瘤引流淋巴结(TdLN)中的交叉呈递CD103+树突状细胞，或
(iii)交叉呈递CD103+树突状细胞占CD45+细胞的百分比。
E121.如实施方案117所述的方法，其中所述效应与抑制T细胞比率被定量为CD8:Treg比率。
E122.如实施方案117所述的方法，其中所述效应记忆T细胞是CD4+和/或CD8+细胞。
E123.如实施方案117所述的方法，其中所述PDL1表达水平被定量为
(i)阳性CD11b+细胞的数量，或
(ii)CD11b+细胞中的PDL1表达。
E124.一种增加有需要的受试者的粒细胞水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用组合物，所述组合物包含:
组合的两种多核苷酸(双联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，并且第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽的第二蛋白质；或
组合的三种多核苷酸(三联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽的第二蛋白质，并且第三多核苷酸编码包含OX40L多肽的第三蛋白质，
其中在从所述受试者获得的一种或多种样品中测量粒细胞水平。
E125.如实施方案124所述的方法，其中粒细胞水平的增加被测量为
(i)粒细胞占CD45+细胞的百分比，和/或
(ii)每mg肿瘤的粒细胞数，
相对于阈值水平或相对于在施用编码IL-23的单一多核苷酸或编码IL-36-γ的单一多核苷酸后的水平。
E126.一种增加有需要的受试者的交叉呈递树突状细胞水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用组合物，所述组合物包含：
组合的两种多核苷酸(双联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，并且第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽的第二蛋白质；或
组合的三种多核苷酸(三联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽的第二蛋白质，并且第三多核苷酸编码包含OX40L多肽的第三蛋白质，
其中在从所述受试者获得的一种或多种样品中测量交叉呈递树突状细胞水平。
E127.如实施方案126所述的方法，其中所述交叉呈递树突状细胞是CD103+细胞。
E128.如实施方案127所述的方法，其中所述交叉呈递CD103+树突状细胞水平的增加被测量为
(i)每mg肿瘤的交叉呈递CD103+树突状细胞数，
(ii)TdLN中的交叉呈递CD103+树突状细胞，
(iii)交叉呈递CD103+树突状细胞占CD45+细胞的百分比，或
(iv)其组合，
相对于阈值水平或相对于在施用编码IL-23的单一多核苷酸、编码IL-36-γ的单一多核苷酸或编码OX40L的单一多核苷酸后的水平。
E129.一种增加有需要的受试者的效应与抑制T细胞比率的方法，所述方法包括向所述受试者施用组合物，所述组合物包含：
组合的两种多核苷酸(双联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，并且第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽的第二蛋白质；或
组合的三种多核苷酸(三联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽的第二蛋白质，并且第三多核苷酸编码包含OX40L多肽的第三蛋白质，
其中在从所述受试者获得的一种或多种样品中测量效应与抑制T细胞比率。
E130.如实施方案129所述的方法，其中所述效应与抑制T细胞比率被测量为CD8:Treg比率。
E131.一种增加有需要的受试者的效应记忆T细胞水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用组合物，所述组合物包含：
组合的两种多核苷酸(双联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，并且第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽的第二蛋白质；或
组合的三种多核苷酸(三联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽的第二蛋白质，并且第三多核苷酸编码包含OX40L多肽的第三蛋白质，
其中在从所述受试者获得的一种或多种样品中测量效应记忆T细胞水平。
E132.如实施方案131所述的方法，其中所述效应记忆T细胞是CD4+和/或CD8+细胞。
E133.如实施方案132所述的方法，其中相对于阈值水平或相对于在施用编码OX40L的单一多核苷酸后的水平，效应记忆T细胞水平的增加被测量为肿瘤内的效应记忆T细胞。
E134.一种增加有需要的受试者的PDL1阳性细胞水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用组合物，所述组合物包含：
组合的两种多核苷酸(双联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，并且第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽的第二蛋白质；或
组合的三种多核苷酸(三联体)，其中第一多核苷酸编码包含IL-23多肽的第一蛋白质，第二多核苷酸编码包含IL-36-γ多肽的第二蛋白质，并且第三多核苷酸编码包含OX40L多肽的第三蛋白质，
其中在从所述受试者获得的一种或多种样品中测量PDL1阳性细胞水平。
E135.如实施方案134所述的方法，其中所述PDL1阳性细胞是CD11b+细胞。
E136.如实施方案117-135中任一项所述的方法，其中所述从受试者获得的样品是选自由以下组成的组：肿瘤组织、肿瘤浸润物、血液、血浆以及其组合。
E137.如实施方案117-136中任一项所述的方法，其中所述一种或多种对照样品是从健康受试者或患有肿瘤的受试者获得的一种或多种样品。
E138.如实施方案117-137中任一项所述的方法，其中所述阈值水平是预定值或从一种或多种样品获得的值。
等效物和范围
本领域的技术人员将认识到，或仅使用常规实验就能够确定本文描述的根据本公开的具体实施方案的许多等效物。本公开的范围不意图限于以上描述，而是如所附权利要求书中所阐述。
在权利要求书中，除非相反指出或另外从上下文明显看出，否则冠词如“一个/种(a/an)”以及“所述(the)”可意指一个/种或多于一个/种。除非相反指出或另外从上下文明显看出，否则如果一个、多于一个或所有组成员存在于、被用于或以其他方式关联于给定的产物或方法，则认为包括在组的一个或多个成员之间的“或”的权利要求或描述得到了满足。本公开包括其中恰有组中的一个成员存在于、被用于或以其他方式关联于给定产物或方法的实施方案。本公开包括其中多于一个或所有的组成员存在于、被用于或以其他方式关联于给定产物或方法的实施方案。
还应该注意术语“包含”意图为开放的并且容许但并非要求包括另外的要素或步骤。当本文中使用术语“包含”时，因此还涵盖并且公开术语“由……组成”。
在给出范围时，端点被包括在内。此外，应该理解，除非另外指出或另外从上下文和本领域普通技术人员的理解显而易见，否则在本公开的不同实施方案中，表述为范围的值可假定为任何特定值或所述范围内的子范围，到所述范围的下限的单位的十分之一，除非在上下文中另有明确规定。
另外，应理解，在现有技术内的本公开的任何具体实施方案可从任何一个或多个权利要求中明确排除。因为认为此类实施方案为本领域普通技术人员所已知的，即使本文没有明确阐述排除，也可排除它们。本公开的组合物的任何特定实施方案(例如，因此编码的任何核酸或蛋白质；任产何生方法；任何使用方法等)可出于无论是否与现有技术存在相关的任何原因而从任何一个或多个权利要求中排除。
所有引用的来源例如参考文献、出版物、数据库、数据库条目和本文引用的技术均以引用的方式并入本申请，即使在引用中没有明确陈述。在引用的来源和本申请的陈述冲突的情况下，应当以本申请中的陈述为准。
小节标题和表格标题并不旨在限制性的。
实施例
实施例1
根据式I的化合物的合成
A.一般考虑因素
除非另有说明，否则使用的所有溶剂和试剂均在商业上获得并原样使用。使用Bruker Ultrashield 300MHz仪器在300K下在CDCl3中记录1H NMR光谱。对于1H，化学位移被报告为相对于TMS(0.00)的百万分率(ppm)。使用ISCO RediSep Rf Gold FlashCartridges(粒度：20-40微米)在ISCO CombiFlash Rf+Lumen仪器上进行硅胶色谱法使用RediSep Rf Gold C18高效柱在ISCO CombiFlash Rf+Lumen仪器上进行反相色谱法。通过使用具有DAD和ELSD的Waters Acquity UPLC仪器和ZORBAX快速分离高清晰度(RRHD)SB-C18LC柱(2.1mm、50mm 1.8μm)和65％至100％于含0.1％TFA的水中的乙腈的梯度以1.2mL/分钟在5分钟内的反相UPLC-MS(保留时间，RT，以分钟计)分析，确定所有最终化合物的纯度大于85％。注入体积是5μL，并且柱温是80℃。使用Waters SQD质谱仪(Milford,MA,USA)和蒸发光散射检测器以正模式基于电喷雾电离(ESI)进行检测。
下文描述的代表性程序可用于化合物1-232的合成。
在本文中使用以下缩略语：
THF：四氢呋喃
DMAP：4-二甲基氨基吡啶
LDA：二异丙基氨基锂
rt：室温
DME：1,2-二甲氧基乙烷
n-BuLi：正丁基锂
B.化合物2：8-((2-羟乙基)(十四烷基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯
代表性程序1：
8-溴辛酸十七烷-9-基酯(方法A)
向8-溴辛酸(1.04g，4.6mmol)和十七烷-9-醇(1.5g，5.8mmol)于二氯甲烷(20mL)中的溶液添加N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.1g，5.8mmol)、N,N-二异丙基乙胺(3.3mL，18.7mmol)和DMAP(114mg，0.9mmol)。使反应物在室温下搅拌18小时。将反应物用二氯甲烷稀释，并用饱和碳酸氢钠洗涤。将有机层分离并用盐水洗涤且经MgSO4干燥。过滤有机层并在真空中蒸发。通过硅胶色谱法(0％-10％于己烷中的乙酸乙酯)纯化残余物以得到8-溴辛酸十七烷-9-基酯(875mg，1.9mmol，41％)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:ppm 4.89(m,1H)；3.42(m,2H)；2.31(m,2H)；1.89(m,2H)；1.73-1.18(br.m,36H)；0.88(m,6H)。
8-((2-羟乙基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(方法B)
将8-溴辛酸十七烷-9-基酯(3.8g，8.2mmol)和2-氨基乙-1-醇(15mL，248mmol)于乙醇(3mL)中的溶液在62℃下搅拌18小时。在真空中浓缩反应混合物，并将残余物溶解于乙酸乙酯和水中。将有机层分离并用水、盐水洗涤且经Na2SO4干燥。将混合物过滤并在真空中蒸发。通过硅胶色谱法(0％-100％于二氯甲烷中的(1％NH4OH、20％MeOH于二氯甲烷中的混合物))纯化残余物以得到8-((2-羟乙基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(3.1g，7mmol，85％)。UPLC/ELSD：RT＝2.67分钟。MS(ES)：对于C27H55NO3，m/z(MH+)442.68
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:ppm 4.89(p,1H)；3.67(t,2H)；2.81(t,2H)；2.65(t,2H)；2.30(t,2H)；2.05(br.m,2H)；1.72-1.41(br.m,8H)；1.40-1.20(br.m,30H)；0.88(m,6H)。
8-((2-羟乙基)(十四烷基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(方法C)
化学式：C41H83NO3
分子量：638.12
使8-((2-羟乙基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(125mg，0.28mmol)、1-溴代十四烷(94mg，0.34mmol)和N,N-二异丙基乙胺(44mg，0.34mmol)于乙醇中的溶液在65℃下搅拌18小时。将反应物冷却至室温并且在真空中蒸发溶剂。将残余物溶解于乙酸乙酯和饱和碳酸氢钠中。将有机层分离、经Na2SO4干燥并在真空中蒸发。通过硅胶色谱法(0％-100％于二氯甲烷中的(1％NH4OH、20％MeOH于二氯甲烷中的混合物))纯化残余物以得到8-((2-羟乙基)(十四烷基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(89mg，0.14mmol，50％)。UPLC/ELSD：RT＝3.61分钟。MS(ES)：对于C41H83NO3，m/z(MH+)638.91。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:ppm 4.86(p,1H)；3.72-3.47(br.m,2H)；2.78-2.40(br.m,5H)；2.28(t,2H)；1.70-1.40(m,10H)；1.38-1.17(br.m,54H)；0.88(m,9H)。
中间体的合成：
中间体A：2-辛基癸酸
将二异丙胺(2.92mL，20.8mmol)于THF(10mL)中的溶液冷却至-78℃，并且添加n-BuLi溶液(7.5mL，18.9mmol，2.5M于己烷中)。使反应物温至0℃。在0℃下，向癸酸(2.96g，17.2mmol)和NaH(754mg，18.9mmol，60％w/w)于THF(20mL)中的溶液中添加LDA溶液，并使混合物在室温下搅拌30分钟。此后，添加1-碘辛烷(5g，20.8mmol)，并将反应混合物在45℃下加热6小时。用1N HCl(10mL)淬灭反应。将有机层经MgSO4干燥，过滤并在真空中蒸发。通过硅胶色谱法(0％-20％于己烷中的乙酸乙酯)纯化残余物以得到2-辛基癸酸(1.9g，6.6mmol，38％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:ppm 2.38(br.m,1H)；1.74-1.03(br.m,28H)；0.91(m,6H)。
中间体B：2-辛基癸酸7-溴庚基酯
使用方法A由2-辛基癸酸和7-溴庚-1-醇合成2-辛基癸酸7-溴庚基酯。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:ppm 4.09(br.m,2H)；3.43(br.m,2H)；2.48-2.25(br.m,1H)；1.89(br.m,2H)；1.74-1.16(br.m,36H)；0.90(m,6H)。
中间体C：(2-己基环丙基)甲醇
将二乙基锌(20mL，20mmol，1M于己烷中)在二氯甲烷(20mL)中的溶液冷却至-40℃持续5分钟。然后逐滴添加二碘甲烷(3.22mL，40mmol)于二氯甲烷(10mL)中的溶液。在使反应在-40℃下搅拌1小时后，添加三氯乙酸(327mg，2mmol)和DME(1mL，9.6mmol)于二氯甲烷(10mL)中的溶液。使反应温至-15℃并在此温度下搅拌1小时。然后将(Z)-壬-2-烯-1-醇(1.42g，10mmol)于二氯甲烷(10mL)中的溶液添加至所述-15℃溶液中。然后是反应物缓慢温至室温并搅拌18小时。此后，添加饱和NH4Cl(200mL)并将反应物用二氯甲烷(3X)萃取，用盐水洗涤且经Na2SO4干燥。将有机层过滤、在真空中蒸发，并且通过硅胶色谱法(0％-50％于己烷中的乙酸乙酯)纯化残余物以得到(2-己基环丙基)甲醇(1.43g，9.2mmol，92％)。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ:ppm 3.64(m,2H)；1.57-1.02(m,12H)；0.99-0.80(m,4H)；0.72(m,1H),0.00(m,1H)。
C.化合物18：8-((2-羟乙基)(8-(壬基氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯
化学式：C44H87NO5
分子量：710.18
根据上述一般程序和代表性程序1合成化合物18。
UPLC/ELSD：RT＝3.59分钟。MS(ES)：对于C44H87NO5，m/z(MH+)710.89。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:ppm 4.86(m,1H)；4.05(t,2H)；3.53(br.m,2H)；2.83-2.36(br.m,5H)；2.29(m,4H)；0.96-1.71(m,64H)；0.88(m,9H)。
D.化合物136：8-((2-羟乙基)((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)氨基)辛酸壬酯
代表性程序2：
8-溴辛酸壬酯(方法A)
向8-溴辛酸(5g，22mmol)和壬-1-醇(6.46g，45mmol)于二氯甲烷(100mL)中的溶液添加N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐(4.3g，22mmol)和DMAP(547mg，4.5mmol)。使反应物在室温下搅拌18小时。将反应物用二氯甲烷稀释，并用饱和碳酸氢钠洗涤。将有机层分离并用盐水洗涤，经MgSO4干燥。过滤有机层并在真空下蒸发。通过硅胶色谱法(0％-10％于己烷中的乙酸乙酯)纯化残余物以得到8-溴辛酸壬酯(6.1g，17mmol，77％)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:ppm 4.06(t,2H)；3.40(t,2H)；2.29(t,2H)；1.85(m,2H)；1.72-0.97(m,22H)；0.88(m,3H)。
8-((2-羟乙基)氨基)辛酸壬酯
将8-溴辛酸壬酯(1.2g，3.4mmol)和2-氨基乙-1-醇(5mL，83mmol)于乙醇(2mL)中的溶液在62℃下搅拌18小时。在真空中浓缩反应混合物，并用乙酸乙酯和水萃取残余物。将有机层分离并用水、盐水洗涤且经Na2SO4干燥。过滤有机层并在真空中蒸发。通过硅胶色谱法(0％-100％于二氯甲烷中的(1％NH4OH、20％MeOH于二氯甲烷中的混合物))纯化残余物以得到8-((2-羟乙基)氨基)辛酸壬酯(295mg，0.9mmol，26％)。
UPLC/ELSD：RT＝1.29分钟。MS(ES)：对于C19H39NO3，m/z(MH+)330.42
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:ppm 4.07(t,2H)；3.65(t,2H)；2.78(t,2H)；2.63(t,2H)；2.32-2.19(m,4H)；1.73-1.20(m,24H)；0.89(m,3H)
8-((2-羟乙基)((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)氨基)辛酸壬酯
化学式：C37H71NO3
分子量：577.98
使8-((2-羟乙基)氨基)辛酸壬酯(150mg，0.46mmol)、(6Z,9Z)-18-溴十八碳-6,9-二烯(165mg，0.5mmol)和N,N-二异丙基乙胺(65mg，0.5mmol)于乙醇(2mL)中的溶液在回流下搅拌48小时。使反应物冷却至室温并在真空下蒸发溶剂。通过硅胶色谱法(0％-10％于二氯甲烷中的MeOH)纯化残余物以得到呈HBr盐的8-((2-羟乙基)((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)氨基)辛酸壬酯(81mg，0.14mmol，30％)。
UPLC/ELSD：RT＝3.24分钟。MS(ES)：对于C37H71NO3，m/z(MH+)578.64
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:ppm 10.71(br.,1H)；5.36(br.m,4H)；4.04(m,4H)；3.22-2.96(br.m,5H)；2.77(m,2H)；2.29(m,2H)；2.04(br.m,4H)；1.86(br.m,4H)；1.66-1.17(br.m,40H)；0.89(m,6H)
E.化合物138：8,8’-((2-羟乙基)氮烷二基)二辛酸二壬酯
代表性程序3：
8,8’-((2-羟乙基)氮烷二基)二辛酸二壬酯
化学式：C36H71NO5
分子量：597.97
使8-溴辛酸壬酯(200mg，0.6mmol)和2-氨基乙-1-醇(16mg，0.3mmol)和N,N-二异丙基乙胺(74mg，0.6mmol)于THF/CH3CN(1:1)(3mL)中的溶液在63℃下搅拌72小时。将反应物冷却至室温并在真空下蒸发溶剂。用乙酸乙酯和饱和碳酸氢钠萃取残余物。将有机层分离，经Na2SO4干燥并在真空下蒸发。通过硅胶色谱法(0％-10％于二氯甲烷中的MeOH)纯化残余物以得的8,8’-((2-羟乙基)氮烷二基)二辛酸二壬酯(80mg，0.13mmol，43％)。
UPLC/ELSD：RT＝3.09分钟。MS(ES)：对于C36H71NO5，m/z(MH+)598.85
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:ppm 4.05(m,4H)；3.57(br.m,2H)；2.71-2.38(br.m,6H)；2.29(m,4H),1.71-1.01(br.m,49H),0.88(m,6H)。
本文公开的所有其他脂质化合物可通过类似于如上所述的代表性程序1-3的方法和/或本领域中已知的方法获得。
实施例2
纳米颗粒组合物的产生
A.纳米颗粒组合物的产生
纳米颗粒可用混合方法如两种流体流的微流体和T型接合混合，其中一种流体流含有多核苷酸，并且另一种流体流具有脂质组分。
通过在乙醇中以约50mM的浓度组合以下来制备脂质组合物：本文公开的可电离氨基脂质，例如根据式(I)的脂质；磷脂(如DOPE或DSPC，可从Avanti Polar Lipids,Alabaster,AL获得)；PEG脂质(如1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(也称为PEG-DMG)，可从Avanti Polar Lipids,Alabaster,AL获得)；以及结构脂质(如胆固醇，可从Sigma-Aldrich,Taufkirchen,Germany获得，或皮质类固醇(如泼尼松龙、地塞米松、泼尼松和氢化可的松)或其组合)。应将溶液冷藏以在例如-20℃下储存。将脂质合并以产生所需的摩尔比，并用水和乙醇稀释至约5.5mM与约25mM之间的最终脂质浓度。
通过将脂质溶液与包含多核苷酸的溶液以约5:1与约50:1之间的脂质组合物与多核苷酸wt:wt比率组合来制备包含多核苷酸和脂质组合物的纳米颗粒组合物。使用NanoAssemblr基于微流体的系统以约10ml/分钟与约18ml/分钟的流速将脂质溶液快速注射到多核苷酸溶液中以产生水与乙醇之比在约1:1与约4:1之间的悬浮液。
对于包含RNA的纳米颗粒组合物，将浓度为0.1mg/ml的RNA在去离子水中的溶液在pH介于3与4之间的50mM柠檬酸钠缓冲液中稀释以形成储备溶液。
可通过透析加工纳米颗粒组合物以除去乙醇并实现缓冲液交换。使用Slide-A-Lyzer盒(Thermo Fisher Scientific Inc.Rockford,IL)将制剂针对pH 7.4、体积为初产物200倍的磷酸盐缓冲盐水透析两次，其中分子量截断是10kD。第一次透析在室温下进行3小时。然后将制剂在4℃下透析过夜。将所得纳米颗粒悬浮液通过0.2μm无菌过滤器(Sarstedt,Nümbrecht,Germany)过滤到玻璃小瓶中并用卷边封闭物密封。通常获得0.01mg/ml至0.10mg/ml的纳米颗粒组合物溶液。
上述方法诱导纳米沉淀和颗粒形成。替代方法(包括但不限于T-接合和直接注入)可用于实现相同的纳米沉淀。
B.纳米颗粒组合物的表征
Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd,Malvern,Worcestershire,UK)可用于测定纳米颗粒组合的粒度、多分散性指数(PDI)和ζ电位，在1X PBS中测定粒度并且在15mM PBS中测定ζ电位。
紫外-可见光谱可用于测定纳米颗粒组合物中的多核苷酸(例如，RNA)的浓度。将100μL的在1×PBS中稀释的制剂添加至900μL的甲醇和氯仿的4:1(v/v)混合物中。在混合后，例如在DU 800分光光度计(Beckman Coulter,Beckman Coulter有限公司,Brea,CA)上在230nm与330nm之间记录溶液的吸收光谱。可基于所述组合物中使用的多核苷酸的消光系数以及在例如260nm波长处的吸光度与在例如330nm波长处的基线值之间的差异来计算纳米颗粒组合物中的多核苷酸的浓度。
对于包含RNA的纳米颗粒组合物，可使用QUANT-ITTM RNA测定(Invitrogen Corporation Carlsbad,CA)来评价纳米颗粒组合物对RNA的包封。将样品在TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 7.5)中稀释至大约5μg/mL的浓度。将50μL的稀释样品转移至聚苯乙烯96孔平板，且然后将50μL的TE缓冲液或50μL的2％Triton X-100溶液添加至孔中。将板在37℃的温度下孵育15分钟。将试剂在TE缓冲液中1:100稀释，将100μL的此溶液添加至每个孔中。可使用荧光平板读取器(Wallac Victor1420Multilablel Counter；Perkin Elmer,Waltham,MA)在例如约480nm的激发波长和例如约520nm的发射波长下测量荧光强度。从每个样品的荧光值中减去试剂空白的荧光值，并且通过用完整样品(没有添加Triton X-100)的荧光强度除以破碎样品(通过添加Triton X-100造成)的荧光值来确定游离RNA的百分比。
纳米颗粒组合物的示例性配方列于以下表9中。
表9：纳米颗粒组合物的示例性配方
实施例3
IL-23mRNA单一疗法在A20(淋巴瘤)和MC38-C(结肠癌)模型中的功效
在A20淋巴瘤模型和MC38-C结肠癌模型中评估使用IL-23mRNA单一疗法的单一疗法功效。在C57BL/6小鼠中皮下建立MC-38结肠腺癌肿瘤。参见Rosenberg等人,Science 233(4770):1318-21(1986)。根据供应商的说明书培养A20小鼠B细胞淋巴瘤细胞(A20，ATCC号TIB-208；ATCC，Manassas，VA)。将A20细胞皮下接种于BALB/c小鼠中以产生皮下肿瘤。监测肿瘤的大小和可触知性。参见Kim等人,Journal of Immunology 122(2):549-554(1979)；Donnou等人,Advances in Hematology 2012:701704(2012)
如本说明书中所描述来制备对应于编码IL-23的mRNA(无miR-122结合位点的mRNA)和NST-FIX对照mRNA的多核苷酸。将mRNA配制在化合物18LNP中。
一旦MC-38或A20肿瘤达到大约100mm3的平均大小，就用单个肿瘤内剂量的mRNA(2.5μg/剂量)处理动物。
用等效剂量的阴性对照mRNA处理对照动物。“NST”对照是编码对照蛋白质的mRNA的不可翻译形式，其中mRNA包含多个终止密码子。
使用手动卡尺在指定时间点测量肿瘤体积。以立方毫米记录肿瘤体积。
A20淋巴瘤模型中的IL-23mRNA单一疗法功效在图1A和1B中示出。图1A示出用NST-FIX mRNA对照(2.5μg mRNA)处理。在12名受试者中的1名(8.3％)中观察到完全反应(CR)。图1B示出用无miRNA结合位点“miRless”的编码mIL-23的mRNA处理(2.5μgmRNA)。用IL-23mRNA处理在12名受试者中的5名(41.6％)中引发完全反应。MC38-C结肠癌模型中的IL-23mRNA单一疗法功效示于图2A和2B中。图2A示出用NST-OXL40mRNA对照(2.5μg mRNA)处理。图2B示出用无miRNA结合位点“miRless”的编码mIL-23的mRNA处理(2.5μg mRNA)。施用IL-23mRNA在10名受试者中的4名(40％)中引发完全反应。在10名受试者中的2名(20％)中观察到部分反应。
实施例4
将编码IL-36γ或IL-18的mRNA添加至编码IL-23的mRNA增加了MC38-C模型中的功效
还在MC38-C结肠癌模型中评估了将编码白细胞介素36-γ或白细胞介素18的mRNA添加至IL-23mRNA处理的影响。如在实施例3中，在C57BL/6小鼠中皮下建立MC-38结肠腺癌肿瘤以产生皮下肿瘤。
如本说明书中所述制备对应于编码IL-23、IL-36-γ和IL-18mRNA的mRNA的多核苷酸。将mRNA配制在化合物18LNP中。一旦MC38肿瘤达到约100mm3的平均大小，就用单个肿瘤内剂量的mRNA处理动物。用等效剂量的阴性对照mRNA处理对照动物。
使用手动卡尺在指定时间点测量肿瘤体积。以立方毫米记录肿瘤体积。在给药后50天期间进行体内功效研究。
数据表明向包含编码IL-23的mRNA的治疗中添加IL-36-γ或IL-18增加了MC38-C结肠癌模型中的治疗功效。图3A示出用编码IL-23的mRNA和NST-FIX mRNA对照(每种mRNA2.5μg)处理。在10名受试者中的3名(30％)中观察到完全反应。在10名受试者中的6名(60％)中观察到部分反应。直到第90天的扩展数据在图3E中示出。
图3B示出用编码IL-23和IL-36-γ的mRNA(每种mRNA 2.5μg)处理。在10名受试者中的9名(90％)中观察到完全反应。在10名受试者中的1名(10％)中观察到部分反应。直到第90天的扩展数据在图3F中示出。
图3C示出用编码IL-23的mRNA和编码IL-18的第二mRNA(每种mRNA 2.5μg)处理。在10名受试者中的6名(60％)中观察到完全反应。在10名受试者中的3名(30％)中观察到部分反应。
图3D示出用单独NST-FIX mRNA对照(5μg mRNA)处理。直到第70天的扩展数据在图3G中示出。
数据表明编码IL-23的mRNA与编码IL-36-γ的第二mRNA的组合比IL-23mRNA单一疗法更有效。此外，IL-23和IL-36-γ组合疗法比IL-36-γ单一疗法加阴性对照mRNA更有效(未示出)。数据还表明，编码IL-23mRNA的mRNA与编码IL-18的第二mRNA的组合比使用编码IL-23的mRNA的单一疗法更有效。此外，编码IL-23的mRNA与编码IL-18的mRNA的组合比编码IL-18的mRNA单一疗法加阴性对照mRNA(未示出)更有效。
实施例5
将miR-122结合位点添加至IL-36-γ和IL-18组合疗法的作用
将编码IL-36-γ的mRNA与IL-23mRNA疗法组合的功效以及将miR-122添加至在与编码IL-23的mRNA的组合疗法中使用的编码IL-36-γ的mRNA的作用进行了评价。
如上所述在A20淋巴瘤模型中评估使用IL-23mRNA组合疗法的功效。根据供应商的说明书培养A20小鼠B细胞淋巴瘤细胞，皮下接种于BALB/c小鼠中以产生皮下肿瘤，并且一旦A20肿瘤达到约100mm3的平均大小，就用单个肿瘤内剂量的mRNA处理动物。
如在本说明书中所述来制备对应于编码NST-FIX对照的mRNA、编码不含miR-122“miRless”的IL-23或IL-18的mRNA以及编码具有miR-122的IL-36-γ或IL-18的mRNA的多核苷酸。将mRNA配制在化合物18LNP中。使用手动卡尺在指定时间点测量肿瘤体积。以立方毫米记录肿瘤体积。在给药后80天期间进行体内功效研究。
图4A-4C示出向编码IL-23的mRNA添加编码IL-36-γ的mRNA增加了A20淋巴瘤模型中的功效。图4A示出用包括编码IL-23的不含miR-122"miRless"的mRNA和NST-FIX mRNA(每种mRNA 2.5μg)的组合疗法处理。在12名受试者中的8名(66.6％)中观察到完全反应。在12名受试者中的1名(8.3％)中观察到部分反应。图4B示出用编码IL-23的不含miR-122"miRless"的mRNA和编码IL-36-γ的具有miR-122的mRNA(每种mRNA 2.5μg)处理。在12名受试者中的10名(83.3％)中观察到完全反应。图4C示出用编码IL-23的不含miR122结合位点“miRless”的mRNA和编码IL-18的不含miR122结合位点“miRless”的mRNA(每种mRNA 2.5μg)处理。在12名受试者中的6名(50％)中观察到完全反应。图4D示出用NST-FIX mRNA对照(5μgmRNA)处理。编码IL-23的mRNA加编码IL-36-γ或IL-18组合的mRNA优于单组分加阴性对照mRNA(IL-1单一疗法未示出)。与包含miRless mRNA的组合(即，在5'-UTR区中不含miR-122结合位点的mRNA)相比，编码IL-23的mRNA加编码IL-36-γ的在mRNA的5'UTR区中包含mR122结合位点的mRNA的组合的功效特别高。
实施例6
编码IL-36-γ的mRNA加编码IL-23的mRNA在A20淋巴瘤模型中的功效
在A20淋巴瘤模型中评估了在固定的5mg剂量mRNA的情况下编码IL-36-γ的mRNA加编码IL-23的mRNA相对于单独编码IL-23的mRNA的功效。如上详述进行实验。
图5A示出用编码IL-23的mRNA(5μg mRNA)处理。在10名受试者中的1名(10％)中观察到完全反应。在10名受试者中的4名(40％)中观察到部分反应。图5B示出用编码IL-36-γ的mRNA(5μg mRNA)处理。在10名受试者中的2名(20％)中观察到完全反应。在10名受试者中的1名(10/％)中观察到部分反应。图5C示出用编码IL-23的mRNA和编码IL-36-γ的mRNA(每种mRNA 2.5μg)处理。图5D示出用NST-FIX mRNA对照(5μg mRNA)处理。数据表明IL-23/IL-36-γmRNA组合在固定的5μg mRNA剂量下优于单组分制剂的施用。g
实施例7
编码IL-23的mRNA加编码IL-36-γ或IL-18的mRNA在MC38-M结肠癌模型中的功效
如上所述，在MC38结肠癌模型中评估了包含编码IL-23的mRNA加编码IL-36-γ或IL-18的mRNA的组合疗法的功效。使用MC38-C模型(免疫原性强)进行先前实施例中的实验。相比之下，当前实施例中的实验使用MC38-M模型(免疫原性差)进行。两种模型之间的免疫浸润的差异和组织学差异在图6A和6B中示出。
图7A和7B示出在MC38-M结肠癌模型中缺乏令人信服的IL-23mRNA单一疗法功效。图7A示出用基于化合物18的LNP中的NST-OX40L mRNA对照(2.5μg mRNA)处理。未观察到反应。图7B示出用基于化合物18的LNP中的编码IL-23的不含miR-122"miRless"的mRNA(2.5μgmRNA)处理。仅观察到一例部分反应(10名中的1名，10％)。MC38-M是相对不敏感的模型，其中OX40L、抗PD-1抗体和IL-23单一疗法都无效。
图7C示出编码IL-23的mRNA与编码IL-36-γ的mRNA的组合在免疫原性差的MC38-M结肠癌中是有效的。所述图示出用编码IL-23的mRNA和编码IL-36-γ的mRNA(每种mRNA 2.5μg)处理。用编码IL-23的mRNA和编码IL-36-γ的mRNA处理在10名受试者中的2名(20％)中引发完全反应，并且在10名受试者中的5名(50％)中观察到部分反应。
图7E示出编码IL-23的mRNA与编码IL-18的mRNA的组合在免疫原性差的MC38-M结肠癌中是有效的。所述图示出用编码IL-23的mRNA和编码IL-18的mRNA(每种mRNA2.5μg)处理。图7D示出用NST-FIX mRNA对照(5μg mRNA)处理。
实施例8
编码IL-23、IL-36-γ和OX40L的mRNA的三联组合在MC38-M结肠癌模型中的功效
如上所述，在MC38结肠癌模型中评估了包括编码IL-23的mRNA、编码IL-36-γ的mRNA和编码OX40L的mRNA的三联组合疗法的功效。使用MC38-M模型(免疫原性差)进行当前实施例中的实验，参见图9C。
图8示出OX40L在A20肿瘤模型中是有效的。相比之下，当OX40L用于MC38-M结肠癌模型中时，缺乏令人信服的功效(图9A)。所观察到的作用类似于在用抗PD-1抗体处理相同模型时观察到的作用(图9B)。
相比之下，当编码IL-23的包含miR-122结合位点的mRNA(基于化合物18的LNP中的5μg mRNA)时，观察到MC38-M结肠癌模型中的功效(图10A)。未观察到完全反应，但观察到8名逃脱者。延长至第70天的实验数据在图10D中示出。
当编码IL-23的包含miR-122结合位点的mRNA(2.5μg mRNA)与编码IL-36-γ的包含miR-122结合位点的mRNA(2.5μg mRNA)组合时(图10B)，观察到三名完全反应者(25％)，并且逃脱者的数量从八名减少至六名。延长至第70天的实验数据在图10E中示出。
当编码IL-23的包含miR-122结合位点的mRNA(1.7μg mRNA)与编码IL-36-γ的包含miR-122结合位点的mRNA(1.7μg mRNA)和与编码OX40L的包含miR-122结合位点的mRNA(1.7μg mRNA)组合时(图10C)，观察到三名完全反应者(25％)，并且逃脱者的数量从八名减少至六名。延长至第70天的实验数据在图10F中示出。
另一实验评估了使用MC38荧光素酶细胞在MC38模型中单次给药双联体和单次或多次给药三联体。将编码IL-23的包含miR-122结合位点的mRNA与编码IL-36-γ的包含miR-122结合位点的mRNA组合并以单剂量(8μg)施用。编码IL-23的包含miR-122结合位点的mRNA、编码IL-36-γ的包含miR-122结合位点的mRNA和编码OX40L的包含miR-122结合位点的mRNA以单剂量或多个剂量的12μg施用。相对于对照，生物发光在单剂量的双联组合以及单剂量和多剂量的三联组合的情况下降低，在三联组合中观察到更显著的降低(图10G)。然而，用多剂量的三联组合处理的小鼠中超过45天的存活减少，其对应于处理相关的死亡(图10H)。
实施例9
由mRNA产生的IL-23的生物活性
在生物测定中评估了由引入细胞中的mRNA产生的IL-23蛋白的活性，并与重组IL-23蛋白的活性进行了比较。如本说明书中所述来制备对应于编码鼠IL-23或人IL-23的mRNA的多核苷酸。用编码鼠IL-23的mRNA(mRNA mIL-23)、编码人IL-23的mRNA(mRNA hIL-23)转染HeLa细胞或模拟转染，并从转染的细胞中收获上清液。通过ELISA测量收集的上清液中IL-23蛋白的量，然后将不同水平(模拟(0ng/ml)、0.1ng/ml、1ng/ml、3.3ng/ml、10ng/ml或100ng/ml)的mRNA产生的蛋白质或重组鼠IL-23(rec mIL-23)或重组人IL-23(mRNA hIL-23)添加至培养的小鼠原代脾细胞中。将脾细胞与含有IL-23的上清液或重组蛋白一起培养3天，并且然后测量由脾细胞产生的IL-17的量。IL-17产生充当IL-23生物活性的指标。
图11示出由mRNA产生的IL-23与重组IL-23蛋白(例如与rechIL-23相比，蛋白形式mRNA hIL-23)具有等效生物活性，即从原代小鼠脾细胞中诱导IL-17表达。另外，确定来自人IL-23mRNA的体内表达大于来自小鼠直向同源物的表达(数据未示出)。
实施例10
由mRNA产生的IL-36-γ的生物活性
在生物测定中评估了由引入细胞中的mRNA产生的IL-36-γ蛋白的活性，并与重组IL-36-γ蛋白的活性进行了比较。如本说明书中所述来制备对应于编码鼠IL-36-γ或人IL-36-γ的mRNA的多核苷酸。
对于鼠IL-36-γ实验，用编码鼠IL-36-γ蛋白的mRNA(mIL-36γmRNA_v1)转染HeLa细胞或模拟转染，并收集来自转染的细胞的上清液。将骨髓来源的树突状细胞(BMDC)暴露于所收集的含有不同浓度的分泌的成熟鼠IL-36-γ或重组鼠IL-36-γ(rmIL-36γ)的上清液中，并且评估暴露的BMDC的IL6产生。IL6产生充当鼠IL-36-γ活性的指标。图12A示出编码鼠IL-36-γ蛋白的mRNA具有与重组人IL-36-γ(与mIL-36γ相比的rmIL-36γ)蛋白等效的生物活性。
对于人IL-36-γ实验，使用表皮样癌(例如A431)细胞评估IL-36-γ的生物活性。用编码具有不同信号肽(hIL-36γmRNA_v1；hIL-36γmRNA_v2；或hIL-36γmRNA_v3)的人IL-36-γ的mRNA转染B16F10细胞，并收集来自转染的细胞的上清液。通过ELISA测定上清液中hIL-36g的浓度。将A431细胞暴露于不同水平的含有hIL-36g的上清液或重组人IL-36-γ(rhIL-36γ)蛋白，并测量处理的A431细胞的上清液中的IL8产生。IL8产生充当人IL-36-γ活性的指标。图12B示出mRNA来源的人IL-36-γ蛋白与重组人IL-36-γ蛋白具有等效的生物活性(与rhIL-36γ相比，hIL-36γmRNA_v1；hIL-36mRNA_v2；或hIL-36γmRNA_v3)。
实施例11
OX40L的体外生物活性
T细胞活化涉及两个同时发生的细胞信号传导事件：来自T细胞受体复合物的主要信号(例如，CD3刺激)和来自共刺激配体-受体相互作用(例如，OX40L/OX40R相互作用)的第二信号。Kober等人,European Journal of Immunology 38:2678–2688(2008)。在此实施例中，评估了在用mOX40L_miR-122或hOX40L_miR-122处理的细胞表面上表达的OX40L的共刺激生物活性。
A.表达OX40L的细胞的制备
将小鼠黑素瘤细胞(B16F10，ATCC号CRL-6475；ATCC,Manassas,VA)以每孔300,000个细胞的密度接种在6孔板中。如上所述，将人宫颈癌细胞(HeLa)接种在6孔板中。如以上在实施例2中所描述将包含编码OX40L多肽的mRNA并且还包含miR-122结合位点的多核苷酸(小鼠OX40L，mOX40L_miR-122，SEQ ID NO:66；人OX40L，hOX40L_miR-122，SEQ ID NO:65)配制在L2K中。在细胞接种后24小时，将含有3μg mOX40L_miR-122或hOX40L_miR-122 mRNA的制剂添加至各孔。对照细胞进行模拟处理或用阴性对照mRNA(相同mRNA的不可翻译型式，除了没有起始密码子)处理。将细胞在37℃下孵育24小时。°
B.初始CD4+T细胞的制备
取出Balb/c小鼠的脾脏并使用本领域的标准技术加工以产生脾细胞的单细胞悬浮液。使用小鼠CD4T细胞分离试剂盒(Miltenyi,San Diego,CA)从脾细胞悬浮液中分离总CD4+T细胞。通过使用可商购的磁珠T细胞分离试剂盒消耗非CD4细胞，从人外周血单核细胞(PBMC)中分离初始人CD4+T细胞。
C.T细胞活化测定
在激动性抗小鼠CD3抗体(R&D Systems,Minneapolis,MN)或Dynabeads人T-活化剂存在下，将200,000个T细胞添加至转染的B16F10细胞或HeLa细胞的每个孔中；并且将细胞共培养72小时(小鼠)或120小时(人)。测定的示意图在图13A中示出。
在与T细胞共培养后，使用小鼠IL-2ELISA测量小鼠IL-2产生。(小鼠IL-2DuoSetELISA,R&D Systems,Minneapolis,MN)。由CD4+T细胞产生的IL-2的量充当T细胞活化的指标。结果在图13B中示出。使用人IL-2ELISA(人IL-2DuoSet ELISA,R&D Systems,Minneapolis,MN)测量人IL-2产生。结果在图13A、13B和13C中示出。
D.结果
图13B示出用mOX40L_miR-122处理的B16F10细胞表面上的mOX40L表达在体外引发T细胞IL-2应答。mOX40L_miR-122mRNA诱导约12ng/ml的IL-2。用非翻译的阴性对照mRNA处理的B16F10细胞显示与模拟处理的细胞相当的T细胞活化的基线水平(即，约6ng/ml的IL-2)。因此，与对照(模拟处理或非翻译的mRNA)相比，mOX40L_miR-122mRNA诱导高约2倍的IL-2表达。
图13C和13D示出，在作为主要T细胞活化剂的Dynabeads人T活化剂存在下，与OX40L mRNA转染的HeLa细胞共培养大大增强了IL-2产生。没有OX40L表达，几乎未检测到IL-2产生。图13E示出当用预刺激的(即，非初始)CD4+T细胞进行相同实验时，相似水平的增加的人IL-2产生。
这些结果表明OX40L多肽作为共刺激分子具有生物活性。
实施例12
用OX40L mRNA处理的肿瘤内的免疫细胞群体的调节
鉴于OX40L对先天免疫自然杀伤(NK)细胞和适应性CD4+/CD8+T细胞的展现的活性，以下研究的目的是评价OX40L肿瘤内处理对肿瘤相关免疫细胞群体的药效学作用。如上所述建立小鼠A20和MC38肿瘤模型。
A.通过流式细胞术进行的细胞分化
用配制在脂质纳米颗粒中的单个12.5μg剂量的mOX40L_miR-122或对照mRNA(RNA/LNP)处理A20肿瘤。初始地在处理后24小时分析肿瘤样品。使用针对成熟NK细胞表面标志物DX5的抗体分化NK细胞。结果在图14A中示出。在用mOX40L_miR-122处理后14天分析其他肿瘤样品。分别使用抗小鼠CD4和抗小鼠CD8抗体鉴别CD4+和CD8+T细胞。结果在图14B-14C中示出。
在MC38肿瘤模型中进行类似的实验。向具有MC38肿瘤的小鼠单次肿瘤内注射mOX40L_miR-122或NST-OX40L。在一些动物中，在第一剂量后6天施用第二剂量的mRNA。在每个剂量的mRNA后24小时和72小时评估免疫细胞浸润的CD8+细胞。结果在图14D中示出。
B.结果
图14A示出在将mOX40L_miR-122施用至A20肿瘤后24小时，与对照相比，NK细胞浸润在OX40L给药的动物中显著增加。图14B-14C示出在将mOX40L_miR-122施用至A20肿瘤后14天，与对照肿瘤样品相比，CD4+(图14B)和CD8+(图14C)T细胞浸润到肿瘤微环境中均显著增加。
图14D示出与对照处理的肿瘤相比，在MC38肿瘤中第二剂量的mOX40L_miR-122后72小时，浸润性CD8+T细胞的显著增加。
来自两种肿瘤模型的这些数据表明，施用包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸促进肿瘤微环境中先天性和适应性免疫细胞的数量增加。
实施例13
肿瘤内施用后编码OX40L的多核苷酸的体内活性
A.制备OX40L修饰的mRNA
如上所述制备包含编码OX40L多肽(鼠OX40L)并且还包含miRNA结合位点(miR-122)的mRNA的多核苷酸(mOX40L_miR-122；SEQ ID NO:66)。还制备了阴性对照mRNA(含有多个终止密码子的相同mRNA的不可翻译形式：NST_OX40L_122)。
B.急性骨髓性白血病(AML)肿瘤模型
在DBA/2小鼠中皮下建立急性骨髓性白血病(AML)肿瘤。将小鼠AML细胞P388D1，ATCC号CCL-46；ATCC,Manassas,VA)根据供应商的说明书进行培养。将细胞皮下接种于小鼠中以产生皮下肿瘤。监测肿瘤的大小和可触知性。
一旦建立肿瘤，就将动物分成两组，即mOX40L_miR-122组和对照组。在肿瘤植入后7天开始，每7天(Q7D)进行肿瘤内给药。I组用肿瘤内剂量的mOX40L_miR-122以12.5ug(固定剂量)mRNA/kg体重的剂量处理。在相同给药方案中，用肿瘤内剂量的对照NST_OX40L_122mRNA处理II组。
C.结果
结果在图15A和15B中示出。图15A示出用肿瘤内剂量的对照NST_OX40L_122mRNA处理的动物中的个体肿瘤生长。图15B示出用肿瘤内剂量的mOX40L_miR-122mRNA处理的动物中的个体肿瘤生长。这些结果表明，与对照mRNA或PBS处理相比，肿瘤内施用编码OX40L多肽的包含miRNA结合位点的多核苷酸减轻或抑制肿瘤生长。
实施例14
编码OX40L多肽的mRNA和抗PD-1抗体的组合的体内功效
A.OX40L修饰的mRNA和抗PD-1的制备
如上所述制备包含编码OX40L多肽(鼠OX40L)并且还包含miRNA结合位点(miR-122)的mRNA的多核苷酸(mOX40L_miR-122；SEQ ID NO:66)。还制备了阴性对照mRNA(NST_OX40L_122)。
通过将等等分部分的储备液(6.37mg/mL)在无菌PBS中稀释至0.5mg/mL来制备抗PD-1(BioXcell BE0146，抗mPD-1，克隆RMP1-14，批号5792-599016J1)给药溶液。0.5mg/mL给药溶液以10mL/kg的给药体积提供5mg/kg剂量。每天新鲜制备抗PD-1给药溶液并在4℃下避光保存。
通过将等等分部分的储备液(7.38mg/mL)在无菌PBS中稀释至0.5mg/mL来制备大鼠IgG2a(BioXcell BE0089，大鼠IgG2a，克隆2A3，批号601416M1)给药溶液。0.5mg/mL给药溶液以10mL/kg的给药体积提供5mg/kg剂量。每天新鲜制备抗PD-1给药溶液并在4℃下避光保存。
B.MC38结肠腺癌模型
如上所述，在C57BL/6小鼠中皮下建立MC-38结肠腺癌肿瘤。
一旦肿瘤建立，就将动物分组并接受肿瘤内剂量的以下表中所示的以下组合疗法之一：
表10：组合给药和间隔时间
小鼠每7天(Q7D)接受肿瘤内剂量的mRNA。小鼠每两周(BIWx2)接受肿瘤内剂量的抗体。
C.结果
结果在图16A-16E和图17中示出。图16A示出用肿瘤内剂量的对照NST_OX40L_122mRNA与肿瘤内剂量的对照抗体组合处理的动物中的个体肿瘤生长。对照组中存在0/15完全反应者(CR)。图16B示出用肿瘤内剂量的mOX40L_miR-122mRNA与肿瘤内剂量的对照抗体组合处理的动物中的个体肿瘤生长。到植入后第90天，对于此组CR为0/15。图16C示出用肿瘤内对照mRNA与肿瘤内剂量的抗PD-1抗体组合处理的动物中的个体肿瘤生长。到植入后第90天，对于此组CR为2/15。图16D示出用肿瘤内剂量的mOX40L_miR-122mRNA与肿瘤内剂量的抗PD-1抗体组合处理的动物中的个体肿瘤生长。到植入后第90天，对于双重组合组CR为6/15。图16E示出用肿瘤内剂量的PBS与肿瘤内剂量的抗PD-1抗体组合处理的动物中的个体肿瘤生长。到植入后第90天，对于此组CR为0/15。图16F示出用肿瘤内剂量的PBS与肿瘤内剂量的对照抗体组合处理的动物中的个体肿瘤生长。到植入后第90天，此处理组的CR为0/14。
这些结果表明，包括包含编码OX40L多肽的mRNA的多核苷酸和免疫治疗剂(如抗PD-1抗体)的组合疗法在体内有效抑制或减少MC38小鼠肿瘤模型中的肿瘤生长。mOX40L_miR-122与抗PD-1的组合显示出协同体内抗肿瘤功效。这些结果还表明，较低剂量的mRNA可用于组合治疗中。
图17示出相同处理组中动物的存活曲线。这些结果表明，与对照处理组相比，将修饰的OX40L mRNA的肿瘤内给药与抗PD-1抗体的肿瘤内给药组合有效提高了小鼠肿瘤模型的存活率。
实施例15
在用组合疗法处理后的体内记忆免疫应答
如上文实施例14中所描述，用mOX40L_miR-122与抗PD-1抗体组合处理小鼠。在肿瘤接种后第90天，将来自mOX40L_miR-122+抗PD-1组合疗法组的四只完全反应动物(CR)用5x105个MC38肿瘤细胞再次激发。作为对照，10只初次接受试验的动物也接种5x105个MC38细胞。分析的结果在图18A和18B中示出。
图18A示出用MC38肿瘤细胞激发的首次接受试验的动物中的肿瘤生长。初次接受试验的小鼠在植入后约5天开始发展可检测的肿瘤，并且在研究期间肿瘤继续生长。图18B示出先前给予肿瘤内剂量的mOX40L_miR-122和抗PD-1抗体的组合疗法的完全反应者动物中的个体肿瘤生长。在用肿瘤细胞再次激发后，完全反应者动物未显示肿瘤生长(0/4只动物)持续23天。相比之下，初次接受试验的动物显示出高百分比的肿瘤生长。这些结果表明，编码OX40L多肽的mRNA与抗PD-1抗体组合的肿瘤内给药诱导具有抗肿瘤作用的记忆免疫应答。
实施例16
使用三联体mRNA疗法在原发性处理的肿瘤和未处理的远端肿瘤两者中的显著功效
使用MC38-S小鼠肿瘤模型进行实验。在每只动物的每个侧腹中植入肿瘤。参见图19A。用对照mRNA(编码OX40L的非翻译mRNA)、编码IL-23和IL36-γ的mRNA的组合或编码IL-23、IL-36-γ和OX40L的mRNA的三联组合处理一侧的原发性肿瘤。然后，在第二(未处理的)肿瘤上测量第一肿瘤的处理的效果。图19A每次处理的mRNA总剂量是5μg的mRNA。mRNA以单次肿瘤内剂量施用。
图19B和19C示出用对照mRNA处理的小鼠中处理的肿瘤和远端肿瘤中的大肿瘤体积。当向近端肿瘤施用双联mRNA疗法时(图19D)，在此远端肿瘤中观察到9例完全反应(50％)(图19E)。当将三联体mRNA疗法施用于近端肿瘤时(图19F)，在远端肿瘤中观察到15例完全反应(83.3％)(图19G)。
此数据表明用mRNA治疗组合物治疗肿瘤可有效地治疗其他位置的肿瘤。
实施例17
三联体mRNA加抗PD-L1Ab在难以治疗B16F10-AP3肿瘤模型中展现改进的功效
为了评估三联体疗法(编码IL-23、IL-36-γ和OX40L的mRNA的三联组合)在对检查点抑制剂无反应的难以治疗模型中的改进的功效，使用了B16F10-AP3鼠黑素瘤细胞模型。如先前实施例中，总mRNA给药是作为单剂量肿瘤内施用的5ug的总mRNA。每周两次以10mg/kg腹膜内给予抗PD-L1抗体。
图20A示出用对照mRNA处理的动物中的肿瘤生长。当单独施用抗PD-L1抗体时未观察到反应(图20B)。当施用三联体mRNA疗法(编码IL23、IL36γ和OX40L的mRNA)时，也未观察到完全反应(图20C)。另一方面，当三联体mRNA疗法与抗PD-L1抗体组合施用时，观察到15名中的5名完全反应(33％)。除了完全反应之外，在一只小鼠中肿瘤尺寸减小至小于60mm3(图20D)。
此数据表明，通过将这种疗法与本文公开的若干mRNA组合(例如，包括编码IL-23、IL-36-γ和OX40L的mRNA的三联疗法)，可有效地治疗用常规疗法(例如抗PD-L1抗体)治疗难治的肿瘤。
实施例18
在用IL-23:IL-36-γ双联体疗法和IL23:IL-36-γ:OX40L三联体疗法处理后的记忆免疫应答
评价了用双联体疗法处理的动物的记忆免疫应答。用双联体组合疗法处理用MC38-S肿瘤细胞接种的小鼠，所述双联体组合疗法由包含编码IL-23多肽的mRNA的多核苷酸和包含编码IL-36-γ多肽的mRNA的第二多核苷酸组成。每周肿瘤内注射5微克总mRNA，持续4周(Q7D)。
十只小鼠中的十只是完全反应者。当用相同癌症激发初次接受试验的动物时，所有小鼠(十五只中的十五只)都是逃脱者(图21A)。相比之下，当将完全反应者的小鼠用相同癌症再次激发时，在任何再次激发的小鼠中未观察到肿瘤生长(图21B)。
如上所述，对于用双联体mRNA疗法(IL-23:IL-36-γ)处理的小鼠并且还对于用三联体mRNA疗法(IL23:IL-36-γ:OX40L)处理的小鼠，观察到局部处理后抗癌记忆的产生(即，在为来自初次处理的完全反应者的再次激发的小鼠中肿瘤未生长)(在为初始处理的完全反应者的5只再次激发的小鼠中的5只中肿瘤未生长；未示出)。
实施例19
双联体和三联体疗法对免疫细胞水平的影响
为了评估双联替疗法(分别编码IL-23和IL-36-γ的mRNA的双联组合)和三联体疗法(编码IL-23、IL-36-γ和OX40L的mRNA的三联组合)的功效，评价了免疫细胞水平。
用双联体疗法处理用MC38-R肿瘤细胞接种的小鼠引起MC38-R肿瘤中Ly6G+粒细胞水平的显著增加，以粒细胞占CD45+细胞的百分比(图22A)或每mg肿瘤的粒细胞数(图22B)测量。在用三联体疗法处理后也观察到粒细胞的显著增加(图23)。
用双联体和三联体疗法处理增加了交叉呈递树突状细胞的水平(参见图24A和24B)。
用双联体疗法处理增加了MC28-R肿瘤中交叉呈递CD103+树突状细胞的水平，以CD103+树突状细胞占CD45+细胞的百分比(图24A)或每mg肿瘤的CD103+树突状细胞数(图24B)测量。用三联体疗法处理接种MC38-R肿瘤细胞的小鼠显示肿瘤和引流淋巴结中交叉呈递树突状细胞的类似增加(参见图25A和图25B)。在其中定量每mg肿瘤的CD103+树突状细胞的分析中观察到(图25A)并且还在其中定量肿瘤引流淋巴结中的CD8+树突状细胞的分析中观察到(图25B)树突状细胞的这些增加。
用三联体疗法处理增加肿瘤中CD11b+树突状细胞的水平，以每mg肿瘤的CD11b+树突状细胞数测量(图26A)。在引流淋巴结中也观察到CD11b+树突状细胞的增加(图26B)。施用三联体疗法引起引流淋巴结中CD11b+树突状细胞中CD86活化的改变(参见图26C和图26D)。
图27A和图27B示出在将三联体mRNA疗法肿瘤内施用至MC38肿瘤后24小时和72小时，作为CD8cDC1细胞的百分比(图27A)或作为平均荧光强度(MFI)(图27B)测量的引流淋巴结中的CD8cDC1上的CD86活化。
此外，在施用双联体和三联体疗法后，观察到CD86和MHCI的早期增加。CD86和MHCI在CD8+树突状细胞上在双联体处理后7小时较高，但在三联体处理后第7天MHCI较高。在CD103+树突状细胞中，在施用后观察到CD86和MHCI的早期增加。在引流淋巴结中的CD8+DC细胞中，施用后CD86和MHCI也增加。CD 86和MHCI在CD8+引流淋巴结中在双联体后72小时较高，但MHCI在三联体后7天时较高(数据未示出)。
三联体疗法的施用还引起肿瘤(图28A)和引流淋巴结(图28B)中炎性树突状细胞(iDC)的增加。在施用三联体疗法后，还在炎性树突状细胞上观察到CD86的增加(图28C和图28D)。
用双联体疗法或三联体疗法处理也增加了MC38-R肿瘤中的CD8:Treg比率，从而证明提高的效应与抑制T细胞比率(图29)。在施用双联体疗法或三联体疗法后7天，这种效应更明显。
在活化后，初始T细胞亚群经历增殖并分化成效应细胞，然后产生记忆T细胞库。基于迁移模式和功能，它们被分类为中央记忆(主要归巢至淋巴结)和效应记忆(主要归巢至淋巴外部位)亚群。用双联体疗法或三联体疗法处理增加了肿瘤内的CD4+(图30A)和CD8+(图30B)中央和效应记忆T细胞。与IL-23:IL-36-γ双联体相比，OX40L:IL-23:IL-36-γ三联体疗法引起肿瘤中效应记忆细胞的更大增加。
图31示出细胞毒性T细胞消耗对接种MC38-R肿瘤细胞的小鼠存活的影响。用肿瘤内施用的5微克剂量的mRNA三联体处理小鼠。图中的箭头表示mRNA三联体疗法的施用日期。在mRNA施用前2天开始抗体消耗(圆圈)。在仅用三联体、用三联体加对照抗体或用三联体加抗CD4抗体处理的小鼠中观察到最长的存活。三联体加抗CD8抗体的共同施用导致存活率的显著降低，从而证明细胞毒性T细胞对于来自OX40L:IL-23:IL-36-γ三联体疗法的存活益处是必需的。
实施例20
包括三联体mRNA疗法和抗PDL1抗体的组合治疗在MC38模型中的功效
双联体和三联体疗法的施用增加了PD-L1的水平。在施用三联体疗法后，在癌细胞(例如CD45-、FsChi和MHCII-)中观察到PD-L1水平的轻微增加(图32A和32B)。
双联体IL-23:IL-36-γ的施用还产生对PD-L1阳性的CD11b+细胞的百分比增加(图33A)。此观察结果与CD11b+细胞中PD-L1表达的增加相关(图33B)。施用三联体组合还产生对PDL1阳性的CD11b+细胞的百分比增加(图34A)和CD11b+细胞中PDL1表达的增加(图34B)。
响应于用三联体mRNA疗法处理，MC38模型中PD-L1表达的增加提供了将三联体疗法与抗PD-L1抗体组合的合理性。总mRNA给药是作为单剂量肿瘤内施用的5ug总RNA。抗体(抗PD-L1抗体10F.9G2或对照)以10mg/kg每周腹膜内给药两次。当单独施用阴性对照抗体(图35A)或抗PD-L1抗体(图35B)时未观察到反应。当施用三联体mRNA疗法(编码IL23、IL36γ和OX40L的mRNA)时，未观察到完全反应(图35C)，但15只小鼠中的4只显示出尺寸减小的肿瘤。在另一方面，当三联体mRNA疗法与抗PD-L1抗体组合施用时，15只小鼠中的12只经历了肿瘤尺寸减小或完全反应(图35D)。此数据表明，通过将这种疗法与本文公开的若干mRNA组合(例如，包括编码IL-23、IL-36-γ和OX40L的mRNA的三联疗法)，可有效地治疗用常规疗法(例如抗PD-L1抗体)治疗难治的肿瘤。
实施例21
双联体和三联体疗法在HCC同源模型中的疗效
以上所示的先前实验表明mRNA组合疗法，例如IL-23/IL-36-γ(双联体)和IL-23/IL-36-γ/OX40L(三联体)组合疗法在MC38结肠腺癌、A20小鼠B细胞淋巴瘤或B16F10-AP3黑素瘤模型中是有效的。本公开中使用的每种细胞系(例如H22、MC38和B16F10细胞系)可用于模拟不同的肿瘤微环境。MC38细胞模拟免疫抑制环境，而B16F10细胞模拟免疫性贫瘠环境。在本实验中，在同源H22细胞系(一种模拟发炎的肿瘤微环境的肝癌细胞系)中评价了双联体和三联体组合疗法的功效。
在三联体组合疗法(IL-23/IL-36-γ/OX40L)中向小鼠施用2.5ug的每种mRNA，即在化合物18脂质纳米颗粒中配制的总共7.5ug；或7.5ug对照mRNA(NST-FIX)。将mRNA肿瘤内施用Q7Dx3(N＝10只小鼠/组)。在30天后，所有对照小鼠都具有体积超过1,500mm3的肿瘤(图36A)。相比之下，用三联体疗法处理的小鼠中没有一个具有体积超过1,500mm3的肿瘤(图36B)，因此表明三联体组合疗法在HCC同源模型中也是有效的。
实施例22
作为MC38-M(R)中OASIS的一部分的人IL-36对比小鼠IL-36功效
为了确定人IL-36γ对比小鼠IL-36在三联体mRNA疗法中的功效，设计了一种研究，其中对编码OX40L、IL-23和小鼠IL-36-γ或人IL-36-γ的mRNA的多种组合进行了测试。所述研究的设计如表11所示。
如上所述，在C57BL/6小鼠中皮下建立MC-38-M结肠腺癌肿瘤。
一旦肿瘤建立，就将动物分组并接受肿瘤内剂量的以下表中所示的以下组合疗法之一。每组包括15只动物。每只动物给予qdx4，总mRNA剂量为25ul总剂量体积中的5ug/小鼠。
表11
对于血浆剂量后6小时+24小时采集血液
当使用人IL-36-γ或小鼠IL-36-γ时，观察到肿瘤尺寸的减小；然而，使用小鼠IL-36γ的三联体疗法的功效是优异的(图37)。数据表明OX40L单一疗法未导致肿瘤尺寸减小。IL-23单一疗法产生肿瘤尺寸减小。然而，肿瘤对IL-23的反应比对IL-23和OX40L的协同组合的反应慢。在测试的mIL-36-γ与OX40和IL-23的所有比例下观察到肿瘤尺寸的减小(图38A)。关于包括hIL-36-γ的三联体mRNA组合观察到类似的效果，尽管这些组合物对平均肿瘤体积的影响不太明显(图38B)。对应于研究中的每个组和每个单独动物的数据呈现于图39A-39O中。第8组(OX40L单一疗法)中的所有动物均为逃脱者(图39H)。组(IL-23单一疗法)中的四只动物是完全反应者(图39I)。OX40L和IL-23单一疗法的组合产生9名完全反应者(图39E)。因此，OX40L和IL-23单一疗法的组合不是相加而是协同的。最有效的组合疗法是三联体疗法，其包含1:1:0.125比例的编码OX40L的mRNA、编码IL-23的mRNA和编码IL-36γ的小鼠mRNA(图39D)。这种三联体疗法产生10例完全反应加两只肿瘤体积低于100mm3的动物。在所述组的15只动物中，有2只是逃脱者。图40和图41A-41O示出测试的不同疗法对体重的影响。
图42示出测试的不同疗法对存活率的影响。在研究中，经过第30天，没有用OX40L单一疗法处理的动物存活。在第50天后，用IL-23单一疗法治处理的动物的存活率略低于40％。然而，在第50天后，用OX40L和IL-23处理的动物的存活率接近70％，从而再次表明组合OX40L和IL-23的协同作用。最高存活率对应于用三联体疗法1:1:1比例(存活率高于90％)或1:1:0.5(80％存活率)的mOX40L:mIL-23:mIL-36-γ处理的动物。在使用小鼠IL-36-γ时观察到的存活率显著高于使用人Il-36-γ时观察到的存活率。
实施例23
双联体mRNA疗法与三联体mRNA疗法在发炎的肿瘤微环境模型中一样有效
使用MC38-S小鼠肿瘤模型作为发炎的肿瘤微环境的模型进行实验。植入肿瘤并用编码IL-23和OX40L的双联体mRNA疗法(即，一种免疫应答引发物和一种免疫应答共刺激信号)或用编码IL-23、IL-36-γ和OX40L的三联体mRNA疗法(即两种免疫应答引发物和一种免疫应答共刺激信号)处理动物。每次处理的mRNA总剂量为5μg的mRNA。通过添加适量的NST对照mRNA，使每个剂量中mRNA的总量保持恒定。mRNA以单次肿瘤内剂量施用。在植入后随时间推移测量肿瘤体积结果在图43A(三联体mRNA疗法)和图43B(双联体mRNA疗法)中示出。结果表明，双联体和三联体mRNA疗法均有效抑制动物中的肿瘤的生长。
此数据表明，使用编码单一免疫应答引发物和单一免疫应答共刺激信号的mRNA(即双联体mRNA疗法)可实现对具有发炎的肿瘤微环境的肿瘤的有效治疗。
其他实施方案
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虽然已关于若干所描述的实施方案相当详细并相当具体地描述了本公开，但是并不预期本公开应限于任何所述细节或实施方案或任何具体实施方案，而是参考随附权利要求进行说明，以便考虑到现有技术提供所述权利要求的最广泛的可能解释，并且因此有效地涵盖本公开的预期范围。
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Claims (146)

1.一种用于减小肿瘤大小或抑制肿瘤生长的组合物，所述组合物包含至少两种多核苷酸，其中所述至少两种多核苷酸是选自由以下组成的组：
(i)至少一种编码第一免疫应答引发物多肽的多核苷酸；
(ii)至少一种编码第二免疫应答引发物多肽的多核苷酸；
(iii)至少一种编码免疫应答共刺激信号多肽的多核苷酸；以及
(iv)它们的组合。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述至少两种多核苷酸是选自由以下组成的组：
(i)至少一种编码第一免疫应答引发物多肽的多核苷酸和至少一种编码第二免疫应答引发物多肽的多核苷酸；以及
(ii)至少一种编码第一免疫应答引发物多肽的多核苷酸、至少一种编码第二免疫应答引发物多肽的多核苷酸和至少一种编码免疫应答共刺激信号多肽的多核苷酸。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述第一免疫应答引发物多肽和所述第二免疫应答引发物多肽具有选自由以下组成的组的一种或多种活性：
(a)引发树突状细胞；
(b)促进树突状细胞成熟；
(c)促进抗原呈递细胞细胞因子和/或趋化因子产生；
(d)扩增或维持Th17细胞；
(e)增强Th1和/或Th9分化；以及
(f)(a)-(f)的任何组合。
4.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述第一免疫应答引发物多肽或所述第二免疫应答引发物多肽是IL-12家族成员。
5.如权利要求4所述的组合物，其中所述IL-12家族成员包括选自由以下组成的组的多肽：IL-12、IL-23、IL-12p40亚基、IL-23p19亚基、IL-27、IL-35以及它们的组合。
6.如权利要求5所述的组合物，其中所述免疫应答引发物多肽是IL-23多肽。
7.如权利要求6所述的组合物，其中所述IL-23多肽包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:140的氨基酸序列。
8.如权利要求6所述的组合物，其中所述IL-23多肽由包括SEQ ID NO:141或142中所示的核苷酸序列的核苷酸序列编码。
9.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述第一免疫应答引发物免疫应答引发物多肽或所述第二免疫应答引发物免疫应答引发物多肽是IL-1家族成员。
10.如权利要求9所述的组合物，其中所述IL-1家族成员包括选自由以下组成的组的多肽：IL-1α、IL-1β、IL-1Ra、IL-18、IL-33、IL-36Ra、IL-36α、IL-36β、IL-36γ、IL-37、IL-38以及它们的组合。
11.如权利要求10所述的组合物，其中所述免疫应答引发物多肽是IL-36-γ多肽。
12.如权利要求11所述的组合物，其中IL-36-γ多肽包含SEQ ID NO:16中所示的氨基酸序列。
13.如权利要求12所述的组合物，其中所述IL-36-γ多肽由包括SEQ ID NO:143或144中所示的核苷酸序列的核苷酸序列编码。
14.如权利要求10所述的组合物，其中所述免疫应答引发物多肽是IL-18多肽。
15.如权利要求14所述的组合物，其中IL-18多肽包含SEQ ID NO:147、149、151或153中所示的氨基酸序列。
16.如权利要求15所述的组合物，其中IL-18多肽由包括选自由SEQ ID NO:148和155-162组成的组的核苷酸序列的核苷酸序列编码。
17.如权利要求1或2中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含编码第一免疫应答引发物多肽和第二免疫应答引发物多肽的至少两种多核苷酸，其中所述第一免疫应答引发物多肽是IL-12家族成员，并且所述第二免疫应答引发物多肽是IL-1家族成员。
18.如权利要求17所述的组合物，其中所述第一免疫应答引发物多肽是IL-23多肽，并且所述第二免疫应答引发物多肽是IL-36-γ多肽。
19.如权利要求17所述的组合物，其中所述第一免疫应答引发物多肽是IL-23多肽，并且所述第二免疫应答引发物多肽是IL-18多肽。
20.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述免疫应答共刺激信号多肽具有选自由以下组成的组的至少一种活性：
(a)活化、刺激、促进或增强T细胞增殖、T细胞存活、T细胞募集或它们的组合；以及
(b)活化、刺激、促进或增强NK细胞增殖、NK细胞存活、NK细胞募集或它们的组合。
21.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述免疫应答共刺激信号多肽具有选自由以下组成的组的至少一种活性：
(c)促进或增强T细胞扩增和/或功能；
(d)促进或增强Th1、Th2和/或Th9细胞发育；
(e)抑制或遏制Treg发育和/或活性；
(f)促进或增强记忆细胞的发育和/或活性；以及
(g)(c)-(f)的任何组合。
22.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述免疫应答共刺激信号多肽是选自由以下组成的组：OX40L、CD80、IL-15以及它们的任何组合。
23.如权利要求22所述的组合物，其中所述免疫应答共刺激信号多肽是选自由以下组成的组：OX40L和IL-15以及它们的任何组合。
24.如权利要求23所述的组合物，其中所述免疫应答共刺激信号多肽是OX40L多肽。
25.如权利要求24所述的组合物，其中所述OX40L多肽包含SEQ ID NO:21中所示的氨基酸序列。
26.如权利要求25所述的组合物，其中所述OX40L多肽由包括SEQ ID NO:145或146中所示的核苷酸序列的核苷酸序列编码。
27.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含编码检查点抑制剂多肽或包含检查点抑制剂多肽的多肽的多核苷酸。
28.如权利要求27所述的组合物，其中所述检查点抑制剂多肽抑制PD1、PD-L1、CTLA4或它们的组合。
29.如权利要求28所述的组合物，其中所述检查点抑制剂多肽是抗体或其抗原结合片段。
30.如权利要求29所述的组合物，其中所述抗体是特异性地结合CTLA4的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段、特异性地结合PD1的抗PD1抗体或其抗原结合片段、特异性地结合PD-L1的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段以及它们的组合。
31.如权利要求30所述的组合物，其中所述抗PD-L1抗体是阿特珠单抗、阿维鲁单抗或德瓦鲁单抗。
32.如权利要求30所述的组合物，其中所述抗CTLA-4抗体是曲美木单抗或伊匹单抗。
33.如权利要求30所述的组合物，其中所述抗PD1抗体是纳武单抗或派姆单抗。
34.一种用于减小肿瘤大小或抑制肿瘤生长的组合物，所述组合物包含编码至少第一和第二多肽的至少两种多核苷酸，其中所述至少两种多核苷酸是选自由以下组成的组：
(i)编码IL-23多肽的多核苷酸；
(ii)编码IL-36γ多肽的多核苷酸；
(iii)编码IL-18多肽的多核苷酸；
(iv)编码OX40L多肽的多核苷酸；
(v)编码CD80多肽的多核苷酸；
(vi)编码抗-CTLA4抗体的多核苷酸；以及
(vii)它们的任何组合。
35.如权利要求34所述的组合物，其中所述至少两种多核苷酸是选自由以下组成的组：
(i)编码IL-23多肽的多核苷酸，
(ii)编码IL-36γ多肽的多核苷酸；
(iii)编码IL-18多肽的多核苷酸；
(iv)编码OX40L多肽的多核苷酸；以及
(v)它们的任何组合。
36.如权利要求34所述的组合物，其中所述至少两种多核苷酸是选自由以下组成的组：
(i)编码IL23多肽的多核苷酸和编码IL36γ多肽的多核苷酸；
(ii)编码IL23多肽的多核苷酸和编码IL-18多肽的多核苷酸；
(iii)编码IL23多肽的多核苷酸和编码OX40L多肽的多核苷酸；
(iv)编码IL36γ多肽的多核苷酸和编码OX40L多肽的多核苷酸；
(v)编码IL36γ多肽的多核苷酸和编码IL18多肽的多核苷酸；以及
(vi)编码IL18多肽的多核苷酸和包含OX40L多肽的多核苷酸。
37.如权利要求34所述的组合物，其还包含至少一种编码第三多肽的第三多核苷酸。
38.一种组合物，其包含编码至少第一多核苷酸、第二多核苷酸和第三多核苷酸的至少三种多核苷酸，其中所述至少三种多核苷酸是选自由以下组成的组：
(i)编码IL23多肽的第一多核苷酸、编码IL36γ多肽的第二多核苷酸和编码OX40L多肽的第三多核苷酸；以及
(ii)编码IL23多肽的第一多核苷酸、编码IL18多肽的第二多核苷酸和编码OX40L多肽的第三多核苷酸。
39.如权利要求38所述的组合物，其中所述组合物包含编码IL23多肽的第一多核苷酸、编码IL36γ多肽的第二多核苷酸和编码OX40L多肽的第三多核苷酸。
40.如权利要求38所述的组合物，其中所述组合物包含编码IL23多肽的第一多核苷酸、编码IL18多肽的第二多核苷酸和编码OX40L多肽的第三多核苷酸。
41.如权利要求38-40中任一项所述的组合物，其中所述编码IL-23多肽的第一多核苷酸包含(i)编码IL-12p40多肽的开放阅读框(ORF)；(ii)编码IL-23p19多肽的ORF；或(iii)编码IL-12p40多肽和IL-23p19多肽两者的ORF。
42.如权利要求41所述的组合物，其中所述编码IL-23多肽的第一多核苷酸包含编码IL-12p40多肽和IL-23p19多肽两者的ORF。
43.如权利要求41所述的组合物，其中所述编码IL-23多肽的第一多核苷酸包含编码IL-12p40多肽、IL-23p19多肽和可操作地位于所述IL-12p40多肽与所述IL-23p19多肽之间的接头的ORF。
44.如权利要求43所述的组合物，其中所述接头是Gly/Ser接头。
45.如权利要求44所述的组合物，其中所述Gly/Ser接头包含(GnS)m，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20，并且m是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20。
46.如权利要求45所述的组合物，其中所述Gly/Ser接头包含(GnS)m，并且其中n是6且m是1。
47.如权利要求43所述的组合物，其中所述IL-23多肽包含SEQ ID NO:140中所示的氨基酸序列。
48.如权利要求43所述的组合物，其中所述编码IL-23多肽的第一多核苷酸包含SEQ IDNO:141中所示的核苷酸序列。
49.如权利要求48所述的组合物，其中所述编码IL-23多肽的第一多核苷酸包含至少一个微小RNA(miR)结合位点。
50.如权利要求49所述的组合物，其中所述miR结合位点是miR-122结合位点。
51.如权利要求49所述的组合物，其中所述miR-122结合位点是miR-122-3p或miR-122-5p结合位点。
52.如权利要求48所述的组合物，其中所述编码IL-23多肽的第一多核苷酸包含3’UTR，所述3’UTR包含至少一个miR-122-5p结合位点。
53.如权利要求52所述的组合物，其中所述miR-122-5p结合位点包含SEQ ID NO:26中所示的核苷酸序列。
54.如权利要求48所述的组合物，其中所述编码IL-23多肽的第一多核苷酸包含3’UTR，所述3’UTR包含SEQ ID NO:120中所示的核苷酸序列。
55.如权利要求48所述的组合物，其中所述编码IL-23多肽的第一多核苷酸包含5’UTR，所述5’UTR包含SEQ ID NO:27中所示的核苷酸序列。
56.如权利要求38所述的组合物，其中所述编码IL-23多肽的第一多核苷酸包含SEQ IDNO:142中所示的核苷酸序列。
57.如权利要求38-56中任一项所述的组合物，其中所述编码IL-36γ多肽的第二多核苷酸包含编码异源信号肽的核苷酸序列，所述编码异源信号肽的核苷酸序列可操作地连接至编码IL-36-γ多肽的ORF。
58.如权利要求57所述的组合物，其中所述异源信号肽源自人免疫球蛋白κ轻链可变区hIGVK4。
59.如权利要求57所述的组合物，其中所述IL-36γ多肽包含SEQ ID NO:16中所示的氨基酸序列。
60.如权利要求57所述的组合物，其中所述编码IL-36γ多肽的第二多核苷酸包含SEQID NO:143中所示的核苷酸序列。
61.如权利要求60所述的组合物，其中所述编码IL-36γ多肽的第二多核苷酸包含至少一个微小RNA(miR)结合位点。
62.如权利要求61所述的组合物，其中所述miR结合位点是miR-122结合位点。
63.如权利要求62所述的组合物，其中所述miR-122结合位点是miR-122-3p或miR-122-5p结合位点。
64.如权利要求60所述的组合物，其中所述编码IL-36γ多肽的第二多核苷酸包含3’UTR，所述3’UTR包含至少一个miR-122-5p结合位点。
65.如权利要求64所述的组合物，其中所述miR-122-5p结合位点包含SEQ ID NO:26中所示的核苷酸序列。
66.如权利要求60所述的组合物，其中所述编码IL-36γ多肽的第二多核苷酸包含3’UTR，所述3’UTR包含SEQ ID NO:120中所示的核苷酸序列。
67.如权利要求66所述的组合物，其中所述编码IL-36γ多肽的第二多核苷酸包含5’UTR，所述5’UTR包含SEQ ID NO:27中所示的核苷酸序列。
68.如权利要求60所述的组合物，其中所述编码IL-36γ多肽的第二多核苷酸包含SEQID NO:144中所示的核苷酸序列。
69.如权利要求38-56中任一项所述的组合物，其中所述编码IL-18多肽的第二多核苷酸包含编码异源信号肽的核苷酸序列，所述编码异源信号肽的核苷酸序列可操作地连接至编码IL-18多肽的ORF。
70.如权利要求69所述的组合物，其中所述异源信号肽源自人免疫球蛋白κ轻链可变区hIGVK4。
71.如权利要求69所述的组合物，其中所述IL-18多肽包含SEQ ID NO:147、149、151或153中所示的氨基酸序列。
72.如权利要求69所述的组合物，其中所述编码IL-18多肽的第二多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:148和155-162组成的组的核苷酸序列。
73.如权利要求72所述的组合物，其中所述编码IL-18多肽的第二多核苷酸包含至少一个微小RNA(miR)结合位点。
74.如权利要求73所述的组合物，其中所述miR结合位点是miR-122结合位点。
75.如权利要求74所述的组合物，其中所述miR-122结合位点是miR-122-3p或miR-122-5p结合位点。
76.如权利要求72所述的组合物，其中所述编码IL-18多肽的第二多核苷酸包含3’UTR，所述3’UTR包含至少一个miR-122-5p结合位点。
77.如权利要求76所述的组合物，其中所述miR-122-5p结合位点包含SEQ ID NO:26中所示的核苷酸序列。
78.如权利要求72所述的组合物，其中所述编码IL-18多肽的第二多核苷酸包含3’UTR，所述3’UTR包含SEQ ID NO:120中所示的核苷酸序列。
79.如权利要求78所述的组合物，其中所述编码IL-18多肽的第二多核苷酸包含5’UTR，所述5’UTR包含SEQ ID NO:27中所示的核苷酸序列。
80.如权利要求69所述的组合物，其中所述编码IL-18多肽的第二多核苷酸包含SEQ IDNO:161中所示的核苷酸序列。
81.如权利要求38-80中任一项所述的组合物，其中所述OX40L多肽包含SEQ ID NO:21中所示的氨基酸序列。
82.如权利要求81所述的组合物，其中所述编码OX40L多肽的第三多核苷酸包含SEQ IDNO:145中所示的核苷酸序列。
83.如权利要求82所述的组合物，其中所述编码OX40L多肽的第三多核苷酸包含至少一个微小RNA(miR)结合位点。
84.如权利要求83所述的组合物，其中所述miR结合位点是miR-122结合位点。
85.如权利要求84所述的组合物，其中所述miR-122结合位点是miR-122-3p或miR-122-5p结合位点。
86.如权利要求85所述的组合物，其中所述编码OX40L多肽的第三多核苷酸包含3’UTR，所述3’UTR包含至少一个miR-122-5p结合位点。
87.如权利要求86所述的组合物，其中所述miR-122-5p结合位点包含SEQ ID NO:26中所示的核苷酸序列。
88.如权利要求82所述的组合物，其中所述编码OX40L多肽的第三多核苷酸包含3’UTR，所述3’UTR包含SEQ ID NO:120中所示的核苷酸序列。
89.如权利要求88所述的组合物，其中所述编码OX40L多肽的第三多核苷酸包含5’UTR，所述5’UTR包含SEQ ID NO:27中所示的核苷酸序列。
90.如权利要求81所述的组合物，其中所述编码OX40L多肽的第三多核苷酸包含SEQ IDNO:146中所示的核苷酸序列。
91.如权利要求38-90中任一项所述的组合物，其还包含编码检查点抑制剂多肽或包含检查点抑制剂多肽的多肽的多核苷酸。
92.如权利要求91所述的组合物，其中所述检查点抑制剂多肽抑制PD1、PD-L1、CTLA4或它们的组合。
93.如权利要求92所述的组合物，其中所述检查点抑制剂多肽是抗体或编码所述抗体的多核苷酸。
94.如权利要求93所述的组合物，其中所述抗体是特异性地结合CTLA4的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段、特异性地结合PD1的抗PD1抗体或其抗原结合片段、特异性地结合PD-L1的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段以及它们的组合。
95.如权利要求94所述的组合物，其中所述抗PD-L1抗体是阿特珠单抗、阿维鲁单抗或德瓦鲁单抗。
96.如权利要求94所述的组合物，其中所述抗CTLA-4抗体是曲美木单抗或伊匹单抗。
97.如权利要求94所述的组合物，其中所述抗PD1抗体是纳武单抗或派姆单抗。
98.如权利要求1-97中任一项所述的组合物，其中每种多核苷酸包含修饰的mRNA。
99.如权利要求98所述的组合物，其中每种mRNA包含至少一种化学修饰。
100.如权利要求99所述的组合物，其中所述化学修饰是选自由以下组成的组：假尿苷、N1-甲基假尿苷、2-硫代尿苷、4’-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷以及2’-O-甲基尿苷。
101.如权利要求100所述的组合物，其中所述化学修饰是选自由以下组成的组：假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲氧基尿苷以及它们的组合。
102.如权利要求100所述的组合物，其中所述化学修饰是N1-甲基假尿苷。
103.如权利要求98所述的组合物，其中所述组合物中的每种mRNA包含完全修饰的N1-甲基假尿苷。
104.如权利要求1-103中任一项所述的组合物，其被配制用于肿瘤内递送。
105.如权利要求1-103中任一项所述的组合物，其被配制在脂质纳米颗粒载体中。
106.如权利要求105所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒载体包含约20％-60％可电离氨基脂质:5％-25％磷脂:25％-55％固醇；以及0.5％-15％PEG修饰的脂质的摩尔比。
107.如权利要求105所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒载体包含约50％可电离氨基脂质:约10％磷脂:约38.5％胆固醇；以及约11.5％PEG修饰的脂质的摩尔比。
108.如权利要求105所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒载体包含约49.83％可电离氨基脂质:约9.83％磷脂:约30.33％胆固醇；以及约2.0％PEG修饰的脂质的摩尔比。
109.如权利要求106-108中任一项所述的组合物，其中所述可电离氨基脂质是选自由以下组成的组：例如，2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)以及二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)-十七烷二酸酯(L319)。
110.如权利要求109所述的组合物，其中所述可电离氨基脂质是化合物18。
111.如权利要求105所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒载体包含约20％-60％化合物18:5％-25％磷脂:25％-55％胆固醇；以及0.5％-15％PEG修饰的脂质的摩尔比。
112.如权利要求105所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒载体包含约50％化合物18:约10％磷脂:约38.5％胆固醇；以及约1.5％PEG修饰的脂质的摩尔比。
113.如权利要求105所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒载体包含约49.83％化合物18:约9.83％磷脂:约30.33％胆固醇；以及约2.0％PEG修饰的脂质的摩尔比。
114.一种脂质纳米颗粒，其包含：
(i)编码人OX40L多肽的多核苷酸；
(ii)编码人IL-23多肽的多核苷酸，其中所述人IL-23多肽包含可操作地连接至人IL-23p19亚基的人IL-12p40亚基；以及
(iii)编码人IL-36γ多肽的多核苷酸，其中所述人IL-36γ多肽包含异源信号肽，
其中所述多核苷酸是修饰的mRNA，并且
其中所述mRNA以1:1:2的OX40L:IL-23:IL-36γ质量比配制。
115.如权利要求114所述的脂质纳米颗粒，其中
(i)所述编码人OX40L多肽的多核苷酸包含SEQ ID NO:145中所示的核苷酸序列；
(ii)所述编码人IL-23多肽的多核苷酸包含SEQ ID NO:141中所示的核苷酸序列；并且
(iii)所述编码人IL-36γ多肽的多核苷酸包含SEQ ID NO:143中所示的核苷酸序列。
116.如权利要求115所述的脂质纳米颗粒，其中每种多核苷酸(i)-(iii)包含3’UTR，所述3’UTR包含SEQ ID NO:120中所示的核苷酸序列。
117.如权利要求115或116所述的脂质纳米颗粒，其中每种多核苷酸(i)-(iii)包含5’UTR，所述5’UTR包含SEQ ID NO:27中所示的核苷酸序列。
118.如权利要求114所述的脂质纳米颗粒，其中
(i)所述编码人OX40L多肽的多核苷酸包含SEQ ID NO:146中所示的核苷酸序列；
(ii)所述编码IL-23多肽的多核苷酸包含SEQ ID NO:142中所示的核苷酸序列；并且
(iii)所述编码人IL-36γ多肽的多核苷酸包含SEQ ID NO:144中所示的核苷酸序列。
119.如权利要求114-118中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中每种mRNA包含至少一种化学修饰。
120.如权利要求119所述的脂质纳米颗粒，其中所述化学修饰是选自由以下组成的组：假尿苷、N1-甲基假尿苷、2-硫代尿苷、4’-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷以及2’-O-甲基尿苷。
121.如权利要求120所述的脂质纳米颗粒，其中所述化学修饰是选自由以下组成的组：假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲氧基尿苷以及它们的组合。
122.如权利要求121所述的脂质纳米颗粒，其中所述化学修饰是N1-甲基假尿苷。
123.如权利要求119所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒中的每种mRNA包含完全修饰的N1-甲基假尿苷。
124.如权利要求114-123中任一项所述的脂质纳米颗粒，其被配制用于肿瘤内递送。
125.如权利要求114-124中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒包含约20％-60％化合物18:5％-25％磷脂:25％-55％胆固醇；以及0.5％-15％PEG修饰的脂质的摩尔比。
126.如权利要求114-124中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒包含约50％化合物18:约10％磷脂:约38.5％胆固醇；以及约1.5％PEG修饰的脂质的摩尔比。
127.如权利要求114-124中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒包含约49.83％化合物18:约9.83％磷脂:约30.33％胆固醇；以及约2.0％PEG修饰的脂质的摩尔比。
128.一种组合物，其包含如权利要求114-127中任一项所述的脂质纳米颗粒和药学上可接受的载体或赋形剂。
129.一种用于治疗个体的癌症或延迟个体的癌症进展的组合物，所述组合物包含如权利要求114-127中任一项所述的脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体，或如权利要求128所述的组合物，其中所述治疗包括与第二组合物组合施用所述脂质纳米颗粒，其中所述第二组合物包含检查点抑制剂多肽和任选的药学上可接受的载体。
130.权利要求114-127中任一项的脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体在制造用于治疗个体的癌症或延迟个体的癌症进展的药物中的用途，其中所述药物包含所述脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体，并且其中所述治疗包括与包含检查点抑制剂多肽和任选的药学上可接受的载体的组合物组合施用所述药物。
131.一种药盒，其包括容器，所述容器包括如权利要求114-127中任一项所述的脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体，或如权利要求128所述的组合物；以及包装插入物，所述包装插入物包括用于施用所述脂质纳米颗粒或药物组合物以用于治疗个体的癌症或延迟个体的癌症进展的说明书。
132.如权利要求131所述的药盒，其中所述包装插入物还包括用于与包含检查点抑制剂多肽和任选的药学上可接受的载体的组合物组合施用所述药物组合物以用于治疗个体的癌症或延迟个体的癌症进展的说明书。
133.一种药盒，其包括药物，所述药物包含权利要求114-127中任一项的脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体，或如权利要求128所述的药物组合物；以及包装插入物，所述包装插入物包括用于单独施用或与包含检查点抑制剂多肽和任选的药学上可接受的载体的组合物组合施用所述药物以用于治疗个体的癌症或延迟个体的癌症进展的说明书。
134.如权利要求133所述的药盒，其中所述药盒还包括包装插入物，所述包装插入物包括用于施用第一药物和所述第二药物以用于治疗个体的癌症或延迟个体的癌症进展的说明书。
135.如权利要求114-127中任一项所述的脂质纳米颗粒，如权利要求128或129所述的组合物，如权利要求130所述的用途或如权利要求131-134中任一项所述的药盒，其中所述检查点抑制剂多肽抑制PD1、PD-L1、CTLA4或它们的组合。
136.如权利要求114-127中任一项所述的脂质纳米颗粒，如权利要求128或129所述的组合物，如权利要求130所述的用途或如权利要求131-134中任一项所述的药盒，其中所述检查点抑制剂多肽是抗体。
137.如权利要求114-127中任一项所述的脂质纳米颗粒，如权利要求128或129所述的组合物，如权利要求130所述的用途或如权利要求131-134中任一项所述的药盒，其中所述检查点抑制剂多肽是选自以下的抗体：特异性地结合CTLA4的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段、特异性地结合PD1的抗PD1抗体或其抗原结合片段、特异性地结合PD-L1的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段以及它们的组合。
138.如权利要求114-127中任一项所述的脂质纳米颗粒，如权利要求128或129所述的组合物，如权利要求130所述的用途或如权利要求131-134中任一项所述的药盒，其中所述检查点抑制剂多肽是选自阿特珠单抗、阿维鲁单抗或德瓦鲁单抗的抗PD-L1抗体。
139.如权利要求114-127中任一项所述的脂质纳米颗粒，如权利要求128或129所述的组合物，如权利要求130所述的用途或如权利要求131-134中任一项所述的药盒，其中所述检查点抑制剂多肽是选自曲美木单抗或伊匹单抗的抗CTLA-4抗体。
140.如权利要求114-127中任一项所述的脂质纳米颗粒，如权利要求128或129所述的组合物，如权利要求130所述的用途或如权利要求131-134中任一项所述的药盒，其中所述检查点抑制剂多肽是选自纳武单抗或派姆单抗的抗PD1抗体。
141.一种在有需要的受试者中减小或缩减肿瘤大小或抑制肿瘤生长的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1-113和128-129中任一项所述的组合物或如权利要求114-127中任一项所述的脂质纳米颗粒。
142.如权利要求141所述的方法，其中肿瘤内施用所述组合物。
143.如权利要求141所述的方法，其中区域性地施用所述组合物。
144.如权利要求141所述的方法，其中腹膜内施用所述组合物。
145.如权利要求141-144中任一项所述的方法，其中所述肿瘤是肝细胞癌。
146.如权利要求141-144中任一项所述的方法，其中所述肿瘤是卵巢肿瘤、结肠肿瘤或播散性胃肿瘤。
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